專利名稱：一種含有植物腫節(jié)風(fēng)有效成分的藥物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物藥物腫節(jié)風(fēng)，更具體的說是腫節(jié)風(fēng)有效部位和其有效成分單體及其由兩者單獨(dú)或分別與其它植物提取物或化合物混合制成的各種制劑及其制備方法和它們?cè)诳鼓[瘤、抗腫瘤的增效減毒及抗血小板減少性紫癜、抗菌抗炎方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫節(jié)風(fēng)(Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai)為金粟蘭科草珊瑚屬植物干燥全草，又名草珊瑚、九節(jié)茶、接骨木、駁骨茶、骨消風(fēng)等。為多年生常綠草本，分布于江西、安徽、浙江、湖南、湖北、四川、廣東、廣西等省，江西省為主要產(chǎn)地。腫節(jié)風(fēng)有活血祛瘀、止痛、清熱解毒等功效。用于治療常見炎癥(包括咽喉炎、氣管支氣管炎、肺炎、角膜炎、蜂窩組織炎、闌尾炎)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。近代用于癌癥輔助治療。對(duì)多種惡性腫瘤如胃癌、胰腺癌、肝癌、食道癌、直腸癌等均有療效?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道腫節(jié)風(fēng)含黃酮類、香豆素、有機(jī)酸、揮發(fā)油、三萜，倍半萜類、酚類等多種成分。《中國(guó)藥典》2000年版和2005年版收載了腫節(jié)風(fēng)片、血康口服液、草珊瑚含片3個(gè)制劑。腫節(jié)風(fēng)片(腫節(jié)風(fēng)浸膏制成)用于肺炎、闌尾炎、蜂窩組織炎，并可用于癌癥輔助治療。血康口服液用于血小板紫癜，可升高血小板。草珊瑚含片用于咽喉炎。《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》收載了腫節(jié)風(fēng)注射液制劑。腫節(jié)風(fēng)注射液同樣用于肺炎、闌尾炎、蜂窩組織炎，癌癥輔助治療。這4個(gè)制劑均屬于總提取物的粗制劑，不是有效部位和單體化合物的制劑，而且有效成分不明確。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服已有技術(shù)的不足，提供一種腫節(jié)風(fēng)有效部位和其有效成分單體及其由兩者單獨(dú)或分別與其它植物提取物或化合物混合制成的各種制劑的抗腫瘤、抗腫瘤的增效減毒及抗血小板減少性紫癜、抗菌抗炎的應(yīng)用。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種含有植物腫節(jié)風(fēng)有效成分的藥物，其特征在于所述的有效成分是腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚；所述的有效成分是腫節(jié)風(fēng)有效單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯。
制備所述的腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚包括如下步驟腫節(jié)風(fēng)總提取物的提取
乙醇回流提取取腫節(jié)風(fēng)藥材粗粉，用35％～70％乙醇10～15倍量作溶劑，浸漬1小時(shí)后，加熱回流提取3～4次，每次1～2小時(shí)，合并回流液，濃縮后得腫節(jié)風(fēng)總提取物；或乙醇滲漉提取取腫節(jié)風(fēng)藥材粗粉，用35％～70％乙醇10～15倍量作溶劑，浸漬1小時(shí)后進(jìn)行滲漉直到滲漉液無色，合并滲漉液，濃縮后得腫節(jié)風(fēng)總提取物；或水煎煮提取取腫節(jié)風(fēng)藥材粗粉加10～15倍量水煎煮，每次1～2小時(shí)，濾過，濾液合并，濃縮后腫節(jié)風(fēng)總提取物；腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚的制備上述方法提取的腫節(jié)風(fēng)總提取物溶解于水中，用正丁醇萃取，合并萃取液，濃縮后得正丁醇萃取物，正丁醇萃取物經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析，先用水洗脫后再用40％乙醇洗脫，收集40％乙醇洗脫液，減壓濃縮后得浸膏。將浸膏溶解于少量25％乙醇中，經(jīng)反相硅膠柱層析，先用水洗脫，后用10％乙醇洗脫，再用25％乙醇洗脫，收集25％乙醇洗脫液；濃縮和干燥腫節(jié)風(fēng)總提取物和腫節(jié)風(fēng)總多酚的濃縮方法可用薄膜濃縮或減壓濃縮，干燥方法可用真空干燥或噴霧干燥或冷凍干燥，濃縮并干燥后得腫節(jié)風(fēng)總多酚；制備所述的腫節(jié)風(fēng)有效單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯包括如下步驟將腫節(jié)風(fēng)總多酚溶解于少量25％乙醇中，經(jīng)反相硅膠柱層析，先用水洗脫，后用25％乙醇洗脫，分段收集25％乙醇洗脫液，用高效液相色譜檢測(cè)每個(gè)組分，將含有單一成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的組分合并，濃縮并干燥后得單體化合物咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯；或試藥3，4-二羥基苯乙酸，咖啡酸，亞硫酰二氯，四氫鋁化鋰，二環(huán)己基碳二亞胺，無水甲醇，無水四氫呋喃，酒石酸，無水硫酸鈉；方法3，4-二羥基苯乙醇的合成將3，4-二羥基苯乙酸溶于無水甲醇中，在0℃條件下逐滴加入亞硫酰二氯并攪拌15分鐘后，于室溫下放置16小時(shí)并不停攪拌；反應(yīng)物經(jīng)減壓濃縮后，其殘留物溶于無水四氫呋喃中，分部加入四氫鋁化鋰后，于室溫下放置16小時(shí)并不停攪拌；反應(yīng)物倒入5％酒石酸溶液中，用乙酸乙酯萃取。合并后的乙酸乙酯萃取液經(jīng)無水硫酸鈉脫水后回收乙酸乙酯得到乙酸乙酯萃取物；乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱層析，用環(huán)己烷和乙酸溶解于無水四氫呋喃中，然后加入二環(huán)己基碳二亞胺；其混合物在室溫下攪拌8小時(shí)，加乙酯的混合溶液作洗脫液，分段收集洗脫液，用薄層層析(TLC)在紫外燈下檢測(cè)每一組分，將含有3，4二羥基苯乙醇的洗脫液合并后回收有機(jī)溶劑得到3，4-二羥基苯乙醇；咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的合成將咖啡酸和3，4-二羥基苯乙醇入微量蒸餾水繼續(xù)攪拌15分鐘。濾過，濾液在60℃下減壓濃縮得棕色稠狀溶液；該棕色稠狀溶液經(jīng)硅膠柱層析，用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作洗脫液，分段收集洗脫液，用TLC在紫外燈下檢測(cè)各組分，將含有咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的各組分合并后回收有機(jī)溶劑得單體化合物咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯。
制備的腫節(jié)風(fēng)總多酚純度大于50％(50％-90％)，有效單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯純度大于80％(80％-100％)，從其他植物或化學(xué)合成方法得到咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯純度大于80％(80％-100％)。
制成的制劑包括片劑口服片、含片、咀嚼片，丸劑、滴丸、膠囊、軟膠囊、顆粒、泡騰劑、針劑小針劑、大針劑、粉針劑、乳劑、混懸液，口服液、糖漿、乳劑、合劑、緩釋劑、控釋劑、靶向制劑。
含有植物腫節(jié)風(fēng)有效成分的藥物，應(yīng)用于抗腫瘤；抗腫瘤增效；降低由放射、化學(xué)治療腫瘤所引起的毒性反應(yīng)如白細(xì)胞下降及血小板減少；抗菌抗炎。
由于本發(fā)明采取了上述的技術(shù)措施，它與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明用多種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明腫節(jié)風(fēng)抗腫瘤及增效減毒作用的有效部位為多酚類化合物，并發(fā)現(xiàn)其主要的有效成分為咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯。腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚的上述作用優(yōu)于目前市售的腫節(jié)風(fēng)注射液、腫節(jié)風(fēng)片和血康口服液粗制劑。本發(fā)明用體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用實(shí)驗(yàn)證明腫節(jié)風(fēng)總多酚和其有效單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對(duì)多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，且單體成分的作用明顯優(yōu)于總多酚。本發(fā)明建立的提取分離純化方法可制備其純度大于50％(50～90％)的腫節(jié)風(fēng)總多酚和純度大于90％(90～98％)的單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯以及純度大于98％的對(duì)照品咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯。而且純度大于90％的單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯還可通過化學(xué)合成而獲得。本發(fā)明為將腫節(jié)風(fēng)開發(fā)成有效成分明確、純度更高、療效更好、毒副作用更少、質(zhì)量可控的各種制劑提供了科學(xué)依據(jù)。
圖1是腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚的高效液相色譜圖；圖2是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的H-C遠(yuǎn)程偶合關(guān)系示意圖；圖4是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的高效液相色譜圖；圖5是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的化學(xué)合成流程圖；圖6是腫節(jié)風(fēng)總多酚和咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的制備工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
一、腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚的制備及含量測(cè)定(一)腫節(jié)風(fēng)總提取物的提取1、乙醇回流提取取腫節(jié)風(fēng)藥材粗粉，用35％～70％乙醇10～15倍量作溶劑，浸漬1小時(shí)后，加熱回流提取3～4次，每次1～2小時(shí)，合并回流液，濃縮后得腫節(jié)風(fēng)總提取物。
2、乙醇滲漉提取取腫節(jié)風(fēng)藥材粗粉，用35％～70％乙醇10～15倍量作溶劑，浸漬1小時(shí)后進(jìn)行滲漉直到滲漉液無色，合并滲漉液，濃縮后得腫節(jié)風(fēng)總提取物。
3、水煎煮提取取腫節(jié)風(fēng)藥材粗粉加10～15倍量水煎煮，每次1～2小時(shí)，濾過，濾液合并，濃縮后腫節(jié)風(fēng)總提取物。
(二)腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚的制備上述三種方法提取的腫節(jié)風(fēng)總提取物溶解于水中，用正丁醇萃取，合并萃取液，濃縮后得正丁醇萃取物，正丁醇萃取物經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析，先用水洗脫后再用40％乙醇洗脫，收集40％乙醇洗脫液，減壓濃縮后得浸膏。將浸膏溶解于少量25％乙醇中，經(jīng)反相硅膠柱層析，先用水洗脫，后用10％乙醇洗脫，再用25％乙醇洗脫，收集25％乙醇洗脫液，濃縮并干燥后得腫節(jié)風(fēng)總多酚。
濃縮和干燥方法本發(fā)明腫節(jié)風(fēng)總提取物和腫節(jié)風(fēng)總多酚的濃縮和干燥方法可用薄膜濃縮，減壓濃縮和真空干燥，噴霧干燥，冷凍干燥等各種方法。選擇何種方法，可視實(shí)際條件。
(三)腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚的含量測(cè)定1、儀器高效液相色譜儀。
2、試藥咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對(duì)照品，從腫節(jié)風(fēng)中提取分離純化，純度大于98％。甲醇(色譜純)，乙酸(分析純)。
3、色譜條件色譜柱Hypersil C18高效液相色譜柱(250×4.6mm，5μm)；柱溫25C；檢測(cè)波長(zhǎng)326nm；流速1.5mL/min；流動(dòng)相見表1。
表1咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯RP-HPLC分析的梯度條件
4、對(duì)照品溶液的制備精密稱取在60℃真空干燥后的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對(duì)照品25.0mg，置25ml容量瓶中，加70％乙醇20ml，置水浴上微熱溶解，放冷，加70％乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
5、供試品溶液的制備精密稱取在60℃真空干燥后的腫節(jié)風(fēng)總多酚樣品50.0mg，置50ml容量瓶中，加70％乙醇35ml，置水浴上微熱溶解，放冷，加70％乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
6、線性關(guān)系考察取濃度為1.0mg/mL的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對(duì)照品溶液2，4，8，10，20μL依次進(jìn)樣，在前述色譜條件下測(cè)定咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，回歸得直線方程Y＝1511.380204X-444.46234，r＝0.99967。結(jié)果表明咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯進(jìn)樣量在2.5～25μg范圍內(nèi)峰面積積分值與濃度呈良好的線性關(guān)系。
7、精密度試驗(yàn)取濃度為1.0mg/mL的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，在前述色譜條件下測(cè)定咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的峰面積，其峰面積的RSD＝0.97％(n＝6)。
8、穩(wěn)定性試驗(yàn)取濃度為1.0mg/mL的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對(duì)照品溶液分別0，1，38，40，45時(shí)內(nèi)進(jìn)樣，每次10μL，在前述色譜條件下測(cè)定咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的峰面積，其峰面積的RSD＝0.64％(n＝5)。
9、樣品測(cè)定取濃度為1.0mg/mL的供試品溶液20μL進(jìn)樣，在前述色譜條件下測(cè)定各單一化合物的峰面積，各單一化合物的含量均以咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯計(jì)算。各單一化合物含量的總和即為腫節(jié)風(fēng)總多酚的含量。本發(fā)明制備的腫節(jié)風(fēng)總多酚的含量為52.6％(n＝3，SD＝0.53)。參照?qǐng)D1，腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚的高效液相色譜圖中，6號(hào)峰為咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯。
二、單體化合物咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的分離，結(jié)構(gòu)鑒定和含量測(cè)定(一)咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的分離將腫節(jié)風(fēng)總多酚溶解于少量25％乙醇中，經(jīng)反相硅膠柱層析，先用水洗脫，后用25％乙醇洗脫，分段收集25％乙醇洗脫液，用高效液相色譜檢測(cè)每個(gè)組分，將含有單一成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的組分合并，濃縮并干燥后得單體化合物咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯。
(二)單體化合物咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的結(jié)構(gòu)鑒定咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的結(jié)構(gòu)(圖2)是根據(jù)1維1H、13C譜，2維1H-1H COSY、HMQC、HMBC(圖3)的核磁共振譜和高分辨的質(zhì)譜分析并與文獻(xiàn)[Amani MD et al.Phytochemistry，2000；55927-931]的光譜數(shù)據(jù)比較而鑒定。該化合物為無定形粉末，溶于甲醇和乙醇中，在甲醇或乙醇與水的混合溶劑中溶解度更大，三氯化鐵反應(yīng)陽性；UV(MeOH)λfmax(nm)212，251(肩峰)，293，326；IR(KBr，cm-1)3429，1693，1606，1524，1448，1384，1263，1162，1116，1056；其1H和13C-NMR數(shù)據(jù)見表2。
表2、咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的氫和碳譜數(shù)據(jù)
參照?qǐng)D2，咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的結(jié)構(gòu)和圖3咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的H-C遠(yuǎn)程偶合關(guān)系。
(三)化合物咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的含量測(cè)定精密稱取在60℃真空干燥后的單體化合物咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯25.0mg，置25ml容量瓶中，加70％乙醇20ml，置水浴上微熱溶解，放冷，加70％乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。取濃度為1.0mg/mL的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯供試品溶液10μL進(jìn)樣，在前述色譜條件下測(cè)定咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的峰面積，并計(jì)算咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的含量。本發(fā)明從腫節(jié)風(fēng)中提取分離的單體化合物咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的含量為91.0％(n＝3，SD＝0.5)。參照?qǐng)D4，單體化合物咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的高效液相色譜圖。
三、咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對(duì)照品的制備及純度測(cè)定1、儀器制備型的高效液相色譜儀。
2、試藥甲醇(色譜純)。
3、色譜條件色譜柱Econosil C18高效液相色譜柱(250×20mm，5μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)326nm；流速3mL/min；流動(dòng)相甲醇/水(45∶55)。
4、方法上述分離得到的單體化合物咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯配成5mg/mL的70％甲醇溶液，用前述制備型的高效液相色譜條件進(jìn)行純化，每次進(jìn)樣500～800μL，收集其保留時(shí)間為56分鐘的組分，合并后的收集液先在60～70℃減壓條件下回收甲醇，其殘留液置冰箱冷凍后再用冷凍干燥法干燥得到對(duì)照品咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯。
5、對(duì)照品的純度測(cè)定對(duì)照品咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯配成1.0mg/mL的70％甲醇溶液，每次進(jìn)樣10μL，在前述高效液相色譜條件下由歸一化法測(cè)定其含量。并由核磁共振譜確證。本發(fā)明分離純化的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的含量大于98％，可作為定量分析的對(duì)照品。
四、咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的化學(xué)合成本發(fā)明以3，4-二羥基苯乙酸和咖啡酸兩種商品化學(xué)品為原料，經(jīng)三步化學(xué)反應(yīng)得到咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯。其方法簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)。
1、試藥3，4-二羥基苯乙酸(3，4-didroxyphenylacetic acid)，咖啡酸(caffeic acid)，亞硫酰二氯(thionyl chloride)，四氫鋁化鋰(LiAlH4)，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，無水甲醇，無水四氫呋喃(TFA)，酒石酸(tartaricaid)，無水硫酸鈉。
2、咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的化學(xué)合成流程參照?qǐng)D5，咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的化學(xué)合成流程。
3、方法(1)3，4-二羥基苯乙醇的合成將3，4-二羥基苯乙酸溶于無水甲醇中，在0℃條件下逐滴加入亞硫酰二氯并攪拌15分鐘后，于室溫下放置16小時(shí)并不停攪拌。反應(yīng)物經(jīng)減壓濃縮后，其殘留物溶于無水四氫呋喃中，分部加入四氫鋁化鋰后，于室溫下放置16小時(shí)并不停攪拌。反應(yīng)物倒入5％酒石酸溶液中，用乙酸乙酯萃取。合并后的乙酸乙酯萃取液經(jīng)無水硫酸鈉脫水后回收乙酸乙酯得到乙酸乙酯萃取物。乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱層析，用環(huán)己烷和乙酸溶解于無水四氫呋喃中，然后加入二環(huán)己基碳二亞胺。其混合物在室溫下攪拌8小時(shí)，加乙酯的混合溶液作洗脫液，分段收集洗脫液，用薄層層析(TLC)在紫外燈下檢測(cè)每一組分，將含有3，4-二羥基苯乙醇的洗脫液合并后回收有機(jī)溶劑得到3，4-二羥基苯乙醇。(2)咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的合成將咖啡酸和3，4-二羥基苯乙醇入微量蒸餾水繼續(xù)攪拌15分鐘。濾過，濾液在60℃下減壓濃縮得棕色稠狀溶液。該棕色稠狀溶液經(jīng)硅膠柱層析，用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作洗脫液，分段收集洗脫液，用TLC在紫外燈下檢測(cè)各組分，將含有咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的各組分合并后回收有機(jī)溶劑得單體化合物咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯。
4、合成品咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的含量測(cè)定將上述合成的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯照前述方法配成1.0mg/mL的供試品溶液，以10μL進(jìn)樣，在前述色譜條件下測(cè)定咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的峰面積，并計(jì)算咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的含量。本發(fā)明用化學(xué)方法合成的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的含量為93.2％(n＝3，SD＝0.22)。
五、腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚和咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的制備工藝參照?qǐng)D6，腫節(jié)風(fēng)總多酚和咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的制備工藝流程。
六、腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚和其有效單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的抗腫瘤、抗腫瘤的增效減毒及抗血小板減少紫癜等應(yīng)用(一)整體實(shí)驗(yàn)通過對(duì)多種腫瘤試驗(yàn)證明，腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚、有效單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯及其配制成的制劑有明顯的直接抗腫瘤的作用。且優(yōu)于目前市售的粗提物制劑腫節(jié)風(fēng)注射液、腫節(jié)風(fēng)片。
1、直接抗腫瘤實(shí)驗(yàn)在直接抗小鼠S180試驗(yàn)中，通過口服、腹腔注射、肌肉注射、尾靜脈注射這四種方式給藥，腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚、有效單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯均有明顯的抗腫瘤作用，抑瘤率在30％和85％之間。S180腹水型腫瘤小鼠的生命延長(zhǎng)率100～200％。
2、增效實(shí)驗(yàn)在環(huán)磷酰胺治療小鼠S180實(shí)體瘤增效試驗(yàn)中，通過口服、腹腔注射、肌肉注射、尾靜脈注射這四種方式分別給以環(huán)磷酰胺及環(huán)磷酰胺加腫節(jié)風(fēng)總多酚或單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯及其由兩者配制成的制劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單用環(huán)磷酰胺小劑量的抑瘤率在5％和20％之間，而與腫節(jié)風(fēng)總多酚和單體成分合用后其抑瘤率在35％和80％以上，說明腫節(jié)風(fēng)總多酚、單體成分與環(huán)磷酰胺合用時(shí)可明顯增強(qiáng)化療藥環(huán)磷酰胺的抗腫瘤作用。在氟尿嘧啶治療小鼠S180腹水型腫瘤增效試驗(yàn)中，通過口服、肌肉注射、尾靜脈注射這三種方式分別給以氟尿嘧啶小劑量、氟尿嘧啶小劑量分別加腫節(jié)風(fēng)總多酚或加單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯及其由兩者配制成的制劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單用小劑量氟尿嘧啶S180腹水型腫瘤小鼠的生命延長(zhǎng)率在5％和15％之間，小劑量氟尿嘧啶加腫節(jié)風(fēng)總多酚或加單體成分合用后其S180腹水型腫瘤小鼠的生命延長(zhǎng)率在20％和80％之間。說明氟尿嘧啶分別與腫節(jié)風(fēng)總多酚和單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯合用時(shí)可明顯增強(qiáng)其抗腫瘤作用。
3、減毒實(shí)驗(yàn)在對(duì)環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷治療小鼠S180實(shí)體瘤減毒試驗(yàn)中，通過口服、腹腔注射、肌肉注射、尾靜脈注射這四種方式分別給以環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷和兩者加腫節(jié)風(fēng)總多酚或單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯及其由兩者配制成的制劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小鼠在給藥環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷后都出現(xiàn)血小板和白細(xì)胞顯著下降，分別加腫節(jié)風(fēng)總多酚及其單體化合物咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯及其由兩者配制成的制劑后，白細(xì)胞和血小板明顯的上升，說明腫節(jié)風(fēng)總多酚和單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯和化療藥合用時(shí)有明顯的減毒作用。
(二)體外實(shí)驗(yàn)1、對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用實(shí)驗(yàn)在對(duì)MTT法體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-8)、人胃癌細(xì)胞(BGC-823)、人卵巢癌細(xì)胞(A-2780)的生長(zhǎng)抑制作用的實(shí)驗(yàn)，腫節(jié)風(fēng)總多酚、單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對(duì)上述三種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制濃度分別為0.5μg/ml，5.0μg/ml，50.0μg/ml，IC50在50μg/ml以下，說明腫節(jié)風(fēng)總多酚、單體成分具有明顯抗腫瘤作用，而且單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的作用明顯優(yōu)于總多酚。
腫節(jié)風(fēng)總多酚及腫節(jié)風(fēng)總提取物注射液(表3)。
表3腫節(jié)風(fēng)總多酚及咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的直接抗腫瘤的作用(MTT法)
2、體外抑菌實(shí)驗(yàn)在體外抑菌試驗(yàn)中，采用綠膿桿菌、肺炎桿菌、變形桿菌、大腸桿菌、白色念球菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌、甲鏈球菌、卡他球菌、流感桿菌、肺炎雙球菌、鏈球菌及脆弱類桿菌等15種117株菌，經(jīng)MIC和MSC試驗(yàn)表明腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚、單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯均有不同程度的抗菌作用。
權(quán)利要求
1.一種含有植物腫節(jié)風(fēng)有效成分的藥物，其特征在于所述的有效成分是腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有植物腫節(jié)風(fēng)有效成分的藥物，其特征在于所述的有效成分是腫節(jié)風(fēng)有效單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有植物腫節(jié)風(fēng)有效成分的藥物的制備方法，其特征在于制備所述的腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚包括如下步驟腫節(jié)風(fēng)總提取物的提取乙醇回流提取取腫節(jié)風(fēng)藥材粗粉，用35％～70％乙醇10～15倍量作溶劑，浸漬1小時(shí)后，加熱回流提取3～4次，每次1～2小時(shí)，合并回流液，濃縮后得腫節(jié)風(fēng)總提取物；或乙醇滲漉提取取腫節(jié)風(fēng)藥材粗粉，用35％～70％乙醇10～15倍量作溶劑，浸漬1小時(shí)后進(jìn)行滲漉直到滲漉液無色，合并滲漉液，濃縮后得腫節(jié)風(fēng)總提取物；或水煎煮提取取腫節(jié)風(fēng)藥材粗粉加10～15倍量水煎煮，每次1～2小時(shí)，濾過，濾液合并，濃縮后腫節(jié)風(fēng)總提取物；腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚的制備上述方法提取的腫節(jié)風(fēng)總提取物溶解于水中，用正丁醇萃取，合并萃取液，濃縮后得正丁醇萃取物，正丁醇萃取物經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析，先用水洗脫后再用40％乙醇洗脫，收集40％乙醇洗脫液，減壓濃縮后得浸膏。將浸膏溶解于少量25％乙醇中，經(jīng)反相硅膠柱層析，先用水洗脫，后用10％乙醇洗脫，再用25％乙醇洗脫，收集25％乙醇洗脫液；濃縮和干燥腫節(jié)風(fēng)總提取物和腫節(jié)風(fēng)總多酚的濃縮方法可用薄膜濃縮或減壓濃縮，干燥方法可用真空干燥或噴霧干燥或冷凍干燥，濃縮并干燥后得腫節(jié)風(fēng)總多酚；制備所述的腫節(jié)風(fēng)有效單體成分咖啡酸3，4～二羥基苯乙酯包括如下步驟將腫節(jié)風(fēng)總多酚溶解于少量25％乙醇中，經(jīng)反相硅膠柱層析，先用水洗脫，后用25％乙醇洗脫，分段收集25％乙醇洗脫液，用高效液相色譜檢測(cè)每個(gè)組分，將含有單一成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的組分合并，濃縮并干燥后得單體化合物咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯；或試藥3，4-二羥基苯乙酸，咖啡酸，亞硫酰二氯，四氫鋁化鋰，二環(huán)己基碳二亞胺，無水甲醇，無水四氫呋喃，酒石酸，無水硫酸鈉；方法3，4-二羥基苯乙醇的合成將3，4-二羥基苯乙酸溶于無水甲醇中，在0℃條件下逐滴加入亞硫酰二氯并攪拌15分鐘后，于室溫下放置16小時(shí)并不停攪拌；反應(yīng)物經(jīng)減壓濃縮后，其殘留物溶于無水四氫呋喃中，分部加入四氫鋁化鋰后，于室溫下放置16小時(shí)并不停攪拌；反應(yīng)物倒入5％酒石酸溶液中，用乙酸乙酯萃取。合并后的乙酸乙酯萃取液經(jīng)無水硫酸鈉脫水后回收乙酸乙酯得到乙酸乙酯萃取物；乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱層析，用環(huán)己烷和乙酸溶解于無水四氫呋喃中，然后加入二環(huán)己基碳二亞胺；其混合物在室溫下攪拌8小時(shí)，加乙酯的混合溶液作洗脫液，分段收集洗脫液，用薄層層析(TLC)在紫外燈下檢測(cè)每一組分，將含有3，4-二羥基苯乙醇的洗脫液合并后回收有機(jī)溶劑得到3，4-二羥基苯乙醇；咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的合成將咖啡酸和3，4-二羥基苯乙醇入微量蒸餾水繼續(xù)攪拌15分鐘，濾過，濾液在60℃下減壓濃縮得棕色稠狀溶液；該棕色稠狀溶液經(jīng)硅膠柱層析，用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作洗脫液，分段收集洗脫液，用TLC在紫外燈下檢測(cè)各組分，將含有咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的各組分合并后回收有機(jī)溶劑得單體化合物咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含有植物腫節(jié)風(fēng)有效成分的藥物的制備方法，其特征在于制備的腫節(jié)風(fēng)總多酚純度大于50％，有效單體成分咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯純度大于80％，從其他植物或化學(xué)合成方法得到咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯純度大于80％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的含有植物腫節(jié)風(fēng)有效成分的藥物，其特征在于制成的制劑包括片劑口服片、含片、咀嚼片，丸劑、滴丸、膠囊、軟膠囊、顆粒、泡騰劑、針劑小針劑、大針劑、粉針劑、乳劑、混懸液，口服液、糖漿、乳劑、合劑、緩釋劑、控釋劑、靶向制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的含有植物腫節(jié)風(fēng)有效成分的藥物，其特征在于應(yīng)用于抗腫瘤；抗腫瘤增效；降低由放射、化學(xué)治療腫瘤所引起的毒性反應(yīng)如白細(xì)胞下降及血小板減少；抗菌抗炎。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的含有植物腫節(jié)風(fēng)有效成分的藥物，其特征在于應(yīng)用于抗腫瘤；抗腫瘤增效；降低由放射、化學(xué)治療腫瘤所引起的毒性反應(yīng)如白細(xì)胞下降及血小板減少；抗菌抗炎。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有植物腫節(jié)風(fēng)有效成分的藥物，其特征在于所述的有效成分是腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚以及有效單體成分咖啡酸3，4－二羥基苯乙酯。有效單體成分咖啡酸3，4－二羥基苯乙酯包括從腫節(jié)風(fēng)和其它植物中提取分離純化和通過化學(xué)合成而得。腫節(jié)風(fēng)有效部位總多酚的制備和其有效單體成分咖啡酸3，4－二羥基苯乙酯的提取分離純化方法包括不同濃度乙醇回流提取、不同濃度乙醇滲漉提取、水煎煮提取、正丁醇萃取、大孔吸附樹脂柱層析、正相和反相硅膠柱層析。本發(fā)明可用于抗腫瘤、增效減毒、抗腫瘤放化療的毒性反應(yīng)及腫瘤輔助治療，亦用于原發(fā)性血小板減少性紫癜及繼發(fā)性血小板減少性紫癜，并可用于治療常見細(xì)菌性感染。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1879672SQ20061005082
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2006年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月17日
發(fā)明者連曉媛 申請(qǐng)人:連曉媛