專利名稱：蚯蚓蛋白ep－2及其分離方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥活性成分及提取分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及具有平喘作用的蚯蚓蛋白EP-2及其分離方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蚯蚓藥名稱為地龍，藥用首載《詩經(jīng)》，《神農(nóng)本草經(jīng)》列為下品。中藥地龍具有清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿之功效，是一種常用動物藥材。中國藥典2005年版收載的地龍為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)、通俗環(huán)毛蚓Pheretima vulagris Chen、威廉環(huán)毛蚓Pheretima guillelm(Michaelsen)或櫛盲環(huán)毛蚓Pheretima pectiniferaMichaelsen的干燥體。除藥典收載品種外湖北環(huán)毛蚓P.hupeiensis、直隸環(huán)毛蚓P.tschiliensis、異毛環(huán)毛蚓P.diffringens、白頸環(huán)毛蚓P.californica、背暗異唇蚓Allolobophora caliginosa trapezoides、赤子愛勝蚓Eiseniafoetida等品種也具有潛在的藥用價值。其中赤子愛勝蚓為正蚓科，現(xiàn)已有大量繁殖。但到目前為止，對于蚯蚓具有藥效的活性成份蛋白未見有分離及作用機理的研究報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過對赤子愛勝蚓粗蛋白按離子強度進行分級，然后進行藥效學(xué)篩選，找出有效部位，提供一種具有藥用價值的活性蛋白組分。
本發(fā)明公開的蚯蚓蛋白EP-2是以新鮮赤子愛勝蚓為原料，經(jīng)水性緩沖液勻漿提取，沉淀劑沉淀分離，弱陰離子交換樹脂純化后獲得的一組蛋白混合物，其中含蛋白F-I-0、F-I-1以及纖溶酶組分A為30％-40％。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是公開上述蚯蚓蛋白EP-2的提取分離方法。
本發(fā)明公開的蚯蚓蛋白EP-2的提取分離方法包括下列步驟1.粗蛋白液的制備取新鮮赤子愛勝蚓用水性緩沖液制成勻漿，經(jīng)冷凍高速離心，取上清液，在0-10℃低溫條件下加入沉淀劑，攪拌均勻，放置過夜；經(jīng)冷凍高速離心，取沉淀，用水性緩沖液溶解，或用水性緩沖液溶解，透析除鹽，即得赤子愛勝蚓粗蛋白液EP；2.粗蛋白的純化取上述粗蛋白液，冷凍高速離心，上弱陰離子交換樹脂柱，用NaCl溶液洗脫，收集洗脫液，透析除鹽，溶液冷凍干燥后，得到淡黃色粉末，即為赤子愛勝蚓蛋白EP-2。
本發(fā)明所述的水性緩沖液選自水、磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液和氯化鈉溶液。
本發(fā)明所述的沉淀劑是65-100％(v/v)乙醇溶液、丙酮或硫酸銨。
本發(fā)明所述的弱陰離子交換樹脂是DEAE Sepharose Fast Flow，DEAESepharose CL-6B，DEAE Sepharose A-50或DEAE Bio-Gel A。
本發(fā)明所述NaCl溶液是指濃度為5mM-500mM的氯化鈉水溶液。
對用本發(fā)明方法獲得的蚯蚓蛋白EP-2采用雙向凝膠電泳進行分析，結(jié)果見圖1。
對用本發(fā)明方法獲得的赤子愛勝蚓蛋白EP-2進行肽指紋圖譜分析及串級質(zhì)譜分析，證明其中含有的蛋白F-I-0、F-I-1以及纖溶酶組分A為絲氨酸蛋白酶類胰蛋白酶家族成員，占總量30％-40％。
本發(fā)明所要解決的再一技術(shù)問題是公開上述蚯蚓蛋白EP-2在制備抗哮喘藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明從赤子愛勝蚓中提取的蚯蚓蛋白EP-2能明顯拮抗白三烯收縮離體豚鼠氣管平滑肌的作用，口含吞服后可明顯抑制致敏豚鼠抗原攻擊引起的哮喘反應(yīng)。因此本發(fā)明蚯蚓蛋白EP-2可作為活性成分與藥用輔料制成抗哮喘的藥物，其劑型可包括各類醫(yī)學(xué)上可接受的藥物劑型。
赤子愛勝蚓提取物的藥效學(xué)篩選
蛋白質(zhì)的提取與制備是一項十分細致的工作。涉及物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)的知識很廣。近年來雖有了不少改進，但其主要原理仍不外乎兩個方面一是利用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配于可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析、有機溶劑提取、層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于不同區(qū)域而達到分離的目的，如電泳、超離心、超濾等。由于蛋白質(zhì)不能溶化，也不能蒸發(fā)，所能分配的物相只限于固相和液相，并在這兩相間互相交替進行分離純化。制備方法可按照分子大小、形狀、帶電性質(zhì)及溶解度等主要因素進行分類。按分子大小和形態(tài)分為差速離心、超濾、分子篩及透析等方法；按溶解度分為鹽析、溶劑抽提、分配層析、逆流分配及結(jié)晶等方法；按電荷差異分為電泳、等電點沉淀、離子交換層析及吸附層析等；按生物功能專一性有親合層析法等。本發(fā)明利用溶解度不同制備赤子愛勝蚓粗蛋白，采用經(jīng)典的整體動物模型—致敏豚鼠抗原攻擊引起的哮喘模型對赤子愛勝蚓組織粗提取物和粗蛋白進行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)赤子愛勝蚓粗蛋白10g生藥/kg口含吞服或5g生藥/kg肌肉注射能明顯抑制致敏豚鼠抗原攻擊后引起的RL增高和Cdyn下降，表明其能明顯抑制致敏豚鼠抗原攻擊引起的哮喘反應(yīng)。而赤子愛勝蚓組織粗提物10g生藥/kg口含吞服則無明顯作用。
實驗方法取致敏豚鼠，♀ 各半，隨機分組，分別以受試藥物赤子愛勝蚓組織粗提物或粗蛋白10.0g生藥/kg、硫酸沙丁胺醇5.0mg/kg或模型組生理鹽水4.0ml/kg，口含后吞服。另一組粗蛋白5.0g生藥/kg肌肉注射，均于抗原攻擊前1小時給藥1次。觀察受試藥物對致敏豚鼠抗原攻擊后肺功能的影響，實驗結(jié)果見表1和表2。
表1赤子愛勝蚓提取物對致敏豚鼠抗原攻擊后氣道阻力(RL)的影響
注統(tǒng)計學(xué)方法Mann-Whitney Rank Sum Test，與模型組比較*P＜0.05；im肌肉注射，其余均采用口含后吞服方式給藥表2 赤子愛勝蚓提取物對致敏豚鼠抗原攻擊后動態(tài)肺順應(yīng)件(Cdyn)的影響
注統(tǒng)計學(xué)方法Mann-Whitney Rank Sum Test，與模型組比較*P＜0.05；im肌肉注射，其余均采用口含后吞服方式給藥從表中數(shù)據(jù)可看出，模型組在抗原攻擊后1-5分鐘內(nèi)RL明顯增高，Cdyn值明顯下降，抗擊后1分鐘達到最高峰，RL值與攻擊前基線值比較增加92±56％，Cdyn值下降49±20％。蚯蚓粗蛋白10g生藥/kg口含后吞服能明顯抑制RL增高和Cdyn下降，抗原攻擊后1分鐘RL最高峰值與攻擊前基線值比較增加35±8％，Cdyn值下降28±17％；與模型組比較分別抑制62％和43％。蚯蚓組織粗提物10g生藥/kg口含后吞服不能抑制RL增高和Cdyn下降，與模型組比較無明顯差異。陽性對照藥沙丁胺醇5mg/kg完全抑制RL增高和Cdyn下降，與模型組比較差異非常顯著。蚯蚓粗蛋白5g生藥/kg肌肉注射也能明顯抑制RL增高和Cdyn下降，抗原攻擊后1分鐘RL最高峰值與攻擊前基線值比較增加26±4％，Cdyn值下降26±4％；與模型組比較分別抑制73％和47％。
用含本發(fā)明方法制得的赤子愛勝蚓蛋白EP-2進行有關(guān)藥效學(xué)研究，結(jié)果如下1.對白三烯(LTD4)收縮離體豚鼠氣管平滑肌的影響先用氨甲酰膽堿(CCH)1×10-6M收縮氣道平滑肌以檢驗平滑肌制備的活性，洗3遍，待回到基線后再次加入氨甲酰膽堿(CCH)1×10-6M收縮平滑肌，洗3遍，待回到基線后加入消炎痛(indomethacin)5×10-6M(避免孵育在克-亨氏液的氣管平滑肌產(chǎn)生環(huán)氧酶產(chǎn)物)和L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-Cysteine鹽酸鹽)3×10-3M(避免LTD4快速降解)，5分鐘后加入受試樣品1×10-7g/L或孟魯司特1×10-7M，最后加入LTD41×10-7M。計算公式LTD41×10-7M收縮％(以CCH1×10-6M收縮高度為100％)＝LTD41×10-7M收縮幅度/CCH1×10-6M收縮幅度×100％，實驗結(jié)果見表3。
表3赤子愛勝蚓蛋白EP-2對LTD4收縮離體豚鼠氣管平滑肌的影響
從表中數(shù)據(jù)看出，與對照組相比，赤子愛勝蚓蛋白EP-2(1×10-7g/L)對LTD4(10-7mol/L)引起的離體豚鼠氣管平滑肌收縮反應(yīng)有明顯的拮抗作用(P＜0.001)，對LTD4的抑制率為43.9％。
2.對致敏豚鼠抗原攻擊后肺功能的影響實驗方法取致敏豚鼠，♀
各半，隨機分組，分別以受試藥物赤子愛勝蚓蛋白EP-2 10.0mg/kg、孟魯司特10mg/kg或模型組生理鹽水4.0ml/kg，口含后吞服給藥1次。觀察赤子愛勝蚓蛋白EP-2對致敏豚鼠抗原攻擊后肺功能的影響，實驗結(jié)果見表4和表5。
表4赤子愛勝蚓蛋白EP-2對致敏豚鼠抗原攻擊后氣道阻力(RL)的影響
統(tǒng)計學(xué)方法T-Test或Mann-Whitney Test，與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；均采用口含后吞服方式給藥，模型組給予生理鹽水表5赤子愛勝蚓蛋白EP-2對致敏豚鼠抗原攻擊后動態(tài)肺順應(yīng)性(Cdyn)的影響
統(tǒng)計學(xué)方法T-Test或Mann-Whitney Test，與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；均采用口含后吞服方式給藥從表中數(shù)據(jù)看出，模型組在抗原攻擊后1-5分鐘內(nèi)RL明顯增高，Cdyn值明顯下降，抗原攻擊后3分鐘達到最高峰，RL值與攻擊前基線值比較增加61.8±20.3％，Cdyn值下降42.7±10.3％?？乖艉?-5分鐘(5個測定點的值)的平均值，與攻擊前基線值比較RL值增加60±2％，Cdyn值下降41±2％?？乖艉?-30分鐘(10個測定點的值)的平均值，與攻擊前基線值比較RL值增加55±5％，Cdyn值下降36±6％。蛋白EP-2(10mg/kg)口含后吞服，抗原攻擊后1-5分鐘(5個測定點的值)的平均值，與攻擊前基線值比較RL值增加32±3％，Cdyn值下降27±1％?？乖艉?-30分鐘(10個測定點的值)的平均值，與攻擊前基線值比較RL值增加30±3％，Cdyn值下降25±3％。孟魯司特(10mg/kg)灌胃給藥，抗原攻擊后1-5分鐘(5個測定點的值)的平均值，與攻擊前基線值比較RL值增加18±4％，Cdyn值下降31±6％?？乖艉?-30分鐘(10個測定點的值)的平均值，與攻擊前基線值比較RL值增加13±6％，Cdyn值下降24±8％。
結(jié)論在整體試驗中，赤子愛勝蚓蛋白EP-2口含吞服后可明顯抑制致敏豚鼠抗原攻擊引起的哮喘反應(yīng)，實驗初步證明赤子愛勝蚓蛋白EP-2可能是白三烯拮抗劑，作用靶點可能通過拮抗白三烯受體。
本發(fā)明公開的赤子愛勝蚓蛋白EP-2，抗哮喘作用顯著，提供了一種具有藥用價值的活性蛋白。
圖1赤子愛勝蚓蛋白EP-2的雙向凝膠電泳圖譜具體實施方式
實施例1(1)赤子愛勝蚓粗蛋白液的制備取新鮮蚯蚓放入水中反復(fù)清洗，排盡其消化道污物，洗凈，稱重，加入2倍量的20mM、PH值為6.8的磷酸鹽緩沖液，組織攪碎機中搗碎，制成勻漿，室溫抽提4-6小時，4℃高速離心20分鐘，取上清液，在4℃下，緩慢加入研磨好的硫酸銨固體，邊加邊攪拌，使硫酸銨的飽和度達到80％，4℃放置過夜，4℃高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀用20mM、PH值為6.8的磷酸鹽緩沖液懸浮，分子量3500透析袋中對20mM、PH值為6.8的磷酸鹽緩沖液透析48小時，中間換液4-5次，所得蛋白液4℃高速離心20分鐘，上清液為蚯蚓粗蛋白液。
(2)赤子愛勝蚓粗蛋白的純化取赤子愛勝蚓粗蛋白液，4℃高速離心20分鐘，上DEAE SepharoseFF弱陰離子交換樹脂柱，依次用150mM NaCl、300mM NaCl洗脫，收集300mMNaCl的洗脫液，透析除鹽，溶液冷凍干燥后，得到淡黃色粉末，即為赤子愛勝蚓蛋白EP-2。
實施例2(1)赤子愛勝蚓粗蛋白液的制備取新鮮蚯蚓放入水中反復(fù)清洗，排盡其消化道污物，洗凈，稱重，加入3倍量的水，組織攪碎機中搗碎，制成勻漿，室溫抽提4-6小時，4℃高速離心20分鐘，取上清液，在4℃下，緩慢加入等量丙酮，攪拌均勻，4℃放置過夜，4℃高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀用水懸浮，4℃高速離心20分鐘，上清液為蚯蚓粗蛋白液。
(2)赤子愛勝蚓粗蛋白的純化取赤子愛勝蚓粗蛋白液，4℃高速離心20分鐘，上DEAE SepharoseCL-6B弱陰離子交換樹脂柱，300mM NaCl洗脫，收集洗脫液，透析除鹽，溶液冷凍干燥后，得到淡黃色粉末，即為赤子愛勝蚓蛋白EP-2。
實施例3(1)赤子愛勝蚓粗蛋白液的制備取新鮮蚯蚓放入水中反復(fù)清洗，排盡其消化道污物，洗凈，稱重，加入1倍量的氯化鈉溶液，組織攪碎機中搗碎，制成勻漿，室溫抽提4-6小時，4℃高速離心20分鐘，取上清液，在4℃下，緩慢加入等量95％乙醇，攪拌均勻，4℃放置過夜，4℃高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀用水懸浮，4℃高速離心20分鐘，上清液為蚯蚓粗蛋白液。
(2)赤子愛勝蚓粗蛋白的純化取赤子愛勝蚓粗蛋白液，4℃高速離心20分鐘，上DEAE SepharoseA-50陰離子交換樹脂柱，200mM NaCl洗脫，收集洗脫液，透析除鹽，溶液冷凍干燥后，得到淡黃色粉末，即為赤子愛勝蚓蛋白EP-2。
實施例4赤子愛勝蚓蛋白EP-2的肽指紋圖譜分析及串級質(zhì)譜分析(1)赤子愛勝蚓蛋白EP-2的雙向凝膠電泳將3mg總蛋白溶于150μl純水中，加入1mM PMSF，離心后，取上清液到Millipore YM-3型超濾管中，在7500G 4℃離心1h(超濾法除去樣品中少量的鹽)，待溶液為15-20μl后，以高速離心將蛋白液離心到新的樣品管中。將80μg總蛋白質(zhì)與重泡漲液[尿素(9mol/L)+CHAPS(4％)+DTT(0.5％)+PMFS(0.14％)+兩性電解質(zhì)(0.5％)+痕量溴酚藍]混合，總體積125μl，加入IPG持膠槽中，IPG干膠條(70mm×3mm×0.5mm，非線性，PH3-10)膠面朝下放入持膠槽中，其上覆蓋一層礦物油以防樣品液蒸發(fā)，加蓋后置于IPGphor水平電泳儀電極板上，20℃下泡漲12h以上。等點聚焦條件設(shè)置①梯度升壓250V/30min；②梯度升壓1000V/h；③快速升壓4000V/h，并保持聚焦8h。等電聚焦結(jié)束后，膠條在平衡液A[Tris(50mmol/L，PH6.8)，尿素(6mol/L)，甘油(30％)，SDS(2％)，DTT(1％)]中平衡10min，于平衡液B[Tris(50mmol/L，PH6.8)，尿素(6mol/L)，甘油(30％)，SDS(2％)，碘乙酰胺(2.5％)]中平衡10min，然后將膠條移至分離膠(12.5％)上端，瓊脂糖(0.5％)封膠。以恒電流方式，20mA/膠電泳至蛋白轉(zhuǎn)至分離膠后，換用30mA/膠，直至溴酚藍前沿遷移至距凝膠底邊1cm處停止電泳。采用快速銀染法染色。雙向凝膠電泳圖譜見圖1。
(2)圖像采集分析染色后的凝膠用凝膠掃描儀透射掃描，得到的數(shù)字化圖像，用Imagemaster 2D軟件進行分析。圖像分析過程包括圖譜的剪切、蛋白質(zhì)點的檢測、分析豐度。
(3)蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解將蛋白點用Ettan切膠儀(Amersham Pharmacia，直徑Φ＝1.4mm的切割頭)切膠，置于96孔板中。在含有膠粒的每個孔中加入200μl脫色液(由100mM硫代硫酸鈉和30mM鐵氰化鉀溶液按照1∶1混合而成)，靜置30分鐘后，棄去上清液。然后加200μl水清洗，靜置30分鐘后棄上清液，并重復(fù)該步驟直至膠粒變?yōu)闊o色。在膠粒中加入200μl乙腈靜置30分鐘后，棄上清液。重復(fù)該步驟至凝膠完全脫水變白。將乙腈吸出舍棄后，將膠粒置于37℃使完全干燥。測序級的胰蛋白酶酶液用20mM碳酸氫銨溶液配制為濃度12.5ng/μl后，加入適量酶液于膠粒中，并于4℃放置30分鐘使膠粒完全泡脹。然后吸出多余的酶液棄去，以防止質(zhì)譜檢測時出現(xiàn)過多的胰蛋白酶自身降解的肽段。加約5μl 25mM碳酸氫銨溶液覆蓋膠粒以防止溶液在酶解過程中干涸。置于37℃控溫箱內(nèi)保溫12-16小時。酶解后的膠粒用60μl0.1％三氟乙酸/50％乙腈提取3次，每次20分鐘。合并提取液。在氮氣流中將溶液吹干以進行后續(xù)的MALDI-TOF-MS鑒定。
(4)肽混合物的質(zhì)譜鑒定將完全干燥的肽段重新溶解于0.7μl 0.5g/lCHCA溶液(溶劑，0.1％三氟乙酸+50％α-羥基肉桂酸)中，并將其全部點到不銹鋼MALDI靶板上，并在室溫下自然干燥。凍干樣品管中加10μl0.5％三氟乙酸溶液，混勻后取1μl做MALDI-TOF-MS肽指紋圖譜分析。樣品用4700串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析，激光源為355nm波長的Nd:YAG激光器，加速電壓為20kV，采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)。PMF質(zhì)量掃描范圍為700-3500Da，且強度最大的5個峰進行串級質(zhì)譜分析；PMF譜圖用兩個trypsin自降解的峰m/z 842.510和m/z 2211.105進行內(nèi)標校正。所得結(jié)果用NCBInr進行數(shù)據(jù)庫檢索。搜索參數(shù)設(shè)置數(shù)據(jù)庫為NCBInr；檢索種屬為Metazoa(animals)；數(shù)據(jù)檢索的方式為combined；最大允許漏切位點為1；酶為胰蛋白酶。質(zhì)量誤差范圍設(shè)置PMF 0.3Da，MS/MS0.4Da；設(shè)置的可變修飾為carbamidomethylation(半胱氨酸)和氧化(甲硫氨酸)。在數(shù)據(jù)庫檢索時胰酶自降解峰和污染物質(zhì)的峰都手工剔除。質(zhì)譜分析及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫同源性檢索的實驗結(jié)果見表6。
表6 質(zhì)譜分析及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫同源性檢索結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種蚯蚓蛋白EP-2，其特征在于該蛋白是以新鮮赤子愛勝蚓為原料，經(jīng)水性緩沖液勻漿提取，沉淀劑沉淀分離，弱陰離子交換樹脂純化后獲得的一組蛋白混合物，其中含蛋白F-I-0、F-I-1以及纖溶酶組分A為30％-40％。
2.一種權(quán)利要求1所述的蚯蚓蛋白EP-2的制備方法，其特征在于所述蛋白由下述方法制得(1)粗蛋白液的制備取新鮮赤子愛勝蚓用水性緩沖液制成勻漿，經(jīng)冷凍高速離心，取上清液，在0-10℃條件下加入沉淀劑，攪拌均勻，放置過夜；經(jīng)冷凍高速離心，取沉淀，用水性緩沖液溶解，或用水性緩沖液溶解，透析除鹽，即得粗蛋白液；(2)粗蛋白的純化取上述粗蛋白液，冷凍高速離心，上弱陰離子交換樹脂柱，用NaCl溶液洗脫，收集洗脫液，透析除鹽，溶液冷凍干燥，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蚯蚓蛋白EP-2的制備方法，其特征在于其中所述的水性緩沖液選自水、磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液和氯化鈉溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蚯蚓蛋白EP-2的制備方法，其特征在于其中所述的沉淀劑是65-95％乙醇溶液、丙酮或硫酸銨。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蚯蚓蛋白EP-2的制備方法，其特征在于其中所述的弱陰離子交換樹脂是DEAE Sepharose Fast Flow，DEAE SepharoseCL-6B，DEAE Sepharose A-50或DEAE Bio-Gel A。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蚯蚓蛋白EP-2的制備方法，其特征在于其中所述的NaCl溶液是指濃度為5mM-500mM的氯化鈉水溶液。
7.一種權(quán)利要求1所述的蚯蚓蛋白EP-2在制備抗哮喘藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及蚯蚓蛋白EP－2及其方法和應(yīng)用。本發(fā)明公開的蚯蚓蛋白EP－2是以新鮮赤子愛勝蚓為原料，經(jīng)水性緩沖液勻漿提取，沉淀劑沉淀分離，弱陰離子交換樹脂純化后獲得的一組蛋白混合物，其中含蛋白F－I－0、F－I－1以及纖溶酶組分A為30％－40％。本發(fā)明蚯蚓蛋白EP－2具有顯著的抗哮喘作用，是一種具有藥用價值的活性蛋白。
文檔編號A61P11/06GK1966517SQ200610024328
公開日2007年5月23日 申請日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日
發(fā)明者馮怡, 徐德生 申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)