抗乙肝病毒的鵲腎樹提取物及其提取工藝的制作方法

專利名稱：：抗乙肝病毒的鵲腎樹提取物及其提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥及提取方法，具體說是抗乙肝病毒的鵲腎樹提取物及其提取工藝。
背景技術(shù)：
：乙肝是一種嚴重危害人類健康的傳染病，引起該病的病原體是乙肝病毒。目前國內(nèi)外治療乙肝的藥物主要用干擾素，核苷類藥物，但這類藥價格昂貴，治療效果也只有30%左右，而且停止用藥后，容易產(chǎn)生反復(fù)。我國是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，現(xiàn)患病率為277人/萬人，年發(fā)病率95人/萬人，全國約有1.3億人是乙肝病毒攜帶者，防治該病的任務(wù)繁重而又迫切。目前，越來越多的科技工作者把研究方向轉(zhuǎn)向了來源豐富，價廉易得、毒副作用小的天然藥物。鵲腎樹為?？迄o腎樹屬植物，屬于喬木或灌木，主要分布在廣東、廣西、云南、海南等省。鵲腎樹具有多種藥用療效，其根提取液可以治療發(fā)燒、痢疾、牙齦炎、口腔潰瘍等，但鵲腎樹提取物能有效抗乙肝病毒，及這種物質(zhì)的提取工藝至今尚未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是要提供一種能有效抗乙肝病毒的鵲腎樹提取物及其提取工藝。本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明以鵲腎樹的枝葉、心材、根、皮為原料經(jīng)粉碎、提取、硅膠柱層析、洗脫得到鵲腎樹提取物。本發(fā)明的提取工藝包括如下步驟1.粉碎風(fēng)干的鵲腎樹枝葉、心材、根、皮；2.用乙醇或甲醇或水提取，得提取液；3.提取液濃縮得紅色濃縮液，分別用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取、濃縮，得到各溶劑萃取物；4.將上述各溶劑萃取物分別進行硅膠柱層析；5.用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、甲醇中的一種或一種以上按不同比例梯度洗脫，得到鵲腎樹木脂素類化物。上述鵲腎樹提取物經(jīng)紅外光譜，紫外光譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、質(zhì)譜的解析，并與文獻對照，鑒定提取物的基本結(jié)構(gòu)式為Gr~Cfi-C6-C:i，證實是包括乙芳基丁烷類、乙芳基丁烯類、芳基四氫萘類、芳基萘和芳基二氫萘類、四氫呋喃類、四氫呋類喃并四氫呋喃類、聯(lián)苯環(huán)辛烯類、苯并呋喃類、二環(huán)辛垸類等木脂素類衍生物。本發(fā)明利用2.2.15細胞培養(yǎng)系統(tǒng)對鵲腎樹提取物進行抗乙肝病毒實驗，結(jié)果表明在體外實驗中，具有較強的抗乙肝病毒作用，其有效部位經(jīng)化學(xué)方法鑒定，證明，主要有效成分為木脂素類化合物。鵲腎樹提取物抑制乙肝病毒H印G2的2.2.15細胞系50%活性時的藥物濃度為IC5U(15ug/ml)，復(fù)篩藥物濃度100ug/ml時，抑制率81.6%，實驗證明木脂素類化合物抗乙肝病毒作用強大，為高活性成分，正中開發(fā)抗乙用藥物的耙點，對于開發(fā)高效低毒的天然抗乙肝冠狀病毒的口服藥、注射劑等藥物具有重大意義；另外，鵲腎樹為一味經(jīng)典常用的中藥，藥性清楚，資源豐富，從鵲腎樹中分離提取抗乙肝病毒有效成份的分離工藝成熟、簡易；鵲腎樹抗乙肝病素有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)與作用機理明確，以此開發(fā)抗乙肝病毒的新藥前途非常光明。具體實施例方式實施例1:(l)提取取自然風(fēng)干的鵲腎樹枝葉、心材、根、皮2公斤，粉碎后用75%的乙醇回流提取，(3X30升)，合并提取液，過濾后回收溶劑，得紅色濃縮液1000毫升，置于5000ml的分液漏斗中，分別用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑后，分別得到石油醚萃取物0.8克，乙醚萃取物3.2克，乙酸乙酯萃取物33克，正丁醇萃取物38克，水溶物87克。(2)分離取乙醚萃取物3.2克進行硅膠柱層析(300-400目，200g)，用Me0H:CHCL3((h100—5:95)梯度洗脫，得五個組分，重量分別是0.3g、0.6g、0.5g、0.2g和1.2g，再將每個組分分別經(jīng)制備薄層層析，洗脫，分離得到3個純化合物木蘭木脂素A(magnolignanA)、厚樸醛D(magnaldehydeD)、鵲腎樹木脂素A(strebluslignanA)。取乙酸乙酯萃取物33g進行硅膠柱層析(100-200目，1000g)用MeOH:CHCL:,.(0:100—40:60)梯度洗脫，得五個組分，重量分別是3.5g、4.0g、8.0g、6.0g和12g，再分別制備薄層層析分離得到2個純化合物鵲腎樹木脂素B(strebluslignanB)、落葉松樹月旨醇[(+)-isolariciresinolj。取正丁醇萃取物38g進行硅膠柱層析(100-200目，200g)，用乙醇乙酯Me0H(0:100—40:60)梯度洗脫，得五個組分，重量分別是1.5g、5.6g、6.2g、4.3g和13.5g，再制備薄層層析分離得到4個純化合物木蘭木脂素A-4'-0-卩-D葡萄糖苷(magnolignanA4'-0-卩-D-glycoskie)、(+)-lyoniresinol-2a-0-(3-L腳arabinopyranoside、5—甲基一9—(3—木糖基一異落葉豐公樹月旨醇[5-methoxy-9-卩-xylopyanosyl-(-)-isolariciresino]、9一卩一木糖基一異落葉松樹月旨醇[9-卩-xylopyanosyl-(-)-isolariciresinoi]。.實施例2:鵲腎樹正丁醇萃取物對H印G2.2.15、細胞系HBsAg和HbeAg表達的影響將H印G2.2.15細胞2X105/ml接種96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔飾l，以800ug/ml、400ug/ml、200ug/ral、100ug/ral的藥物濃度加入細胞培養(yǎng)板中，每個濃度設(shè)3孔，設(shè)10y。DMSO組，3孔作用為陰性對照，分別于第3天，第6天取培養(yǎng)基上清液-2(TC凍存，集中用ELISA法測定HBsAg、HbeAg，測定波長450咖處的吸光度，按下式計算藥物對細胞的抑制率。10%DMS0陰性對照孔0D值藥物孔0D值抑制率=--X100%10%DMS0陰性對照孔0D值陰性血清0D值藥物對HbsAg、HbeAg分泌的抑制率結(jié)果見表l、表2:表l鵲腎樹提取物對H印G2.2.15細胞系HbsAg表達的抑制作用(X土D，n二3)<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從以上實驗可知，鵲腎樹提取物在小劑量(100ug/ml)，中劑量(400ug/ml)和大劑量(800ug/ml)的抑制率在給藥第3天分別為76.5%、89.3%、97.4%，第6天的抑制率分別為70.5%、96.0%、100%，對HBsAg平均抑制率分別為85.0%和85.1%,IC5o分別為64.68士56.12嗎.mL"和63.98±51.02iig.mL-1，結(jié)果表明該提取物具有很高的抗HbsAg表達的能力。當分別取小劑量(100ug/ml)，中劑量(400ug/ml)和大劑量(800ug/ml)進行抗HbeAg表達實驗，抑制率于給藥第3天分別是3.8%、31.4%、48.8%,效果不明顯；但持續(xù)給藥至第5天，其抑制率分別可以達到81.6%、97.0%、98.1%，平均抑制率為91.3%，IC50為54.43土36.58嗎.mL"，證明該提取物具有很強的抑制HbeAg表達的作用，從實驗結(jié)果表明鵲腎樹提取物具有很強的抗乙肝病毒的療效?？梢蚤_發(fā)成片劑、膠囊、口服液、注射劑等劑型。權(quán)利要求1.一種抗乙肝病毒的鵲腎樹提取物，其特征是它由鵲腎樹經(jīng)粉碎、提取、濃縮、萃取、硅膠柱層析、洗脫得到的具有C3-C6-C6-C3基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的丙烯基酚及其衍生物和烯丙基酚及其衍生物的木脂素類化合物。2.如權(quán)利要求1所述的鵲腎樹提取物，其特征是所述的鵲腎樹木脂素類化合物包括乙醚萃取提取的3個化合物木蘭木脂素A即magnolignanA、厚樸醛D即magnaldehydeD、鵲腎樹木脂素A即strebluslignanA，或乙酸乙酯萃取提取的2個化合物鵲腎樹木脂素B即strebluslignanB、落葉松樹脂醇即(+)-isolariciresinol，或正丁醇萃取提取的4個化合物木蘭木脂素A-4'-0-卩-D葡萄糖苷即magnolignanA4'-0-卩-D-glycoside、(+)-lyoniresinol-2a-0-卩-L-arabinopyranoside、5—甲基—9—(3—木糖基一異落卩十松樹脂醇即5-methoxy-9-卩-xylopyanosyl-(-)-isolariciresino、9—(3—木糖基一異落葉松樹月旨醇艮卩9-卩-xylopyanosyl-(-)-isolariciresino1。3.抗乙肝病毒的鵲腎樹提取物的提取方法，其特征是包括如下步驟.將風(fēng)干的鵲腎樹粉碎；②.用乙醇或甲醇或水提取，得提取液；③.提取液濃縮得紅色濃縮液，分別用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取、濃縮，得到各溶劑萃取物；④.將上述各溶劑萃取物分別進行硅膠柱層析；.用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、甲醇中的一種或一種以上按不同比例梯度洗脫，即得到基本化學(xué)結(jié)構(gòu)為CrC6-C6-C3的鵲腎樹木脂素類化合物。4.抗乙肝病毒的鵲腎樹提取物，其特征是將提取物鵲腎樹木脂素化合物應(yīng)用于抗乙肝病毒。全文摘要本發(fā)明公開了抗乙肝病毒的鵲腎樹提取物及其提取工藝，提取物是基本結(jié)構(gòu)式為C₃-C₆-C₆-C₃的鵲腎樹木脂素類化合物。提取工藝為粉碎鵲腎樹→乙醇或甲醇或水提取→提取液濃縮→濃縮液分別用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取→萃取物分別進行硅膠柱層析→用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、甲醇中的一種或一種以上梯度洗脫→鵲腎樹木脂素類化合物。體外實驗表明，對乙肝病毒HepG2.2.15細胞系HBsAg表達的抑制作用藥物劑量在100μg/ml時抑制率達76.5％以上；對HbeAg表達的抑制作用藥物劑量在100μg/ml時抑制率達81.6％以上。本發(fā)明不僅找到了抗乙肝病毒的一種新的中藥藥源，而且藥物的提取工藝簡單成熟，對開發(fā)高效低毒的抗乙肝病毒的新藥有非常積極的意義。文檔編號A61K36/60GK101195645SQ20061002246公開日2008年6月11日申請日期2006年12月6日優(yōu)先權(quán)日2006年12月6日發(fā)明者何星存,廖日權(quán),張艷軍,俊李,蘇小建,金柏峰,艷黃,黃錫山,波龍申請人:廣西師范大學(xué)