專利名稱：具內(nèi)皮素拮抗作用的天然蛋白的酶介混合肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶介混合肽，為具有內(nèi)皮素拮抗作用的天然蛋白的酶介混合肽。
背景技術(shù)：
上世紀(jì)80年代人們就發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素(Endothelin)為一類具有吸縮血管活性的肽類物質(zhì)[Yanagisawa M，Kurihara H，Kimura S et al.Anovel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelialcells[J].Nature，1988，322411-415]，并參與多種心血管疾病的病理生理過程。上世紀(jì)90年代初日本的Imokawa等又發(fā)現(xiàn)[Imokawa G，YadaY，Miyagishi MEndothelins secreted from human keratinocytes areintrinsic mitogens for human melanocytes.J Biol Chem 26724675-24680，1992；Yada Y.Higuchi K，Imokawa GEffects of endothelins on signaltransduction and proliferacion in human melanocytes.J Biol Chem26618352-18357，1991]，在UV照射下，角質(zhì)細(xì)胞也釋放內(nèi)皮素，當(dāng)它被黑色素細(xì)胞的受體接受后，會(huì)刺激黑色素細(xì)胞的增殖分化，激活酪氨酸酶的活性，提高黑色素的合成量。同時(shí)他們又證實(shí)了如將內(nèi)皮素抗體(antibody)加入到含內(nèi)皮素、角質(zhì)細(xì)胞、黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)液中，能大大抑制內(nèi)皮素刺激黑色素細(xì)胞合成黑色素的作用。人工合成的肽類內(nèi)皮素拮抗劑應(yīng)用于心血管疾病的預(yù)防和治療之前已見諸報(bào)道[CN1202890A氨基酸衍生物，它們的制備和其作為內(nèi)皮素拮抗劑的應(yīng)用；CN133076A 內(nèi)皮素拮抗劑]。
人們希望能找尋到一種既安全、又易得的類內(nèi)皮素抗體的內(nèi)皮素拮抗劑來抑制內(nèi)皮素刺激黑色素的合成，即與內(nèi)皮素抗體同樣具有和內(nèi)皮素作用位點(diǎn)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)鍵肽段，然而，分子量卻比內(nèi)皮素抗體小得多，且簡(jiǎn)單易得，成本也下降，從而能將內(nèi)皮素拮抗劑進(jìn)入美白的實(shí)用化。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有內(nèi)皮素拮抗作用的天然蛋白的酶介混合肽。
本發(fā)明的目的還提供一種具有內(nèi)皮素拮抗作用的天然蛋白的酶介混合肽的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種具有內(nèi)皮素拮抗作用的天然蛋白的酶介混合肽的應(yīng)用。
本發(fā)明的一種具內(nèi)皮素拮抗作用的酶介混合肽，是一種將單一或混合的動(dòng)植物蛋白用酶進(jìn)行酶介，獲得的具內(nèi)皮素拮抗作用的酶介混合肽；所述的動(dòng)物蛋白為烏骨雞蛋白、牡蠣蛋白、蠶蛹蛋白、蠶絲蛋白、白僵蠶蛋白、豬胰蛋白、珍珠蛋白或卵白蛋白；所述的植物蛋白為木瓜蛋白、菠蘿蛋白、桃仁蛋白或杏仁蛋白等蛋白。
本發(fā)明的酶介混合肽為含固量0.1～2％的水溶液；或干燥成含氮量為8～15％其分子量≤2000的干粉。
所述的酶是肌蛋白酶(actinasl)、胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(frypsin)、木瓜酶(papain)、肽酶(peptiolasl)或菠蘿蛋白酶(bromelin)。
本發(fā)明的一種具有內(nèi)皮素拮抗作用的天然蛋白的酶介混合肽的制備方法是在10～80℃和pH值為2～10時(shí)，將單一或混合的動(dòng)植物蛋白用酶進(jìn)行酶介10分鐘～12小時(shí)，超濾膜超濾或者再經(jīng)干燥成粉，酶解時(shí)蛋白和水之比為1∶5～1∶120，所述的酶和蛋白的比例為1∶10至1∶1000；推薦酶和蛋白的比例為1∶50至1∶100；所述的超濾膜超濾的孔徑為2000分子量。
采用本發(fā)明的方法的酶介混合肽的制備方法，最好酶解溫度為30～50℃；酶解的時(shí)間為1～6小時(shí)；酶解時(shí)蛋白和水之比為1∶10～1∶30。PH則視不同的酶而定。
本發(fā)明方法中所述的動(dòng)植物蛋白和酶如前所述。
所述的干燥是冷凍干燥、真空低溫干燥(室溫～≤60℃)，或二者結(jié)合。
本發(fā)明的方法不僅原料易得、方法簡(jiǎn)便，而且①本發(fā)明所獲得的內(nèi)皮素拮抗劑完全是由天然動(dòng)植物蛋白酶解而得；②本發(fā)明的內(nèi)皮素拮抗劑經(jīng)B16黑色素瘤細(xì)胞模型篩選，具有對(duì)內(nèi)皮素引起的色素形成有明顯的抑制作用，既能作為天然美白劑應(yīng)用于化妝品，又能作為心血管疾病的天然保健品；③本發(fā)明所用的動(dòng)植物蛋白都是從古代方劑中所得，皆為人們長(zhǎng)期使用、服用的天然動(dòng)植物蛋白，已證實(shí)無副作用，所用的酶也為人們熟知常用的酶，對(duì)人體十分安全。
具體實(shí)施例方式
通過下述實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但並不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)施例1經(jīng)去脂肪及打碎的100克烏骨雞蛋白、1克木瓜酶、1.5克肽酶、水500克和0.2克EDTA，調(diào)至pH為7～8，在間歇攪拌下，45～8℃酶解6小時(shí)，加熱至沸，冷卻，用上海樹脂廠732陽離子樹脂，調(diào)PH至7，離心，上清液經(jīng)2000分子量超濾膜超濾后即得無菌酶解液。經(jīng)冷凍干燥得粉狀物32克，含氮量12.3％。
實(shí)施例2蠶絲先經(jīng)0.5％Na2CO3煮沸脫膠，水洗，脫水，干燥后稱100克上述干燥后蠶絲加入45％CaCl2溶液1000克加熱至沸，冷卻，透析脫鹽，清液加入3克菠蘿蛋白酶，調(diào)pH值為5，溫度維持在48℃，保溫，不時(shí)攪拌，至5小時(shí)酶解中止，加熱至90℃，維持5分鐘，冷卻離心，上清液用上海樹脂廠717陰離子樹脂中和的中和液經(jīng)2000分子量超濾膜超濾后，減壓濃縮至100ml，經(jīng)冷凍干燥成粉得43克，含氮量11.8％。
實(shí)施例3白僵蠶粉碎，用有機(jī)混合溶劑(醋酸乙酯∶溶劑油＝3∶7)，攪拌浸泡4小時(shí)，過濾，將100克濾渣懸浮于1kg水中，加入胰蛋白酶2克，木瓜酶1.5克，酶解溫度為45℃，pH≈7.5，不時(shí)攪拌，3小時(shí)酶解終止，加溫至90℃，殺酶，經(jīng)2000分子量超濾膜超濾后，薄膜減壓濃縮(溫度＜60℃)至100ml再冷凍干燥得干粉18克，含氮量10.8％。
實(shí)施例4桃仁100克粉碎后，用7∶3(醋酸乙酯∶溶劑油)混合溶劑脫脂，脫脂物，在1000ml 1％醋酸溶液中7～8℃冰箱中浸泡8小時(shí)，勻漿，再放置7～8℃冰箱中4小時(shí)，離心，分出上清液，用蒸餾水透析，加入肽酶1克，木瓜酶1克，在pH8，溫度45℃下酶解5小時(shí)，加溫至80℃保持5分鐘，降溫，離心，上清液用2000分子量超濾膜進(jìn)行超濾，得蛋白酶解液，冷凍干燥，得粉狀物26克，含氮量10.6％。
實(shí)施例5將牡蠣殼蛋白100克，加入1000ml蒸餾水，加溫至45℃，加入2克木瓜酶，0.1克乙二胺四乙酸二鈉鹽，1克鹽酸半胱氨酸，酶解5小時(shí)，離心，上清液用2000分子量超濾膜進(jìn)行超濾，得液體產(chǎn)品；也可將上清液減壓濃縮至100ml再進(jìn)行冷凍干燥，得干粉產(chǎn)品17克，含氮量11.8％。
實(shí)施例6
取乳酸0.3立升加入蒸餾水1.2立升，充分?jǐn)噭?，?00克珍珠粉分次加入到乳酸溶液中，反應(yīng)完成后，離心，將不溶部分的珍珠蛋白加入蒸餾水1立升，加入1.5克木瓜蛋白酶，1克鹽酸半脫氨酸，1克EDTA，加畢后，38℃中酶解5小時(shí)，離心，得酶解液。此酶解液以2000分子量的膜進(jìn)行超濾，超濾液減壓濃縮至100ml，隨即冷凍干燥得干粉6.3克，含氮量10.55％。
實(shí)施例7將干桃仁蛋白和干珍珠蛋白各50克加入蒸餾水1000ml，加入2克菠蘿蛋白酶，2克胃蛋白酶，在42℃中酶解1小時(shí)，加溫，殺酶，離心，上清液用2000分子量超濾膜超濾，得混合蛋白酶解液，經(jīng)冷凍干燥得粉狀物10.6克，含氮量9.8％。
實(shí)施例8稱取卵白蛋白10kg(卵白蛋白由新鮮雞、鴨蛋中取出)，10克木瓜蛋白酶加入12kg蒸餾水，加入鹽酸半酰氨酸1克，攪拌充分混和均勻后，在溫度為49℃±1℃，PH7±1反應(yīng)1小時(shí)，停止反應(yīng)，水介完畢，熱溫至沸，離心除去未酶介的卵白蛋白滓渣。上清液再加入亞硫酸氫鈉千分之零點(diǎn)七，分裝，高壓滅菌清毒，得酶介卵白蛋白溶液。
實(shí)施例9
1.實(shí)驗(yàn)材料①內(nèi)皮素(E-7764)Sigma試劑公司產(chǎn)品，50μ/瓶，批號(hào)17H49501。
②內(nèi)皮素拮抗劑實(shí)例3得凍干粉，配制成1％水溶液。
③B16細(xì)胞上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理室傳代維持④培養(yǎng)基(15％小牛血清蛋白+青、鏈霉素)，消化液(胰蛋白酶+EDTA)。
⑤細(xì)胞培養(yǎng)瓶、24孔培養(yǎng)板等。
2.實(shí)驗(yàn)方法在24孔培養(yǎng)板各孔中放入小玻片后加入0.8ml 1×105個(gè)/ml的B16細(xì)胞懸液。設(shè)空白對(duì)照組、內(nèi)皮素組(0.5μg/ml)+內(nèi)皮素拮抗劑100μg/ml，內(nèi)皮素(0.5μg/ml)+內(nèi)皮素拮抗劑200μg/ml，內(nèi)皮素(0.5μg/ml)+內(nèi)皮素拮抗劑300μg/ml三個(gè)實(shí)驗(yàn)組。將培養(yǎng)板置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72小時(shí)后在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果0.5μg/ml的內(nèi)皮素對(duì)B16細(xì)胞的色素形成有明顯的促進(jìn)作用，色素增加約50％。內(nèi)皮素拮抗劑在100、200、300μg/ml時(shí)對(duì)B16細(xì)胞未顯示細(xì)胞毒性，對(duì)內(nèi)皮素引起的色素形成有明顯的抑制作用。內(nèi)皮素拮抗劑在100μg/ml時(shí)對(duì)B16細(xì)胞由內(nèi)皮素引起的色素形成即有明顯的抑制作用。
權(quán)利要求
1.一種具內(nèi)皮素拮抗作用的酶介混合肽，其特征是將單一或混合的動(dòng)植物蛋白用酶進(jìn)行酶介，經(jīng)B16黑色素瘤細(xì)胞模型篩選，獲得的具內(nèi)皮素拮抗作用的酶介混合肽；所述的動(dòng)植物蛋白為烏骨雞蛋白、桃仁蛋白、杏仁蛋白、牡蠣蛋白、蠶蛹蛋白、蠶絲蛋白、豬胰蛋白、珍珠蛋白、木瓜蛋白、菠蘿蛋白、白僵蠶蛋白或卵白蛋白；所述的酶為肌蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜酶、肽酶或菠蘿蛋白酶。
2.如權(quán)利要求1所述的一種具內(nèi)皮素拮抗作用的酶介混合肽，其特征是其為含固量0.1～2％的水溶液或濃縮冷凍干燥成含氮量為8～15％，分子量≤2000的干粉。
3.一種如權(quán)利要求1所述的具內(nèi)皮素拮抗劑作用的酶介混合肽的制備方法，其特征是10～80℃和pH值為2～10時(shí)，將單一或混合的動(dòng)植物蛋白用酶進(jìn)行酶介10分鐘～12小時(shí)，超濾膜超濾或者再經(jīng)干燥成粉，酶解時(shí)蛋白和水之比為1∶5～1∶120，所述的酶和蛋白的比例為1∶10至1∶1000。
4.如權(quán)利要求3所述的具內(nèi)皮素拮抗劑作用的酶介混合肽的制備方法，其特征是所述的酶和蛋白的比例為1∶10至1∶1000，最佳比例為1∶50至1∶100。
5.如權(quán)利要求3所述的具內(nèi)皮素拮抗劑作用的酶介混合肽的制備方法，其特征是所述的酶解溫度為10～80℃，最佳溫度為30～50℃，酶解的時(shí)間為10分鐘～12小時(shí)；最佳時(shí)間為1～6小時(shí)；酶解時(shí)蛋白和水之比為1∶10～1∶30。
6.如權(quán)利要求3所述的具內(nèi)皮素拮抗劑作用的酶介混合肽的制備方法中，其特征是所述的超濾步驟中超濾膜孔徑的分子量為2000。
7.如權(quán)利要求3所述的具內(nèi)皮素拮抗劑作用的酶介混合肽的制備方法，其特征是所述的干燥是冷凍干燥、真空低溫干燥或上述二者結(jié)合。
8.一種如權(quán)利要求1所述的具內(nèi)皮素拮抗作用的酶介混合肽的用途，其特征是用于制備保健品和營(yíng)養(yǎng)品。
9.一種如權(quán)利要求1所述的具內(nèi)皮素拮抗作的酶介混合肽的用途，其特征是作為美白劑來抑制黑色素的合成。
全文摘要
本發(fā)明涉及從若干天然動(dòng)植物蛋白經(jīng)酶介獲得的混合肽，其具有內(nèi)皮素拮抗劑作用，作為美白劑可用它來抑制由內(nèi)皮素激發(fā)的黑色素合成，也可用于保健和營(yíng)養(yǎng)品。
文檔編號(hào)A61K8/64GK1908183SQ20061003012
公開日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2006年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月16日
發(fā)明者江志潔, 朱育新 申請(qǐng)人:上海奧利實(shí)業(yè)有限公司, 上海益人生化技術(shù)開發(fā)有限公司