專利名稱：：地錢提取物的制備工藝及其在制備治療肝癌和乙型肝炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物提取物及其醫(yī)療用途，尤其是地錢提取物的制備工藝及其在制備治療肝癌和乙型肝炎藥物中的應(yīng)用，屬于中藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：地錢屬植物(Marchantineae)屬于苔蘚植物門(Bryophyta)苔綱(Hepaticae)地錢目(Marchantiales)。又名膿痂草(陜西)，地浮萍、一團(tuán)云、地梭欏(貴州)，地龍皮(西藏)，龍眼草(秦嶺巴山)，巴骨龍、米海苔(陜西)(參見高謙等.東北苔類植物志.北京:科學(xué)出版社，1981;192)。我國地錢屬植物除有地錢(MarcA。"ria/o/拜o—aL.)分布夕卜，還有拳巻地錢(A/a/r/w油'aconvo/她GaoetChang)、粗裂地錢(Aforc/i。"tofpa/eaceaBert.)和風(fēng)兜地錢(MGw/w"f/"c^&raMont,)等3種，它們混生在一起，難以區(qū)別(參見中國科學(xué)院植物研究所編.中國高等植物圖鑒(第一冊(cè)).北京:科學(xué)技術(shù)出版社,1972;27)。地錢是地錢目的代表植物，是具有葉狀體的苔類植物中形態(tài)構(gòu)造最復(fù)雜,進(jìn)化比較高等的種類;是苔蘚植物中最常見的草藥之一。地錢屬植物的藥用始載于《名醫(yī)別錄》，明代李時(shí)珍《本草綱目》中謂之"石衣"，味淡，性涼，歸肝經(jīng)，有清熱利濕，解毒斂瘡，清心明目之功效(參見胡人亮，苔蘚植物學(xué).高等教育出版社，1987;2)。拳巻地錢(Mm/wnftV3co"vo/wtoGaoChang)為苔蘚植物門苔綱地錢屬植物，為中國特有植物(參見朱華等，商品藥材地錢原植物葉狀體顯微構(gòu)造特征及檢索，世界衛(wèi)生雜志，2003;3:110，)。國外對(duì)地錢屬植物的化學(xué)成分研究取得了不少進(jìn)展,但對(duì)我國的傳統(tǒng)草藥地錢有效成分的提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定研究卻是一個(gè)空白。相關(guān)文獻(xiàn)及査新報(bào)告表明，國外學(xué)者對(duì)日本、德國、南非和印度的地錢科植物進(jìn)行了廣泛的研究，而很少涉及到中國出產(chǎn)的地錢。植化研究表明，地錢主要含有相關(guān)文獻(xiàn)及查新報(bào)告表明，國外學(xué)者對(duì)日本、德國、南非和印度的地錢科植物進(jìn)行了廣泛的研究,而很少涉及到中國出產(chǎn)的地錢。植化研究表明，地錢主要含有黃酮類化合物和揮發(fā)油類化合物(參見[l]肖建波，等，反相高效液相色譜法用于地錢中黃酮類化合物的分離和測(cè)定,分析試驗(yàn)室,2005;4:17;[2]肖建波，等，拳巻地錢中揮發(fā)油的C02超臨界流體萃取及其GC-MS分析，中藥新藥與臨床藥理，2005;3:33;[3曹慧,等,拳巻地錢不同提取部位的GC-MS分析比較和部分生物活性研究.質(zhì)譜學(xué)報(bào),2005,1:1;[4]朱華,等,硅膠柱色譜/RP-HPLC/LC-ESI-MS分離純化鑒定拳巻地錢中斧菜素-7-0-P-D-葡萄糖醛酸甙,天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2005,1:38;[5]鄒登峰,等,地錢、拳巻地錢和粗裂地錢的紫外譜線組法鑒別,天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2005,4:463和[6]肖建波，等，拳巻地錢中黃酮類化合物的含量測(cè)定,天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2005,2:186)。關(guān)于地錢的治療作用未見相關(guān)報(bào)道。應(yīng)用方面，未見地錢及其它地錢屬植物作為藥物的專利和文獻(xiàn)。肝癌是全球高發(fā)惡性腫瘤之一，在我國肝癌的死亡率居各種惡性腫瘤第二位。目前肝癌有有效的根治措施是早期肝癌的肝葉切除術(shù)或肝移植術(shù)，但肝癌起病隱匿，早期確診機(jī)會(huì)并不多，而肝移植術(shù)供體肝有限，費(fèi)用高昂，難以普及。其他治療比如肝動(dòng)脈栓塞化療、經(jīng)皮肝穿瘤內(nèi)無水乙醇或乙酸注射、射頻或冷凍治療、超聲波治療等，均可在一定程度上抑制腫瘤的生長(zhǎng)，但均屬姑息性治療。因此，很多肝癌患者自確診后其平均生存期不到一年，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、化療藥物的毒副作用、肝功能衰竭等是影響患者預(yù)后及生存期的主要因素?，F(xiàn)己公認(rèn)，治愈肝癌最有希望的手段是包括手術(shù)、栓塞化療、免疫及生物治療等在內(nèi)的綜合治療，其中生物治療近年來發(fā)展尤有前景。乙型肝炎(HepatitisB)是由乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)引起的一種嚴(yán)重的世界范圍內(nèi)危害人類健康的疾病，其傳染性強(qiáng)、發(fā)病率高。根據(jù)WHO的統(tǒng)計(jì)，目前，全世界約有3.5億的慢性乙肝病毒攜帶者，其中我國人群中HBV的感染率高居不下。我國的慢性無癥狀HBV攜帶者(ASC)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過1.2億人。現(xiàn)患乙型肝炎病人為2800萬人，現(xiàn)患病率約為2770/10萬，年發(fā)病率約230/10萬。慢性乙型肝炎(CHB)的流行率為0.1%1.0%。15%25%的慢性乙型肝炎患者將過早地死于肝硬化和肝細(xì)胞癌。HBV感染已經(jīng)成為我國乃至全世界最主要的傳染病之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供二種兩種地錢提取物及總黃酮提取物和萜烯提取物。本發(fā)明的目的還在于證實(shí)地錢提取物具有抗肝癌和抗乙型肝炎病毒的作用。本發(fā)明所說的地錢總黃酮提取物是通過下述方法獲得的將地錢原料粉碎，加溶媒10-20倍量，于50-10(TC條件下，提取2-3次，每次0.5-1.5小時(shí)，提取液過濾，濃縮至干,得地錢粗提物。粗提物依次分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，正丁醇萃取液減壓蒸餾,回收溶劑,濃縮至干,甲醇溶解后，通過層析柱(以硅膠或硅藻土等為填料)，先用氯仿洗柱，再經(jīng)甲醇洗柱，或通過大孔吸附樹脂柱，先用水洗，再用乙醇洗脫，甲醇或乙醇液于40-5(TC減壓濃縮，濃縮液經(jīng)真空干燥或噴霧干燥或冷凍干燥得到總黃酮含量為70-90%的提取物。本發(fā)明所說的地錢萜烯提取物是通過下述方法獲得的將地錢原料粉碎，加溶媒10-20倍量，于50-10(TC條件下，提取2-3次，每次0.5-1.5小時(shí)，提取液過濾，濃縮至干,得地錢粗提物。粗提物依次分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至干,甲醇溶解后，通過硅膠層析柱，用二氯甲烷洗脫，二氯甲烷洗脫液于30-40°C減壓濃縮，濃縮液經(jīng)真空干燥或噴霧干燥或冷凍干燥得到萜烯含量為70-90%的提取物。本發(fā)明所說的地錢原料是指地錢屬植物中的任何一種，包括地錢(MaArZ/a""a/o/>wo—o)、拳巻地錢(Ma/r/za"f/aco"vo/wto)、粗裂地錢(Man:/7a油.a戸/eacea)禾口風(fēng)兜地錢(Mw:/2a"to卻&ra)等。將地錢總黃酮或萜烯提取物，或含有地錢總黃酮或萜烯提取物的組合物，與制藥中可以被接受的輔助添加成分混合，按常規(guī)的制劑工藝，即可制成口服型藥物制劑或注射型藥物制劑。如與口服制劑中可以被接受的崩解劑、賦型劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、填充劑等常用的輔助添加成分混合后，按常規(guī)方法即可制成為片劑、膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑和丸劑等口服固體藥物制劑；與常用的增溶劑、乳化劑、潤(rùn)濕劑、起泡或消泡劑等表面活性劑、稀釋劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、增稠劑等混合，按相應(yīng)的常規(guī)方法，即可制成為水劑、糖漿劑等口服液體藥物制劑；與注射劑中常用的適當(dāng)溶劑和附加劑配合和操作，還可以制備成相應(yīng)的凍干粉針、水針等肌肉注射藥物制劑。以下細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)地錢提取物及總黃酮提取物和萜烯提取物分別具有抗乙型肝炎病毒和抑制肝癌細(xì)胞的作用實(shí)驗(yàn)例1(1)地錢總黃酮提取物在乙肝病毒2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞毒性<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注1)用藥組與細(xì)胞對(duì)照組間比較tp〈0.01;用藥組間比較0.01<、<0.052)上表系兩次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果(2)地錢總黃酮提取物在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)3d后對(duì)HBeAg的抑制作用地錢總黃酮提取物的最大無毒濃度為40pg/mL，4個(gè)稀釋濃度40^ig/mL、20pg/mL、10pg/mL和5pg/mL的3批試驗(yàn)結(jié)果顯示:各濃度地錢總黃酮提取物對(duì)2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)第3d后上清液中HBeAg均有抑制作用，其平均抑制率分別為28.68%、27.92%、15.30%、13.38%，而陽性藥物對(duì)照為23.52%，抑制抗原半數(shù)有效濃度ICso為35.48jig/mL。(3)地錢總黃酮提取物在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)3d后對(duì)朋sAg的作用40pg/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL4個(gè)劑量組的地錢總黃酮提取物對(duì)2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)第3d上清液對(duì)HBsAg的平均抑制率分別為28.53%、26.94%、26.31%和18.86%。而陽性藥物對(duì)照為14.58%，抑制抗原半數(shù)有效濃度IC50為24.45pg/mLo(4)地錢總黃酮提取物對(duì)2.2.15細(xì)胞形態(tài)的改變當(dāng)2.2.15細(xì)胞用40ng/mL、20pg/mL、10ng/mL、5pg/mL地錢總黃酮提取物處理3天后，在細(xì)胞形態(tài)上發(fā)生明顯改變，細(xì)胞發(fā)生收縮。(附圖l)(5)地錢總黃酮提取物在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA的抑制作用地錢總黃酮提取物的4個(gè)稀釋濃度4(^g/mL、20Pg/mL、10Pg/mL和5Pg/mL處理2.2.15細(xì)胞，第4d分別提取DNA，分別點(diǎn)于硝酸纖維素膜上，用冊(cè)V—DNA探針作斑點(diǎn)雜交，放射自顯影洗片(用酶標(biāo)儀測(cè)定各點(diǎn)0Ds7。值可見，地錢總黃酮提取物40Pg/mL組的HBV—DNA與細(xì)胞對(duì)照HBV—DNA比較，平均抑制率達(dá)31.52%;20Pg/niL組抑制率達(dá)27.60%;L(mg/mL組抑制率為19.36%;5Pg/mL組抑制率為11.60%。(附圖2)實(shí)驗(yàn)例2地錢萜烯提取物在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制癌癥細(xì)胞活性(1)地錢萜烯提取物對(duì)人H印G2肝癌細(xì)胞的抑制B濃度(pg/mL)MTT吸光度值(570細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率01.608土6.93X1(T2—150.918±0.2742.88300.714土6.85X1(T253.66_^_0.686土5.60X10—2_57.31_(2)同時(shí)考察地錢萜烯提取物對(duì)H1299小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)地錢萜烯提取物對(duì)人H1299小細(xì)胞肺癌細(xì)胞毒性的抑制不明顯，可以佐證地錢路烯提取物對(duì)人H印G2肝癌細(xì)胞的特異性作用.B濃度(pg/mL)MTT吸光度值(570nm)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制01駕±0.13—151.856土7.25X10-26.31301.631土5.78X1(T217.65401.605±1.37X10-218.9附圖1:4(Hig/mL、20^ig/mL、l(Hig/mL、5^ig/mL地錢總黃酮提取物處理2.2.15細(xì)胞3天后，對(duì)HBsAg、HBeAg有顯著影響，細(xì)胞發(fā)生收縮。附圖2:不同濃度的地錢總黃酮提取物對(duì)HBV—DNA的抑制作用。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。實(shí)施例1將地錢(Mwc/w""fl/7o(ywor/7/w)原料300g,適當(dāng)粉碎，加乙醇(即溶媒)20倍量，于100°C條件下，提取3次，每次0.5小時(shí)，提取液過濾，濾液合并后，濃縮至干，得粗提物。粗提物依次分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，正丁醇萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至干，甲醇溶解后，通過硅膠(青島海洋化工廠)層析柱，先用氯仿400ml洗脫，再用500ml甲醇洗脫，甲醇洗脫液于48°C減壓濃縮，濃縮液經(jīng)真空干燥得到總黃酮含量為86%的提取物。乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至干，甲醇溶解后，通過硅膠層析柱，依次用3000ml二氯甲烷洗脫，二氯甲烷洗脫液于38。C減壓濃縮，濃縮液經(jīng)真空干燥得到萜烯含量為78%的提取物。實(shí)施例2將拳巻地錢(A/wc/2""f/aco"vo/wto)原料300g，適當(dāng)粉碎，加乙醇(即溶媒)13倍量，于70°C條件下，提取3次，每次1.5小時(shí)，提取液過濾，濾液合并后，濃縮至干，得粗提物。粗提物依次分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，正丁醇萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至干，甲醇溶解后，通過AB-8大孔吸附樹脂柱(南開大學(xué)化工廠)層析柱，先用水洗柱，再用1000ml乙醇洗柱，乙醇洗脫液于46"C減壓濃縮，濃縮液經(jīng)噴霧干燥得到總黃酮含量為90%的提取物。乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至干，甲醇溶解后，通過硅膠層析柱，依次用3000ml二氯甲垸洗脫，二氯甲垸洗脫液于30-40°C減壓濃縮，濃縮液經(jīng)真空干燥得到萜烯含量為84%的提取物。實(shí)施例3將粗裂地錢(Marc/w""a/7fl/e"cea)原料300g，適當(dāng)粉碎，力卩80%乙醇水溶液(即溶媒)16倍量，于80°C條件下，提取3次，每次1.0小時(shí)，提取液過濾，濾液合并后，濃縮至干，得粗提物。粗提物依次分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，正丁醇萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至干，甲醇溶解后，通過S-8大孔吸附樹脂柱(南開大學(xué)化工廠)層析柱，先用水洗柱，再用1000ml乙醇洗柱，乙醇洗脫液于49°C減壓濃縮，濃縮液經(jīng)噴霧干燥得到總黃酮含量為71%的提取物。乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至干，甲醇溶解后，通過硅膠層析柱，依次用3000ml二氯甲垸洗脫，二氯甲烷洗脫液于35°C減壓濃縮，濃縮液經(jīng)真空干燥得到萜烯含量為75%的提取物。實(shí)施例4將風(fēng)兜地錢(A/^r/z"""a^p&ra)原料300g，適當(dāng)粉碎，力卩70%乙醇水溶液(即溶媒)10倍量，于70°C條件下，提取3次，每次1.5小時(shí)，提取液過濾，濾液合并后，濃縮至干，得粗提物。粗提物依次分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，正丁醇萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至干，甲醇溶解后，通過Aft大孔吸附樹脂柱(南開大學(xué)化工廠)層析柱，先用水洗柱，再用lOOOnil乙醇洗柱，乙醇洗脫液于5(TC減壓濃縮，濃縮液經(jīng)冷凍干燥得到總黃酮含量為82%的提取物。乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至干，甲醇溶解后，通過硅膠層析柱，依次用3000ml二氯甲烷洗脫，二氯甲垸洗脫液于37。C減壓濃縮，濃縮液經(jīng)真空干燥得到萜烯含量為86%的提取物。權(quán)利要求1、一種地錢總黃酮提取物，它通過下述方法獲得將地錢原料粉碎，加溶媒10-20倍量，于50-100℃條件下，提取2-3次，每次0.5-1.5小時(shí)，提取液過濾，濃縮至干，得地錢粗提物。粗提物依次分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，正丁醇萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至干，甲醇溶解后，通過層析柱(以硅膠或硅藻土等為填料)，用氯仿洗柱，再經(jīng)甲醇洗柱，或通過大孔吸附樹脂柱，先用水洗，再用乙醇洗脫，甲醇或乙醇洗脫液于40-50℃減壓濃縮，經(jīng)真空干燥或冷凍干燥或噴霧干燥得到總黃酮含量為70-90％的提取物。2、一種地錢萜烯提取物，它通過下述方法獲得將地錢原料粉碎，加溶媒10-20倍量，于50-100。C條件下，提取2-3次，每次0.5-1.5小時(shí)，提取液過濾，濃縮至干，得地錢粗提物。粗提物依次分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至干，甲醇溶解后，通過硅膠層析柱，用二氯甲烷洗脫，二氯甲烷洗脫液于30-40°C減壓濃縮，濃縮液經(jīng)真空干燥得到萜烯含量為70-90%的提取物。3、根據(jù)權(quán)利要求l和2所述的地錢提取物，其特征在于所述地錢原料是指地錢屬(Marchantineae)植物中的任何一種，包括地錢(A/crrc/2aw"crpo(ywo777/wf)、拳巻地錢(A/a/r/flW/aco"vo/wto)、粗裂地錢(A^w:/za""a/w/efircea)和風(fēng)兜地錢4、權(quán)利要求1所述地錢總黃酮提取物在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。5、權(quán)利要求2所述地錢萜烯提取物在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。6、根據(jù)權(quán)利要求4和5所述的地錢總黃酮和萜烯提取物在制備治療乙型肝炎和肝癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述藥物劑型是片劑、膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑、丸劑、水劑、糖漿劑等口服劑型或凍干粉針、水針等注射劑型。全文摘要本發(fā)明公開了兩種地錢提取物，地錢總黃酮提取物和地錢萜烯提取物，證實(shí)地錢兩個(gè)提取部位的具有抗肝癌和抗乙型肝炎病毒的作用，并公開其在制備治療乙型肝炎和肝癌藥物中的應(yīng)用。其提取方法是將地錢原料粉碎，加溶媒10-20倍量，于50-100℃條件下，提取2-3次，每次0.5-1.5小時(shí)，提取液過濾，濃縮至干，得地錢粗提物。粗提物依次分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，正丁醇萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至干，甲醇溶解后，通過層析柱(以硅膠或硅藻土等為填料)，先用氯仿洗柱，再經(jīng)甲醇洗柱，或通過大孔吸附樹脂柱，先用水洗，再用乙醇洗脫，甲醇或乙醇液于40-50℃減壓濃縮，濃縮液經(jīng)真空干燥或噴霧干燥或冷凍干燥得到總黃酮含量為70-90％的提取物。乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至干，甲醇溶解后，通過硅膠層析柱，用二氯甲烷洗脫，二氯甲烷洗脫液于30-40℃減壓濃縮，濃縮液經(jīng)真空干燥或噴霧干燥或冷凍干燥得到萜烯含量為70-90％的提取物。文檔編號(hào)A61K36/10GK101185661SQ20061003132公開日2008年5月28日申請(qǐng)日期2006年3月10日優(yōu)先權(quán)日2006年3月10日發(fā)明者明徐,徐曉萌,肖建波申請(qǐng)人:徐明;肖建波;徐曉萌