專利名稱：：胰島素樣生長因子-1(igf-i)和聚乙二醇的綴合物的制作方法胰島素樣生長因子-l(IGF-l)和聚乙二醇的綴合物本發(fā)明涉^J1烏素樣生長因子-I(IGF-I)與聚乙二醇(PEG)的級合物，包含這類綴合物的藥物組合物和生產(chǎn)和使用這類級合物的方法.發(fā)明背景阿爾茨海默病(AD)為曰益增加的神經(jīng)變性的a形式，其在65歲以上年齡的全部癡呆病例中約占50%-60%。據(jù)估計它目前影響M界1500萬人，并且由于在人群中老齡化人口的相對增加，所以其患病率可能在接下來的20年到30年內(nèi)增加.AD是一種進(jìn)行性病癥，其中從臨床癥:RJL作到死亡之間的平均期限約有8.5年.與高^神功能相關(guān)的大腦區(qū)域中的錐體神經(jīng)元死亡和神經(jīng)元突觸喪失產(chǎn)生了典型癥狀，其特征在于i^知功能的嚴(yán)重和進(jìn)行性受損(Francis,P.T.等人，/.iVeurosMfg:尸sycA1W1y66(1999)137-147)。AD在世界中為老年性和早老性癡呆的最常見形式并且在臨床上被視為殘酷的進(jìn)行性癡呆，與之共同存在的情況是記憶、智力功能喪失和語言障礙增加(Merritt，4r狄幼卯itn/iVe"ivtogy，笫6&Lea&Febiger，費城，第484489頁，1979),從神經(jīng)病理學(xué)上講，AD的主要標(biāo)志在于存在兩種特征性損害:淀粉狀老年蛋白斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT).盡管所述的斑沉積在神經(jīng)元外，但是在死亡后的大腦中的神經(jīng)元內(nèi)部觀察到了纏結(jié).淀粉狀蛋白斑核心中的主要成分之一為病理性沉積的小淀粉狀蛋白-P-肽(AP)，其被來自淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)的分泌酶裂解(Selkoe，D.J.，iV^wo/.及ev.81(2001)741-766;Hardy，J.，和Selkoe，D丄，5W幼ce297(2002)353-356;Bush，A.L，和Tanzi，R.E.，ZVvc.iVa汰f/5^99(2002)7317-7319).3943個殘基的自聚集肷AP(MW~4kDa)作為較大APP(110-120kDa)的一部分合成.APP為具有大的N-末端J^卜結(jié)構(gòu)域、單一跨膜結(jié)構(gòu)域和短M尾的I型膜^#蛋白.AP區(qū)跨APP的胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域部分。APP參與AD中神經(jīng)元細(xì)胞死亡的最常見推斷為淀粉狀蛋白假說.這一假說推斷淀粉狀蛋白沉積或部分聚集的可溶性AP引起神經(jīng)毒性級聯(lián)，由此產(chǎn)生與AD病理學(xué)相似的神經(jīng)變性(Selkoe，D丄，Physiol.Rev.81(2001)741-766;Hardy,J"和Selkoe，D.J.，Science297(2002)353-356)。胰島素樣生長因子I(IGF-I)為在結(jié)構(gòu)上與胰島素相關(guān)的循環(huán)激素。傳統(tǒng)上認(rèn)為IGF-I是生長激素對外周組織起作用的主J^h體。IGF-I由70個M酸組成并且也稱作生長調(diào)節(jié)素C且定義為SwissProtNo.P01343,用途、活性和產(chǎn)生在下列文獻(xiàn)中提及:例如，leBouc，Y.等人，i^5S丄e汰196(1986)108-112;dePagter-Holthuizen，P.等A^T^AS丄e汰195(1986)179-184;SandbergNordqvist，A.C.等人，丑raZ"及es.AfoAJiymzi12(1992)275-277;Steenbergh,P.H.等人，祝ocAe挑.5/o;pA",及幼.Co挑附im.175(1991)507-514;Tanner,J.M.等A^cto五mtoci7VwA(T印幼AJ84(1977)681-696;Uthne，K.等人，/C7f".Emtocw"o/:MCa6.39(1974)548-554;EP0123228;EP0128733;US5,861,373;US5,714,460;EP0597033;WO02/32449;WO93/02695,IGF-I功能的調(diào)節(jié)是十分復(fù)雜的.在循環(huán)中，僅0.2%的IGF-I以游離形式存在，而大部分與IGF-結(jié)合蛋白(IGFBP)結(jié)合，它們對IGF具有極高的親和力并且調(diào)節(jié)IGF-I功能。該因子可以通過釋放IGF-I的機(jī)制，諸如蛋白酶對IGFBP的蛋白水解局部釋，放。IGF-I在發(fā)育和成熟大腦中起旁分泌作用(Werther，G.A.等人，五"化ctiViC4(1990)773-778).體外研究表明IGF-I為CNS中幾種類型神經(jīng)元的有效的非選擇性營養(yǎng)劑(Knusel，B.等人，/.iV戰(zhàn)wsd.10(1990)558-570;Svrzic，D.，和Schubert,D.，i/odte挑.5/tf/;/^s.CV附附m".172(1990)54-60)，包括多巴胺能神經(jīng)元(Kmisel，B.等人，義iV戰(zhàn)wsd.10(19卯)558-570)和少突^t細(xì)胞(McMorris，F(xiàn).A.，和Dubois-Dalcq,M"丄iVewnwd:及m.21(1988)199-209;McMorris,F.A.等A^Mi汰jCflrf.S"83(1986)822-826;Mozell，R丄.，和McMorris,F.A.，/iVe"r仍"及es.30(1991)382-3卯))。US5,093,317中提及了^4^能神經(jīng)元細(xì)胞的存活通過施用IGF-I得到提高。進(jìn)一步已知IGF-I刺激外周神經(jīng)再生(Kanje，M.等人，5fyw'"486(1989)396-398)并且提高鳥氨酸脫羧酶活性(US5,093,317)。US5，861，373和WO93/02695中提及了治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病的方法，這主要通過增加IGF-I和/或其類似物在患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的活性濃度來影響神經(jīng)膠質(zhì)和/或非膽喊能神經(jīng)元細(xì)胞。WO0232449涉及減輕或預(yù)防哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中局部缺血性損傷的方法，這通過向哺乳動物鼻腔施用包含治療有效量的IGF-I或其生物活性變體的藥物組合物來進(jìn)行。有效減輕或預(yù)防與局部缺血事件相關(guān)局部缺血性損傷的量的IGF-I或其變體通過哺乳動物的鼻腔吸收并且被轉(zhuǎn)運入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。EP0874641請求保護(hù)IGF-I或IGF-II在制備用于治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元損傷的藥物中的用途，所述的神經(jīng)元損傷是因為AIDS-相關(guān)癡呆、AD、帕金森病、皮克病、亨廷頓舞蹈病、肝性腦病、皮質(zhì)-基底神經(jīng)節(jié)綜合征、進(jìn)行性癡呆、具有痙攣性截癱的家族性癡呆、進(jìn)行性核上麻瘠、多發(fā)性硬化、Schilder腦硬化或急性壞死性出血性腦脊髄炎引起的，其中所述的藥物為用于在血腦屏障或血-脊髄屏障外部以有效量腸胃外施用所述IGF的形式。游離IGF-I的腦和血清水平的下降與AD的散發(fā)和家族形式的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。此夕卜，IGF-I防止神經(jīng)元受到AP-誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的影響(Niikura，T.等人/iVeKiwd21(2001)1902-1910;Dore，S.等A^戶niVfl汰^c/wf.t/5"j94(1997)4772-4777;Dore，S.等人，iVT^cfld:890(1999)356-364)。近來，經(jīng)證實外周施用IGF-I能夠降低大鼠和小鼠腦AP水平(Carro，E.等人，M/.8(2002)1390-1397)。此外，研究證實在轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型中，延長的IGF-I治療顯著減少了腦淀粉狀蛋白斑的堆積。這些數(shù)據(jù)強烈支持了IGF-I能夠通過從大腦中清除AP降低腦Ap水平和減輕與斑相關(guān)的腦癡呆的觀點。蛋白質(zhì)與聚乙二醇(PEG)的共價修飾證實是延長蛋白質(zhì)的體內(nèi)循環(huán)半衰期的有用方法(Hershfield,M.S.等人，iV./Merf.316(1987)589-596;Meyers,F.J.等人，C7/".P^mmc"/.77^r.49(1991)307-313;Delgado，C等人,CWY.及《v.7Tr仏Cfl/r/e,5y化9(1992)249-304;Katre，WvflwcerfiV"-"^!^,!^10(1993)91;EP-A0400472;Monfardini，C等人J"am/i/ga紐CAe加.6(1995)62-69;Satake隱Ishikawa，R.等人，C《//^n/"17(1992)157-160;Katre，N.V.等人，iV"汰5W.fAS^484(1987)1487-1491;Tsutsumi，Y.等人，丄Ca/icer85(1994)9誦12;Inoue，H.等人/丄W.C7iw.124(1994)529-536;Chamow，S.M.等人，5,》cwi/"gflteCAeiw.5(1994)133-140)。聚乙二醇化的其它優(yōu)點在于溶解度增加和蛋白質(zhì)免疫原性下降(Katre，TV;F.，//w附"朋/:144(1990)209-213)。用于蛋白質(zhì)聚乙二醇化的常用方法為使用殺基反應(yīng)性試劑如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化的聚乙二醇.使用這類試劑使聚乙二醇與蛋白質(zhì)在游離伯氨基，諸如N-末端oc-氨基和賴氨酸殘基的e-絲上連接.然而，這種手段的主要局f!L4于蛋白質(zhì)一般包含大量的賴氨酸^且由此聚乙二醇基以非特異性方式與蛋白質(zhì)在所有游離f-UJi連接，從而產(chǎn)生隨機(jī)聚乙二醇化蛋白質(zhì)的異源產(chǎn)物混合物，因此，許多NHS-聚乙二醇化蛋白質(zhì)因低特異性活性而不適合于商業(yè)化應(yīng)用。失活是因生物活性所需的一個或多個賴氨酸殘基或N-末端氨基殘基的共價修飾或蛋白質(zhì)活性位點附近或位點上的聚乙二醇叛基的共價連接所致.例如，發(fā)現(xiàn)使用NHS-聚乙二醇化試劑修飾人生長激素將蛋白質(zhì)的活性降低了10-倍以上(Clark，R.等人，/C%effi.271(1996)21969-21977).人生長激素包含9個賴氨酸與N-末端氨基酸.這些賴氨酸中的某些位于已知對受體結(jié)合而言關(guān)鍵的蛋白質(zhì)區(qū)內(nèi)(Cunningham,B.C.等人，254(1991)821-825)。此外，通過使用殺羞反應(yīng)性聚乙二醇試劑修飾紅細(xì)胞生成素也導(dǎo)致生物活性接近完全喪失(Wojchowski，D.M.等人，說》c似肌說印Ays.910(1987)224-232)。^^^^^反應(yīng)性聚乙二醇化試劑共價修飾干擾素-a2導(dǎo)致生物活性喪失40-75%(美國專利US5,382,657)。對G-CSF的類似修飾導(dǎo)致活性喪失600/。以上(Taiiaka,H.等人，Ca"cef及es.51(1991)3710-3714)且對白細(xì)胞介素-2的類似修飾導(dǎo)致生物活性喪失90%以上(Goodson，R.J"和Katre，N.V.，51orecA/fo/ogv8(19卯)343-346)。WO94/12219和WO95/32003中請求保護(hù)包含PEG和IGF或半胱氨酸突變的IGF的聚乙二醇綴合物，所述的PEG與所述的突變蛋白在突變蛋白的N-末端區(qū)的游離半胱氨酸上連接。WO2004/60300中描述了N-末端聚乙二醇化的IGF-I。發(fā)明概述本發(fā)明包含IGF-I變體,其特征在于在野生型IGF-IM酸序列的27，37，65和/或68位M酸上具有氨基酸改變，使得37、65、68位氨基酸中的一個或多個為賴氨酸(K)且第27位氨基酸為極性氨基酸，但不是賴氨酸。優(yōu)選第27位氨基酸為精氨酸。這類IGF-I變體用作生產(chǎn)賴氨酸-聚乙二醇化IGF-I的中間體(IGF-I中間體)。令人意外地發(fā)現(xiàn)賴氨酸-聚乙二醇化IGF-I變體(^J^反應(yīng)性聚乙二醇化IGF-I變體)，優(yōu)選20kDa-100kDa的聚乙二醇化IGF-I變體且尤其優(yōu)選單聚乙二醇化IGF-I變體在治療應(yīng)用方面具有優(yōu)良特性.本發(fā)明的另一個實施方案為本發(fā)明賴氨酸-聚乙二醇化IGF-I變體和N-末端聚乙二醇化的IGF-I變體組合物。優(yōu)選摩爾比為9:1-1:9.另外優(yōu)選一種組合物，其中該摩爾比至少為l:l(每一份N-末端聚乙二醇化IGF-I變體中有至少1份賴氨酸-聚乙二醇化IGF-I變體)，優(yōu)選至少6:4(每4份N-末端聚乙二醇化IGF-I變體中有至少6份賴氨酸-聚乙二醇化IGF-I變體)。優(yōu)選賴氨酸-聚乙二醇化IGF-I變體和N-末端聚乙二醇化IGF-I變體均為單聚乙二醇化的。優(yōu)選在該組合物中，在賴氨酸-聚乙二醇化IGF-I變體和N-末端聚乙二醇化IGF-I變體中所述變體是相同的.變體優(yōu)選地選自RRKK、RRKR、RRRK、RKRR。PEG優(yōu)選具有的平均分子量為30-45kDa，尤其是30kDa或40kDa。賴氨酸-聚乙二醇化IGF-I變體和N-末端聚乙二醇化IGF-I變體在IGF結(jié)合蛋白(例如BP4和BP5)的結(jié)合方面表現(xiàn)出相差無幾的親和力，但在IGF-IR磷酸化方面表現(xiàn)出活性不同.本發(fā)明提供了由IGF-I變體(IGF-I綴合物或綴合物)和聚乙二醇基組成的綴合物，其特征在于所述的IGF-I變體在野生型IGF-IM酸序列的27、37、65和/或68位^J^酸上具有氨基酸改變，使得37、65、68位氨基酸中的一個或多為賴氨酸(K)，第27位氨基酸為極性氨基酸，但不是賴氛酸，并且所述的PEG與所述的IGF-I變體通過伯^J^，優(yōu)選通過賴氨酸的伯氨基綴合。優(yōu)選聚乙二醇基具有的總分子量至少為20kDa，更優(yōu)選約20-100kDa并且尤其優(yōu)選20-80kDa。聚乙二醇基與IGF-I變體通過賴氨酸的伯^JL在37、65、68位氨基酸中的一個或多個M酸上綴合CijL反應(yīng)性聚乙二醇化)并且任選在N-末端氨基酸上聚乙二醇化。綴合物優(yōu)選在37、65、68位氨基酸的一個或多個賴氨酸殘基上單聚乙二醇化或二聚乙二醇化并且任選在N-末端氨基酸上聚乙二醇化。進(jìn)一步優(yōu)選所述的綴合物在K65、K68或K37上單聚乙二醇化或在K65和K68上二聚乙二醇化并且任選在N-末端氨基酸上聚乙二醇化。優(yōu)選不超過20%的聚乙二醇化IGF-I變體另外在N-末端聚乙二醇化。如下命名IGF-I變體:K65意指第65位氨基酸為賴氨酸，R27意指第27位M酸為精氨酸等。帶有氨基酸R27、K37、K65、K68的IGF-I變體命名為RKKK。IGF-I野生型命名為KRKK。尤其優(yōu)選的IGF-I變體和級合物中的變體為:RRKK、RRKR、RRRK、RKRR。另外優(yōu)選本發(fā)明的(聚乙二醇化)IGF-I變體為這樣的一種變體，其中在N-末端上的至多三個(優(yōu)選所有三個)^酸被截去。相應(yīng)的野生型突變體稱作Des(l-3)-IGF-I并且缺乏來自N-末端的氨基酸殘基gly、pro和glu(Kummer，A.等人，/.Z)ifl6ew'^4(2003)45-57)。聚乙二醇基為線性或支化的。本發(fā)明進(jìn)一步包含使用IGF-I中間體制備本發(fā)明綴合物的方法。該方法包括制備包含IGF-I變體和一個或兩個聚乙二醇基的綴合物，所述的聚乙二醇基優(yōu)選具有的總分子量至少為20kDa，更優(yōu)選約20-100kDa并且尤其優(yōu)選20-80kDa，該方法通過使IGF-I中間體與活化的聚乙二醇在一定條件下反應(yīng)來進(jìn)行，所述的^Ht使得所述聚乙二醇通過化學(xué)方式與所述的IGF-I中間體經(jīng)IGF-I變體的賴氨酸伯M結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步包含藥物組合物，其包含本發(fā)明的綴合物，優(yōu)選包含本發(fā)明的綴合物與可藥用栽體。本發(fā)明進(jìn)一步包含生產(chǎn)包含本發(fā)明綴合物的藥物組合物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步包含本發(fā)明綴合物在制備用于治療AD的藥物中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步包含治療AD的方法，其特征在于向有這類治療需要的患者施用藥物有效量的氨基反應(yīng)性聚乙二醇化IGF-I變體，優(yōu)選每周施用l誦2次。發(fā)明詳述本文所用的，，聚乙二醇化IGF-I變體"或，'殺基反應(yīng)性聚乙二醇化"意指IGF-I變體與一個或兩個聚乙二醇基通過IGF-I變體分子的一個或兩個賴氨酸發(fā)生殺基反應(yīng)性偶聯(lián)而共價結(jié)合，PEG基連接在IGF-I變體分子的賴氨酸側(cè)鏈的伯e-iJ^位點上.另外可能的情況是，聚乙二醇化還發(fā)生在N-末端(X"^上.因合成方法和所用的變體，聚乙二醇化IGF-I變體可以由具有或不具有N-末端聚乙二醇化的、在K65、K68和/或K37上聚乙二醇化IGF-I變體的混合物組成，由此聚乙二醇化位點在不同分子上可以不同或在每個分子的聚乙二醇側(cè)鏈的量和/或分子的聚乙二醇化位點方面基本上為均一的.優(yōu)選IGF-I變體為單聚乙二醇化和/或二聚乙二醇化的并且尤其是從N-末端聚乙二醇化IGF-I變體純化的。本文所用的Jl^反應(yīng)性聚乙二醇化指的是通過使用反應(yīng)性(活化的)聚乙二醇，優(yōu)選使用N-羥基琥珀酰亞胺基酯類，優(yōu)選甲氡基聚乙二醇使聚乙二醇鏈與IGF-I變體的賴氨酸伯M隨機(jī)連接的方法。該偶聯(lián)反應(yīng)4吏聚乙二醇與IGF-I的賴氨酸殘基的反應(yīng)性伯e-M和任選的IGF-I的N-末端氨基酸的(X"JLS連接。PEG與蛋白質(zhì)的這類M綴合為本領(lǐng)域眾所周知的，例如，這類方法的綜述由Veronese,F.M.，Biomaterials22(2001)405-417提供。按照Veronese所述，可以通過使用對伯^J^進(jìn)行烷基化的活化的PEG進(jìn)行PEG與蛋白質(zhì)伯M的綴合.為了進(jìn)行這類JM^，可以使用活化烷基化PEG,例如PEG醛，PEG-三氟代乙烷磺酰氯或PEG環(huán)氧化物。另外有用的試劑為酰化PEG,諸如羧化PEG的羥基琥珀酰亞胺基酯類或末端羥基被氯甲酸酯類或羰基咪唑活化的PEG。另外有用的PEG試劑為具有M酸臂的PEG.這類試劑可以包含所謂的支化PEG,由此至少2個相同或不同的PEG分子通過肽間隔基(優(yōu)選賴氨酸)彼此連接，并且例如與作為賴氨酸間隔基的活化羧酸酯的IGF-I變體結(jié)合。單-N-末端偶聯(lián)還描述于Kinstler，O.等的Adv.DrugDeliv.Rev.54(2002)477485中。本文所用的"PEG或聚乙二醇"意指商購或可以按照本領(lǐng)域眾所周知的方法通過對乙二醇進(jìn)行開環(huán)聚合制備的水溶性聚合物(Kodera，Y.等人，ProgressinPolymerScience23(1998)1233-1271;Francis,G,E.等A^Int.J.Hematol.68(1998)1-18)。術(shù)語，，PEG，，廣泛用于包括任意的聚乙二醇分子，其中乙二醇單元的數(shù)量至少為460，優(yōu)選460-2300且尤其優(yōu)選460-1840(230個PEG單元折合分子量約為10kDa),PEG單元的上限值僅受級合物的溶解度限制.通常不使用大于包含2300個單元的PEG的PEG。優(yōu)選本發(fā)明中所用的PEG—端為羥基或甲HJ"(甲H基PEG,mPEG)并且在另一端上通過醚氧鍵與接頭部分共價連接。聚合物為線性或支化的。支化PEG例如描述于Veronese,F.M.等人，JournalofBioactive和CompatiblePolymers12(1997)196-207中.有用的PEG試劑例如購自NektarTherapeutics(Vww.nektar.com、,可以實際需務(wù)紜意分子量的PEG,例如，約20千道爾頓(Da)-100kDa(n為460-2300)。對以道爾頓描述的分子量而言，在PEG中重復(fù)單元的數(shù)量"n，，為近似的。例如，如果兩個PEG分子與接頭連接，其中每個PEG分子具有10kDa(n各自約為230)的相同分子量，那么接頭上PEG的總分子量約為20kDa。與接頭連接的PEG的分子量也可以不同，例如，在接頭上的兩個分子中，一個PEG分子可以為5kDa并且一個PEG分子可以為15kDa。分子量始終意指平均分子量。在下文的實施例中，描述了用于生產(chǎn)氨基反應(yīng)性聚乙二醇化IGF-I變體的某些優(yōu)選試劑。應(yīng)理解，例如基于Veronese,F.M.，Biomaterials22(2001)405417所述方法的修飾可以在操作步驟中進(jìn)行，只要該方法可以產(chǎn)生本發(fā)明的綴合物即可。在靶蛋白中存在至多三個可能的反應(yīng)性伯Jl^(至多兩個賴氨酸和一個末端氨基酸)產(chǎn)生了一系列聚乙二醇化IGF-I變體異構(gòu)體，它們在聚乙二醇鏈的連接點上不同。本發(fā)明提供了具有改進(jìn)的特性的IGF-I變體的聚乙二醇化形式。這類聚乙二醇化IGF-I變體綴合物包含與之隨機(jī)連接的線性或支化的一個或兩個PEG基，由此綴合物中所有PEG基團(tuán)的總分子量優(yōu)選約20-80kDa。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見來自這一分子量范圍的小的衍生形式是可能的，只要該聚乙二醇化IGF-I變體在降低大腦中AP肽水平方面表現(xiàn)出活性即可。此外，使用具有大于80kDa的分子量的PEG使IGF-I變體聚乙二醇化產(chǎn)生了較高的生物利用度。然而，預(yù)計這類活性隨分子量的增加而降低，這是因IGF-I受體活化和血腦屏障轉(zhuǎn)運減少所致.因此，必須將20-100kDa的PEG分子量范圍理解為用于有效治療AD患者的PEG和IGF-I變體的綴合物的最佳范圍。本文所用的"分子量"意指PEG的平均分子量。下列IGF-I變體的聚乙二醇化形式為考慮的本發(fā)明級合物的實施方案:誦單聚乙二醇化IGF-I變體，其中PEG基具有20-80kDa的分子量(460-1840個PEG單元)；陽二聚乙二醇化IGF-I變體，其中每一PEG基具有約10-50kDa的分子量(230-1150個PEG單元)；及其混合物。尤其優(yōu)選選自RRKK、RRKR、RRRK和RKRR的單聚乙二醇化IGF-I，其中支化PEG基具有3045，優(yōu)選40-45kDa的分子量(約920個PEG單元)。例如，基于PEG的44kDa的平均分子量和IGF-I的7.6kDa的分子量，這類單PEG-IGF-I的計算平均分子量約為51.6kDa。另外優(yōu)選單聚乙二醇化IGF-I，其選自RRKK、RRKR、RRRK和RKRR，其中PEG具有30或40kDa的平均分子量。本發(fā)明的"PEG或PEG基"意指包含聚乙二醇作為必需部分的殘基。這類PEG可以包含對結(jié)合反應(yīng)而言必不可少的額外化學(xué)基團(tuán)；其因分子的化學(xué)合成而產(chǎn)生；或為用于分子部分彼此之間最佳間隔的間隔基。此外，這類PEG可以由一個或多個彼此連接的PEG側(cè)鏈組成。帶有一個以上PEG鏈的PEG基稱作多臂或支化PEG。例如，可以通過將聚環(huán)氧乙烷添加到各種多元醇，包括甘油、季戊四醇和山梨醇上而制備支化PEG。例如，可以由季戊四醇和環(huán)氧乙烷制備四臂支化PEG。支化PEG通常帶有2-8個臂并且描述于例如EP-A0473084和美國專利US5,932,462中。尤其優(yōu)選帶有兩個通過賴氨酸伯氨基連接的PEG側(cè)鏈(PEG2)的PEG(Monfardini,C等人，股oconjugateChem.6(1995)62-69)。本文所用的"基本上均一的"意指產(chǎn)生、包含或使用的聚乙二醇化IGF-I變體分子僅為那些帶有一個或兩個所連接PEG基的分子。該制品可以包含少量未反應(yīng)的(即缺乏PEG基)蛋白質(zhì)，正如根據(jù)肽作圖和N-末端測序確定的，下文的一個實例揭，供了至少90%PEGJGF-I變體綴合物和至多5%未反應(yīng)蛋白質(zhì)的制品。可以通過常用的純化方法，優(yōu)選大小排阻色鐠法對聚乙二醇化IGF-I變體的這類均一制品進(jìn)行分離和純化。本文所用的"單聚乙二醇化"意指IGF-I變體為每個IGF-I變體分子僅在一個賴氨酸上聚乙二醇化，由此僅一個PEG基在該位點上共價聯(lián)機(jī).這類單聚乙二醇化IGF-I可以在一定程度上在N-末端上額外聚乙二醇化。純的單聚乙二醇化IGF-I變體(沒有N-末端聚乙二醇化)占制品的至少80%,優(yōu)選90%，并且最優(yōu)選單聚乙二醇化IGF-I變體占制品的92%或92%以上，剩余部分為例如未反應(yīng)的(未聚乙二醇化)IGF-I和/或N-末端聚乙二醇化IGF-I變體。因此，本發(fā)明的單聚乙二醇化IGF-I變體制品的均一性足以展示出均一性制品的優(yōu)點，例如，在藥物應(yīng)用中。這同樣應(yīng)用于二聚乙二醇化分子。"活化的PEG或活化的PEG試劑"為本領(lǐng)域當(dāng)前水平眾所周知的。優(yōu)選使用親電子活化的PEG,諸如聚乙二醇的烷氡基丁酸琥珀酰亞胺基酯類("低級烷氧基-PEG-SBA")或聚乙二醇的烷氧基丙酸琥珀酰亞胺基酯類("低級烷IL^-PEG-SPA")或N-羥基琥珀酰亞胺活化的PEG。可以使用使活化的酯與胺反應(yīng)而形成酰胺的任意常規(guī)方法。在活化的PEG與IGF-I的反應(yīng)中，典型的琥珀酰亞胺基酯為導(dǎo)致酰胺形成的離去基。琥珀酰亞胺基酯類在生產(chǎn)帶有蛋白質(zhì)的綴合物中的用途公開在美國專利US5，672，662中。所用的M條件對不同聚乙二醇化IGF-I變體的相對量具有影響。通過控制反應(yīng)制f(例如試劑之比、pH、溫度、蛋白質(zhì)濃度、反應(yīng)時間等)，不同聚乙二醇化分子的相對量可以改變。優(yōu)選反應(yīng)在pH8-10的包含5-15。/。(v/v)乙醇和0.5-4。/。(v/v)乙二醇的緩沖水溶液中進(jìn)行。如果產(chǎn)生單聚乙二醇化變體，則蛋白質(zhì):PEG之比優(yōu)選為1:0.5-1:2,并且如果產(chǎn)生二聚乙二醇化變體，則蛋白質(zhì):PEG之比優(yōu)選為1:2.2-1:5?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識改變反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間，由此高溫和長反應(yīng)時間導(dǎo)致聚乙二醇化增加。如果產(chǎn)生單聚乙二醇化變體，那么由此優(yōu)選在4X:下進(jìn)行至多30分鐘。當(dāng)將聚乙二醇化試劑與IGF-I變體在由50mM硼酸鈉、10%乙醇和1V。二(乙二醇)(DEG)組成pH約9.0的M緩沖液中以1:1.5的蛋白質(zhì):PEG之比混合時，并J^^應(yīng)溫度從41C開始，產(chǎn)生單聚乙二醇化分子、二聚乙二醇化分子和微量三聚乙二醇化分子的混合物。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì):PEG之比約為1:3時，主要產(chǎn)生二聚乙二醇化和寡聚乙二醇化分子。本發(fā)明的IGF-I變體^^物如下制備通過使IGF-I變體的賴氨酸伯的該中間體與活化的聚乙二醇衍生物共價反應(yīng)而形成IGF-I變體綴合物。在上述方法中，所述的雙官能試劑優(yōu)選為N-琥珀跣亞胺基-S-乙酖^P充代丙酸酯或N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰l^危代乙酸酯，并且活化的聚乙二醇衍生物優(yōu)選地選自硤-乙g-甲H^-PEG、甲IL^-PEG-乙烯基諷和甲IL^-PEG-馬來跣亞胺。尤其優(yōu)選使用分子量為40kDa的N-羥基琥珀酰亞胺基活化的支化PEG酯(mPEG2-NHS)(Monfardini，C等人，BioconjugateChem.6(1995)62-69;Veronese,F.M.等人，J.BioactiveCompatiblePolymers12(1997)197-207;美國專利US5,932,462)?？梢酝ㄟ^巰基與IGF-I變體進(jìn)行^J^反應(yīng)性共價連接("活化")并且使所得到的活化的IGF-I變體與聚乙二醇(PEG)衍生物偶聯(lián)制備IGF-I變體綴合物。第一步包含通過IGF-I變體賴氨酸NHr基共價連接的巰基。使用攜帶被保護(hù)的巰基和額外的反應(yīng)基的雙官能試劑對IGF-I變體進(jìn)行這種活化，分別諸如活性酯類(例如琥珀酰亞胺基酯)、酸酐類、磺酸酯類、羧酸和磺酸卣化物。用本領(lǐng)域公知的基團(tuán)，例如乙Sfe^保護(hù)巰基。這些雙官能試劑能夠通過形成SU^與賴氨酸的f-^J^反應(yīng)。所述雙官能試劑的制備為本領(lǐng)域公知的。雙官能NHS酯類的前體描述于DE3924705中，而對乙酰巰基化合物的衍生描述于March,J.,jrfvflwcerfOfgfliwcC^w/s化K1977)375-376中。雙官能試劑SATA為商購的(MolecularProbes,Eugene,OR，USA和Pierce,Rockford,IL)并且描述于Duncan,R丄，Anal.Biochem.132(1983)68-73中。例如，反應(yīng)在pH6.5-8.0的緩沖水溶液，例如，在10mM磷酸鉀，300mMNaCl，pH7.3中進(jìn)行?？梢詫㈦p官能試劑加入到DMSO中.在M完成后，優(yōu)選在30分鐘后，通過添加賴氨酸終止反應(yīng)，可以通過本領(lǐng)域公知的方法，例如通itit析或柱過濾分離過量的雙官能試劑?？梢酝ㄟ^例如Grasetti,D.R，.和Murray,J.F.，Arch.Biochem.Biophys.119(1967)4149中所述的光度測定法測定加入到IGF-I變體上的統(tǒng)基的平均數(shù)量。上^應(yīng)后共價偶聯(lián)活化的聚乙二醇(PEG)衍生物.活化的PEG衍生物為本領(lǐng)域公知的并且就PEG"乙烯基鞏而言描述于例如Morpurgo,M.等人，J.BioconjugateChem.7(1996)363-368中。直鏈和支化PEG分子均適合于制備式I的化合物。反應(yīng)性PEG試劑的實例為碘-乙S^-甲fU^PEG和曱IL^-PEG"乙烯基諷。這些硤活化的物質(zhì)的用途為本領(lǐng)域中公知的并且描述于例如Hermanson,G.T.，BioconjugateTechniques,AcademicPress,SanDiego(1996)pp.147-148中。本發(fā)明化合物的進(jìn)一步純化，包括單聚乙二醇化和/或二聚乙二醇化IGF-I變體的分離且優(yōu)選從N-末端聚乙二醇化形式中的分離可以通過本領(lǐng)域/^P的方法進(jìn)行，例如，柱色鐠法，優(yōu)選離子交換色鐠法，尤其是陽離子交換色鐠法。單PEG綴合物的百分比以及單PEG和二PEG分子之比可以通過混合洗脫峰周圍的較寬范的級分而減少組合物中單PEG的百分比或混合較窄的級分而增加組合物中單PEG百分比來控制。約卯％的單PEG綴合物在產(chǎn)率和活性間達(dá)良好平衡。有時，例如，至少95%或至少98%的綴合物為單PEG分子的組合物可能是理想的。在本發(fā)明的一個實施方案中，單聚乙二醇化綴合物的百分比為90%-98%。本文所用的"極性氨基酸，'意指選自半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、組氨酸(H)、天冬跣胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)的絲酸。賴氨酸也為極性絲酸，但不包括在內(nèi)，因為按照本發(fā)明賴氨酸被取代。精氨酸優(yōu)選用作極性氨基酸。藥物制劑本發(fā)明的聚乙二醇化IGF-I提供了改善的循環(huán)穩(wěn)定性，從而能夠在整個體內(nèi)在低施用間隔持續(xù)接近IGF-I受體?？梢詫⒕垡叶蓟疘GF-I變體作為混合物或作為離子交換色鐠法或大小排阻色譜法分離的不同聚乙二醇化種類施用?？梢园凑沼糜谥苽浔绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的藥物組合物的方法配制本發(fā)明的化合物。為了生產(chǎn)這類組合物，可以將本發(fā)明的聚乙二醇化IGF-I變體與可藥用載體混合，優(yōu)選通itxt含有藥物組合物所需組分的水溶液透析來進(jìn)行.例如，這類可接受的載體描述于Remington'sPharmaceuticalSciences,18thedition,1990，MackPublishingCompany,Oslo等編輯(例如1435-1712頁)中。典型組合物包含有效量的本發(fā)明物質(zhì)，例如約0.1-100mg/ml，與適量的載體?？梢酝╥t^胃外施用該組合物。優(yōu)選通過皿內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)或鼻內(nèi)施用本發(fā)明的聚乙二醇化IGF-I?？梢园凑毡绢I(lǐng)域公知的方法制備本發(fā)明的藥物制劑。通常將聚乙二醇化IGF-I變體的溶液對指定用于藥物組合物的緩沖液透析并且通過濃縮或稀釋調(diào)整所需的最終蛋白質(zhì)濃度。這類藥物組合物可以用于注射或輸注施用，優(yōu)選通過腹膜內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)或鼻內(nèi)施用，并且包含有效量的聚乙二醇化IGF-I變體與可藥用稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或栽體。這類組合物包括各種緩沖內(nèi)含物的稀釋劑(例如精氨酸、乙酸鹽、磷酸鹽)；pH和離子強度劑；添加劑，諸如去污劑和增溶劑(例如Tween80/聚山梨醇酯、pluronicF68);抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)；防腐劑(TimersoF4、芐醇)和填充物質(zhì)(例如蔗糖、甘露糖醇)；將所迷物質(zhì)摻入聚合物化合物，諸如聚乳酸、聚乙醇酸等微粒制品或摻入脂質(zhì)體。這類組合物可以影響本發(fā)明單聚乙二醇化IGF-I釋放和清除的物理狀態(tài)穩(wěn)定率。劑量和藥物濃度一般而言，在標(biāo)準(zhǔn)治療方案中，在一定時間期限內(nèi)使用0.001-3mg、優(yōu)選0.01-3mg聚乙二醇化IGF-I變體/kg/天范圍的劑量治療患者，持續(xù)1天至約30天乃至30天以上。將藥物作為單一每日皮下或靜脈內(nèi)或劇度內(nèi)快速彈丸注射或輸注包含0.1-100mg聚乙二醇化IGF-I/ml的藥物制劑施用。將這種治療方法與任意標(biāo)準(zhǔn)(例如化療)治療聯(lián)用，通過在所述的標(biāo)準(zhǔn)治療之前、治療過程中或治療之后施用聚乙二醇化IGF-I來進(jìn)行.這導(dǎo)致與單一標(biāo)準(zhǔn)治療相比效果改善。發(fā)現(xiàn)每周僅施用1或2次本發(fā)明的聚乙二醇化IGF-I可以進(jìn)行成功治療。本發(fā)明的另一個實施方案由此為治療阿爾茨海默病的方法，包括向有此需要的患者施用治療有效量的本發(fā)明聚乙二醇化IGF-I，一次劑量范圍為每kg和每3-8天、優(yōu)選每7天0.001-3mg、優(yōu)選0.01-3mg的聚乙二醇化IGF-I變體。當(dāng)使用聚乙二醇化IGF-I時，優(yōu)選地，單聚乙二醇化IGF-I優(yōu)選作為本發(fā)明賴氨酸-聚乙二醇化IGF-I變體與N-末端聚乙二醇化IGF-I變體(其中摩爾比至少為l:l)的組合物使用。本發(fā)明的另一個實施方案為本發(fā)明的聚乙二醇化IGF-I在制備治療阿爾茨海默病的藥物中的用途，所述治療為向有此需要的患者施用治療有效量的和1或2個劑量，其范圍為每kg和每6-8天、優(yōu)選每7天0.001-3mg、優(yōu)選0.01-3mg的聚乙二醇化IGF-I變體。當(dāng)使用聚乙二醇化IGF-I時，優(yōu)選地，單聚乙二醇化IGF-I優(yōu)選作為本發(fā)明賴氨酸-聚乙二醇化IGF-I變體與N-末端聚乙二醇化IGF-I變體(其中摩爾比至少為l:l)的組合物使用。提供下列實施例、參考文獻(xiàn)和附圖有助于理解本發(fā)明，其確切的范圍如后附權(quán)利要求中所述。應(yīng)理解可以在不脫離本發(fā)明精神的情況下對所述操作步驟進(jìn)行修改。序列表SEQIDNO:l為人IGF-I的絲,列(SwissProtP01343，絲酸1-70:IGF-I;M酸71-105:前肽)。附圖簡述圖1:PEG-IGF的IEC-HPLC.使用制備型強陽離子交換柱(TOSOH-BIOSEP，SP-5PW)從聚乙二醇化混合物中分離純的位置異構(gòu)體。分離5個不同的峰級分(編號0-4)并且處理以便進(jìn)一步分析。圖2:單PEG-IGF-I峰的SDS-PAGE分析.通過4-12%Tris-甘氨酸SDS-PAGE在非還原(A)和還原(B)條件下對5個純化的峰級分(編號04)進(jìn)行電泳并且使用考馬斯藍(lán)對凝膠中的蛋白質(zhì)染色.MW，分子量標(biāo)記.圖3:單聚乙二醇化IGF-I峰1，2和3的肽分析.使用Asp-N消化純化的單聚乙二醇化峰1，2和3并且通過HPLC分離肽級分。通過如所述的EdmanN-末端肽降解獲得聚乙二醇化片段的Jlt^列。A:HPLC分析在30-45分鐘保留時間時產(chǎn)生rhIGF-I肽的6個不同片段并且聚乙二醇化峰的主要片段7(和最小的片段7，)在70^保留時間時達(dá)到峰值。箭頭表示與rhIGF-I相比不同峰中肽片段的主要相對改變。B:獲自rhIGF-I的Asp-N裂解的6個片段的M列。用黑體字標(biāo)記賴氨酸(K)并且在片段3和4中出現(xiàn)。片段5例示了N-末端肽。C:Edman降解后聚乙二醇化肽片段7的肽序列。半胱氨酸和聚乙二醇化賴氨酸殘基遞送該肽序列中的片段。圖4:來自IGF-I和單聚乙二醇化異構(gòu)體的不同總體表達(dá)鐠的AD的分級蔟類分析。IGF-I和聚乙二醇化變體的孵育時間為24小時；使用小鼠細(xì)胞系NIH-3T3。數(shù)據(jù)分析*描述于文中。(A)下調(diào)的基因蔟。(B)上調(diào)的基因簇。圖5:IGF-IR通過rhIGF-I和單PEG-IGF-I的磷酸化。使人IGF-IR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞血清幼減過夜并且與增加劑量(0.01-10pg/ml)的rhIGF-I或單PEG"IGF-I異構(gòu)體(峰l、2、3、峰混合物、Des(l-3)峰3)—起孵育30*。^處理細(xì)胞以便進(jìn)行方法中所述的蛋白質(zhì)印跡或細(xì)胞中的分析，得到分別使用rhIGF-I(A)、峰1(B)、峰2(C)、峰3(D)、峰混合物(E)和Des(l-3)峰3(F)的劑量響應(yīng)曲線。將磷酸化信號對各孔中的IGF-IR水平歸一化。數(shù)據(jù)點表示來自3次獨立培養(yǎng)的6個測定值的平均值土SEM。圖6:NIH-3T3細(xì)胞中IGF-IR磷酸化的定量分析。使用單點結(jié)合動力學(xué)擬合獲自實施例7中實驗的劑量響應(yīng)曲線，以便獲得特異性結(jié)合(BMax)、半數(shù)最大結(jié)合濃度(EC鄰)和希爾系數(shù)(iiH).數(shù)據(jù)表示來自3次獨立培養(yǎng)的6個測定值的平均值士SEM。圖7:rhIGF-I體內(nèi)降低PS2APP小鼠中腦AP。用rhIGF-I(50pg/kg雌注射)將2-3月齡的雙重轉(zhuǎn)基因PS2AAP小鼠(11=10)處理2小時。制備皮質(zhì)提取物并且如方法中所述評價APP、C99、AP和對照蛋白質(zhì)(清蛋白)水平.從對清蛋白歸一化的值計算C99/APP、AP/APP和C99/AP比值并J^示為占未處理對照的o/o并X^示為平均值土SEM。A:2月齡^f提取物的代表性蛋白質(zhì)印跡。注意通過rhIGF-I處理AP水平明顯下降，而其它水平未改變。B:來自PS2APP小鼠皮質(zhì)提取物的定量分析C^，與未處理對照相比p<0.01)。圖8:rhlGF-I體內(nèi)降低PS2APP小鼠中AP的時程。用rMGF-I(50j^g/kg腹腔注射)將2月齡小鼠處理2、6或24小時。Pt^評估AP/APP和C99/AP水平并且如所述計算比例。將數(shù)據(jù)表示為占未處理對照的％并且表示示為平均值土SEM。(n=10-13)。A:注射后2、6和24小時時AP/APP比值；B:注射后2、6和24小時時C99/AP比值(**，與未處理對照相比p<0.01)。圖9:峰1-3體內(nèi)降低AAP和PS2APP小鼠中AP。在單一轉(zhuǎn)基因APP和雙重轉(zhuǎn)基因PS2APP小鼠的混合，中進(jìn)行實驗。峰1、2和3的AP/APP和C99/AP比值共同顯示了其對AP降低和清除的相對作用的直接比較(n=8-10)。A:AP/APP比值表示峰1-3對腦AP積累的作用。B:峰1-3的C99/AP比值表示AP從腦中的清除(、p<0.05;**,p<0.01;***，p<0.001，與未處理對照相比)。圖IO:峰3體內(nèi)降低AAP和PS2APP小鼠中AP的時程。用峰3(50jtig/kg^注射)將2月齡APP和PS2APP小鼠的混合^^處理2、6、24、48或72小時。隨后評估APP，C99，Ap和肌動蛋白水平并且如所述計算比例。將數(shù)據(jù)表示為占未處理對照的。/。并且表示為平均值土SEM。(n=10-15)。A:注射后6、24和48小時時AP/APP;B:注射后6、24和48小時時C99/Ap比值。，p<0.05;**，p<0.01;***，p<0.001，均與未處理對照相比)。圖11:峰1-3體內(nèi)降低PS2APP小鼠中的AP.峰1、2和3的AP/APP比值共同顯示了其對Ap降低和清除的相對作用的直接比較(11=3-13);*，與未處理對照相比p<0.05),圖12:峰3體內(nèi)降低PS2APP小鼠中AP的時程.用峰3的單一注射(50/tg/kg雌注射)將2月齡PS2APP小鼠處理2、6、24、48或72小時。隨后如所述計算AP/APP比值。將數(shù)據(jù)表示為占未處理對照的。/。并J^示為平均值土SEM(n-4-13;*，p<0.05;**,p<0.01，與未處理對照相比)。實施例材料和方法重組人胰島素樣生長因子(rhIGF-I)通過CellConcepts(Umkirch，Germany)購自PeproTech(RockyHill,NJ,USA)并且Des(l-3)-IGF-I獲自GroPep(Adelaide,Australia)。聚乙二醇(PEG)試劑來自NektarLtd.(SanCarlos,CA，USA)。用于^研究的所有其它化學(xué)品和溶劑具有可獲得的最高純度。可以根據(jù)本領(lǐng)域當(dāng)前水平通過重組方式生產(chǎn)IGF-I變體，例如通過使用位點定向誘變與優(yōu)選例如在US6,509,443或US6，403，764中所述在大腸桿菌(E.coli)中的表達(dá)方法的組合。IGF-I的聚乙二醇化產(chǎn)生在單一位點上具有聚乙二醇化的IGF-I(單PEG-IGF-I)。通過使賴氨酸f-i^&在IGF-I分子表面或N-末端上與40kDa分子量的活化支化PEG部分綴合制備單PECMGF-I。聚乙二醇化反應(yīng)混合物包含在50mM硼酸鈉緩沖液(10%乙醇和1%DEG),pH9.0中的1:1,5摩爾比的rhIGF畫I和40kDaPEG-NHS。使該反應(yīng)在4"C下進(jìn)行30分鐘?；谒肞EG部分的44kDa平均分子量和IGF-I的7.6kDa分子量，預(yù)計計算的單PEG-IGF-I的平均分子量約為51.6kDa。通過離子交換色鐠法分離PEG-IGF-I位置異構(gòu)體使用制備型強陽離子交換柱(TOSOH-BIOSEP，SP-5PW，內(nèi)徑30mm和長75mm)的純化方案制備純的單PEG-IGF-I同種型。緩沖系統(tǒng)由調(diào)整至pH4.5的7.5mM乙酸鈉、10%乙醇和1%二甘醇(緩沖液A)和調(diào)整至pH6.5的20mM磷酸鉀、10%乙醇和1。/。二甘醇(緩沖液B)組成。用25%緩沖液B將該柱預(yù)平衡.在加栽PEGJGF-I樣品后，用35%緩沖液B洗滌該柱，隨后使線性梯度上升至65%緩沖液B以便分離異構(gòu)體.為了洗脫未聚乙二醇化IGF-I,將系統(tǒng)切換至具有pIL8.0的改變的緩沖液B。流速為8ml/分鐘并且在218nm處進(jìn)行檢測。手工收集所得蛋白質(zhì)樣品并且等分儲存在-20X:下以便通過各種蛋白質(zhì)化學(xué)和生物分析法進(jìn)行分析(參見下文).使用分析型強陽離子交換柱(TOSOH-BIOSEP，SP-NPR，顆粒大小2.5pm，直徑4.6mm，長3.5cm)研究分離的位置異構(gòu)體的純度.就這種分析柱而言，我們使用了與制備型分析柱相同的流動相，但流速和運行時間下降。通過分光光度法，基于單PEG-IGF-I蛋白質(zhì)部分的280nm吸收(Elmg/ml280=0.584)測定單PEG-IGF-I異構(gòu)體的蛋白質(zhì)濃度。單PEG-IGF-I純度的分析通過4-12%Tris-甘氨酸SDS-PAGE在非還原或還原條件下分析各單PEOIGF-I異構(gòu)體。固定蛋白質(zhì)并且使用SimpleBlueSaveStain(Invitrogen，Basel,Switzerland)染色。單PEOIGF-I異構(gòu)體的質(zhì)鐠鑒定使用Asp-N裂解純化的單PEG-IGF異構(gòu)體以便鑒定N-末端、K27、K65或K68上4個可能的聚乙二醇化位點。裂解緩沖液由100mMTris/HClpH8.0與0.04pg/nlAsp陽N(RocheDiagnosticsGmbH，DE)組成，在裂解緩沖液中，將20單PEG"IGF在371C下與1將Asp-N—起孵育16小時。16小時后，通過添加TCEP(IOmM)在37"C下反應(yīng)1.5小時還原該反應(yīng)混合物。隨后通過添加1/20體積的10%TFA^A應(yīng)溶液終止以便完成裂解反應(yīng)。通過聯(lián)機(jī)HPLCESI質(zhì)傳、HPLC直接分析獲得的肽混合物或儲存在-80TC下，為了進(jìn)行ESI-LC-MS分析，在配備有PhenomenexJupiterC18反相柱(lx250mm，5|tm，300A)的Agilent1100HPLC系統(tǒng)上分離肽混合物，其中5ltil為40p!/分鐘。另外在220nm處讀取UV信號。使Q-ToFII或LCT質(zhì)^^(Micromass)與HPLC系統(tǒng)直接偶聯(lián)。在200-2000m/z質(zhì)量范圍內(nèi)以1次掃描/秒記錄ESI-ToF光鐠.評價UV和TIC光鐠并且可以在色鐠圖中對每一肽指定一個單峰，為了進(jìn)行HPLC分析，在配備有PhenomenexJupiterC18《j目柱(1x250mm,5pm，300A)的Agilent1100HPLC系統(tǒng)上分離肽混合物，其中流速為40/d/分鐘。另外在220nm處讀取UV信號。在保留時間內(nèi)PEG肽類向較高乙腈濃度移位并且手動收集它們且對其進(jìn)行N-末端Edman降解HPLC試驗糾(溶劑A:0.1%的水中的TFA;溶劑B:0.1%的乙腈中的TFA)如表1中所示表l.梯度<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在帶有procise系統(tǒng)控制軟件的AppliedBiosystemsProteinsequencerProcise492上并根據(jù)制造商的說明進(jìn)行N-末端Edman降解測序。將自HPLC收集的20pl級分直接應(yīng)用于BioBrenePlusconditionedmicroTFA濾器.在濾筒密封墊密封的氬氣環(huán)境中將濾器干燥并且導(dǎo)入蛋白質(zhì)測序儀.使用自動化標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)Χ嚯倪M(jìn)行序列降解.使用AppliedBiosystems數(shù)據(jù)評估軟件610A對來自每一降解循環(huán)的HPLC色諮圖進(jìn)行分析揭示出了每一氨基酸的位置。半胱氨酸以及修飾的氨基酸，如聚乙二醇化賴氨酸作為色譜圖中的缺口出現(xiàn)。寡核苷酸陣列轉(zhuǎn)錄分析為了對不同單PEG-IGF-I異構(gòu)體進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄鐠分析，使IGF-IR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)^清饑俄2小時并且在24小時內(nèi)無血清存在下與0.1或1pg/mlrhIGF和1pg/ml相應(yīng)單PEG-IGF-I異構(gòu)體或所獲得的未分離異構(gòu)體混合物一起孵育。隨后收集培養(yǎng)的細(xì)胞并且用RNA-BeeTM提取總細(xì)胞RNA。將每一樣品中的IOpgRNA逆轉(zhuǎn)錄、標(biāo)記并且使用商品試劑盒并按照供應(yīng)商的說明(Invitrogen，Basel,Switzerland;Ambion，Huntingdon,UK)處理。用于堿性熱片段化的方法和用于MOE430AGeneChip陣列的雜交條件為制造商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟(Affymetrix，US)。使用共焦激光掃描器記錄陣列的熒光(細(xì)胞強度)并且使用MAS5.0軟件(Affymetrix,US)分析數(shù)據(jù)。將各基因的表達(dá)水平計算為與錯配寡核苷酸雜交相比熒光強度的歸一化的平均差(表示為平均差(AD))。每次實驗均按照一式三份進(jìn)行以便解釋生物變異性。選擇下面的兩個標(biāo)準(zhǔn)用于選擇差異表達(dá)的基因:i)處理細(xì)胞的mRNA水平值必須至少高于未處理的細(xì)胞5倍或低于其5倍；ii)標(biāo)準(zhǔn)偏差必須顯著小于平均差的絕對改變并且將計算的基因的置信水平設(shè)定在大于97%(p<0.03)。IGF-IR磷酸化測定將使用人IGF-IR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的第2-4代之間的NIH-3T3細(xì)胞用于這些實驗。將細(xì)胞在未包被的24-孔或96-孔平板中培養(yǎng)并且使其生長至70%匯合。隨后將細(xì)胞血清饑俄過夜，然后與rhIGF-I或相應(yīng)的PEG-IGF-I峰(或峰混合物)一起孵育30M.然后在L狄mmli緩沖液中裂解細(xì)胞以便進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡或用4%多聚甲醛固定30分鐘以便進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)IGF-IR磷酸化分析.為了進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，通過10%Bis-TrisSDS-PAGE分離蛋白質(zhì)提取物并且印跡在硝化纖維膜上。將印跡與小鼠抗磷酸酪氨酸(4G10，1:1000;Upstate)和兔抗IGF畫IR(C誦20，1:1000;SantaCruz)—級抗體共孵育并且用抗小鼠Alexa680(l:10000;MolecularProbes)和抗兔IRDye800二級抗體(1:10000;Jackson)標(biāo)記。為了進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)分析，封閉固定的細(xì)胞并且用2%山羊血清和TritonX-100(0.1%)透化處理且與相同的初級和二級抗體一起孵育。使用Odyssey成像系統(tǒng)(LicorBiosciences)對蛋白質(zhì)帶進(jìn)行熒光檢測。從數(shù)字圖像中對蛋白質(zhì)帶的像素強度進(jìn)行定量并且使用GraphPadPrism軟件分析劑量響應(yīng)曲線。使用獲自所關(guān)注的相同區(qū)的IGF-IR值歸一化磷酸酪氨酸水平以便獲得實時IGF-IR活化改變。一式兩份進(jìn)行實驗并且重復(fù)3次以便獲得每一劑量的6個獨立研究結(jié)果。將數(shù)據(jù)表示為平均值士SEM。使用rhIGF-I和PEG-IGF-I異構(gòu)體的體內(nèi)實驗將由單一轉(zhuǎn)基因AAP和雙重轉(zhuǎn)基因PS2AAP小鼠組成的阿爾茨海默病小鼠模型(Richards,J.G.等人J.Neurosci.23(2003)8989-卯03)用于研究rhIGF-I(和單PEG-IGF-I)對大腦淀粉樣變性病的作用，近期已經(jīng)在其它小鼠和大鼠模型中證實了該大腦淀粉樣變性病(Carro，E.等人，Nat.Med.8(2002)13卯-1397)。已經(jīng)證實在2個月時PS2APP小鼠模型發(fā)生具有可測定AP水平的淀粉樣變性病并且在8月齡時斑塊沉積發(fā)作(Richards，J.G.等人，J.Neurosci.23(2003)8989-卯03)。單一轉(zhuǎn)基因APP小鼠在其幼齡時表現(xiàn)出極為相似的AP水平且因此包括在該組中。我們分析了前斑塊齡(2-3個月)以便研究rhIGF-I和PEG-IGF-I異構(gòu)體對可溶性大腦AP水平的作用。所有實驗均按照Swiss動物保護(hù)權(quán)利進(jìn)行并且將對動物的損害保持在最低水平。由在含有10%甘油的1mMHCl(rMGF-I)或PBS中的儲備溶液(單PEG-IGF-I異構(gòu)體)制備在溶劑低于1%的0.9%NaCl中的注射溶液。給對照組注射0.9%NaCI。注射在輕度異氟)^醉下皿注射進(jìn)行'在注射后不同時間點(2、6、24、48或72小時)時在異IU^寐醉下處死動物。將小鼠斷頭并且取出大腦用于分離端腦(包括海馬的皮質(zhì))。在低滲裂解緩沖液中制備皮質(zhì)蛋白質(zhì)提取物，所述的緩沖液包含4mMTrispH7.4和320mM蔗糖(均來自Fluka)與蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物(均來自Sigma)。樣品緩沖液為包含8M脲的Laemmli(Fluka)。通過4-12%Bis-TrisSDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并且印i^硝化纖維膜上。將印跡與檢測APP的小鼠抗淀粉狀前體蛋白(APP)抗體(WO-2克隆，1:5000;TheGeneticsCompany)、C99片段和AP和山羊抗肌動蛋白抗體(C-ll，1:5000;SantaCmz)—級抗體共孵育并且用抗小鼠Alexa680(l:10000;MolecularProbes)和抗山羊IRDye800二級抗體(l:10000;Jackson)標(biāo)記。使用Odyssey成像系統(tǒng)(LicorBiosciences)對蛋白質(zhì)帶進(jìn)行熒光檢測。使用GraphPadPrism軟件從數(shù)字圖像中分析對蛋白質(zhì)帶的像素強度。將數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM。將所有值對肌動蛋白(或清蛋白作為對照蛋白)歸一化并且計算具體比值(C99/APP、A^/APP、C99/AP)。C99/APP比值給出了有關(guān)P-分泌酶和y-分泌酶的活性狀態(tài)的信息，因為C99為P-分泌酶的產(chǎn)物和y-分泌酶的底物；在這一測定值中的改變可以指示著對這些不依賴于Ap晚期^的分泌酶之一的調(diào)節(jié)作用.由于在特定治療后C99/APP水平恒定，所以C99/AP比值可以監(jiān)測不依賴于其產(chǎn)生的AP的清除率，即隨清除率增加而升高并且隨其降低而降低。此外，將AP對APP歸一化，因為其產(chǎn)生依賴于在個體小鼠之間改變的轉(zhuǎn)基因APP表達(dá)。對每一個體動物進(jìn)行比值計算。將所有獲得的數(shù)據(jù)以占包括在每次實驗中的未治療的對照的％表示。將每種劑量/時間間隔使用2-5只動物的個體實驗重復(fù)2-4次。根據(jù)平均值土SEM，通過未配對t檢驗評價統(tǒng)計學(xué)差異，其中將p〈0.05視為具有統(tǒng)計學(xué)意義。實施例1單PEG-IGF-I位置異構(gòu)體的色謙分離IGF-I包含作為潛在聚乙二醇化位點的4個氨基并且預(yù)計有4種可能的單聚乙二醇化IGF-I(單PEG-IGF-I)異構(gòu)體。根據(jù)反應(yīng)^的不同預(yù)計其它的衍生物被寡聚乙二醇化，研發(fā)強陽離子高壓液相色鐠法(IEC-HPLC)用于基于其局部電荷差異分離PEG-IGF-I或Des(l-3)-IGF-I異構(gòu)體。5mgPEG-IGF-I的制備型洗脫分布圖如圖1中所示.該方法的結(jié)果可分離成5個主要的峰，3個峰具有基線分離并且2個峰具有部分分離。基線吸收降至色語圖的末端提示無在較高保留時間時洗脫的額外單聚乙二醇化IGF-I分子。因切換至具有不同pH的改進(jìn)緩沖液B而在峰3與4之間出現(xiàn)額外26的峰。用分析型IEC-HPLC估計各異構(gòu)體的純度和IEC級分中其它位置異構(gòu)體的污染。所有單聚乙二醇化峰具有的純度>99%。實施例2單PEG-IGF-I異構(gòu)體的SDS-PAGE分析在非還原和還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE以便評估不同IGF-I分子通過分子間二硫鍵的潛在的不必要的交聯(lián)。兩種條件均產(chǎn)生類似的結(jié)果，il*明無大量蛋白質(zhì)異常交聯(lián)(圖2)。SDS-PAGE分析顯示峰0具有的殺J見分子量>100kDa而主要檢測帶為在70kDa的峰1-3;另夕卜，在~70kDa處檢測到峰4，這是預(yù)計的未聚乙二醇化IGF-I的大小(圖2)。我們根據(jù)HPLC中獲得的這一運行分布圖和保留時間推斷峰0最可能由二PE(MGF-I和寡PEG-IGF-I組成。相反，將峰1-3命名為3種不同的單PEG-IGF-I異構(gòu)體。在對單PEG-IGF-I預(yù)計的分子量(51.6kDa)與70kDa的表觀大小之間存在偏差；然而，觀察到的較高^J見分子量可以解釋為因使PECMGF-I的電泳運動相當(dāng)緩慢的水結(jié)合和^l分子量增加導(dǎo)致的較大的PEG流體力學(xué)體積(Foser,S.等人，PharmacogenomicJ.3(2003)319)。IEC-HPLC和SDS-PAGE實驗共同表明，可以認(rèn)為IEC級分的純度對進(jìn)一步表征而言是足夠純的。與rhIGF-I相對比對單PEGJ)es(l-3)-IGF-I進(jìn)行聚乙二醇化和分離并且類似地產(chǎn)生3個主要的單PEG-Des(l-3)-IGF-I峰。實施例3單PEG-IGF-I異構(gòu)體的分析使用HPLC在30-45分鐘保留時間分離Asp-N裂解rhIGF-I的6個獨立肽片段(圖3A，上組)。在裂解純化的峰l-3(圖3A,下組)后，觀察6個片段的不同分布和額外片段(片段7)的出現(xiàn)，以便在~70分鐘的保留時間時洗脫。就峰1而言，特異性肽片段4隨片段7的增加而減小。就峰2而言，我們觀察到片段3明顯減小和片段5輕度減小以及主要和次要PEG片段的出現(xiàn)(7和7')。類似地，對峰3的HPLC分析產(chǎn)生了片段3和5的明顯減小同時伴隨著片段7和7'的出現(xiàn)。圖11B表示通過rhIGF-I的Asp-N裂解獲得的相應(yīng)片段的肽序列。我們使用EdmanN-末端肽降解分析了使用聚乙二醇化峰l、2和3獲得的主要片段7的肽序列。由此半胱氨酸和聚乙二醇化氨基酸遞送該肽序列中的片段。使用這種分析可以將峰1清楚M應(yīng)于在K27聚乙二醇化的rhIGF-I(圖3C)。就峰2而言，將主要片段7(>卯％)對應(yīng)于在K65聚乙二醇化的rMGF-I，因為通過Edman降解證實K68為未〈I^的賴氨酸(K)。相反，峰3的級分為在K68處的聚乙二醇化(序列中的缺口)，其中K65在Edman降解HPLC色譜圖中產(chǎn)生信號(圖3C)。無法通過Edman降解對次要峰7'測序，表明N-末端不易于反應(yīng)，最可能的是因聚乙二醇化所致。這些數(shù)據(jù)共同表明峰l由K27聚乙二醇化異構(gòu)體組成,峰2為在K65處聚乙二醇化的IGF-I且峰3為在K68聚乙二醇化且大量N-末端聚乙二醇化的IGF-I。實施例4rhIGF-I和單PEG-IGF-I異構(gòu)體的轉(zhuǎn)錄鐠分析我們使用DNA微陣列測定了使用rMGF-I或PEGJGF-I異構(gòu)體處理用人IGF-IR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞24小時的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，因此，我們使用0.1和1pg/ml的IGF-I或1]Kg/ml的單PEGJGF-I峰或獲自聚乙二醇化反應(yīng)的峰混合物刺激細(xì)胞.我們使用商品芯片類型(MOE430A;AffymetrixInc.)比較了使用對照培養(yǎng)物刺激的細(xì)胞的總體轉(zhuǎn)錄活性，該芯片包含用于約14,000種小鼠基因，包括所有已知IGF-I應(yīng)答基因的探針組。將mRNA豐度表示為正確匹配的寡核苷酸探針與在中心位置上具有錯配的相應(yīng)探針之間的平均差(AD)。我們僅考慮在三個同樣生物樣品中具有改變大于5倍并97。/。再現(xiàn)性的基因(p值<0.03),該分析產(chǎn)生了總計162個基因，86個被所有IGF-I變體上調(diào)且76個被所有IGF-I變體下調(diào)。不同單PEG-IGF-I異構(gòu)體的轉(zhuǎn)錄活性的一般相關(guān)概況解釋為圖4中上調(diào)和下調(diào)基因的分級蔟的形式。檢查0.1ng/ml和1.0^g/mlIGF-I對各基因的豫導(dǎo)水平顯示所選擇的簇極為類似。峰3在相同濃度下產(chǎn)生了與未聚乙二醇化IGF-I類似的表達(dá)鐠并且比PEG-IGF混合物和其它峰更有效。有意義的是，峰2引起了與PEG-IGF混合物類似的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。與生物活性一致，峰1表現(xiàn)出了最弱的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，i^明聚乙二醇化干擾了受體相互作用。實施例5和6rhIGF-I和單PEG-IGF-I導(dǎo)致的體外IGF-IR磷酸化為了對IGF-IR活化進(jìn)行體外分析，使用穩(wěn)定表達(dá)人IGF-IR的NIH-3T3細(xì)胞。在血清饑俄過夜后，使用增加劑量的rhIGF-I或相應(yīng)PEG-IGF-I異構(gòu)體(0.003-10pg/ml)處理細(xì)胞。按照上述進(jìn)行磷酸化IGF-IR的蛋白質(zhì)印跡分析并且使獲得的劑量響應(yīng)曲線用單點結(jié)合動力學(xué)擬合，包括希爾系數(shù)(nH);結(jié)合曲線的定量數(shù)據(jù)如圖6中的表中所示。從rhIGF-I的劑量響應(yīng)曲線(圖5A)得到EC鄰為6.3nM并且?guī)缀跻匀驘o方式出現(xiàn)，其中nH為2.27(圖6)。相反，單PEG-IGF-I的峰1表現(xiàn)出不飽和的明顯劑量響應(yīng)，nH為0,34且估計的EC5o為91.5nM(圖5B，6).峰2和3(圖5C和5D)表現(xiàn)出類似的結(jié)合親和力，其中EQo值分別為13.4和21.5nM(圖6)。在兩種情況中，nH是有^^性的，分別為1.27和1.19.峰混合物表現(xiàn)出類似的IGF-IR活化模式，其中親和力輕度降低，EC鄰為28.8nM且規(guī)律性的nH為1.28(圖5E，7)。最后，PEG-Des(l-3)-IGF-I峰3具有所有PEG異構(gòu)體中最高的親和力，其中EC鄰為10.8nMJJM^性的nH為1.08(圖5F，7)。該數(shù)據(jù)表明，給峰1外的所有峰均可特異性活化人IGF-IR，其與rhIGF-I相比親和力喪失2-5倍。實施例7rhIGF-I對2月齡PS2APP小鼠的體內(nèi)AP降低將雙重轉(zhuǎn)基因PS2APP小鼠用于分析rhIGF-I對大腦AP積累的短期作用。我們使用50/ig/kgrhIGF-I腹腔注射處理這些小鼠并且在注射后2小時分析了皮質(zhì)AP。圖7A表示來自2月齡小鼠的大腦提取物的蛋白質(zhì)印跡。而APP、C99和對照蛋白(清蛋白)水平顯示未因rhIGF-I而改變，在rhIGF-I注射后2小時AP水平下降。進(jìn)行定量分析并且計算相應(yīng)的^象素強度比以便獲得有關(guān)rhIGF-I對AP產(chǎn)生的潛在作用的信息。這種分析揭示出APP/對照蛋白(對照的97.5±5.7%)和C99/APP(對照的87.2±9.8%)比值未改變，表明在使用rhIGF-I處理后2小時轉(zhuǎn)基因APP表達(dá)和APP加工均未改變(圖7B)。相反，AP/APP顯著降至對照的68.4±7.1%(p<0.01)并且C99/AP增加至對照的157.9±16.6%(pO.Ol)，表明rhIGF-I降低了AP。這些數(shù)據(jù)共同表明，用rhIGF-I處理幼小PS2APP小鼠2小時主要增加了AP從大腦中的清除率。實施例8rhIGF-I對PS2APP小鼠的體內(nèi)AP降低的時程為了評價這種rhIGF-I對可溶性大腦AP的短期作用的時程，通it^腔注射50pg/kgrhIGF-I處理無大腦斑塊的幼小的PS2APP小鼠(2月齡)并Jjt此后2、6或24小時檢測^LtAPP、C99、AP和肌動蛋白水平.APP/清蛋白和C99/APP比值在任意研究的時間點處均未因rMGF-I而顯著改變。在注射后2小時觀察到了rhIGF-I對AP/APP的降低，而在6和24小時后這種作用不存在(圖8A)。類似地，僅在2小時時可檢測到通過C99/AP比值監(jiān)測的AP減少的增加，并且在6和24小時時消失(圖8B)。這表明rhIGF-I對Ap清除率的作用可能因在血流中分離的IGF-I的半衰期短而具有短的持續(xù)時間.實施例9峰1-3在2月齡APP和PS2APP小鼠的體內(nèi)AP清除效率中的對比分析在本實施例中，共同顯示了PEG-IGF-I峰1-3的數(shù)據(jù)以便對AP降低和AP清除的效率進(jìn)行直接比較。與rhIGF-I類似，APP/肌動蛋白(本文將肌動蛋白用作對照蛋白)或C99/APP比值未因任何濃度的峰1、2或3而改變。峰3在腹腔注射后6小時時在降低AP/APP方面具有最高的效率(圖9A)。相反，峰1在整個測試濃度范圍內(nèi)均無活性并且峰2僅在所用的最高濃度(500pg/kg)下對降低Ap/APP發(fā)揮了顯著作用。類似地，正如圖9B中所示，峰3僅在低劑量(15-50pg/kg)下為在增加C99/AP比值(作為增加的Ap清除率的代表)方面具有活性的化合物。此外，在該評價中，峰1無活性并且峰2M500^g/kg下發(fā)揮出顯著作用。這些數(shù)據(jù)共同表明，在該體內(nèi)實驗范例中峰3為最具有活性的單PEG-IGF-I異構(gòu)體。圖11表示了僅雙重轉(zhuǎn)基因PS2APP小鼠模型中的結(jié)果。實施例10峰3對PS2APP小鼠的體內(nèi)AP降低的時程在腹腔注射后6小時，50pg/kg的峰3在降低大腦AP水平方面發(fā)揮顯著作用.為了測試這種作用維持多長時間，我們分析了來自用50Mg/kg峰3處理2、6、24、48和72小時的PS2APP小鼠的大腦提取物。在整個時間期限內(nèi)均未觀察到APP/肌動蛋白或C99/APP比值的顯著改變。相反，在腹腔注射后6、24和48小時時AP/APP水平顯著下降(分別為p<0.05、p<0.001和p<0.01),表明峰3在至少48小時內(nèi)具有降低AP的作用(圖IOA)。代表AP清除率不依賴于AP產(chǎn)生的C99/AP比值(因為C99/APP保持恒定)以極為類似的時程顯著增加，在注射后至少24小時內(nèi)得以充分維持(圖IOB)。這些數(shù)據(jù)共同表明峰3能夠降低PS2APP的大腦AP。圖12表示僅雙重轉(zhuǎn)基因PS2APP小鼠模型中的結(jié)果.實施例11與IGF結(jié)合蛋白IGFBP4(BP4)和IGFBP5(BP5)的結(jié)合由Shimasaki，S"Mol.Endocrinol.4(1990)1451-1458鑒定并且克隆了IGFBP4(SwissProt22692)。由Kiefer,M.C.，Biochem.Biophys.Res.Commun.176(1991)219-225鑒定并且克隆了IGFBP5(SwissProt24593)。兩種結(jié)合蛋白均以重組方式在大腸桿菌中產(chǎn)生。為了對蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行表面等離振子共振(SPR)分析，使用Biacore3000儀器。試驗和反應(yīng)緩沖液為在25*€下的HBS-P(IOmMHEPES，150mMNaCl，0.005%聚表面活性劑，ph7.4)。在12匸下預(yù)冷卻所有樣品。在5^g/ml濃度下使IGFBP4和IGFBP5進(jìn)朽胺偶聯(lián)。在CM5芯片上的偶聯(lián)產(chǎn)生700RUs的負(fù)荷信號。以1.23nM-lOOnM間的5個濃度注射聚乙二醇化IGF-I樣品(分析物)5分鐘(結(jié)合期)并且以50/d/分鐘的力ti4用HBS-P洗滌5分鐘。通過一次注射100mMHC11分鐘再生芯片表面。芯片、分析方式和注射的序列對應(yīng)于表2中的描述。通過使用1:1Langmuir結(jié)合模型進(jìn)行數(shù)據(jù)評價。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>縮寫40kDa:40kDa支化PEG40kDa/NT-RRRK:使用40kDaPEG在N-末端聚乙二醇化的RRRK40kDa/RRRK:使用40kDaPEG在K68賴氨酸聚乙二醇化的RRRK組合物:40kDa/NT-RRRK和40kDa/RRRK的組合物(l:l)這些結(jié)果表明所有聚乙二醇化IGF樣品在類似范圍內(nèi)有效結(jié)合IGFBP4和IGFBP5。所有聚乙二醇化樣品與未聚乙二醇化IGF相比均表現(xiàn)出顯著下降的結(jié)合率常數(shù)。從樣品曲線中扣除陰性對照數(shù)據(jù)(例如緩沖液曲線)以便校準(zhǔn)系統(tǒng)內(nèi)在基線漂移和信躁下降。實施例12配體導(dǎo)致的IGF-IR自磷酸化為了測定本發(fā)明多肽活化IGF-IR并且誘導(dǎo)IGF-IR磷酸化的能力，用本發(fā)明的多肽刺激過表達(dá)IGF-IR的細(xì)胞且隨后通過ELISA分析IGF-IR磷酸化狀態(tài)。為了進(jìn)行ELISA，用100pi抗人IGF-IRoc(0.5mg/ml)的單克隆抗體(在含有3%BSA的PBST中以1:350稀釋)包被96-孔鏈霉抗生物素包被的聚苯乙烯平板(Nunc)。于室溫下在平板振蕩器上孵育1小時后，除去包被溶液并且用200;dPBST/孔將平板洗滌三次。將IGF-IR轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞在補充了2mML-谷氨Sb^(Gibco，目錄號25030-024)和0.5%熱滅活FCS(PAA，目錄號A15-771)的高葡萄糖MEMDulbecco培養(yǎng)基(DMEM)(PAA，目錄號E15-009)中鋪板。為了測定ECso值，在371C和5。/0C02糾下將使用1.3乂104個細(xì)勿孑1#種的96孔平板培養(yǎng)2天'在使用^^清培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時后，謹(jǐn)慎除去培養(yǎng)基并且換成用50相應(yīng)培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的本發(fā)明多肽。在37匸和5%C02條件下孵育10分鐘后,通過抽吸謹(jǐn)慎除去培養(yǎng)基并且每孔添加120pl冷裂解緩沖液(50mMTrispH7.5，1mMEDTA，1mMEGTA,20%甘油，1%Triton畫X100，lOOmMNaF,1mMNaV04，Complete窗蛋白酶抑制劑)。將平板與裂解緩沖液于41C下在平板振蕩器上孵育15分鐘并且此后將100^的孔內(nèi)含物轉(zhuǎn)入用抗人IGF-IRa的單克隆抗體包被的ELISA平板上.于室溫下在平板振蕩器上將裂解物孵育1小時以使IGF-IR結(jié)^#獲抗體并且在此后謹(jǐn)慎抽吸。通過用每次200/dPBST/孔洗滌三次除去未結(jié)合的物質(zhì)。為了檢測結(jié)合的磷酸化IGF-IR，將100pl抗人IGF-IRa的多克隆IgG兔抗體(在3%BSA/PBST中以1:12650稀釋)加入到各孔中，隨后于室溫下在平板振蕩器上再孵育1小時。再次謹(jǐn)慎除去孔內(nèi)含物并且用200/dPBST/孔將各孔洗滌三次。為了檢測多克隆的兔抗體，將100jdHRP(CellSignalingTechnologyInc.USA)偶聯(lián)的抗兔IgG多克隆抗體(在3%BSA/PBST中以1:6000稀釋)加入到各孔中。于室溫下在振蕩器上孵育1小時后，通過用200PBST/孔將平板洗滌6次除去未結(jié)合的檢測抗體。作為用于抗體偶聯(lián)的HRP的底物，將100pi的3，3，-5，5，-四甲J^:苯胺加入到各孔中，隨后于室溫下在平板振蕩器上再孵育0.5小時。在用25^1/孔1MH2S04^L終止后通過測定在450nm波長處的吸收進(jìn)行定量。以10nMIGF-I作為100。/。(max)并且無IGF-I作為0。/。(min)對照，通過下列公式將獲得的樣品OD450值轉(zhuǎn)化成活化百分比:活化百分比-(樣品-min)/(max-min)。將所得到的EC鄰(在IGF-1R半數(shù)最大活化下的多肽濃度)值概括在表3中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>縮寫參見實施例11。參考文獻(xiàn)Bush，A.I.，andTanzi,R.E.，Proc,Natl,Acad.Sci.USA99(2002)7317-7319Carro,E.，etal"Nat.Med.8(2002)1390-1397Chamow，S.M.,etal.，BioconjugateChem.5(1994)133-140Clark,R.,etal.，J.Biol.Chem.271(1996)21969-21977Cunningham,B.C.,etal.，Science254(1991)821-825dePagter-Holthuizen,P.,etal.,FEBSLett.195(1986)179-184;DE3924705Delgado,C.,etal,,Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.9(1992)249-304Dore,S.,etal"Ann.NYAcad.Sci.890(1999)356-364Dore,S.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94(1997)4772-4777Duncan,RJ"Anal.Biochem.132(1983)68-73EP0123228EP0128733EP0597033EP-A0400472EP畫A0473084Foser,S.，etal.，PharmacogenomicJ.3(2003)319Francis,G.E.,etal.,Int.J.Hematol.68(1998)1-18Francis,P.T.,etal"J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry66(1999)137-147Goodson,R.J.,andKatre,N.V.,BioTechnology8(1990)343-346Grasetti,D.R,.andMurray,J.F.，Arch.Biochem.Biophys.119(1967)41-49Hardy,J.,andSelkoe,DJ.,Science297(2002)353-356Hermanson,G.T.，BioconjugateTechniques,AcademicPress,SanDiego(1996)pp.147-148Hershfield,M.S.,etal.，N,Engl.J.Med.316(1987)589-596Inoue,H.，etal.,J.Lab.Clin.Med.124(1994)529-536Kanje,M.，etal.，BrainRes.486(1989)396-398Katre，AdvancedDrugDeliverySystems10(1993)91Katre,N.V"etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(1987)1487-1491Katre,N.V.，J.Immunol.144(1990)209-213Kiefer,M.C,Biochem.Biophys,Res.Commun.176(1991)219-225Kinstler,O.，etal"Adv.DrugDeliv.Rev.54(2002)477-485Knusel,B.，etal"J.Neurosd.10(1990)558-570Kodera,Y.,etal"ProgressinPolymerScience23(1998)1233-1271Kummer，A.,etal.,Int.J.Exp.DiabesityRes.4(2003)45-57leBouc，Y.,etal,,FEBSLett.196(1986)108-112;March,J.，AdvancedOrganicChemistry(1977)375-376McMorris,F.A.，andDubois-Dalcq,M.，J，Neurosci.Res.21(1988)199-209McMorris,F.A.，etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83(1986)822-826Merritt,ATextbookofNeurology,6thedition,Lea&Febiger，Philadelphia,pp.484-489,1979Meyers,F.J.,etal.，Clin.Pharmacol.Ther.49(1991)307-313Monfardini,C.,etal.,BioconjugateChem.6(1995)62-69Morpurgo,M.,etal.，J.BioconjugateChem.7(1996)363-368Mozell,R丄.，andMcMorris,F.A.,J.Neurosci.Res.30(1991)382-390Niikura，T.，etal.，J.Ne咖sci，21(2001)1902-1910Remington'sPharmaceuticalSciences,18thedition,1990,MackPublishingCompany,editedbyOsloetal.(e.g.pp.1435-1712Richards,J.G,，etal.，J.Neurosci.23(2003)8989-9003SandbergNordqvist,A.C.,etal.,BrainRes.Mol.BrainRes.12(1992)275-277Satake-Ishikawa,R.,etal.,CellStruct.Funct.17(1992)157-160Selkoe,D.J.,Physiol.Rev.81(2001)741-766Shimasaki,S.,Mol.Endocrinol.4(1990)1451-1458Steenbergh,P，H.，etal.，Biochem.Biophys.Res.Commun.175(1991)507-514;Svrzic，D.，andSchubert,D.,Biochem.Biophys.Res.Commun.172(1990)54-60Tanaka，H.，etal.，CancerRes.51(1991)3710-3714Tanner,J.M.,etal"ActaEndocrinol.(Copenh.)84(1977)681-696Tsutsumi,Y.,etal"Jpn.J.CancerRes.85(1994)9-12US5,093,317US5,672,662US5,714,460US5,861,373US5,932,462US6,403,764US6,509,443Uthne，K.，etal"J.Clin.Endocrinol.Metab.39(1974)548-554Veronese,F.M.,Biomaterials22(2001)405-417Veronese,F.M.,etal.，Journa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