細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A及其編碼多核苷酸的制作方法

專利名稱：細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A及其編碼多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞凋亡(apoptosis)-特異性真核起始因子("eIF -5A")或稱作"細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A"或"elF-5Al"。
背景技術(shù)：
細(xì)胞凋亡是遺傳程序性的細(xì)胞事件，其特征在于明確的形態(tài)學(xué)特 征，例如細(xì)胞收縮、染色質(zhì)凝聚、核碎裂和膜起泡。Kerr等(1972) Br. J. Cancer, 26， 239-257; Wyllie等(1980) Int. Rev. Cytol" 68， 251 -306。它在正常的組織發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用，且認(rèn)為細(xì)胞 凋亡程序中的缺陷導(dǎo)致許多人類障礙，從神經(jīng)變性病和自身免疫病到 贅生物。Thompson (1995) Science, 267， 1456- 1462; Mullauer等 (2001) Mutat. Res， 488， 211 - 231。盡管充分地表征了細(xì)胞凋亡的細(xì)胞 的形態(tài)學(xué)特征，但對(duì)調(diào)節(jié)該過程的分子途徑的闡明還僅僅處于開始階 段。
認(rèn)為在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用的一組蛋白是稱為天冬氨酸特異 性半胱氨酸蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶家族，似乎大多數(shù)細(xì)胞凋亡途徑
都需要它。Oeagh & Martin (2001) Biochem. Soc. Trans, 29， 696-701; Dales等(2001) Leuk. Lymphoma, 41， 247 - 253。天冬氨酸特異性 半胱氨酸蛋白酶通過剪切各種細(xì)胞蛋白來觸發(fā)細(xì)胞凋亡，以響應(yīng)細(xì)胞 凋亡刺激，這導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的典型表現(xiàn)，包括細(xì)胞收縮、膜起泡和 DNA斷裂。Chang & Yang (2000) Microbiol. Mol. Biol. Rev.， 64， 821 -846。
促細(xì)胞凋亡(pro — apoptotic )蛋白，例如Bax或Bak，也通過 釋放能活化天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的分子在細(xì)胞凋亡途徑 中起關(guān)鍵作用，所述的分子例如線粒體細(xì)胞色素c，由此通過細(xì)胞凋 亡促進(jìn)細(xì)胞死亡。Martinou & Green (2001) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol" 2， 63 —67; Zou等(1997) Cell, 90， 405-413。抗細(xì)胞凋亡蛋白，例如 Bel-2，通過拮抗促細(xì)胞凋亡蛋白Bax和Bak的活性來促進(jìn)細(xì)胞的 存活。Tsujimoto (1998) Genes Cells, 3， 697 - 707 Kroemer (1997) Nature Med" 3， 614-620。認(rèn)為Bax:BcI - 2的比率是決定細(xì)胞命運(yùn) 的一種途徑；過量的Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而過量的Bcl-2促進(jìn)細(xì)胞 存活。Salomons等(1997) Int. J. Cancer， 71， 959- 965; Wallace-Brodeur & Lowe (1999) Cell Mol. Life Sci" 55， 64-75。
參與細(xì)胞凋亡的另一種關(guān)鍵蛋白是腫瘤抑制基因p53編碼的蛋 白。該蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)受損的和遺傳不穩(wěn)定的細(xì)胞中的細(xì) 胞凋亡的轉(zhuǎn)錄因子，可能是通過Bax的上調(diào)。Bold等(1997) Surgical Oncology, 6， 133 - 142; Ro腦等，1996; Schuler & Green (2001) Biochem. Soc. Trans" 29， 684 - 688; Ryan等(2001) Curr. Opin. Cell Biol" 13， 332 - 337j Z6rnig等(2001) Biochem, Biophys. Acta, 1551， Fl -F37。
認(rèn)為細(xì)胞凋亡途徑的改變?cè)谠S多疾病過程中起關(guān)鍵作用，包括癌 癥。Wyllie等,(1980) Int. Rev. Cytol. ， 68， 251 -306 ; Thompson (1995) Science, 267， 1456 - 1462 ; Sen & D， Incalci (1992) FEBS Letters, 307， 122 - 127，. McDonnell等，(1995) Seminars in Cancer and Biology, 6， 53 - 60。對(duì)癌癥發(fā)展和進(jìn)展的研究，已經(jīng)傳統(tǒng)地集中 在細(xì)胞增殖上。但是，近來已經(jīng)明白了細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生中的重要 作用。實(shí)際上，已經(jīng)使用腫瘤模型研究了許多現(xiàn)在關(guān)于細(xì)胞凋亡所已
知的內(nèi)容，因?yàn)榭偰芤阅承┓绞礁淖儗?duì)腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡的控
制。Bold等，(1997) Surgical Oncology, 6， 133 - 142.
細(xì)胞因子也已經(jīng)涉入細(xì)胞凋亡途徑。生物學(xué)系統(tǒng)需要細(xì)胞相互作 用，以實(shí)現(xiàn)它們的調(diào)節(jié)，而細(xì)胞之間的相互影響通常包含大量的細(xì)胞 因子。細(xì)胞因子是許多種類的刺激引起的許多不同細(xì)胞類型產(chǎn)生的介 質(zhì)。細(xì)胞因子是多效性的分子，其可以對(duì)許多不同的細(xì)胞類型產(chǎn)生許 多不同的作用，但是在免疫反應(yīng)和造血細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)中是特 別重要的。根據(jù)具體的細(xì)胞因子、相對(duì)濃度和其它介質(zhì)的存在，細(xì)胞 因子對(duì)耙細(xì)胞的作用可以促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖、活化、分化或細(xì)胞凋 亡。
抗- 細(xì)胞因子在治療自身免疫性疾病(例如牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎和Crohn氏病)方面的用途日益普及。促炎細(xì)胞因子IL - 1和 tnf在這些慢性病的病理學(xué)中起很大的作用。減少這2種細(xì)胞因子 的生物學(xué)活性的抗-細(xì)胞因子治療可以提供治療益處(Dinarello和 Abraham, 2002)o
白細(xì)胞介素1 (IL-I)是一類重要的細(xì)胞因子，其介導(dǎo)局部的和全 身的炎癥反應(yīng)，且可以與tnf在許多障礙(包括血管炎、骨質(zhì)疏松 癥、神經(jīng)變性障礙、糖尿病、狼瘡腎炎和自身免疫性疾病例如類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎)的發(fā)病機(jī)理中協(xié)同作用。近來，還通過注射黑素瘤細(xì)胞時(shí) IL-1P敲除的小鼠對(duì)轉(zhuǎn)移和血管發(fā)生的抗性，證實(shí)了 IL-1P在腫 瘤血管發(fā)生和侵入力中的重要性(Voronov等，!2003)。
白細(xì)胞介素18(IL - 18)是最近發(fā)現(xiàn)的IL- 1家族的成員，且在結(jié) 構(gòu)、受體和功能上與IL-l有關(guān)。作為它誘導(dǎo)干擾素-y(IFN- y)、 tnf- cx和IL-1的能力的結(jié)果，IL-18是參與炎癥和自身免疫性 疾病的中心細(xì)胞因子。IL-1P和IL-18都能誘導(dǎo)tnf- ot的生產(chǎn)， 已知tnf- a是在心肌缺血過程中造成心功能障礙的細(xì)胞因子 (Maekawa等，2002)。發(fā)現(xiàn)通過用IL - 18結(jié)合蛋白的中和來抑制IL -18，減少了缺血-誘導(dǎo)的上部融合(suprafused)的人心房心肌的 缺血/再灌注模型的心肌功能障礙(Dinarello， 2001)。使用小鼠IL - 18 結(jié)合蛋白來中和il-18，也能降低ifn- y、 tnf- oc和il - 1 ^轉(zhuǎn) 錄物水平，并能減少膠原-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型的關(guān)節(jié)損傷(Banda 等，2003)。 IL-18生產(chǎn)或可用性的減少，也可以證實(shí)對(duì)控制轉(zhuǎn)移性
癌癥的益處，因?yàn)榻o小鼠黑素瘤模型注射IL-18結(jié)合蛋白成功地抑 制了轉(zhuǎn)移(Carrascal等，2003)。作為對(duì)它作為促炎細(xì)胞因子的重要 性的進(jìn)一步指示，IL- l8的血漿水平在患有慢性肝病的患者中升高， 且升高的水平與該病的嚴(yán)重性相關(guān)聯(lián)(Ludwiczek等，2002)。類似 地，在有腎病的糖尿病患者的血清中的IL-18和TNF- cc有所升高 (Moriwaki等，2003)。外傷性腦損傷后的神經(jīng)炎癥也由促炎細(xì)胞因子 介導(dǎo)，且在腦外傷后的小鼠中，IL-18結(jié)合蛋白對(duì)IL-18的抑制改 善了神經(jīng)恢復(fù)(Yatsiv等，2002)。
TNF- ct是TNF家族細(xì)胞因子的成員，它是一種具有多效性作 用的促炎細(xì)胞因子，包括對(duì)造血細(xì)胞的輔助促有絲分裂(co-mitogenic)作用、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)許多細(xì)胞類型的細(xì)胞死亡。 TNF- a—般由細(xì)菌脂多糖、寄生物、病毒、惡性肺瘤細(xì)胞和細(xì)胞因 子誘導(dǎo)，且通常有益地發(fā)揮作用，以保護(hù)細(xì)胞免受感染和癌癥。但是， TNF- oc的不適當(dāng)誘導(dǎo)是由急性和慢性炎癥(例如自身免疫性疾病) 產(chǎn)生的障礙的主要病因，且也可以導(dǎo)致癌癥、AIDS、心臟病和膿毒 癥(綜述見Aggarwal和Natarajan， 1996，. Sharma和Anker， 2002)。疾 病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型(即膿毒性休克和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)以及人障礙(即 炎性腸疾病和急性移植物抗宿主病)已經(jīng)證實(shí)了阻斷TNF- a的有益 作用(Wallach等，l"9)。 TNF - a的抑制還已經(jīng)有效地用于緩解患 有自身免疫性疾病例如Crohn氏病(van Deventer， 1999)和類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎(Richard - Miceli和Dougados， 2001)的患者。還認(rèn)為TNF -oc促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)的能力在慢性B型淋巴細(xì)胞性白血 病(B-CLL)的發(fā)病機(jī)理中起作用，且在B-CLL中的T細(xì)胞表達(dá)的 TNF- cx的水平與肺瘤塊和疾病階段正相關(guān)(Bojarska - Junak等， 2002)。白細(xì)胞介素-lp(IL-ip)是已知誘導(dǎo)TNF- oc生產(chǎn)的細(xì)胞 因子。
因而，由于過量的細(xì)胞因子和TNF - ct的積累可以導(dǎo)致對(duì)身體的 有害后果，包括細(xì)胞死亡，所以需要減少體內(nèi)的細(xì)胞因子的水平以及 抑制或減少細(xì)胞凋亡的方法。本發(fā)明滿足了這些需要。
已知脫氧8 -羥-2,7,10 -三氨基癸酸合酶(DHS)和含有8 -羥-2，7，10 -三氨基癸酸的真核翻譯起始因子-5A (eIF - 5A)在許多細(xì)胞 進(jìn)程中起重要作用，包括細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。8 -羥-2，7，10 -三氨基癸
酸是一種獨(dú)特的氨基酸，在所有檢查的真核生物和古細(xì)菌中都有發(fā)
現(xiàn)，但是在真細(xì)菌中未發(fā)現(xiàn)，且eIF-5A是唯一已知的含有8-羥-2，7，10 -三氨基癸酸的蛋白。Park (1988) J. Biol. Chem.， 263， 7447 -7449; Schtimann & Klink (1989) System. Appl. Microbiol" 11， 103 -107; Bartig等(1990) System. Appl. Microbiol" 13， 112 - 116，. Gordon 等(1987a) J. Biol. Chem.， 262， 16585 - 16589。有活性的elF - 5A是在 2個(gè)翻譯后步驟中形成的第一步是，通過脫氧8-羥-2，7，10-三氨 基癸酸合酶的催化，將亞精胺的4-氨基丁基部分轉(zhuǎn)移到前體eIF-5A的特定賴氨酸的ct -氨基上，形成脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸 酸殘基；第二步包括，脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸羥化酶對(duì)該4
一氨基丁基部分進(jìn)行羥基化，以形成8 -羥-2，7，10 —三氨基癸酸。
eIF — 5A的氨基酸序列在物種之間是非常保守的，且在eIF - 5A 的8 -羥-2，7，10 -三氨基癸酸殘基周圍的氨基酸序列存在嚴(yán)格的保 守，這暗示該修飾對(duì)于存活是重要的。Park等(1993) Biofactors， 4， 95
-104。該假設(shè)進(jìn)一步得到了下述觀察的支持，即迄今為止在酵母中 發(fā)現(xiàn)的elF-5A的兩種同工型的失活或DHS基因的失活均阻斷細(xì)胞 分裂，其中所述DHS基因催化它們的活化中的第一步。Schnier等 (1991) Mol. Cell. Biol" 11， 3105-3114; Sasaki等(1996) FEBS Le仏， 384， 151 一 154; Park等(1998) J. Biol. Chem" 273， 1677 - 1683。但是， 酵母中elF - 5A蛋白的消耗僅僅導(dǎo)致總蛋白合成的微小降低，這暗示 elF-5A可能是翻譯mRNA的特定亞型所需要的，而不是蛋白總合 成所需要的。Kang等(1993)， "Effect of initiation factor elF - 5A depletion on cell proliferation and protein synthesis, " in Tuite， M. (編)，Protein Synthesis and Targeting in Yeast， NATO Series H。近來 發(fā)現(xiàn)結(jié)合eIF-5A的配體共有高度保守的基序，這也支持了 elF-5A 的重要性。Xu & Chen (2001) J. Biol. Chem.， 276,2555 - 2561 。另夕卜， 發(fā)現(xiàn)修飾的elF - 5A的8 -羥-2，7，10 —三氨基癸酸殘基對(duì)于與RNA 的序列特異性的結(jié)合是重要的，且結(jié)合沒有提供防止核糖核酸酶作用 的保護(hù)。
另外，elF-5A的胞內(nèi)消耗導(dǎo)致特定的mRNA在核中明顯積累， 從而表明elF-5A可能負(fù)責(zé)將特定種類的mRNA從核中穿梭運(yùn)送到 細(xì)胞質(zhì)中。Liu & Tartakoff (1997) Supplement to Molecular Biology
of the Cell, 8， 426a. Abstract No. 2476， 37tn American Society for Cell Biology Annual Meeting. eIF - 5A在與核孔有關(guān)的核內(nèi)絲處積累和它 與一般的核輸出受體的相互作用進(jìn)一步暗示，elF-5A是核質(zhì)穿梭蛋 白，而不是多核糖體的組分。Rosorius等(1999) J. Cell Science, 112， 2369 - 2380。
Smit-McBride等在1989年從人克隆出了 elF - 5A的第一個(gè) cDNA，且此后，已經(jīng)從各種真核生物克隆出了 eIF-5A的cDNA或 基因，包括酵母、大鼠、雞胚胎、苜蓿和番茄。Smit - McBride等(1989) J, Biol. Chem., 264， 1578 - 1583; Sdmier等(1991)(酵母》Sano， A. (1995) in Imahori, M.等(eds)， Polyamines, Basic and Clinical Aspects, VNU Science Press,荷蘭，81-88 (大鼠)；Rinaudo & Park (1992) FASEB J" 6， A453 (雞胚胎)；Pay等(1991) Plant Mol. Biol" 17，927 一 929 (苜蓿)；Wang等(2001) J Biol. Chem.， 276， 17541 - 17549 (番茄)。
已經(jīng)在各種人組織和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中探究了 eIF-5A mRNA 的表達(dá)。例如，在血清喪失后加入血清之后，已經(jīng)在人成纖維細(xì)胞中 觀察到了 elF - 5A表達(dá)的變化。Pang & Chen (1994) J. Cell Physiol" 160， 531 - 538。還在衰老的成纖維細(xì)胞中觀察到了與年齡有關(guān)的脫氧 8 -羥-2，7，10 —三氨基癸酸合酶活性的降低和充裕的前體elF 一 5A，盡管還沒有確定這反映同工型中的平均差異變化的可能性。Chen & Chen (1997) J. Cell Physiol" 170， 248 - 254。
研究已經(jīng)顯示，elF-5A可能是病毒蛋白的細(xì)胞靶，所述病毒蛋 白例如l型人免疫缺陷病毒Rev蛋白和l型人T細(xì)胞白血病病毒Rex 蛋白。Ruhl等(1993) J. Cell Biol" 123， 1309 一 1320; Katahira等(1995) J, Virol" 69， 3125-3133。初步研究表明，elF - 5A可以通過與其它 RNA結(jié)合蛋白(例如Rev)的相互作用來導(dǎo)向到RNA上，這暗示這 些病毒蛋白可召集用于病毒RNA加工的elF-5A。Liu等(1997) Biol. Signals, 6， 166- 174。
因而，盡管已知了 elF5A和DHS，但仍然需要理解這些蛋白如 何參與細(xì)胞凋亡途徑以及細(xì)胞因子刺激，以便能調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞 因子表達(dá)。本發(fā)明滿足了該需要。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及細(xì)胞凋亡特異性的真核起始因子5A(elF-5A),其稱 作"細(xì)胞凋亡特異性的eIF-5A"或"eIF-5A1"，和使用反義核苷 酸或siRNA抑制細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A表達(dá)來抑制或阻抑細(xì) 胞的細(xì)胞凋亡的方法。
本發(fā)明還涉及通過提高細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá)來 提高細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的方法。
附圖簡(jiǎn)述


圖1說明了大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A的3'端的核苷酸序 列(SEQ ID NO: ll)和衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO: 12)。
圖2說明了大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A cDNA的5'端的核 苷酸序列(SEQ ID NO: 15)和衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO: 16)。
圖3說明了大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A全長(zhǎng)cDNA 的核苷酸序列(SEQ ID NO: 1)。氨基酸序列顯示在SEQ ID NO: 2 。
圖4說明了大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的DHS cDNA的3'端的核苷 酸序列(SEQ ID NO: 6)和衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO: 7)。
圖5是大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A cDNA的全長(zhǎng)核苷 酸序列(SEQ ID NO: 20)和人eIF - 5A的核苷酸序列(SEQ ID NO: 3) (登記號(hào)BC000751或NM_001970， SEQ ID NO: 3)的比對(duì)。
圖6是大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A cDNA的全長(zhǎng)核苷 酸序列(SEQ ID NO: 20)和人elF - 5A的核苷酸序列(SEQ ID NO: 4) (登記號(hào)NM—020390， SEQ ID NO: 4)的比對(duì)。
圖7是大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A cDNA的全長(zhǎng)核苷 酸序列(SEQ ID NO: 20)和小鼠elF - 5A的核苷酸序列(登記號(hào) BC003889)的比對(duì)。小鼠核苷酸序列(登記號(hào)BC003889)是SEQ ID NO: 5。
圖8是大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性的elF - 5A的衍生的全長(zhǎng)氨基 酸序列(SEQ ID NO: 2)和人elF - 5A的衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO: 21)(登記號(hào)BC000751或NM—001970)的比對(duì)。
圖9是大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性的elF — 5A的衍生的全長(zhǎng)氨基 酸序列(SEQ ID NO: 2)和人elF - 5A的衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO: 22)(登記號(hào)NMJ)203卯)的比對(duì)。
圖10是大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的衍生的全長(zhǎng)氨 基酸序列(SEQ ID NO: 2)和小鼠elF - 5A的衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO: 23)(登記號(hào)BC003889)的比對(duì)。
圖ll是大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性的DHScDNA的部分長(zhǎng)度的 核苷酸序列(SEQ ID NO: 6的核苷酸1 - 453 )和人DHS的核苷酸序 列(SEQ ID NO: 8)(登記號(hào)BC000333, SEQ ID NO: 8)的比對(duì)。
圖12是用"P-dCTP-標(biāo)記的大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性的elF - 5A cDNA的3，-端探測(cè)的總RNA的RNA印跡(頂端)和溴化乙 錠染色的凝膠(底端)。
圖13是用"P-dCTP-標(biāo)記的大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性的 DHS cDNA的3，-端探測(cè)的總RNA的RNA印跡(頂端)和溴化乙 錠染色的凝膠(底端)。
圖14說明了 DNA斷裂成梯(DNA laddering)實(shí)驗(yàn)，其中檢查 了注射PGF - 2 ot后的超排卯的大鼠黃體中的細(xì)胞凋亡程度。
圖15是從細(xì)胞凋亡的大鼠黃體中分離的基因組DNA的瓊脂糖凝 膠，顯示了用PGFF-2a處理大鼠后的DNA斷裂成梯。
圖16說明了 DNA斷裂成梯實(shí)驗(yàn)，其中在大鼠中檢查了超排卵的 大鼠黃體的分散細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡程度，所述的大鼠在暴露于PGF -2a之前用亞精胺處理。
圖17說明了 DNA斷裂成梯實(shí)驗(yàn)，其中在大鼠中檢查了超排卵的 大鼠黃體中的細(xì)胞凋亡程度，所述的大鼠用亞精胺和/或PGF-2a處 理過。
圖18是使用32P-dCTP標(biāo)記的部分長(zhǎng)度的大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A cDNA探測(cè)的大鼠基因組DNA的DNA印跡。
圖19說明了 pHM6，它是哺乳動(dòng)物附加表位表達(dá)載體(Roche Molecular Biochemicals )。
圖20是使用32P-dCTP標(biāo)記的大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性的 DHS cDNA的3'-非翻譯區(qū)探測(cè)的、通過撤出血清誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后從 COS - 7細(xì)胞分離出的總RNA的RNA印跡(頂端)和溴化乙錠染色 的凝膠(底端)。
圖21是說明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞的方法的流程圖。
圖22是用pHM6轉(zhuǎn)染后外來蛋白在COS-7細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá) 的蛋白印跡。
圖23顯示在正常的成纖維細(xì)胞中通過用硝普鈉處理誘導(dǎo)細(xì)胞凋 亡上調(diào)了細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A。
圖24是從RKO細(xì)胞分離的人elF5A2 ( SEQ ID NO: 24 )和人 elF5A2的序列(SEQ ID NO: 22 ) ( Genbank登記號(hào)XM_113401) 的比對(duì)。共有序列顯示于SEQIDNO: 28。
圖25顯示了人細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的序列(SEQ ID NO:29)和本發(fā)明的5種siRNA的序列(SEQ ID NO:30、 31、 32、 33和34 )。
圖26顯示了人細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A的序列(SEQ ID NO:29)和本發(fā)明的3種反義寡核苷酸的序列(按照出現(xiàn)的次序分別 是SEQIDNO:35、 37和39 )。
圖27顯示了靶向人細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的3種反義寡 核苷酸(按照出現(xiàn)的次序分別是SEQIDNO:25-27)的結(jié)合位置。 全長(zhǎng)核苷酸序列是SEQ ID NO: 19。
圖28a和b顯示了相對(duì)于人增殖elF — 5A的人細(xì)胞凋亡—特異性 的elF-5A的核苷酸比對(duì)(按照出現(xiàn)的次序分別是SEQ ID NO: 41 和42 )和氨基酸比對(duì)(按照出現(xiàn)的次序分別是SEQ ID NO: 43和22 )
圖29說明了針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA的設(shè) 計(jì)。siRNA具有SEQ ID NO: 45、 48、 51、 54和56。全長(zhǎng)核普酸序 列顯示于SEQ ID NO: 29中。
圖30顯示了由遺傳毒性應(yīng)激增加的elF5Al表達(dá)。圖30A提供 了在正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞中的elF5Al表達(dá)的RNA印跡分析，且圖 30B提供了從正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞中分離出的細(xì)胞溶解產(chǎn)物的蛋白 印跡。
圖31顯示elF5Al不是細(xì)胞增殖所必需的。
圖32是elF5Al功能和調(diào)節(jié)的模型。在健康細(xì)胞中，elF5Al由 DHS進(jìn)行8-羥-2，7，10-三氨基癸酸化并位于細(xì)胞質(zhì)中。8-羥-2,7,10-三氨基癸酸化的elF5Al可以經(jīng)由某些未知的細(xì)胞質(zhì)功能支 持細(xì)胞生長(zhǎng)。遺傳毒性應(yīng)激或死亡受體激活刺激elF5Al轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入 核，在其中它參與細(xì)胞凋亡細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)或執(zhí)行。由遺傳毒性應(yīng)激
誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡事件中，核elF5Al可能通過調(diào)節(jié)其mRNA的核輸出 起作用以調(diào)節(jié)p53的表達(dá)。
圖33顯示HA-標(biāo)記的elF5All在體外不是8-鞋-2，7,10-三 氨基癸酸化的。
圖34顯示XTT細(xì)胞增殖測(cè)定的結(jié)果。該結(jié)果顯示針對(duì)細(xì)胞凋亡 -特異性的elF-5A (elF-5A1)的siRNA不抑制細(xì)胞分裂。針對(duì) 細(xì)胞增殖elF-5A (elF-5A2)的siRNA抑制細(xì)胞分裂。 圖35說明了在炎癥和細(xì)胞凋亡中包括的各種方案。 圖36-38中的圖說明了在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，在RKO和RKO-E6細(xì)
胞中發(fā)生的細(xì)胞凋亡的百分比。
圖39提供了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后RKO細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果。
圖40顯示了其中RKO細(xì)胞用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A(elF -51) siRNA轉(zhuǎn)染隨后用放線菌素D處理(它誘導(dǎo)細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞凋 亡)的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖41提供了從用0.25Mg/ml放線菌素D處理0、 3、 7、 24和48 小時(shí)的RKO細(xì)胞提取出的蛋白質(zhì)的蛋白印跡。
圖42顯示在用反義寡核苷酸1、 2和3 (其為細(xì)胞凋亡-特異性 的eIF - 5A的)(分別為SEQ ID NO: 35、 37和39 )處理后的RKO
細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水平。
圖43顯示elF-5Al響應(yīng)放線菌素D調(diào)節(jié)p53的表達(dá)。用對(duì)照 siRNA或針對(duì)elF - 5A1的siRNA轉(zhuǎn)染RKO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)， 細(xì)胞用0.5jig/ml放線菌素D處理0、 4、 8或24小時(shí)。A)細(xì)胞裂解 物用針對(duì)elF5Al、 p53或^ -肌動(dòng)蛋白的抗體印跡的蛋白印跡。結(jié)果 代表了3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。B)蛋白印跡中相對(duì)強(qiáng)度的p53的繪圖，其對(duì) 相應(yīng)的肌動(dòng)蛋白條帶進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。p53/肌動(dòng)蛋白強(qiáng)度比率對(duì)設(shè)定為值 1的0小時(shí)對(duì)照獲得的比率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。該值表示n = 3的平均值+ 標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)。星號(hào)(*)表示通過配對(duì)斯氏t檢驗(yàn)認(rèn)為與對(duì)應(yīng)的對(duì) 照值顯著不同的值(p<0.05)。
圖44顯示了人elF5Al的超表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。RKO細(xì)胞用 pHM6-LacZ或pHM6 - elF5Al轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，4吏用TUNEL 方法固定并標(biāo)記細(xì)胞以檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞的DNA斷裂特征。通過流
式細(xì)胞術(shù)分析定量細(xì)胞凋亡細(xì)胞。值是11 = 3的平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤。星 號(hào)(*)表示通過配對(duì)斯氏t檢驗(yàn)認(rèn)為顯著不同的值(p<0.01)。
圖45顯示人elF5Al的超表達(dá)不依賴p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。用pHM6 - LacZ、 pHM6 elF5Al或pHM6 - elF5AlA37 ( C末端37個(gè)氨基酸 的截短)轉(zhuǎn)染RKO細(xì)胞(A)或RKOE6細(xì)胞(B)。轉(zhuǎn)染后48小 時(shí)，使用TUNEL方法固定和標(biāo)記細(xì)胞。核用Hoescht 33258染色， 并且標(biāo)記的細(xì)胞通過焚光顯微鏡術(shù)觀察。染為明亮綠色的細(xì)胞記作細(xì) 胞凋亡的。Hoescht-染色的核用于測(cè)定總細(xì)胞數(shù)目。值是n-4(A) 或n = 3 (B)的平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤。星號(hào)(*)表示通過配對(duì)斯氏t檢 驗(yàn)與對(duì)照(pHM6-LacZ)顯著不同(p<0.02)。
圖46說明了當(dāng)用在有義方向含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的 eIF-5A的pHM6瞬時(shí)感染COS-7細(xì)胞時(shí)，由提高的天冬氨酸特異
性半胱氨酸蛋白酶活性反映的增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡。
圖47說明了當(dāng)用在有義方向含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞時(shí)，由提高的DNA斷裂反 映的增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡。
圖48說明了當(dāng)用在有義方向含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞時(shí)，由提高的核碎裂反映的
細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。
圖49說明了當(dāng)用在有義方向含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞時(shí)，由提高的核碎裂反映的 增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡。
圖50說明了當(dāng)用在有義方向含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋'亡-特異性的 eIF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞時(shí)，由磷脂酰絲氨酸暴露反 映的細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。
圖51說明了當(dāng)用在有義方向含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞時(shí)，由提高的磷脂酰絲氨酸
暴露反映的增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡。
圖52說明了當(dāng)用在有義方向含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞時(shí)，由提高的核碎裂反映的 增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡。
圖53說明了當(dāng)用在有義方向含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的
elF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞時(shí)，增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡。圖54說明了當(dāng)用在有義方向含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞時(shí)，Bel-2的下調(diào)。上圖是考馬斯藍(lán)染色的蛋白印跡；下圖是對(duì)應(yīng)的蛋白印跡。圖55是使用Bel-2作為探針，用在反義方向含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞 凋亡-特異性的elF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的COS - 7細(xì)胞的考馬 斯藍(lán)染色的蛋白印跡和對(duì)應(yīng)的蛋白印跡。圖56是使用c-Myc作為探針，用在有義方向含有全長(zhǎng)大鼠細(xì) 胞凋亡-特異性的elF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的COS - 7細(xì)胞的考 馬斯藍(lán)染色的蛋白印跡和對(duì)應(yīng)的蛋白印跡。圖57是使用p53作為探針時(shí)，用在有義方向含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞 凋亡-特異性的elF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的COS - 7細(xì)胞的考馬 斯藍(lán)染色的蛋白印跡和對(duì)應(yīng)的蛋白印跡。圖58A - C是使用抗—[HA—過氧化物酶探針對(duì)pHM6 —全長(zhǎng)大 鼠細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)的考馬斯藍(lán) 染色的蛋白印跡和對(duì)應(yīng)的蛋白印跡，和使用p53探針時(shí)，pHM6-全 長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)的考 馬斯藍(lán)染色的蛋白印跡和對(duì)應(yīng)的蛋白印跡。圖59中的條線圖表明細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A和增殖eIF -5A都在心臟組織中表達(dá)。心臟組織取自接受冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù) ("CABG")的患者。將細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A的基因表達(dá) 水平(淺灰柱)與增殖elF-5A (深灰柱)進(jìn)行了對(duì)比。X-軸是患 者識(shí)別號(hào)碼。圖60中的條線圖表明細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A和增殖eIF -5A都在心臟組織中表達(dá)。心臟組織取自接受瓣膜換置術(shù)的患者。 將細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的基因表達(dá)水平(淺灰柱)與增殖 eIF-5A(深灰柱)進(jìn)行了對(duì)比。X-軸是患者識(shí)別號(hào)碼。圖61中的條線圖顯示了在缺血前的心臟組織和缺血后的心臟組 織中，通過實(shí)時(shí)PCR測(cè)得的細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A ( elf5a ) 與增殖elF-5A (elF5b)比較的基因表達(dá)水平。圖62A-F報(bào)告了患者數(shù)據(jù)，其中細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A 的水平和IL - 1 P和IL - 18的水平相關(guān)聯(lián)。圖62A是從冠狀動(dòng)脈旁 路移植術(shù)(CABG)患者得到的數(shù)據(jù)的圖。圖62B是從瓣膜換置術(shù)患 者得到的數(shù)據(jù)的圖。圖62C是說明CABG患者中的細(xì)胞凋亡-特異 性的eIF - 5A和IL - 18的關(guān)聯(lián)的圖。圖62D是說明CABG患者中的 增殖eIF-5A和IL-18的關(guān)聯(lián)的圖。圖62E是說明瓣膜換置術(shù)患者 中的細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A和IL-18的關(guān)聯(lián)的圖。圖6F是 說明瓣膜換置術(shù)患者中的增殖eIF - 5A和IL - 18的關(guān)聯(lián)的圖。圖63- 64中的圖顯示了心臟組織在缺血事件前、期間和后的收 縮力。缺血后的組織產(chǎn)生的收縮力沒有缺血前組織產(chǎn)生的多。 圖65顯示了 IL-18在人心肌(mycocardium)中的定位。 圖66顯示缺血/再灌注誘導(dǎo)人心房組織中合成IL - 18。 圖67顯示ICE抑制劑(白細(xì)胞介素-1|3轉(zhuǎn)化酶)的存在減少缺 血/再灌注損傷。圖68顯示由IL-18BP (IL-18的內(nèi)源性抑制劑)中和IL-18 減少缺血/再灌注損傷。圖69顯示當(dāng)暴露于TNF-a時(shí)，心臟組織收縮力隨著時(shí)間的過 去而減少。圖70顯示IL-18BP減少了 TNF-a誘導(dǎo)的心肌阻抑。圖71顯示IL-18BP減少了 IL-ip誘導(dǎo)的心肌阻抑。圖72顯示通過抑制IL - 1|3和IL - 18的加工或抑制IL - l卩和IL- 18活性在實(shí)施缺血/再灌注的心房組織中保留了肌酸激酶活性 (CK)。圖73顯示在缺血/再灌注后肌細(xì)胞損傷的示意圖和TNFa至IL — 18的級(jí)聯(lián)。圖74顯示細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A ( eIF - 5A1)在缺血的 心臟組織中以大于增殖elF-5A (elF-5A2)的量上調(diào)。圖75顯示在缺血和非缺血性心力衰竭中，IL- 18的表達(dá)提高。 圖76顯示與正常心臟組織相比，在缺血性和擴(kuò)張性心肌病中IL- 18的相對(duì)表達(dá)提高而IL - 18BP(IL- 18的內(nèi)源性抑制劑)的表達(dá)圖77A和B顯示了熒光標(biāo)記的反義寡核普酸的攝入。 圖78- 82顯示了與未用反義細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A寡核 苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，已經(jīng)用反義細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A寡 核苷酸處理的細(xì)胞中的經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞百分比的降低。圖83顯示用TNF- a和/或喜樹堿處理篩板細(xì)胞，造成經(jīng)歷細(xì)胞 凋亡的細(xì)胞的數(shù)目的增加。圖84和85顯示了與未用反義細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A寡 核苦酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，已經(jīng)用反義細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A 寡核苷酸處理的細(xì)胞中的經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞百分比的降低。圖86A和B顯示在有或沒有血清存在的情況下，篩板細(xì)胞攝取 標(biāo)記的siRNA。圖87-89顯示，在暴露于喜樹堿和TNF- oc后，用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A s股NA轉(zhuǎn)染的篩板細(xì)胞具有比未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞更低 的經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞百分比。圖90是從圖89和實(shí)施例13所述的實(shí)驗(yàn)得到的用siRNA轉(zhuǎn)染、 并用喜樹堿和TNF- oc處理的Hoescht-染色的篩板細(xì)胞系#506的 照片?？吹降母髁恋厝旧募?xì)胞是凋亡的細(xì)胞。因?yàn)槿旧|(zhì)凝聚， 它們具有更小的核，且在形狀上更小和不規(guī)則。圖91通過免疫熒光表征了篩板細(xì)胞。圖92中的圖顯示了用喜樹堿和TNF- oc處理引起的篩板細(xì)胞系 #506的細(xì)胞凋亡百分比。圖93顯示了在喜樹堿或TNF- ct +喜樹堿處理過程中，針對(duì) 細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá)水平。圖94顯示了用siRNA轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A在 篩板細(xì)胞系#506和#517中的表達(dá)水平。圖95顯示了用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A siRNA轉(zhuǎn)染的和用 TNF- oc和喜樹堿處理的篩板細(xì)胞系#506細(xì)胞的細(xì)胞凋亡百分比。圖96顯示了用細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A siRNA # 1轉(zhuǎn)染的和 用TNF- oc和喜樹堿處理的篩板細(xì)胞系#517細(xì)胞的細(xì)胞凋亡百分 比。圖97a - d顯示了用細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A siRNA # 1轉(zhuǎn)染 的和用TNF- ot和喜樹堿處理的篩板細(xì)胞系#506細(xì)胞的TUNEL-標(biāo)記。圖A代表著使用熒光素濾色片，通過熒光顯微鏡術(shù)觀察栽玻 片，以顯現(xiàn)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的斷裂的DNA的TUNEL-標(biāo)記。圖B
代表著通過紫外線濾色片觀察相同的載玻片，以顯現(xiàn)Hoescht-染色 的核。圖98顯示用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn) 生較少的細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A蛋白，且另外產(chǎn)生更多的Bcl -2蛋白。細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A表達(dá)的減少與BCL-2表達(dá) 的提高相關(guān)。圖99顯示用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn) 生較少的細(xì)胞凋亡因子5a蛋白。圖100顯示用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A轉(zhuǎn)染的、IL-l暴露 的HepG2細(xì)胞分泌的TNF- oc比未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞更少。圖IOIA提供了其中針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA 已減少(如果未抑制的話)轉(zhuǎn)染的HT-29細(xì)胞中TNF- oc的產(chǎn)生的 蛋白印跡的圖片。圖101B提供了 ELISA的結(jié)果。圖102提供了 ELISA結(jié)果。與對(duì)照細(xì)胞相比，在用針對(duì)細(xì)胞凋 亡-特異性的elF-5A的siRNA處理的細(xì)胞中TNF - ot的產(chǎn)生減 少。圖103中的條線圖顯示，產(chǎn)生的IL-8是對(duì)TNF- ot和干擾素的 響應(yīng)。該圖顯示，針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA阻斷 對(duì)干擾素響應(yīng)產(chǎn)生的幾乎全部的IL-8和作為干擾素和TNF的組合 處理的結(jié)果產(chǎn)生的顯著量的IL-8。圖104是另一個(gè)條線圖，它顯示產(chǎn)生的IL-8是對(duì)TNF- oc和干 擾素的響應(yīng)。該圖顯示，針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA 阻斷對(duì)干擾素響應(yīng)產(chǎn)生的幾乎全部的IL-8和作為干擾素和TNF的 組合處理的結(jié)果產(chǎn)生的顯著量的IL-8。圖105是用IFNy處理8和24小時(shí)的HT - 29細(xì)胞的蛋白印跡。 該印跡顯示千擾素Y引起的針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A在HT -29細(xì)胞中的上調(diào)(在8小時(shí)時(shí)，4倍)。圖106顯示了實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中提供了針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的 eIF- 5A的siRNA用于減少在干擾素y和LPS的存在下的NKkB活 化。圖107顯示了來自用對(duì)照siRNA或細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A siRNA轉(zhuǎn)染的HT-29細(xì)胞的細(xì)胞裂解物的蛋白印跡。該圖顯示，細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA抑制細(xì)胞凋亡-特異性的eIF -5A的表達(dá)。圖108顯示用細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5AsiRNA轉(zhuǎn)染的HT-29細(xì)胞具有減少水平的TNF生產(chǎn)。圖109顯示用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5AsiRNA轉(zhuǎn)染的HT -29細(xì)胞表現(xiàn)出比對(duì)照細(xì)胞降低的細(xì)胞凋亡。用干擾素y預(yù)處理、并 還用TNF- oc處理了對(duì)照和siRNA-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。圖110顯示用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5AsiRNA轉(zhuǎn)染的HT-29細(xì)胞表達(dá)比對(duì)照細(xì)胞更少的TLR4蛋白。圖lll顯示用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5AsiRNA轉(zhuǎn)染的HT-29細(xì)胞表達(dá)比對(duì)照細(xì)胞更少的TNFR1蛋白。圖112顯示用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5AsiRNA轉(zhuǎn)染的HT-29細(xì)胞表達(dá)比對(duì)照細(xì)胞更少的iNOS蛋白。圖113顯示用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5AsiRNA轉(zhuǎn)染的HT-29細(xì)胞表達(dá)比對(duì)照細(xì)胞更少的TLR4 mRNA。圖114顯示在暴露于IFN- y和LPS的HP-29細(xì)胞中，用針對(duì) 細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA轉(zhuǎn)染導(dǎo)致NFicB p50活性和 TNF- oc產(chǎn)生的減少。圖115顯示針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A的siRNA阻抑HT - 29細(xì)胞中內(nèi)源性細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A的表達(dá)。圖116顯示在HT-29細(xì)胞中，siRNA-介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡-特異 性的eIF - 5A的阻抑響應(yīng)IFN - y減少了 IFN - y受體-oc積累。圖117顯示在HT-29細(xì)胞中，siRNA-介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡-特異 性的eIF - 5A的阻抑響應(yīng)IFN - y減少了 Toll受體4 ( TLR4 )積累。圖118顯示在HT-29細(xì)胞中，siRNA-介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡-特異 性的eIF - 5a的阻抑響應(yīng)IFN - y減少了 jak1和stat1磷酸化。圖119顯示了 elF5Al的免疫熒光定位。通過間接免疫熒光測(cè)定 用IFN - y和TNF- cx ( A)或放線菌素D (B)刺激的HT - 29細(xì) 胞中elF5Al蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。A) HT-29細(xì)胞未被處理(i) 或在用TNF - oc刺激0分鐘(ii) 、 10分鐘(iii) 、 30分鐘(iv )、 90分鐘(v)或8小時(shí)(vi)前用IFN- Y預(yù)處理16小時(shí)。B ) HT-29細(xì)胞未被處理(i )或用放線菌素D處理30分鐘(ii)、 90分鐘(Hi)、 4小時(shí)(iv) 、 8小時(shí)(v)或16小時(shí)(vi)。所有照片都是在400倍放大倍數(shù)時(shí)拍攝的。該結(jié)果代表著3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。圖120顯示了 PBMC實(shí)驗(yàn)的時(shí)程(見實(shí)施例18)。圖121顯示了在時(shí)程內(nèi)來自從2個(gè)供體收集的PBMC的細(xì)胞裂解物的蛋白印跡。用PMA處理、并隨后用LPS刺激PBMC,以使其具有提高的細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A表達(dá)。圖122顯示用PMA處理、并隨后用LPS刺激的PBMC具有提高的細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A表達(dá)，這與提高的TNF生產(chǎn)一致。 圖123證實(shí)PBMC對(duì)LPS響應(yīng)，而無PMA分化。 圖124顯示了用細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A siRNA轉(zhuǎn)染的PBMC證實(shí)了細(xì)胞凋亡-特異性的elF - 5A的表達(dá)的阻抑。圖125顯示了用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5AsiRNA轉(zhuǎn)染、并用LPS刺激的PBMC生產(chǎn)了比未用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5AsiRNA轉(zhuǎn)染的PBMC更少的TNF。圖126顯示U-937分化實(shí)驗(yàn)的時(shí)程。見實(shí)施例16。圖127顯示蛋白印跡的結(jié)果，它顯示在單核細(xì)胞分化和后續(xù)的TNF - oc分泌過程中細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A是上調(diào)的。 圖128顯示U937處理的時(shí)程。圖129顯示細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A在U937細(xì)胞中受到 PMA的上調(diào)。圖130顯示細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A在U937細(xì)胞中受到 LPS的上調(diào)。圖131顯示在siRNA處理數(shù)小時(shí)后，細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A蛋白的表達(dá)仍然是減少的。圖132顯示siRNA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A的下調(diào) 與TLR4的減少相一致。圖133顯示siRNA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的下調(diào) 與U937細(xì)胞中的較少的糖基化形式的干擾素Y受體相一致。圖134顯示siRNA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的下調(diào) 與U937細(xì)胞中的TNFR1的減少相一致。圖135顯示siRNA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡-特異性的elF - 5A的下調(diào) 與U937細(xì)胞中的LPS-誘導(dǎo)的TNF - a生產(chǎn)的減少相一致。
圖136顯示siRNA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的下調(diào) 與U937細(xì)胞中的LPS-誘導(dǎo)的IL-lp生產(chǎn)的減少相一致。圖137顯示siRNA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡-特異性的eIF- 5A的下調(diào) 與U937細(xì)胞中的LPS-誘導(dǎo)的IL-8生產(chǎn)的減少相一致。圖138顯示U937細(xì)胞中的IL-6生產(chǎn)不依賴于siRNA介導(dǎo)的 細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A的下調(diào)。圖139顯示針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA的靜脈 內(nèi)送遞導(dǎo)致血清中TNF- oc水平下降。圖140顯示針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA的經(jīng)鼻 送遞導(dǎo)致肺中TNF- oc水平下降。圖141顯示針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA的經(jīng)鼻 送遞導(dǎo)致肺中MIP-1水平下降。圖142顯示針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA的鼻內(nèi) 送遞導(dǎo)致IL - 1 ot水平下降。圖143顯示在小鼠鼻內(nèi)接受LPS和elF-5Al siRNA后具有比接 受對(duì)照siRNA的小鼠減少的髓過氧化物酶活性。圖144顯示通過用細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A siRNA預(yù)處理阻 斷了鼻-LPS -誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞的喪失。圖145顯示細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A siRNA的鼻內(nèi)送遞實(shí)驗(yàn)的時(shí)程。圖146顯示通過用細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A siRNA預(yù)處理阻 斷了鼻-LPS-誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞的喪失。圖147顯示針對(duì)eIF - 5A的siRNA減少了 IL - 6、 IFN - y和IL -la的生產(chǎn)。圖148顯示針對(duì)elF-5A的siRNA作為L(zhǎng)PS處理的結(jié)果能夠減 少TNFot的表達(dá)。上圖顯示了原始數(shù)據(jù)，且下圖顯示了條線圖中的 數(shù)據(jù)。圖149顯示了其中用不同濃度的siRNA并在不同時(shí)間處理膿毒 性Balb/C小鼠的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖150以不同形式顯示了圖133的結(jié)果。圖151顯示了其中用不同濃度的siRNA并在不同時(shí)間處理膿毒 性C57BL/6小鼠的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖152以不同形式顯示了圖151的結(jié)果。圖153- 155顯示了 Balb/C小鼠中組合的膿毒癥存活研究的結(jié) 果。該研究顯示了接受細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A的小鼠存活得比 對(duì)照小鼠更久。圖156- 158顯示了 C57BL/6小鼠中組合的膿毒癥存活研究的結(jié) 果。該研究顯示了接受細(xì)胞凋亡_特異性的eIF - 5A siRNA的小鼠存 活得比對(duì)照小鼠更久。圖159概括了膿毒癥研究，顯示用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A siRNA處理的小鼠具有更好的存活機(jī)會(huì)。圖160顯示了在膿毒性小鼠模型中使用的siRNA構(gòu)建體。圖161是用對(duì)照siRNA處理的腫瘤和非腫瘤(健康)組織的照 片，并顯示在癌性組織中，存在很少的或沒有細(xì)胞凋亡。圖162- 170顯示在用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A siRNA處理的腫瘤中存在很強(qiáng)的細(xì)胞凋亡，但在非腫瘤組織中沒有細(xì)胞凋亡。顯 示了各種組織(圖167中為腎，圖168中為肝，圖169中為心臟，和 圖170中為脾)。圖171中顯示的圖證實(shí)全身注射的ad5orioP.螢光素酶選擇性地表達(dá)于鼻咽異種移植腫瘤中。圖172顯示ad5orioP.elF - 5A1在2次細(xì)胞分裂中選擇性殺死98 %鼻咽癌細(xì)胞(C666- 1 )。圖173顯示了其中將癌細(xì)胞注射到小鼠中并導(dǎo)致肺癌發(fā)展的實(shí) 驗(yàn)的結(jié)果。用elF-5A注射的小鼠與對(duì)照小鼠相比癌性細(xì)胞量減少。圖174顯示用細(xì)胞凋亡-特異性的eIF — 5A處理的癌性肺組織與 未用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A處理的對(duì)照肺相比癌性組織的量 減少。圖175顯示了在肺癌實(shí)驗(yàn)中使用的肺的重量。圖176說明了干細(xì)胞分化和針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A的 siRNA抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生的用途。圖177顯示細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A siRNA抑制LPS i秀導(dǎo) 的COX-2上調(diào)。圖178顯示了其中elF-5A1能夠下調(diào)VEGF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖179顯示了在滑膜肉瘤細(xì)胞系中超表達(dá)細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A減少了由胂瘤細(xì)胞產(chǎn)生VEGF。發(fā)明詳述已經(jīng)分離了真核起始因子5A ( "elF-5A")的幾個(gè)同工型， 并呈現(xiàn)在公開的數(shù)據(jù)庫中。認(rèn)為這些同工型在功能上是冗余的。本發(fā) 明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，緊在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡之前， 一個(gè)同工型會(huì)受到上調(diào)，它 已經(jīng)被命名為細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A或eIF-5A1。本發(fā)明的 主題是細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A。圖l-ll顯示了大鼠、小鼠和 人elF-5A的序列(核普酸和氨基酸)。認(rèn)為另一種同工型參與細(xì)胞 增殖，并稱為增殖elF-5A或elF-5As。圖28顯示細(xì)胞凋亡-特異 性的elF-5A與增殖elF-5A ( eIF - 5A2 )的比較。圖31顯示細(xì)胞 凋亡-特異性的elF-5A不是細(xì)胞增殖所必需的。在圖31A中，使 用XTT細(xì)胞增殖測(cè)定測(cè)量用elF-5Al siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的代謝活 性。用對(duì)照siRNA或elF5Al siRNA轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將HT - 29細(xì) 胞接種在96-孔板上。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，細(xì)胞在測(cè)量代謝活性前未處 理或用放線菌素D(1.0pg/ml)處理48小時(shí)。值是一式四份執(zhí)行的2 個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值并對(duì)設(shè)定為1的0小時(shí)對(duì)照獲得的值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。圖 31B顯示了用對(duì)照或elF5Al siRNA轉(zhuǎn)染的HT - 29細(xì)胞的增殖能力 與和50 jiM GC7溫育72小時(shí)的細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行比較。通過BrdU 摻入測(cè)量細(xì)胞的增殖。值是n = 4的平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤并對(duì)設(shè)定為1的 GC7 ( + )血清樣品的值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。星號(hào)(*)表示通過配對(duì)斯氏t 檢驗(yàn)認(rèn)為顯著不同的值(/ <0.01)。圖34顯示針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA不抑制細(xì) 胞分裂，而針對(duì)細(xì)胞增殖elF-5A的siRNA抑制細(xì)胞分裂。細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A在細(xì)胞凋亡過程中是上調(diào)的。圖 23顯示在正常成纖維細(xì)胞中用硝普鈉誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后，細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá)提高。圖30顯示細(xì)胞凋亡-特異性的eIF -5A受到遺傳毒性應(yīng)激的上調(diào)。圖30A提供了在用0.5 jig/ml放線菌 素D處理O、 1、 4和8小時(shí)的正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞中的elF5Al表達(dá) 的RNA印跡分析。圖30B提供了從用0.5 pg/ml放線菌素D處理0、 1、 4和24小時(shí)的正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞中分離出的細(xì)胞溶解產(chǎn)物的蛋 白印跡。印跡用針對(duì)elF5Al、 p53和0 -肌動(dòng)蛋白的抗體進(jìn)行探測(cè)。 該圖顯示在用放線菌素D處理后elF-5A蛋白提高。在造成細(xì)胞凋亡的疾病狀態(tài)中，細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A可 能是合適的用于進(jìn)行干涉的靶，因?yàn)樗坪踉趨⑴c細(xì)胞凋亡途徑的下 游效應(yīng)物和轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)水平發(fā)揮作用。具體地，細(xì)胞凋亡 -特異性的elF-5A似乎能選擇性地促進(jìn)編碼細(xì)胞凋亡的下游效應(yīng) 物和轉(zhuǎn)錄因子的mRNA從核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，隨后它們?cè)谶@里被翻 譯。啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的最終決定似乎源自內(nèi)部的和外部的促-和抗- 細(xì) 胞凋亡信號(hào)之間的復(fù)雜相互作用。Lowe & Lin( 2000 )Carcinogenesis, 21， 485-495。通過它促進(jìn)下游細(xì)胞凋亡效應(yīng)物和轉(zhuǎn)錄因子的翻譯的 能力，細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A似乎能破壞有利于細(xì)胞凋亡的 這些信號(hào)之間的平衡。因此，本發(fā)明提供了通過施用抑制或減少細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A表達(dá)的試劑，來阻抑或減少細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的方法?？梢砸?制或減少細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A表達(dá)的一種試劑是細(xì)胞凋亡 -特異性的eIF - 5A的反義寡核苷酸。通過減少或抑制細(xì)胞凋亡 - 特 異性的elF-5A的表達(dá)，可以延遲或抑制細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。反義寡核普酸已經(jīng)成功地用于實(shí)現(xiàn)體外和體內(nèi)的基因-特異性 的阻抑。反義寡核苷酸是短的、合成的DNA鏈(或DNA類似物)， RNA鏈(或RNA類似物)或DNA/RNA雜合體，其對(duì)特定的DNA 或RNA耙是反義的(或互補(bǔ)的)。反義寡核苷酸被設(shè)計(jì)用于通過結(jié) 合耙mRNA和在轉(zhuǎn)錄、翻譯或剪接水平停止表達(dá)，來阻斷由DNA或 RNA靶編碼的蛋白的表達(dá)。通過使用修飾的抗降解的主鏈(Blake等， 1985),例如將寡核苷酸中的磷酸二酯鍵替換為硫代磷酸酯鍵來阻礙 核酸酶降解(Matzura和Eckstein, 1968),反義寡核苷酸已經(jīng)成功 地用于細(xì)胞培養(yǎng)和疾病的動(dòng)物模型(Hogrefe， 1999 )。本領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員已知且理解為使寡核苷酸更穩(wěn)定和對(duì)降解更有抗性而對(duì)反 義寡核苷酸進(jìn)行的其它修飾。如本文所使用的，反義寡核苷酸包括雙 鏈或單鏈DNA、雙鏈或單鏈RNA、 DNA/RNA雜合體、DNA和RNA類似物和具有堿基、糖或主鏈修飾的寡核苷酸。通過本領(lǐng)域已知的方 法，可以修飾寡核苷酸，以提高穩(wěn)定性、增強(qiáng)對(duì)核酸酶降解的抗性， 200580045766.0說明書第22/122頁等等。這些修飾是本領(lǐng)域已知的，且包括但不限于修飾寡核苷酸的主 鏈，修飾糖部分，或修飾堿基。優(yōu)選地，本發(fā)明的反義寡核苷酸具有編碼細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A多肽的部分的核苷酸序列，或其完整編碼序列。發(fā)明人已經(jīng) 用編碼如下所述的細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A多肽的部分的反義 核苷酸轉(zhuǎn)染了各種細(xì)胞系，并測(cè)量了經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的數(shù)目。與 未用反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染的類似細(xì)胞群體相比，用反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞群體表現(xiàn)出經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的數(shù)目的降低。圖78-82顯示 了與未用反義細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相 比，已用反義細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中 的經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞百分比的降低。本發(fā)明預(yù)期許多合適的編碼細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A多肽 的核酸序列的用途。例如，本發(fā)明提供了下面的細(xì)胞凋亡-特異性的 eIF-5A核酸序列(SEQIDNOS:l、 3、 4、 5、 11、 12、 15、 16、 19、 20和21)的反義核苷酸以及本文描述的其他反義核苷酸。本發(fā)明的 反義寡核苷酸不需要是完整長(zhǎng)度的提供的SEQ ID NO。它們的長(zhǎng)度 只要足以結(jié)合以抑制或減少細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá)即 可。"表達(dá)的抑制或減少"或"表達(dá)的阻抑"是指，沒有來自靶基因 的蛋白和/或mRNA產(chǎn)物的水平，例如細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A，或其水平的可檢測(cè)的降低。示例性的不包含完整編碼序列的細(xì)胞凋亡-特異性的elF- 5A 的反義寡核苷酸是具有下面的SEQ ID NO: 35、 37和39的細(xì)胞凋亡 —特異性的elF — 5A的反義寡核苷酸。"細(xì)胞凋亡-特異性的eIF — 5A的反義寡核苷酸"包括與細(xì)胞凋 亡-特異性的elF-5A具有相當(dāng)大的序列同一性或相當(dāng)大的同源性 的寡核苷酸。本發(fā)明的細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的其它反義寡核 苷酸包括與上面列出的那些具有相當(dāng)大的序列同一性的那些(即90 %同源性)或具有能在高嚴(yán)格性條件下與列出的SEQ ID NO雜交的 序列的那些。如本文所使用的，術(shù)語"相當(dāng)大的序列同一性"或"相 當(dāng)大的同源性"是指與另一個(gè)序列表現(xiàn)出相當(dāng)大的結(jié)構(gòu)的或功能的等 價(jià)的序列。具有相當(dāng)大的序列同 一性或相當(dāng)大的同源性的序列之間的 任何結(jié)構(gòu)的或功能的差異都是最小的；也就是說，它們不影響該序列 如所需應(yīng)用所示發(fā)揮功能的能力。差異可以是由于例如不同物種之間 的密碼子選擇中的固有變化。如果2個(gè)或更多個(gè)不同序列之間存在顯 著量的序列重疊或相似性，或者即使序列的長(zhǎng)度或結(jié)構(gòu)不同，但是如 果該不同序列表現(xiàn)出類似的物理特征，則認(rèn)為結(jié)構(gòu)差異是最小的。這 樣的特征包括，例如，在限定的條件下進(jìn)行雜交的能力，或在蛋白的 情況下，免疫學(xué)上的交叉應(yīng)答性，類似的酶活性等。通過本領(lǐng)域已知 的方法，熟練的從業(yè)人員可以容易地確定這些特征中的每一項(xiàng)。
另外，2個(gè)核苷酸序列是"基本上互補(bǔ)的"，如果它們之間的序 列具有至少約70%或更大、更優(yōu)選80%或更大、甚至更優(yōu)選約90% 或更大、且最優(yōu)選約95%或更大的序列相似性的話。2個(gè)氨基酸序列 是基本上同源的，如果它們?cè)谟谢钚缘幕蚬δ苌嫌嘘P(guān)的多肽部分具有 至少70%、更優(yōu)選至少80%、甚至更優(yōu)選至少90%和最優(yōu)選至少95 %的相似性的話。
為了確定2個(gè)序列的百分比同一性，為了最佳的對(duì)比而將序列進(jìn) 行比對(duì)(例如，為了最佳的比對(duì)，可以將缺口引入第一個(gè)和第二個(gè)氨 基酸或核酸序列中的l個(gè)或2個(gè)中，且為了對(duì)比目的，可以忽略非同 源的序列)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，為了對(duì)比目的，比對(duì)了至少30 %、 40%、 5(T/q、 60%、 70%、 80%或90%或更大長(zhǎng)度的參考序列。 然后對(duì)比了在對(duì)應(yīng)的氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核 苷酸。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)序列中的位置被與第二個(gè)序列中的對(duì)應(yīng)位置相同的氨 基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則在該位置分子是相同的(如本文所使用 的，氨基酸或核酸的"同一性"等同于氨基酸或核酸的"同源性")。 2個(gè)序列的百分比同一性是序列共有的相同位置的數(shù)目的函數(shù)，同時(shí) 應(yīng)考慮缺口的數(shù)目和每個(gè)缺口的長(zhǎng)度，為了 2個(gè)序列的最佳比對(duì)，需 要導(dǎo)入所述的缺口。
使用數(shù)學(xué)算法，可以完成2個(gè)序列之間的序列對(duì)比和百分比同一 性和相似性的確定。(Computational Molecular Biology, Lesk， A.M., 編,Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.，編,Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1， Griffin, A.M.,和 Griffin， H.G.，編，Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje， G.， AcademicPress, 1987;和Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.和Devereux, J.，編，M Stockton Press, New York, 1991)。本發(fā)明的核酸和蛋白序列還可以用作"查詢序列"，以對(duì)序列數(shù) 據(jù)庫進(jìn)行搜索，以例如，鑒別其它家族成員或相關(guān)的序列?？梢允褂?Altschul，等(1990 )/.編丑/。/. 215: 403 - 10的NBLAST和XBLAST 程序(2，0版)進(jìn)行這樣的搜索?？梢允褂肗BLAST程序進(jìn)行BLAST 核苷酸搜索?？梢允褂肵BLAST程序進(jìn)行BLAST蛋白搜索，以得到 與本發(fā)明的蛋白同源的氨基酸序列。為了對(duì)比目的，為了獲得有缺口 的比對(duì)，可以如Altschul等(1997 ) 7V"c/"'c 紐25 ( 17 ) 3389 -3402所述使用有缺口的BLAST。當(dāng)使用BLAST和有缺口的 BLAST程序時(shí)，可以使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST )的 默認(rèn)參數(shù)。術(shù)語"細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A"包括其功能衍生物。術(shù)語 核酸的"功能衍生物"在本文中是指氨基酸或核苷酸序列的同源物或 類似物。功能衍生物保留給定基因的功能，這允許它根據(jù)本發(fā)明的用 途。如本文所述的細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A多肽的"功能衍生 物"或細(xì)胞凋亡—特異性的eIF — 5A的反義寡核苷酸的功能衍生物是 細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的片段、變體、類似物或化學(xué)衍生物， 其保留細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A活性或與對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性 的elF - 5A特異性的抗體的免疫學(xué)交叉應(yīng)答性。細(xì)胞凋亡-特異性的 elF - 5A多肽的片段是指該分子的任何亞型。功能變體還可以含有類似氨基酸的替代，其不導(dǎo)致功能的變化， 或?qū)е鹿δ艿牟幻黠@的變化。通過本領(lǐng)域已知的方法，例如定點(diǎn)誘變 或丙氨酸-掃描誘變，可以鑒別出對(duì)功能必需的氨基酸(Cunningham 等(1989) Science 244: 1081- 1085)。后一種方法在分子中的每個(gè) 殘基處導(dǎo)入單個(gè)丙氨酸突變。然后測(cè)試得到的突變分子的生物學(xué)活 性，例如激酶活性，或者在測(cè)定中，測(cè)試?yán)珞w外增殖活性。通過結(jié) 構(gòu)分析，例如結(jié)晶、核磁共振或光親和標(biāo)記，還可以確定對(duì)于結(jié)合配 偶體/底物結(jié)合關(guān)鍵的位點(diǎn)(Smith等(1992) J. Mol. Biol. 224: 899 -卯4; de Vos等(1992 ) Science 255: 306 - 312 )。"變體"是指與完整基因或其片段基本上相似的分子，例如含有 一個(gè)或多個(gè)替代的核苷酸、但是保留與特定基因雜交或編碼能與天然DNA雜交的mRNA轉(zhuǎn)錄物的能力的核苷酸替代變體。"同源物"是 指來自不同動(dòng)物屬或物種的片段或變體序列。"類似物"是指非天然 的分子，其與完整分子、其變體或片段基本上相似或功能上相關(guān)。變體肽包括天然產(chǎn)生的變體和通過本領(lǐng)域熟知的方法生產(chǎn)的那 些。使用分子技術(shù)和本文公開的序列信息，可以容易地鑒別/制造出 這樣的變體。而且，基于與本發(fā)明的elF-5A的序列和/或結(jié)構(gòu)同源 性，可以將這些變體容易地與其它蛋白區(qū)別開。存在的同源性/同一 性的程度主要基于蛋白是功能變體還是非功能變體、平行進(jìn)化同源 (paralog)家族中存在的趨異量和定向進(jìn)化同源(ortholog )之間的 進(jìn)化距離。使用重組技術(shù)，可以容易地產(chǎn)生本發(fā)明的elF-5A多核苷酸、反 義寡核苷酸或蛋白的非天然產(chǎn)生的變體。這樣的變體包括但不限于核 苷酸或氨基酸序列中的缺失、添加和替代。例如， 一類替代是保守的 氨基酸替代。這樣的替代是，將蛋白中的給定氨基酸替代為具有相似 特征的另 一種氨基酸。 一般視為保守替代的是，脂族氨基酸Ala、 Val、 Leu和lie中的彼此替代；羥基殘基Ser和Thr的互換；酸性殘基Asp 和Glu的交換；酰胺殘基Asn和Gin之間的替代；堿性殘基Lys和 Arg的交換；和芳族殘基Phe和Tyr中的替代。關(guān)于哪種氨基酸變化 可能是表型沉默的指導(dǎo)，參見Bowie等，Science 247: 1306- 1310 (1990)。如本文所使用的，術(shù)語"雜交"通常是指核酸在合適的嚴(yán)格條件 下的雜交，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)探針序列和靶序列的性質(zhì)能容易 地明白的。雜交和洗滌條件是本領(lǐng)域熟知的，且通過改變溫育時(shí)間、 溫度和/或溶液的離子強(qiáng)度，可以根據(jù)需要的嚴(yán)格性容易地調(diào)節(jié)條 件。見，例如，Sambrook， J.等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989。條件的選擇取決于要雜交的序列的長(zhǎng)度，特別是探針序列的長(zhǎng) 度，核酸的相對(duì)G-C含量和允許的錯(cuò)配量。當(dāng)需要在具有更低程度 的互補(bǔ)性的鏈間進(jìn)行部分雜交時(shí)，優(yōu)選低嚴(yán)格性的條件。當(dāng)需要完全 的或接近完全的互補(bǔ)性時(shí)，優(yōu)選高嚴(yán)格性的條件。高嚴(yán)格性條件是 指，雜交溶液含有6X S.S.C.， 0.01 M EDTA， IX Denhardt氏溶液和0.5 %SDS。對(duì)于克隆的DNA片段，在約68匸雜交約3至4小時(shí)，而對(duì) 于總真核DNA，雜交約12至16小時(shí)。對(duì)于更低的嚴(yán)格性，將雜交 溫度降低到雙鏈體的解鏈溫度(Tm)以下約42<€。已知Tm是G-C含量、雙鏈體長(zhǎng)度以及溶液離子強(qiáng)度的函數(shù)。如本文所使用的，短語"與DNA或RNA分子的對(duì)應(yīng)部分雜交"是指，在合適的條件下，雜交的分子，例如，寡核苷酸、多核苷酸或 任何核苷酸序列(以有義或反義方向)識(shí)別另一種近似相同大小、且 與其具有足夠的序列相似性的核酸分子的序列并與之雜交，以實(shí)現(xiàn)雜 交。例如，100個(gè)核苷酸長(zhǎng)的有義分子將識(shí)別核苷酸序列的約100個(gè) 核苷酸的部分并與之雜交，只要2個(gè)序列之間具有約70%或更多的 序列相似性。應(yīng)當(dāng)明白，"對(duì)應(yīng)部分"的大小將允許雜交中的一些錯(cuò) 配，從而"對(duì)應(yīng)部分"可以小于或大于與其雜交的分子，例如比其大 或小20-30%、優(yōu)選比其大或小不超過約12-15%。本發(fā)明還提供了可以抑制或減少細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A 的表達(dá)的其它試劑。一種這樣的試劑包括小抑制性RNA( "siRNA")。 siRNA技術(shù)已經(jīng)作為反義寡核苷酸的可行替代方案而出現(xiàn)，因?yàn)橐_(dá) 到等同或優(yōu)于用反義寡核苷酸實(shí)現(xiàn)的阻抑水平，只需要更低的濃度(Thompson, 2002 )。已經(jīng)使用長(zhǎng)雙鏈RNA來沉默許多生物(例如 植物、線蟲和果蠅)中的特定基因的表達(dá)。稱作切酶(Dicer)的RNA 酶-III家族酶將這些長(zhǎng)雙鏈RNA加工成21-23個(gè)核苷酸的小干擾 RNA，然后將后者整合進(jìn)RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC) 。 siRNA 的解旋活化RISC，并允許單鏈siRNA通過堿基配對(duì)指導(dǎo)復(fù)合物到達(dá) 內(nèi)源mRNA。 RISC對(duì)內(nèi)源mRNA的識(shí)別導(dǎo)致它的切割，并隨后使它 不能用于翻譯。長(zhǎng)雙鏈RNA向哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的導(dǎo)入產(chǎn)生有效的抗 病毒反應(yīng)，這可以通過siRNA的使用來繞過(Elbashir等，2001 )。 siRNA已經(jīng)廣泛地用于細(xì)胞培養(yǎng)，且能常規(guī)地使特定基因表達(dá)減少90%或更多。siRNA的應(yīng)用還已經(jīng)在疾病的動(dòng)物模型中抑制基因表達(dá)方面得 到了普及。最近的研究證實(shí)，針對(duì)安光素酶的siRNA能阻斷出生后 小鼠的許多器官中共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒表達(dá)螢光素酶(Lewis等，2002)。 流體動(dòng)力學(xué)地注射進(jìn)小鼠尾靜脈中的針對(duì)Fas ( TNF家族的受體)的 siRNA，在最后一次注射后，能轉(zhuǎn)染超過80%肝細(xì)胞，并使肝中的 Fas表達(dá)降低90 o/q最多10天(Song等，2003 ) 。 Fas siRNA還能保 護(hù)小鼠免于肝纖維化和暴發(fā)性肝炎。通過使用針對(duì)TNF-a的 siRNA，抑制了用致死劑量的脂多糖處理的小鼠中的膿毒癥的發(fā)展 (S0rensen等，2003 )?？紤]到它們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)中的長(zhǎng)久效力、它們 的體內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的能力和它們對(duì)血清中的體內(nèi)降解的抗性，siRNA具 有成為非常有效的體外抑制特定基因表達(dá)的藥物的潛力(Bertrand 等，2002) 0本發(fā)明人已經(jīng)用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA轉(zhuǎn)染了 細(xì)胞，并研究了對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá)的作用。圖 99顯示，用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A s股NA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生產(chǎn)更 少的細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A蛋白。圖87-89顯示，在暴露于 喜樹堿和TNF- oc后，用細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A siRNA轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞群體具有比未用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A siRNA轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞更低的經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞百分比。因而，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方 案提供了，通過用包含細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA的載 體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，抑制細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A的表達(dá)。優(yōu)選的細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A的siRNA包括具有SEQ ID NO: 31、 31、 32和33的那些。其它的siRNA包括與列出的那些具有 相當(dāng)大的序列同一性的那些(即90%同源性)，或具有在高嚴(yán)格性 條件下與列出的SEQ ID NO雜交的序列的那些。上面針對(duì)本發(fā)明的 反義寡核苷酸，描述了相當(dāng)大的序列同一性和同源性的含義。如上面 針對(duì)本發(fā)明的反義寡核苷酸所述的，術(shù)語"細(xì)胞凋亡-特異性的eIF -5A的siRNA"包括功能變體或衍生物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知siRNA和包含siRNA的表達(dá)構(gòu)建體/載體 的送遞。在這里整體引作參考的美國(guó)申請(qǐng)2004/106567和 2004/0086884提供了許多表達(dá)構(gòu)建體/載體以及送遞機(jī)理，包括病毒 載體、非病毒載體、脂質(zhì)體送遞載體、質(zhì)粒注射系統(tǒng)、人工病毒被膜 和聚賴氨酸綴合物，這僅是舉幾個(gè)例子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解用于含有反義寡核苷酸或siRNA的 表達(dá)構(gòu)建體/載體的調(diào)節(jié)序列。例如，調(diào)節(jié)序列可以是組成型啟動(dòng)子、 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織-特異性的啟動(dòng)子或其組合。
通過用反義多核苷酸或siRNA細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A減 少哺乳動(dòng)物細(xì)胞中細(xì)胞凋亡-特異性的eIF — 5A的表達(dá)，細(xì)胞的細(xì)胞 凋亡減少。例如，用pHM6-LacZ或pHM6-細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了 RKO和RKO-E6細(xì)胞。用放線菌素D處理的 和用pHM6-細(xì)I^Tt-特異牧的eiF-5A^^^欣(^^的細(xì)^& 凋亡比用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染的但是未用放線菌素D處理的細(xì)胞增加 了 240。/。。用放線菌素D處理的和用pHM6-細(xì)胞凋亡-特異性的eIF -5A轉(zhuǎn)染的RKO-E6細(xì)胞的細(xì)胞凋亡比用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染的但 是未用放線菌素D處理的細(xì)胞增加了 105%。見圖36。圖37的圖說明了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，在RKO細(xì)胞中發(fā)生的細(xì)胞凋亡的 百分比。用pHM6-LacZ、 pHM6 -細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A、 pHM6 - elF5A2或pHM6 -截短的細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A瞬時(shí) 轉(zhuǎn)染了 RKO細(xì)胞。用pHM6-細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡比用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞增加了 25%。用 pHM6 - elF5A2或pHM6 -截短的細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒有明顯的所述增加。圖38的圖說明了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，在RKO細(xì)胞中發(fā)生的細(xì)胞凋亡的 百分比。RKO細(xì)胞未轉(zhuǎn)染，或者用pHM6-LacZ或pHM6-細(xì)胞凋 亡-特異性的elF-5A進(jìn)行了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。校正轉(zhuǎn)染效率后，60%的用 pHM6 一細(xì)胞凋亡—特異性的eIF — 5A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是細(xì)胞凋亡的。圖39提供了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后RKO細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)分析 結(jié)果。RKO細(xì)胞未轉(zhuǎn)染，或者用pHM6-LacZ、 pHM6-細(xì)胞凋亡 -特異性的elF-5A、 pHM6-eIF5A2或pHM6-截短的細(xì)胞凋亡-特異性的 eIF - 5A進(jìn)行了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。該表說明了基于每種方式(gate ) 的峰下面積計(jì)算出的經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞百分比。對(duì)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的 背景細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行校正后，80%的用pHM6-細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡。用pHM6-LacZ、 pHM6 - elF5A2或pHM6 -截短的細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞僅僅表現(xiàn)出背景水平的細(xì)胞凋亡。圖40顯示了其中RKO細(xì)胞用細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A( eIF -51) siRNA轉(zhuǎn)染隨后用放線菌素D處理(它誘導(dǎo)細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞凋 亡)的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。已用siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示了較少的elF-5A 表達(dá)、較少的p53表達(dá)、更多的bcl-2表達(dá)，以及與對(duì)照基因肌動(dòng)蛋白相同的表達(dá)水平。圖41提供了從用0.25yg/ml放線菌素D處理O、 3、 7、 24和48 小時(shí)的RKO細(xì)胞提取出的蛋白質(zhì)的蛋白印跡。上圖說明了使用抗-p 5 3作為第 一 抗體的蛋白印跡。中圖說聽了使用抗-細(xì)胞諷亡-特異 性的elF-5A作為第一抗體的蛋白印跡。下圖說明了化學(xué)發(fā)光檢測(cè)以 證實(shí)相同加載后用于考馬斯藍(lán)染色的抗-細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A印跡的膜。p53和細(xì)胞凋亡—特異性的eIF — 5A都通過放線菌素D 處理來上調(diào)。圖42顯示在用反義寡核苷酸1、2和3(細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A的)(分別為SEQ ID NO: 35、 37和39 )處理后的RKO細(xì)胞 產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水平。在已用反義細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A寡核苷 酸轉(zhuǎn)染后RKO細(xì)胞產(chǎn)生較少的凋亡-特異性-elF-5A以及較少的 p53。因此，圖36- 42顯示當(dāng)細(xì)胞群體中的細(xì)胞凋亡-特異性的eIF -5A表達(dá)減少時(shí)，所述細(xì)胞群體隨后用已知誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的化合物 處理，表達(dá)較少的細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A的細(xì)胞經(jīng)歷較少的細(xì) 胞凋亡。除了導(dǎo)致細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A的表達(dá)減少，本發(fā)明的反 義多核苷酸或siRNA還導(dǎo)致下列應(yīng)答TLR4、 IFN - YRa、 TNF -a、 IL-8、 TNFR-1、 p53、 iNOS和IL-l、 IL-12、 IFN - y 、 IL - 6和IL - 18的表達(dá)減少，STAT1 a和JAK1應(yīng)答的磷酸化減少， NF- kB p50活化減少，髓過氧化物酶水平降低，MIP-la水平降 低和BCL-2表達(dá)提高。許多重要的人疾病是由細(xì)胞凋亡控制的異常造成的。這些異?？?導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目的病理學(xué)增加(例如癌癥)或細(xì)胞的破壞性的喪失(例 如變性病)。作為非限制性的實(shí)例，本發(fā)明的方法和組合物可以通過 使用反義多核苷酸或針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA以 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A表達(dá)減少，經(jīng)由減少或抑制哺乳動(dòng) 物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物組織中細(xì)胞凋亡-特異性的eIF- 5A的 表達(dá)，用于預(yù)防或治療具有下述與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病和病癥的受試 者神經(jīng)學(xué)的/神經(jīng)變性病(例如，阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷 頓舞蹈病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(Lou Gehrig氏病))、自身免疫病 (例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、多發(fā)性硬化)、 杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元障礙、缺血、心臟缺血、慢 性心力衰竭、中風(fēng)、嬰兒脊髓性肌萎縮、心搏停止、腎衰竭、特應(yīng)性 皮炎、膿毒癥和膿毒性休克、AIDS、肝炎、青光眼、糖尿病(l型和 2型)、孝喘、色素性視網(wǎng)膜炎、骨質(zhì)疏松癥、異種移植物排斥和燒 傷。一種這樣的由細(xì)胞凋亡控制的異常造成的疾病是青光眼。各種眼 組織中的細(xì)胞凋亡是造成青光眼患者失明的關(guān)鍵性因素。青光眼是一 組由視神經(jīng)損傷造成的眼狀況，其導(dǎo)致進(jìn)行性失明。已經(jīng)顯示，細(xì)胞 凋亡是該視神經(jīng)損傷的直接原因。青光眼研究領(lǐng)域的早期工作已經(jīng)表明，升高的眼內(nèi)壓("IOP") 造成在篩板(多孔的、膠原結(jié)締組織)水平上對(duì)軸突運(yùn)輸?shù)母蓴_，隨 后是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡。Quigley和Anderson (1976)「& Sc/.， 15， 606 — 16; Minckler， Bunt，和IClock， (1978) T""veW. Pp/^/ra/nio/. K/s. iSc/" 17, 33 — 50 ; Anderson和Hendrickson， (1974) /ai額/. 0盧Afl/歸/. m 13， 771 - 83 ; Quigley等，(1980) J"veW. ppA狄/i/附0/. Sc/" 19， 505 — 17。青光目艮動(dòng)物模型和死后人 組織的研究表明，青光眼中的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡通過細(xì)胞凋亡 發(fā)生。Garcia - Valenzuela等,(1995) J 平￡>e61， 33 - 44; Quigley等，(1995) O盧/ifl/附C 36,774 - 786 ;Monard， (1998) In: Haefliger IO， Flammer J (eds) A7/r/c 6te/e "/id /" 尸威oge"^s/s G7"wco附a， New York, NY，Lippincott - Raven， 213-220。升高的IOP造成的軸突運(yùn)輸?shù)闹袛啵?可能通過剝奪營(yíng)養(yǎng)因子而導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡。Quigley， (1995) ^"W7VZ/0/^,Afl/附o/，23(2)，85-91。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，青光眼中的視神 經(jīng)乳頭星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生提高水平的一些神經(jīng)毒性物質(zhì)。例如，已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)了腫瘤壞死因子-a (TNF - a) (Yan等，(2000) Jrc/i. 0/^Aa/wo/.， 118， 666 - 673)和產(chǎn)生氧化氮的酶氧化氮合酶(Neufeld 等，(1997)血c^. OpMa/腳/" 115， 497 - 503)在青光眼視神經(jīng)乳頭中 的提高的生產(chǎn)。另外，已經(jīng)在遺傳性視網(wǎng)膜病的大鼠模型中觀察到了 活化的視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)可謙導(dǎo)形式的氧化氮合酶(iNOS)和
TNF-a的提高的表達(dá)。Cotinet等，(1997) G/iVi， 20， 59 - 69 ; de Kozak等，(1997) Oc"/. /附附tmo/. /"^7 附/ .， 5， 85- 94 ; Goureau等, (1999)/. A^"fY c/^附，72， 2506- 2515。在青光眼的視神經(jīng)乳頭中，已 經(jīng)將過量的氧化氮與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突變性相關(guān)聯(lián)。Arthur 和Neufeld， (1999) Si/rv 0盧W腳/， 43 (Suppl 1)， S129 - S135。最后， 已經(jīng)顯示，模擬的缺血或升高的流體靜力壓引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì) 胞對(duì)TNF-a的升高的生產(chǎn)，誘導(dǎo)共培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞 凋亡。Tezel和Wax, (2000) /. iVeim7sc/" 20 (23)， 8693 - 8700。正在研究保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受細(xì)胞凋亡的變性，作為對(duì)青 光眼引起的失明的潛在新治療/預(yù)防。反義寡核苷酸已經(jīng)成功地用于 眼病的動(dòng)物模型。在瞬時(shí)全視網(wǎng)膜缺血的模型中，天冬氨酸特異性半 胱氨酸蛋白酶2的表達(dá)在缺血過程中得到了提高，主要是在視網(wǎng)膜 的內(nèi)核和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。如通過視網(wǎng)膜電流圖鐠所確定的，使用反義 寡核苷酸阻抑天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶導(dǎo)致顯著的組織病理 學(xué)的和功能的改善。Singh等，(2001) J. Neurochem" 77 (2)， 466-75。另一個(gè)研究證實(shí)，在視神經(jīng)轉(zhuǎn)染后，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上調(diào)促細(xì) 胞凋亡蛋白Bax并經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。在處理視神經(jīng)后，將Bax反義寡 核苷酸重復(fù)注射進(jìn)大鼠的顳半側(cè)上視網(wǎng)膜抑制Bax的局部表達(dá)，并增 加存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目。Isenmann等，(1999)Cell Death Differ" 6 (7). 673-82。通過將寡核苷酸被嚢化在脂質(zhì)體中，然后通過融合給后者包被滅 活的日本血凝病毒(HVJ;仙臺(tái)病毒)的被膜(HVJ脂質(zhì)體)，已經(jīng)改善 了反義寡核苷酸向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的送遞。給小鼠玻璃體內(nèi)注射 被嚢化在HVJ脂質(zhì)體中的FITC-標(biāo)記的反義寡核普酸，在44%神 經(jīng)節(jié)層細(xì)胞中產(chǎn)生持續(xù)3天的高熒光，而棵FITC-標(biāo)記的反義寡核 苷酸的熒光則在1天后消失。Hangai等，(1998)爿rcA OpA,/^/附o/， 116 (7)， 976。本發(fā)明的一種方法涉及預(yù)防或減少眼細(xì)胞和組織中的細(xì)胞凋 亡，例如但不限于星形膠質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)膠 質(zhì)細(xì)胞和篩板。青光眼中的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡通過細(xì)胞凋亡發(fā) 生，且這導(dǎo)致失明。因而，提供抑制或減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的細(xì) 胞凋亡或通過保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受細(xì)胞凋亡變性的方法，提供
了預(yù)防由青光眼引起的失明的新治療。該方法涉及阻抑細(xì)胞凋亡 -特異性的elF-5A的表達(dá)以減少細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A是有效的基因，它似乎能調(diào)節(jié)整個(gè)細(xì)胞凋亡過程。因而，通過阻 斷細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá)控制視神經(jīng)乳頭的細(xì)胞凋亡 提供了青光眼的治療。通過將人細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的反義寡核苷酸或 siRNA施用給眼細(xì)胞，例如但不限于篩板、星形膠質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜 神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，可以阻抑細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A的表達(dá)。反義寡核苷酸和siRNA的定義如上，即具有編碼至 少部分細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A多肽的核苷酸序列。示例性的用 于本發(fā)明的該方面的反義寡核苷酸包含SEQ ID NO : 26或27或在高 嚴(yán)格性條件下結(jié)合與SEQIDNO:26或27互補(bǔ)的序列、且抑制細(xì)胞 凋亡-特異性的eIF-5A的表達(dá)的寡核苷酸。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了阻抑篩板細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡-特異性的eIF -5A的表達(dá)的方法。將靶向人細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的反義 寡核苷酸或siRNA (例如但不限于SEQID NO : 26和27 )施用給篩 板細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 細(xì)胞可以是人源的。圖77A和B顯示篩板細(xì)胞中熒光標(biāo)記的反義寡核苷酸的成功攝 入。圖86A和B顯示在有或沒有血清存在的情況下，篩板細(xì)胞攝入 標(biāo)記的siRNA。圖78- 82、 84-85和88顯示了幾次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中篩板細(xì)胞 用針對(duì)細(xì)胞凋亡—特異性的eIF — 5A的反義多核苷酸和喜樹堿(誘導(dǎo) 細(xì)胞凋亡的試劑)處理。該結(jié)果顯示與未用反義細(xì)胞凋亡-特異性的 elF- 5A的寡核苷酸處理的細(xì)胞相比，已用反義細(xì)胞凋亡-特異性的 eIF — 5A的寡核苷酸處理的細(xì)胞中經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞百分比減 少。如圖所示，使用不同的時(shí)程和喜樹堿濃度。還測(cè)試了幾種不同的 篩板細(xì)胞系(細(xì)胞系506和517)。作為對(duì)照，用TNF- a和/或喜 樹堿處理圖篩板細(xì)胞，這導(dǎo)致經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞數(shù)目增加。見圖83 和92。以40,000細(xì)胞/孔，將篩板細(xì)胞系#506細(xì)胞接種到8 -孑L培 養(yǎng)載玻片上。3天后，用10 ng/ml TNF - oc 、 50 nM喜樹堿或10 ng/mlTNF- oc + 50 pM喜樹堿，處理匯合的LC細(xì)胞。將等體積的 DMSO、喜樹堿的載體對(duì)照加入未處理的對(duì)照細(xì)胞。處理后48小時(shí)， 用Hoescht 33258對(duì)細(xì)胞染色，并使用紫外線濾色片，通過熒光顯微 鏡術(shù)觀察。將具有明亮地染色的凝聚的或破碎的核的細(xì)胞記作細(xì)胞凋 亡的。圖94顯示用細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A的siRNA處理的細(xì)胞 生產(chǎn)更少的細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A蛋白。以10，000細(xì)胞/孔， 將篩板細(xì)胞#506和#517細(xì)胞接種到24-孔平板上。3天后，用 GAPDH siRNA、細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A siRNA # 1 - 4( SEQ ID NO: 30-33)或?qū)φ誷iRNA#5 (SEQ ID NO: 34)轉(zhuǎn)染LC細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染后3天，收獲蛋白裂解物，通過SDS-PAGE,從每份樣品分離 了5^ig蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用抗-elF-5A抗體進(jìn)行蛋白 印跡。通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)了結(jié)合的抗體，并曝光于x-射線膠片。剝 離膜，并用抗-P -肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)部加載對(duì)照，重新印跡。因此如所預(yù)期的，與用反義多核普酸見到的結(jié)果類似，導(dǎo)致細(xì)胞 凋亡-特異性的eIF - 5A表達(dá)減少的針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A的siRNA與對(duì)照相比也導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少。見圖88-89。圖90 顯示了從圖89和實(shí)施例13所述的實(shí)驗(yàn)得到的用siRNA轉(zhuǎn)染、并用 喜樹堿和TNF- oc處理的Hoescht-染色的篩板細(xì)胞系#506的照 片?？吹降母髁恋厝旧募?xì)胞是凋亡的細(xì)胞。因?yàn)槿旧|(zhì)凝聚，它 們具有更小的核，且在形狀上更小和不規(guī)則。圖91通過免疫熒光表征了篩板細(xì)胞。通過免疫熒光，表征了從 83歲男性的視神經(jīng)乳頭分離的篩板細(xì)胞(#506)。第一抗體是a) 肌動(dòng)蛋白；b)纖連蛋白；c)層粘連蛋白；d)GFAP。所有照片都 是在400倍放大倍數(shù)時(shí)拍攝的。圖93顯示了在喜樹堿或TNF- oc+喜樹堿處理過程中，細(xì)胞凋亡 -特異性的eIF-5A的表達(dá)水平。該圖顯示細(xì)胞凋亡-特異性的eIF -5A作為喜樹堿和TNF- oc處理的結(jié)果上調(diào)，而對(duì)照基因肌動(dòng)蛋白 的表達(dá)水平保持不變。以40,000細(xì)胞/孔，將篩板細(xì)胞#506細(xì)胞接 種到24-孔平板上。3天后，用50jiM喜樹堿或10ng/mlTNF- ot + 50 pM喜樹堿處理LC細(xì)胞，并在l、 4、 8和24小時(shí)后，收獲蛋白 裂解物。將等體積的DMSO加入對(duì)照細(xì)胞中作為載體對(duì)照，并在1 和24小時(shí)后收獲細(xì)胞裂解物。通過SDS-PAGE，從每份樣品分離 了 5jig蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用抗-細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A抗體進(jìn)行蛋白印跡。通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)了結(jié)合的抗體，并曝光 于x-射線膠片。然后剝離膜，并用抗-P -肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)部加載 對(duì)照，重新印跡。圖95 (細(xì)胞系#506)和圖96 (細(xì)胞系517)顯示，與未用細(xì)胞 凋亡-特異性的eIF - 5A siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，用細(xì)胞凋亡-特異 性的elF-5A siRNA處理的細(xì)胞在喜樹堿和TNFa處理后細(xì)胞凋亡 的百分比較小。以7500細(xì)胞/孔，將篩板細(xì)胞系#506細(xì)胞接種到8 -孔培養(yǎng)載玻片上。3天后，用GAPDH siRNA、細(xì)胞凋亡-特異性 的eIF - 5A siRNA # 1 - 4 ( SEQ ID NO: 30 - 33 )或?qū)φ誷iRNA # 5(SEQIDNO:34)轉(zhuǎn)染了 LC細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，用10 ng/ml TNF -oc十50jiM喜樹堿處理轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。24小時(shí)后，用Hoescht 33258 對(duì)細(xì)胞染色，并使用紫外線濾色片，通過熒光顯微鏡術(shù)觀察。將具有 明亮地染色的凝聚的或破碎的核的細(xì)胞記作細(xì)胞凋亡的。該圖代表了 n-4獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖97a - d顯示了用細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A siRNA # 1轉(zhuǎn)染 的和用TNF- a和喜樹堿處理的篩板細(xì)胞系#506細(xì)胞的TUNEL-標(biāo)記。該圖顯示在siRNA處理的細(xì)胞中存在較少的細(xì)胞凋亡(較少 的核碎裂)。以7500細(xì)胞/孔，將篩板細(xì)胞系#506細(xì)胞接種到8-孔培養(yǎng)載玻片上。3天后，用細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A siRNA弁1(SEQ ID NO: 30 )或?qū)φ誷iRNA # 5 ( SEQ ID NO: 34 )轉(zhuǎn)染了 LC 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，用10 ng/ml TNF - a+50 jiM喜樹堿處理轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞。24小時(shí)后，用Hoescht 33258對(duì)細(xì)胞染色，并使用末端脫 氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶-介導(dǎo)的dUTP -洋地黃毒苷切口末端標(biāo)記(TUNEL)方法，原位評(píng)價(jià)了 DNA斷裂。圖A代表著使用熒光素 濾色片，通過熒光顯微鏡術(shù)觀察到的載玻片，以顯現(xiàn)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞 的斷裂的DNA的TUNEL-標(biāo)記。圖B代表著通過紫外線濾色片觀 察到的相同的載玻片，以顯現(xiàn)Hoescht-染色的核。該結(jié)果代表著2 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。所有圖片都是在400倍放大倍數(shù)時(shí)拍攝的。圖59和60中的條線圖顯示細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A和增殖 elF-5A都在心臟組織中表達(dá)。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡-特異
性的elF-5A水平與缺血的心臟組織中的高水平的2種細(xì)胞因子(白 細(xì)胞介素1-P "IL-1P"和白細(xì)胞介素18 "IL-18")相關(guān)聯(lián)， 因而進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A參與細(xì)胞死亡，因?yàn)?它存在于缺血的心臟組織中。在非缺血的心臟組織中，沒有看到該細(xì) 胞凋亡-特異性的eIF-5A/白細(xì)胞介素關(guān)聯(lián)。圖61和"中的條線圖 顯示了在缺血前的心臟組織和缺血后的心臟組織中，通過實(shí)時(shí)PCR 測(cè)得的細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A( eIF - 5A1 )與增殖eIF - 5A( eIF -5A2)比較的基因表達(dá)水平。Y-軸是pg/ng 18s(信使RNA的皮 克數(shù)比核糖體RNA 18S的納克數(shù))。這些圖中說明的結(jié)果顯示細(xì)胞 凋亡-特異性的eIF - 5A在缺血的心臟組織中優(yōu)先上調(diào)。圖65顯示了 IL-18在人心肌中的定位。圖66顯示缺血/再灌注 誘導(dǎo)人心房組織中合成IL-18。圖62A-F顯示了細(xì)胞凋亡-特異性 的eIF - 5A和IL - 1 P和IL - 18之間的關(guān)聯(lián)。使用PCR測(cè)量，在各 種缺血的心臟組織(來自冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)和瓣膜(二尖瓣和心房 瓣)換置術(shù)患者)中測(cè)量了細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A和增殖elF 一5A ( "elF-5A2")-另一種同工型)、IL — 1 P和IL — 18的水 平，并進(jìn)行了對(duì)比。因此，似乎細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的水平 提高與IL - 1 P和IL - 18的水平提高相關(guān)。細(xì)胞凋亡-特異性的eIF -5A與這些有效的白細(xì)胞介素的關(guān)聯(lián)進(jìn)一步表明，通過控制細(xì)胞凋 亡 -特異性的elF-5A的水平，可以控制缺血中的炎癥和細(xì)胞凋亡途 徑。調(diào)節(jié)/減少/抑制細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的上調(diào)(即用本發(fā) 明的反義多核苷酸或siRNA)將導(dǎo)致IL-18的上調(diào)減少。IL-18和 其他細(xì)胞因子的水平導(dǎo)致缺血心臟中的損傷，并且因此IL-18和其 他細(xì)胞因子的水平降低將導(dǎo)致較少的缺血損傷。(見，圖67顯示ICE 抑制劑(白細(xì)胞介素-1(3轉(zhuǎn)化酶)的存在減少缺血/再灌注損傷；圖 68顯示由IL - 18BP (IL - 18的內(nèi)源性抑制劑)中和IL - 18減少缺 血/再灌注損傷；圖69顯示當(dāng)暴露于TNF-a時(shí)，心臟組織收縮力隨 著時(shí)間的過去而減少；圖70顯示IL-18BP減少了 TNF-a誘導(dǎo)的心 肌阻抑；圖71顯示IL-18BP減少了 IL-1(3誘導(dǎo)的心肌阻抑；且圖 72顯示通過抑制IL - 1(3和IL - 18的加工或抑制IL - 1(3和IL18活性 在實(shí)施缺血/再灌注的心房組織中保留了肌酸激酶活性(CK))。因 此，通過用反義核苷酸或sIRNA降低細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的水平，在缺血性組織中產(chǎn)生較少的IL-18和其他細(xì)胞因子，并將 因此導(dǎo)致來自缺血的組織損傷的減少。人外周血單核細(xì)胞(PBMC)正常表達(dá)非常低水平的eIF-5A， 但是在用T-淋巴細(xì)胞-特異性的刺激進(jìn)行刺激后，細(xì)胞凋亡-特異 性的elF-5A的表達(dá)急劇增加，該事實(shí)提示了細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A參與免疫反應(yīng)的其它證據(jù)(Bevec等，1994)。這暗示了細(xì) 胞凋亡-特異性的elF-5A在T-細(xì)胞增殖和/或活化中的作用。由 于活化的T細(xì)胞能生產(chǎn)許多種類的細(xì)胞因子，所以也可能需要細(xì)胞凋 亡-特異性的elF-5A作為細(xì)胞因子mRNA的核質(zhì)穿梭機(jī)制。上面 引用的文章的作者還在HIV-1患者的PBMC中發(fā)現(xiàn)了高水平的 elF5A，這可能有助于這些細(xì)胞中的有效的HIV復(fù)制，因?yàn)橐呀?jīng)證實(shí) 了 elF5A是HIV Rev蛋白的細(xì)胞結(jié)合因子，且為HIV復(fù)制所必需 (Ruhl等，1993 )。最近，發(fā)現(xiàn)在樹突細(xì)胞成熟過程中會(huì)升高eIF-5A表達(dá)(Kruse 等，2000)。樹突細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞，其可以敏化輔助和殺傷T細(xì) 胞，以誘導(dǎo)T細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫(Steinman，1991)。未成熟的樹突 細(xì)胞缺乏刺激T細(xì)胞的能力，且需要適當(dāng)?shù)拇碳?即炎癥細(xì)胞因子和 /或微生物產(chǎn)品)來成熟成為能活化T細(xì)胞的細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)脫氧8-羥 —2,7,10 —三氨基癸酸合酶(需要該酶來活化細(xì)胞凋亡-特異性的eIF -5A)的抑制劑通過預(yù)防CD83表面表達(dá)，來抑制樹突細(xì)胞對(duì)T淋 巴細(xì)胞的活化(Kruse等，2000)。因而，細(xì)胞凋亡-特異性的eIF -5A可以通過發(fā)揮CD83 mRNA的核質(zhì)穿梭機(jī)制的作用，促進(jìn)樹突 細(xì)胞成熟。在這2項(xiàng)暗示eIF — 5A在免疫系統(tǒng)中的作用的研究中(Bevec等， 1994; Kruse等，2000)，作者沒有說明或鑒別他們研究的是eIF-5A的哪種同工型，他們也沒有理由這樣做。如上面所討論的，已知 人類具有elF5A的2種同工型，細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A( "eIF -5A1")和增殖elF-5A( "eIF - 5A2" ) ， 二者都在分開的染色 體上編碼。在本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)之前，認(rèn)為這2種同工型是功能上冗余 的。Bevec等描述的用于檢測(cè)刺激的PBMC中的elF5A mRNA的寡 核苷酸與人細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A具有100°/。同源性，且該研 究發(fā)生在增殖elF-5A的克隆之前。類似地，Kruse等描述的用于 在樹突細(xì)胞成熟過程中通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)elF5A的引物 與人細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A具有100%同源性。本發(fā)明涉及控制細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá)，以控制樹 突細(xì)胞成熟和PBMC活化的速度，這又可以控制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫 的速度。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)于免疫系統(tǒng)是關(guān)鍵的，因?yàn)樗鼈兛梢?識(shí)別、并通過外來侵入物變得活化/受激、并產(chǎn)生細(xì)胞因子以使免疫 系統(tǒng)的其他部分警醒。用PMA處理、并隨后用LPS刺激PBMC，以使其具有提高的細(xì) 胞凋亡-特異性的elF-5A表達(dá)。關(guān)于蛋白印跡見圖121。圖122顯 示這種提高的表達(dá)與提高的TNF生產(chǎn)相一致。圖123證實(shí)PBMC能 對(duì)LPS響應(yīng)，而無PMA分化。圖124顯示了用細(xì)胞凋亡-特異性 的elF-5A siRNA轉(zhuǎn)染的PBMC證實(shí)了細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A的表達(dá)的阻抑，且圖125顯示細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的阻 抑與減少的TNF生產(chǎn)相一致。因此，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的反 義多核苷酸或siRNA來減少PBMS中細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A 表達(dá)的方法，這又導(dǎo)致TNF表達(dá)減少或下調(diào)。本發(fā)明人還使用U-937細(xì)胞系，研究了細(xì)胞凋亡-特異性的eIF -5A在單核細(xì)胞分化成貼壁的巨噬細(xì)胞中的作用，這是因?yàn)橐阎猆 - 937表達(dá)eIF - 5A mRNA ( Bevec等，1994 ) 。 U - 937是一種人單 核細(xì)胞細(xì)胞系，其能懸浮生長(zhǎng)，且在用PMA刺激后，能變成貼壁的， 并分化成巨噬細(xì)胞。當(dāng)通過改變培養(yǎng)基來去除PMA時(shí)，細(xì)胞會(huì)變成 休眠的，然后能生產(chǎn)細(xì)胞因子(Barrios - Rodiles等，J. Immunol.， 163:963-969 ( 1999))。作為對(duì)脂多糖(LPS )的響應(yīng)，所述脂多糖是在許多細(xì)菌的外膜上發(fā)現(xiàn)且已知誘導(dǎo)普通的炎癥應(yīng)答的一種因 子，巨噬細(xì)胞生產(chǎn)TNF- a和IL-1P兩者(Barrios - Rodiles等， 1999)。見圖176，該圖顯示了干細(xì)胞分化和造成的細(xì)胞因子的生產(chǎn)。 在LPS-刺激后，U-937細(xì)胞也生產(chǎn)IL-6和IL-10 (Izeboud等， J. Receptor & Signal Transduction Research, 19 ( 1 - 4 ) : 191 一 202. (1999))。使用U- 937細(xì)胞，顯示細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A在單核細(xì) 胞分化和TNF- ot分泌過程中受到上調(diào)。見圖127，和129- 130。用 細(xì)胞凋亡-特異性的elF - 5A siRNA阻抑細(xì)胞凋亡-特異性的elF - 5A蛋白表達(dá)。見圖131。通過關(guān)于細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A、 toll -樣受體4 (TLR4)、腫瘤壞死因子受體(TNF-R1)和干擾素y受 體(IFNy-Roc )的表達(dá)的蛋白印跡比較對(duì)照siRNA和細(xì)胞凋亡-特 異性的eIF-5A siRNA-處理的細(xì)胞。通過ELISA和液相電化學(xué)發(fā) 光(ECL)對(duì)細(xì)胞因子TNF、白細(xì)胞介素-1|3 (IL- ip) 、 IL-6 和IL-8進(jìn)行定量。結(jié)果顯示，相對(duì)于用對(duì)照siRNA處理的細(xì)胞，用細(xì)胞凋亡-特 異性的eIF - 5A siRNA處理特異性地下調(diào)了細(xì)胞凋亡-特異性的eIF -5A蛋白表達(dá)超過80。/。。 PMA、 LPS和IFN-y處理誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 -特異性的elF-5A蛋白表達(dá)。細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A表達(dá) 減少的細(xì)胞還顯示TLR4 (圖132) 、 TNF-Rl (圖134 )和IFNy-Ra(圖133)蛋白表達(dá)減少。初期實(shí)驗(yàn)還提示在細(xì)胞凋亡-特異性的 eIF-5A表達(dá)減少的細(xì)胞中，LPS-誘導(dǎo)的TNFa表達(dá)在3小時(shí)時(shí)減 少(圖135 )，和LPS -誘導(dǎo)的IL - 1(3 (圖136 )和IL - 8產(chǎn)生在24 小時(shí)時(shí)減少(圖137)。這些研究表明細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A 可能涉及許多關(guān)鍵細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(包括受體(TLR4、 TNF -Rl和IFNy-Ra)和細(xì)胞因子(TNFa、 IL-l(3和IL-8))的翻 譯后調(diào)節(jié)。圖138顯示IL-6生產(chǎn)不依賴于siRNA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 -特異性的eIF-5A的下調(diào)。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供抑制或延遲巨噬細(xì)胞的成熟，以抑 制或減少細(xì)胞因子生產(chǎn)的方法。該方法包含提供能減少細(xì)胞凋亡 -特 異性的elF-5A的表達(dá)的試劑。因?yàn)榧?xì)胞凋亡-特異性的elF-5A 在單核細(xì)胞分化和TNF- a分泌的過程中受到上調(diào)，所以認(rèn)為細(xì)胞 凋亡-特異性的elF-5A是發(fā)生這些事件所必需的。因而，通過減少 細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A表達(dá)，可以減少單核細(xì)胞分化和TNF -oc分泌?？梢允褂媚軠p少細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A的表達(dá)的任 意試劑，這包括但不限于，且優(yōu)選如本文所述的針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異 性的eIF - 5A的反義寡核苷酸或siRNA。本發(fā)明人也已經(jīng)使用已知能可預(yù)測(cè)地對(duì)特定刺激產(chǎn)生響應(yīng)從而 生產(chǎn)細(xì)胞因子的細(xì)胞系，在體外研究了人細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A通過發(fā)揮細(xì)胞因子mRNA的核質(zhì)穿梭機(jī)制的作用來促進(jìn)細(xì)胞因 子的翻譯的能力。 一些近期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，人肝細(xì)胞系可以通過誘
導(dǎo)其它細(xì)胞因子的生產(chǎn)，而對(duì)細(xì)胞因子刺激產(chǎn)生響應(yīng)。HepG2是充 分表征的對(duì)細(xì)胞因子敏感的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系。作為對(duì)IL- 1 P的響 應(yīng)，H印G2細(xì)胞能以劑量依賴性的方式迅速生產(chǎn)TNF- cc mRNA和 蛋白(Frede等，1996; Rowell等，1997; Wordemann等，1998)。 因而，使用HepG2細(xì)胞作為模型系統(tǒng)，來研究對(duì)TNF- oc生產(chǎn)的 調(diào)節(jié)。本發(fā)明人已經(jīng)顯示，抑制HepG2細(xì)胞中的人細(xì)胞凋亡-特異 性的eIF-5A表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞在已經(jīng)轉(zhuǎn)染了針對(duì)細(xì)胞凋亡因子-特異 性的elF-5a的反義寡核苷酸后，生產(chǎn)更少的TNF- a。參見圖100。因而，本發(fā)明的方法可用于減少細(xì)胞因子的水平。該方法包含施 用能減少細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá)的試劑。減少細(xì)胞凋亡 -特異性的elF-5A的表達(dá)，也減少細(xì)胞因子的表達(dá)，并從而導(dǎo)致細(xì) 胞生產(chǎn)減少量的細(xì)胞因子。細(xì)胞因子優(yōu)選地是促炎細(xì)胞因子，包括但 不限于IL-1、 IL-18、 IL-6和TNF-ot。合適的試劑是如上所討 論的，并包括細(xì)胞凋亡—特異性的eIF - 5A的反義寡核苷酸和人細(xì)胞 凋亡-特異性的eIF - 5a的siRNA。另外，本發(fā)明提供了治療特征在于升高的IL-1、 TNF-oc、 IL -6或il- 18水平的病理學(xué)狀況的方法，其包含給患有所述病理學(xué) 狀況的哺乳動(dòng)物施用如上所述的減少細(xì)胞凋亡-特異性的eIF- 5A 的表達(dá)的試劑(反義寡核苷酸和siRNA)。已知的特征在于升高的IL - 1、 TNF- oc或il-6水平的病理學(xué)狀況包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎、哮喘、變態(tài)反應(yīng)、動(dòng)脈炎癥、Crohn氏病、炎性腸 疾病(ibd)、潰瘍性結(jié)腸炎、冠心病、嚢性纖維化、糖尿病、狼瘡、 多發(fā)性硬化、格雷夫斯病、牙周炎、青光眼和黃斑變性、眼表面病 (ocular surface disease)(包括圓錐形角膜)、器官缺血(心臟、 腎臟)、再灌注損傷、膿毒癥、多發(fā)性骨髓瘤、器官移植排斥、牛皮 癬和濕滲。例如，炎性腸疾病的特征在于部分通過由腸上皮細(xì)胞釋放 的促炎細(xì)胞因子和趨化因子引起的組織損傷。干擾素y (ifn- y )是由自然殺傷(nk)細(xì)胞和t淋巴細(xì)胞 產(chǎn)生的細(xì)胞因子，它在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中起著中心作用。IFN-y在敏 感細(xì)胞中誘導(dǎo)各種應(yīng)答，包括抗病毒、抗增殖和免疫-調(diào)節(jié)活性。IFN -y與其受體(ifn- yR)的結(jié)合導(dǎo)致Janiis激酶jak1和jak2 的自磷酸化作用。認(rèn)為jak1在酪氨酸殘基1022和1023處的磷酸化涉及催化事件的活化(Liu等，( 7 ) : 817 - 826 ( 1997 ))。 IFN - yR由命名為IFN - yRoc和IFN - yRP的至少2條鏈組成。 該受體與其配體IFN- y的結(jié)合導(dǎo)致JAK1的自磷酸化作用，這導(dǎo)致 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT )轉(zhuǎn)錄因子的募集和酪氨酸磷酸化。 STAT轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化導(dǎo)致STAT的二聚作用和核轉(zhuǎn)運(yùn)，在核中它 隨后與耙啟動(dòng)子上游元件結(jié)合以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。JAK-STAT途徑代表了 抗炎療法的良好靶，因?yàn)楦淖僇AK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)可以減少細(xì)胞因 子-誘導(dǎo)的促炎應(yīng)答，并且ifn- y的不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)被認(rèn)為促進(jìn)自身 免疫性病癥。腸上皮細(xì)胞在正常生理?xiàng)l件下對(duì)天然的腸內(nèi)菌群的產(chǎn)物包括脂 多糖(LPS)低反應(yīng)性。IFN - Y似乎能夠使得腸上皮細(xì)胞對(duì)LPS應(yīng) 答，因?yàn)樗鼘?dǎo)致細(xì)胞因子例如il-8和tnf- oc的產(chǎn)生。ifn- y能 夠恢復(fù)腸上皮細(xì)胞的LPS敏感性的一種機(jī)制是通過提高M(jìn)D-2和 Toll受體4 ( TLR4 ) (2種LPS識(shí)別所需蛋白質(zhì))的表達(dá)來提高LPS 的攝入(Suzuki等，/附附""/(v,. ( 71 ) : 3503 — 3511(2003))。認(rèn)為增強(qiáng)的Thl細(xì)胞因子例如IFN- y的產(chǎn)生促進(jìn)表征 炎性腸疾病的慢性炎癥，所述細(xì)胞因子導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞對(duì)共生的細(xì)菌 的微生物產(chǎn)物改變應(yīng)答性。本發(fā)明人已顯示當(dāng)HP-29細(xì)胞(人上皮細(xì)胞系)暴露于IFN-Y和LPS時(shí)，針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA導(dǎo)致TNF-a表達(dá)的減少(圖101-102， 108)。另外，本發(fā)明人已顯示當(dāng) hp-29細(xì)胞(人上皮細(xì)胞系)暴露于ifn- y和tnf- oc時(shí)，針對(duì) 細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA導(dǎo)致IL-8表達(dá)的減少(圖 103和104)。本發(fā)明人還顯示用針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A 的siRNA轉(zhuǎn)染并暴露于IFN的HT - 29細(xì)胞表達(dá)較少的TNFR1 (圖 111)、較少的iNOs蛋白(圖112)、較少的TLR4(圖113和117)、 和較少的IFN - yRoc (圖116) mRNA。炎癥中包括的另一種分子是nfk - P (也稱作NKk - P或nfkB) 。 NFkP是炎癥的重要細(xì)胞-信號(hào)傳導(dǎo)分子，因?yàn)樗幕罨T 導(dǎo)COX-2的表達(dá)，后者導(dǎo)致組織炎癥。認(rèn)為負(fù)責(zé)在炎癥部位大量生 產(chǎn)前列腺素的COX-2-編碼基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上受NFkB的 調(diào)節(jié)。NFkB存在于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，且結(jié)合在它的抑制劑上。有
害的和炎癥的刺激從抑制劑釋放出NFkB。 nfkb移動(dòng)進(jìn)核中，并 活化負(fù)責(zé)表達(dá)COX-2的基因。因而，通過減少NFk P的水平，可 以減少炎癥。在本發(fā)明人的一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用靶向細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-SA 的siRNA處理了人上皮細(xì)胞(HT-29細(xì)胞)。然后，通過加入TNF 或干擾素Y和LPS處理1小時(shí)，由NFKB誘導(dǎo)了炎癥。該實(shí)驗(yàn)的結(jié) 果顯示，用siRNA抑制細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá)，減少 了干擾素Y和LPS活化的NFkB的水平。見圖106和114。本發(fā)明人還已證實(shí)通過Hoechst染色和TUNEL標(biāo)記，用針對(duì)細(xì) 胞凋亡-eIF - 5A的siRNA轉(zhuǎn)染的HT - 29細(xì)胞在暴露于IFN - y和 TNF- oc后顯示了細(xì)胞凋亡的減少。見圖109。圖118還證實(shí)siRNA -介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A表達(dá) 的阻抑導(dǎo)致響應(yīng)于IFN- v處理的STATloc和JAK1的磷酸化的減 少。用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A siRNA降低IFN - y -刺激的 TLR4的上調(diào)與前述數(shù)據(jù)相一致，所述前述數(shù)據(jù)證實(shí)細(xì)胞凋亡-特異 性的elF-5A siRNA減少HT - 29細(xì)胞中響應(yīng)于IFN - y和LPS的 NF- kB p50活化和TNF- a產(chǎn)生。該數(shù)據(jù)與細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A通過JAK-STAT途徑調(diào)節(jié)IFN - y信號(hào)傳導(dǎo)的理論相一 致。因此用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá)干擾阻止了 IFN- Y -刺激的TLR4的上調(diào)(這是結(jié)腸上皮細(xì)胞檢測(cè)LPS所必需的)并 且細(xì)胞因此保留了對(duì)LPS的低反應(yīng)性。因此，NFicBp50不響應(yīng)于 LPS結(jié)合TLR4而激活，并且細(xì)胞因子的產(chǎn)生(TNF- ot和IL - 8 ) 受到抑制。細(xì)胞凋亡-特異性的elF - 5A調(diào)節(jié)IFN - Y信號(hào)傳導(dǎo)的想法的進(jìn) 一步支持是細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A siRNA顯著減少STAT1 a 和JAK1磷酸化的發(fā)現(xiàn)，所述STAT1 oc和JAK1磷酸化是IFN - y信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的2個(gè)重要步驟。盡管在ifn- y刺激后可見IFN- y受體 a上調(diào)的下降，但I(xiàn)FN- y的量在IFN- y處理前似乎是相同的，無 論它是用對(duì)照siRNA還是細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A siRNA處 理。盡管IFN - yRP鏈可能受細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A siRNA 影響，但數(shù)據(jù)表明與其受體結(jié)合的IFN- Y可以不受細(xì)胞凋亡-特異 性的eIF-5A siRNA影響。這表明細(xì)胞凋亡-特異性的elF - 5A可 能是JAK1或調(diào)節(jié)JAK1表達(dá)或磷酸化的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)所必需 的。很明顯JAK - STAT途徑的正確的功能(至少通過JAK1和STAT1 a )和由此的IFN- Y信號(hào)傳導(dǎo)需要細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A。還值得注意的是，對(duì)照siRNA能夠引起HT-29細(xì)胞中的應(yīng)答， 這可能是通過TLR3檢測(cè)雙鏈RNA的結(jié)果。具體地，用對(duì)照siRNA處 理的HT-29細(xì)胞比未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生明顯更多的TNF- a和IL-8。細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5AsiRNA不產(chǎn)生這種應(yīng)答。同樣地， Jakl在未用IFN- Y處理的對(duì)照siRNA-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中是磷酸化的 (見圖118)。這可能反映了 JAK-STAT途徑的激活，所述JAK-STAT途徑的激活涉及經(jīng)由TLR3識(shí)別雙鏈RNA引起的干擾素應(yīng) 答。該數(shù)據(jù)未顯示在細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5AsiRNA-處理的細(xì) 胞中，甚至在不存在IFN- Y處理下的JAK1磷酸化，這提示細(xì)胞凋 亡—特異性的eIF- 5A siRNA能夠阻斷由雙鏈RNA檢測(cè)觸發(fā)的干擾 素應(yīng)答的可能性，所述干擾素應(yīng)答也可通過Jak- STAT途徑發(fā)生。本發(fā)明人在HT-29細(xì)胞中使用siRNA抑制細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A的表達(dá)以檢查對(duì)干擾素Y (IFN- y )信號(hào)傳導(dǎo)的作用。細(xì) 胞凋亡-特異性的eIF-5AsiRNA使ht-29細(xì)胞響應(yīng)于IFN- y和 LPS分泌TNF- a的能力減少了超過90。/。。細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A siRNA還抑制應(yīng)答于IFN- y而不應(yīng)答于TNF - a的IL - 8分 泌。同樣地，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5AsiRNA以IFN- y -特異性的方式減少NF-kB p50的活化并減少IFN- y -刺激的 TLR4和TNFR1的表達(dá)。更有趣的是下述發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞用IFN - Y 刺激時(shí)與模擬轉(zhuǎn)染的對(duì)照相比，用對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染顯著提高了 TNF -a分泌，且細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A siRNA能夠顯著減少這種 應(yīng)答。這些結(jié)果表明細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A可能是IFN- y — 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑并且還可能涉及針對(duì)雙鏈RNA的細(xì)胞 應(yīng)答。由siRNA抑制細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A干擾了 IFN - Y 信號(hào)傳導(dǎo)并減少了腸上皮細(xì)胞分別經(jīng)由TLR4和TNFR1對(duì)LPS和 TNF-a應(yīng)答的能力。因此，細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的抑制似 乎對(duì)腸上皮細(xì)胞具有直接的免疫調(diào)節(jié)作用，并且可能是炎性腸疾病的 治療耙。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了通過抑制或減少內(nèi)源性細(xì)胞
凋亡-特異性的elF — 5A的表達(dá)來抑制或減少促炎應(yīng)答的方法。細(xì)胞 凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá)抑制優(yōu)選通過使用如前文所述的本 發(fā)明的細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的反義多核苷酸或siRNA來進(jìn) 行。如上文所呈現(xiàn)的，本發(fā)明人已顯示當(dāng)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡-特異性的 eIF 一 5A的表達(dá)減少發(fā)生時(shí)，在炎癥級(jí)聯(lián)中涉及的各種生物分子的表 達(dá)也減少了 。炎癥級(jí)聯(lián)所需的這些生物分子水平的減少或這些生物分 子活化的減少導(dǎo)致炎癥減少。減少細(xì)胞進(jìn)入炎癥級(jí)聯(lián)的能力在治療與 慢性炎癥相關(guān)的疾病/狀況中證明可以是有用的，所述疾病/狀況例 如，但不限于，炎性腸疾病、關(guān)節(jié)炎、Chron氏病和狼瘡。因此，本發(fā)明還提供了降低p53水平，降低促炎細(xì)胞因子水平， 降低活性NFk p; TLR4; TNFR-1、 IFN - yRoc、 iNOS或TNF -oc水平，和減少STAT1和JAK1磷酸化的方法，其通過使用針對(duì) 細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的反義或siRNA抑制或阻抑細(xì)胞凋亡 —特異性的eIF — 5A表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。除了減少炎癥級(jí)聯(lián)中涉及的各種有害生物分子的表達(dá)之外，本發(fā) 明還涉及用于減少p53的表達(dá)的方法。該方法包含施用能減少細(xì)胞凋 亡-特異性的elF-5A的表達(dá)的試劑，例如上述的反義寡核苷酸或 siRNA。如圖42和實(shí)施例10所顯示的，用反義寡核苷酸(SEQ ID NO: 26和27)減少細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá)減少了 p53 的表達(dá)。本發(fā)明還涉及增加Bcl-2的表達(dá)的方法。該方法需要施用能減 少人細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A的表達(dá)的試劑。優(yōu)選的試劑包括上 述的反義寡核苷酸和siRNA。如圖98和實(shí)施例13所顯示的，減少細(xì) 胞凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá)增加Bcl-2的表達(dá)。圖98顯示， 用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生產(chǎn)更少的細(xì)胞 凋亡-特異性的eIF-5A蛋白，且另外生產(chǎn)更多的Bel-2蛋白。細(xì) 胞凋亡-特異性的elF-5A表達(dá)的減少與BCL-2表達(dá)的增加相關(guān) 聯(lián)。本發(fā)明還提供了將siRNA體內(nèi)送遞給哺乳動(dòng)物肺細(xì)胞的方法。 給小鼠鼻內(nèi)(與水混合)施用針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的 siRNA。針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF- 5A的siRNA施用后24小時(shí)， 給小鼠鼻內(nèi)施用脂多糖(LPS) 。 LPS是細(xì)菌的大分子細(xì)胞表面抗原，
當(dāng)體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，它觸發(fā)炎癥應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)。鼻內(nèi)送遞LPS造成肺中的嗜 中性粒細(xì)胞數(shù)目的增加。 一件基本的事件是，通過受體-介導(dǎo)的過程 活化單核吞噬細(xì)胞，導(dǎo)致許多細(xì)胞因子(包括TNF- a )的釋放。 TNF- a誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的增強(qiáng)的粘附又導(dǎo)致肺間 隙的大量浸潤(rùn)。另外24小時(shí)后，取出右肺，并測(cè)量髓過氧化物酶。髓過氧化物 酶("MPO")是在嗜中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的溶酶體酶。MPO使用過 氧化氫酶將氯化物轉(zhuǎn)化成次氯酸。次氯酸與細(xì)菌反應(yīng)，并破壞細(xì)菌。 當(dāng)動(dòng)脈發(fā)炎時(shí)，也會(huì)生成髓過氧化物酶。因而，髓過氧化物酶顯然與 嗜中性粒細(xì)胞和炎癥應(yīng)答相關(guān)聯(lián)。與對(duì)照siRNA相比，小鼠細(xì)胞凋 亡-特異性的eIF-5A siRNA將髓過氧化物酶阻抑了接近90。/。。在 該研究中，每組中有5只小鼠。該研究的結(jié)果顯示，可以將siRNA 成功地體內(nèi)送遞給哺乳動(dòng)物的肺組織，且針對(duì)細(xì)胞凋亡—特異性的 eIF-5A的siRNA抑制細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá)，從而 阻抑髓過氧化物酶生產(chǎn)。因此本發(fā)明人已證實(shí)，用siRNA下調(diào)細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A，降低了暴露于LPS (它通常產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，包含髓過氧化物酶 的生產(chǎn))后的肺組織中的髓過氧化物酶水平，并從而減少或抑制炎癥 應(yīng)答。見顯示在小鼠鼻內(nèi)接受LPS和eIF - 5A1 siRNA后具有比接受 對(duì)照siRNA的小鼠減少的髓過氧化物酶活性的圖143。因此，本發(fā)明 的一個(gè)實(shí)施方案提供了通過送遞針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A 的siRNA以抑制或減少細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A表達(dá)來減少肺 組織中MPO水平的方法。細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A表達(dá)的減少 導(dǎo)致MPO減少。細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA的送遞可以 是鼻內(nèi)的。MPO水平是由自身免疫性病癥造成的心臟病發(fā)作和細(xì)胞因子-誘導(dǎo)的炎癥的關(guān)鍵性預(yù)測(cè)因子。降低或阻抑炎癥應(yīng)答的這種能力可以 用于治療炎癥相關(guān)病癥，例如自身免疫性病癥。此外，降低MPO的 能力可以是保護(hù)患者免于缺血事件和心臟病發(fā)作的手段。圖139顯示在小鼠中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中針對(duì)細(xì)胞凋亡-特 異性的elF-5A的siRNA能夠減少小鼠血清中TNF - oc的水平。 siRNA靜脈內(nèi)送遞到小鼠的尾靜脈中。在施用LPS后90分鐘和在靜
脈內(nèi)轉(zhuǎn)染針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的eIF- 5A的siRNA后48小時(shí)測(cè)量 TNFoc的血清水平。圖140顯示在小鼠中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中 siRNA經(jīng)鼻進(jìn)行送遞(如上所述)。在小鼠血清中測(cè)量TNF- oc的 總體水平。針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA導(dǎo)致TNF-ot量減少。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了通過送遞針對(duì)細(xì)胞凋 亡-特異性的elF-5A的siRNA以抑制或減少細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A的表達(dá)來減少血清中TNF- oc水平的方法。細(xì)胞凋亡-特異 性的elF-5A表達(dá)的減少導(dǎo)致血清中TNF- oc的減少。圖141顯示巨噬細(xì)胞炎性蛋白1- oc (MIP-lot )的水平也減少 了。 MIP-lct是屬于細(xì)胞因子的RANTES (激活調(diào)節(jié)的、正常T細(xì) 胞表達(dá)和分泌的蛋白)家族的低分子量趨化因子并與受體CCR1、 CCR5和CCR9結(jié)合。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了通過送遞 針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA以抑制或減少細(xì)胞凋亡 -特異性的elF-5A表達(dá)來減少肺組織中MIP-la水平的方法，細(xì) 胞凋亡-特異性的elF-5A表達(dá)的減少導(dǎo)致MIP- loc的減少。圖142顯示其中小鼠用針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的 siRNA處理(鼻內(nèi)/經(jīng)鼻送遞)的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。結(jié)果顯示在用LPS處 理后90分鐘和在用siRNA處理后48小時(shí)，與未用針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA處理的小鼠肺比較，測(cè)得的小鼠肺的II -la水平顯著降低。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了通過送遞 針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA以抑制或減少細(xì)胞凋亡 -特異性的elF-5A的表達(dá)來減少肺組織中Il-lot水平的方法。細(xì) 胞凋亡-特異性的eIF-5A表達(dá)的減少導(dǎo)致II - lot的減少。圖144和146顯示通過用細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A siRNA預(yù) 處理阻斷了鼻-LPS-誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞的喪失。因此，本發(fā)明的一個(gè) 方法提供了保護(hù)免于LPS-誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的方法，其中 針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA鼻內(nèi)送遞給哺乳動(dòng)物。胸腺細(xì)胞T細(xì)胞發(fā)育是涉及增殖和細(xì)胞死亡不同階段的復(fù)雜事 件。細(xì)菌感染導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁組分例如LPS、脂磷壁質(zhì)和肽聚糖的釋 放。這些細(xì)胞壁組分導(dǎo)致細(xì)胞因子例如OL-1 P 、 IL-6、 IL-8和 TNF- oc的產(chǎn)生，所述細(xì)胞因子每種都促進(jìn)膿毒癥發(fā)展為膿毒病綜合 征、休克和死亡的危險(xiǎn)提高。在全身炎癥狀況的動(dòng)物模型中，施用微 生物產(chǎn)物例如LPS，觀察到胸腺細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。由革蘭氏-陰性細(xì)菌引起的肺部感染激活肺泡巨噬細(xì)胞，從而導(dǎo) 致細(xì)胞因子例如IL-1和TNF- ct的產(chǎn)生。這些細(xì)胞因子又募集多 形核嗜中性粒細(xì)胞進(jìn)入炎性部位并在嚴(yán)重炎癥的晚期，可能發(fā)展膿毒 性休克。增多的證據(jù)提示在膿毒癥過程中細(xì)胞凋亡發(fā)生在許多器官 中，包括胸腺。因此，研究了鼻內(nèi)LPS施用對(duì)胸腺細(xì)胞的細(xì)胞凋亡 的影響。該研究的結(jié)果顯示用LPS鼻內(nèi)處理小鼠已降低了胸腺的細(xì) 胞構(gòu)成。胸腺的細(xì)胞構(gòu)成在鼻內(nèi)LPS后24小時(shí)顯著降低并在48小 時(shí)后回到對(duì)照水平。類似地，在LPS施用后24小時(shí)觀察到峰細(xì)胞凋 亡(32%)并經(jīng)由48小時(shí)恢復(fù)。這些觀察類似于腹膜內(nèi)注射LPS觀 察到的結(jié)果，其中在LPS施用后24小時(shí)達(dá)到峰細(xì)胞凋亡(28% )， 以及我們先前已在靜脈內(nèi)注射伴刀豆凝集素A后觀察到的結(jié)果(46 % )。Fas和FasL表達(dá)在胸腺中并且LPS -誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞的細(xì)胞凋 亡由糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)，這又增加了 Fas/FasL的表達(dá)。siRNA elF5A 可能通過下調(diào)胸腺細(xì)胞的Fas/FasL減少LPS-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此 外，LPS激活NF- kB,這導(dǎo)致多種促炎介質(zhì)的合成和釋放，包括 IL 一 1、 IL - 6、 IL 一 8和TNF - oc ( 37 )。因?yàn)門NF - ct和IFN — y都是胸腺萎縮和胸腺細(xì)胞的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的全身炎癥中的關(guān)鍵介 質(zhì)，所以siRNA抑制LPS-誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的機(jī)制可以 歸因于較低水平的TNF - ot和其他促炎細(xì)胞因子，因?yàn)閟iRNA eIF-5A強(qiáng)烈抑制IFN - y預(yù)處理的HT-29細(xì)胞響應(yīng)于LPS生產(chǎn)TNF-a。因此，siRNA eIF - 5A阻抑LPS-誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的 機(jī)制可以是TNF- ot和IFN- Y合成減少的結(jié)果，從而表明elF-5A 可能是抗-炎治療劑開發(fā)的重要靶。圖147顯示鼻內(nèi)送遞針對(duì)elF-5A的siRNA減少了小鼠中IL -6、 IFN- y和IL-loc的生產(chǎn)。圖148顯示針對(duì)eIF - 5A的siRNA 作為L(zhǎng)PS處理的結(jié)果能夠減少TNFot的表達(dá)。上圖顯示了原始數(shù)據(jù)， 且下圖顯示了條線圖中的數(shù)據(jù)。因此，本發(fā)明人顯示了細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A和免疫應(yīng)答 之間的關(guān)聯(lián)，還顯示了針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A的siRNA 阻抑髓過氧化物酶的產(chǎn)生(即炎癥應(yīng)答的部分)。發(fā)明人還已顯示通 過簡(jiǎn)單鼻內(nèi)送遞可能將siRNA體內(nèi)送遞到肺組織中。siRNA只與水 混合。這呈現(xiàn)了主要的突破和發(fā)現(xiàn)，因?yàn)楸绢I(lǐng)域其他技術(shù)人員已試圖 設(shè)計(jì)關(guān)于siRNA送遞的可接受的方法。在另一實(shí)驗(yàn)中，小鼠類似地用針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A 的siRNA進(jìn)行處理。給小鼠施用脂多糖(LPS)以誘導(dǎo)炎癥和免疫系 統(tǒng)應(yīng)答。在對(duì)照條件下，LPS殺死胸腺細(xì)胞，這是在胸腺中產(chǎn)生的用 以抵抗感染的重要的免疫系統(tǒng)前體細(xì)胞。然而，使用針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的eIF- 5A的siRNA允許胸腺細(xì)胞在LPS的存在下大約90% 的存活(survivability)。當(dāng)胸腺細(xì)胞被破壞時(shí)，因?yàn)樗鼈兪荰細(xì)胞的 前體，所以身體的天然免疫性由于不能產(chǎn)生T細(xì)胞而受到危害并且因 此不能逐退細(xì)菌感染等。因此，針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的 siRNA可以用于減少炎癥(如第一個(gè)實(shí)施例中較低水平的MPO所顯 示的)而不破壞身體的天然免疫防御系統(tǒng)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了通過施用針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性 的eIF-5A的siRNA治療膿毒癥的方法。膿毒癥也已知為全身炎癥 應(yīng)答綜合征("SIRS")。 膿毒癥由可以起源于身體任何地方的細(xì) 菌感染引起。膿毒癥可以簡(jiǎn)單地定義為由患者對(duì)感染的免疫應(yīng)答引起 的臨床狀況譜，所述臨床狀況語的特征在于全身性炎癥和凝固。它包 括從全身炎癥應(yīng)答綜合征(SIRS)至器官功能障礙至多器官衰竭和 最終死亡的應(yīng)答的全部范圍。膿毒癥是非常復(fù)雜的系列事件并且仍需進(jìn)行許多工作以完全理 解患者如何從SIRS發(fā)展至膿毒性休克。膿毒性休克的患者具有雙相 免疫應(yīng)答。最初它們表現(xiàn)出對(duì)感染的壓倒性的炎癥應(yīng)答。這很可能歸 因于促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(TNF) 、 IL-1、 IL-12、干擾素 y (IFNy )和IL-6。身體隨后通過產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子(IL-10)、 可溶性抑制劑[TNF受體、IL-1II型受體、和IL-1RA(滅活形式 的IL-l)調(diào)節(jié)這種應(yīng)答，這在患者中通過免疫抑制時(shí)間段證明。 這種低反應(yīng)性的持續(xù)與醫(yī)院感染和死亡的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。這種全身性炎癥級(jí)聯(lián)由各種細(xì)菌產(chǎn)物發(fā)起。這些細(xì)菌產(chǎn)物(革蘭 氏陰性細(xì)菌=內(nèi)毒素、曱酰肽、外毒素和蛋白酶；革蘭氏陽性細(xì)菌= 外毒素、超抗原(中毒性休克綜合征毒素(TSST)、鏈球菌致熱性 外毒素(SepA)、腸毒素、溶血素、肽聚糖和脂磷壁質(zhì)、和真菌細(xì) 胞壁材料)與宿主巨噬細(xì)胞上的細(xì)胞受體結(jié)合并激活調(diào)節(jié)蛋白例如核因子kB(NFkB)。內(nèi)毒素通過與幾種受體相互作用激活調(diào)節(jié)蛋白。 CD受體在細(xì)胞表面上匯集LPS-LPS結(jié)合蛋白復(fù)合物并隨后TLR 受體將信號(hào)翻譯到細(xì)胞中。產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子是胂瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素1、 6 和12以及干擾素y (IFNy )。這些細(xì)胞因子可以直接發(fā)揮作用以影 響器官功能或者它們可以通過次級(jí)介質(zhì)間接發(fā)揮作用。次級(jí)介質(zhì)包括 氧化氮、血栓烷、白細(xì)胞三烯、血小板活化因子、前列腺素和補(bǔ)體。 TNF和IL- 1 (以及內(nèi)毒素)還可引起組織因子通過內(nèi)皮細(xì)胞釋放， 從而導(dǎo)致血纖蛋白沉積和彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)。隨后這些初級(jí)和次級(jí)介質(zhì)導(dǎo)致凝固級(jí)聯(lián)、補(bǔ)體級(jí)聯(lián)活化以及前列 腺素和白細(xì)胞三烯的產(chǎn)生。凝塊存在于血管中，這降低了器官的豐富 性并可以導(dǎo)致多器官系統(tǒng)衰竭。過一定時(shí)間之后，凝固級(jí)聯(lián)的這種激 活耗盡了患者制造凝塊的能力，從而導(dǎo)致DIC和ARDS。這種級(jí)聯(lián)的累積作用是不平衡的狀態(tài)，其中發(fā)炎超過抗炎且凝固 超過纖維蛋白溶解。導(dǎo)致微血管血栓形成、血流灌注不足、缺血和組 織損害?？梢猿霈F(xiàn)嚴(yán)重的膿毒癥、休克和多器官功能障礙，從而導(dǎo)致 死亡。發(fā)明人先前已顯示(并在上文提出)針對(duì)eIF-5A的siRNA能 夠減少各種炎癥細(xì)胞因子例如TNF- oc的表達(dá)。在包括施用針對(duì)細(xì) 胞凋亡-特異性的eIF-5A的siRNA以治療小鼠膿毒癥的研究中， 本發(fā)明人已進(jìn)一步顯示siRNA可以用于體內(nèi)治療膿毒癥。見實(shí)施例 21和圖149- 160。在這個(gè)研究中，向小鼠給予在LPS施用后48小 時(shí)內(nèi)在動(dòng)物中誘導(dǎo)膿毒癥和死亡的LPS劑量。在LPS施用之前和之 后不同時(shí)間段給小鼠腹膜內(nèi)施用siRNA ( 3， - GCC UUA CUG AAG GUC GAC U-5，)。在某些測(cè)試組中，接受siRNA的所有5只小 鼠存活。認(rèn)為siRNA的使用能夠關(guān)閉炎癥級(jí)聯(lián)并因此預(yù)防小鼠中的 膿毒癥。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A的siRNA寡核苷酸，其中所述siRNA寡核苷酸阻抑細(xì)胞中的細(xì) 胞凋亡-特異性的elF-5A的內(nèi)源性表達(dá)并且具有3， -GCC UUA CUG AAG GUC GAC U - 5，的序列。通過阻抑細(xì)胞凋亡-特異性的
elF-5A的表達(dá)，炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生被抑制或減少，從而使得炎癥 級(jí)聯(lián)不開始并導(dǎo)致膿毒性休克。認(rèn)為細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A將涉及細(xì)胞凋亡和炎癥的 mRNA亞組穿梭出核外。如果elF-5A的量被減少或完全消除，那 么沒有穿梭機(jī)制能將各種炎癥和細(xì)胞死亡細(xì)胞因子的mRNA穿梭出 核外。這導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子的量減少，并因此抑制炎癥級(jí) 聯(lián)的開始。因?yàn)槟摱景Y和膿毒性休克是炎癥級(jí)聯(lián)的結(jié)果，所以關(guān)閉級(jí) 聯(lián)提供了治療或預(yù)防膿毒癥/膿毒性休克的方法。因此，本發(fā)明的另 一實(shí)施方案提供了用于治療哺乳動(dòng)物中的膿毒癥的方法，其包括給哺 乳動(dòng)物施用前述siRNA。本發(fā)明還提供了通過施用編碼細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的 多核苷酸以提高癌癥/腫瘤中的細(xì)胞凋亡來治療癌癥和/或減少血管發(fā) 生的方法(或藥物以治療癌癥和/或減少血管發(fā)生)。本發(fā)明人已顯 示細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的超表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見圖44-58。本發(fā)明人已顯示細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A多核苷酸提高了幾 種腫瘤/癌癥模型中的細(xì)胞凋亡并且另外，似乎不誘導(dǎo)周圍非癌性組 織中的細(xì)胞凋亡。見圖161-171。在鼻咽癌細(xì)胞模型中，本發(fā)明人已證實(shí)ad5orioP.elF - 5A1在2 次細(xì)胞分裂中選擇性殺死98%鼻咽癌細(xì)胞(C666- 1 )。在肺癌模型中，用對(duì)肺組織具有親和力的一種類型的黑素瘤處理 小鼠。處理3周后，通過重量比較處理和未處理的小鼠的肺以評(píng)估腫 瘤負(fù)荷。"處理的小鼠"注射了包含eIF-5A核苷酸的質(zhì)粒(見實(shí)施 例25)。接受EIF-5A的小鼠顯示相對(duì)于未處理的小鼠腫瘤重量平 均41%減少。另外，將近一半的處理的小鼠的肺重量與沒有任何肺 瘤的對(duì)照(健康)小鼠在統(tǒng)計(jì)學(xué)上可比較。見圖173- 175。發(fā)明人還已顯示當(dāng)通過使用外源性細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A多核苷酸誘導(dǎo)癌細(xì)胞超表達(dá)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A時(shí)，癌 細(xì)胞顯示VEGF表達(dá)減少。見實(shí)施例24和圖178- 179。 VEGF是介 導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和血管發(fā)生的細(xì)胞因子。認(rèn)為VEGF在病理性血管 發(fā)生中重要，因?yàn)榻^大多數(shù)細(xì)胞系分泌VEGF。已發(fā)現(xiàn)VEGF在大多 數(shù)人腫瘤中是上調(diào)的。 本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的方法。因?yàn)榘┘?xì)胞已在表 面上繞過了正常的細(xì)胞死亡途徑，所以需要有誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的機(jī)制。本發(fā)明人已使用針對(duì)elF-5Al的siRNA誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞 凋亡。另外，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)非8-羥-2，7，10-三氨基癸酸化形式 的elF-5A1能夠i秀導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中已事先i人為elF-5A1必須由 DNS進(jìn)行8 -羥-2，7，10 -三氨基癸酸化來激活。見實(shí)施例22。本發(fā)明人已檢查了 elF-5Al在細(xì)胞凋亡過程中的作用并觀察到 結(jié)腸癌細(xì)胞系中elF-5A1的超表達(dá)以p53-不依賴性的方式誘導(dǎo)細(xì) 胞凋亡。由腫瘤壞死因子a (TNF- oc )死亡受體激活或由放線菌素 D誘導(dǎo)的遺傳毒性應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)后還觀察到elF-5A1蛋 白從細(xì)胞質(zhì)動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)到核，從而提示elF-5A1可能具有與細(xì)胞凋亡 有關(guān)的重要的核功能。本發(fā)明的發(fā)明人的先前工作已證實(shí)用TNF- ct處理人篩板細(xì)胞 上調(diào)elF-5Al并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外，針對(duì)eIF - 5A1的siRNA保護(hù)篩板細(xì)胞免于由這種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡12。這些觀察表明 elF-5Al在TNF- ot誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起作用。為了檢查eIF - 5A1 還參與DNA損傷-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的可能性，用放線菌素D處理正 常的結(jié)腸成纖維細(xì)胞，所述放線菌素D是抑制拓樸異購酶II的抗腫 瘤劑，并且通過RNA印跡和蛋白印跡檢查elF-5Al的表達(dá)(圖30)。 RNA印跡分析表明eIF — 5A1轉(zhuǎn)錄物在這些細(xì)胞中組成型表達(dá)并且用 放線菌素D處理不影響elF-5A1轉(zhuǎn)錄物的豐度(圖30A)。elF-5Al 蛋白在處理前在成纖維細(xì)胞中呈現(xiàn)中等水平，并且在放線菌素D處 理1小時(shí)內(nèi)觀察到elF-5Al蛋白表達(dá)適度提高(圖30B)。蛋白質(zhì) 在處理后繼續(xù)積累至少24小時(shí)(圖30B)。在提高的轉(zhuǎn)錄物水平不 存在下elF-5Al蛋白的積累提示elF-5A1可能是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的。 還檢查了這些細(xì)胞中響應(yīng)于放線菌素D的p53的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其與 elF-5A1平行增加并在處理后持續(xù)增加至少24小時(shí)(圖30B )。因 此，elF-5A1可能涉及由DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。使用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系HT-29檢查了放線菌素D-誘導(dǎo)的細(xì)胞 毒性中對(duì)于eIF-5A1的需求。用放線菌素D處理在48小時(shí)后使HT -29細(xì)胞的生存力減少60% (圖31A)。通過用siRNA轉(zhuǎn)染阻抑eIF - 5A1減少了放線菌素D的細(xì)胞毒性作用。在放線菌素D處理elF5Al -阻抑的細(xì)胞后觀察到細(xì)胞生存力相對(duì)于用對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 提高40% (圖31A)。因此，放線菌素D的細(xì)胞毒性作用似乎部分 依賴于elF5Al的存在，從而提示elF5Al在遺傳毒性應(yīng)激途徑中的 作用。眾多報(bào)告暗示elF5Al還可參與細(xì)胞增殖。例如，用DHS抑制劑 例如GC7阻斷elF5Al的8 -羥-2，7，10 —三氨基癸酸化在各種腫瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡3，6，8，19。在闡明所提出的 elF5Al在細(xì)胞增殖中的牽涉的努力中，檢查了 siRNA-介導(dǎo)的 elF5Al阻抑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。HT-29細(xì)胞用于這些研究，并且通 過BrdU摻入測(cè)量細(xì)胞增殖。通過用elF5Al siRNA轉(zhuǎn)染HT - 29細(xì) 胞耗盡elF5Al蛋白質(zhì)，這使elF5Al表達(dá)減少>90 % (數(shù)據(jù)未顯示)， 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和生存力沒有作用(圖31A和2B)。在用這種siRNA轉(zhuǎn) 染的任何細(xì)胞系中沒有觀察到對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)面作用。使用在血清的 存在或不存在下生長(zhǎng)的HT-29細(xì)胞，將elF5Al siRNA對(duì)細(xì)胞增殖 的作用與GC7的作用進(jìn)行比較(圖31B)。用GC7處理細(xì)胞抑制 HT - 29細(xì)胞增殖，與以前的關(guān)于這種DHS抑制劑抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力的報(bào)道相一致，并且這種作用通過血清饑餓顯著提高(圖 31B)。相反，當(dāng)與對(duì)照siRNA比較時(shí)，通過用siRNA轉(zhuǎn)染耗盡來 自細(xì)胞的elF5Al蛋白對(duì)細(xì)胞增殖不產(chǎn)生任何顯著的作用(圖31B)。 因此，如通過代謝活性或新DNA合成所測(cè)量的，elF5Al蛋白水平的 減少對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的能力沒有作用，從而表明elF5Al不是細(xì) 胞生存力和生長(zhǎng)所必需的。這些結(jié)果提示所報(bào)告的GC7和其他DHS 抑制劑的抑制細(xì)胞活性與8 -羥-2，7，10 -三氨基癸酸化的elF5Al的 水平減少無關(guān)，并且elF5Al不是細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的。本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室的近期工作已證實(shí)HA-標(biāo)記的elF5Al在體外 不是8 -羥-2，7，10 -三氨基癸酸化的。為了確定HA -標(biāo)記的elF5Al 是否能夠被8-羥-2，7，10-三氨基癸酸化，將表達(dá)HA-elF5Al融 合蛋白的pHM6-elF5Al構(gòu)建體電穿孔到COS-7細(xì)胞中。電穿孔 的細(xì)胞隨后與[3司-亞精胺一起溫育2天，因?yàn)閬喚肥荄HS使用 的底物以將elF5Al中的保守賴氨酸修飾為8-羥-2,7,10-三氨基 癸酸。使用抗-HA抗體從細(xì)胞裂解物中免疫沉淀出HA-標(biāo)記的 elF5Al，并通過SDS-PAGE分離免疫沉淀的蛋白質(zhì)。將所分離的蛋
白質(zhì)轉(zhuǎn)移至膜并曝光于X -射線膠片以檢測(cè)摻合到elF5Al蛋白中的 [3H。在17kDa處檢測(cè)到標(biāo)記的條帶，這對(duì)應(yīng)預(yù)期的elF5Al的大小 (圖33A )。通過蛋白印跡用抗-elF5Al抗體(圖8B )和抗-HA 抗體(圖33C)測(cè)定elF5Al蛋白在膜上的位置。有趣的是，在抗-elF5Al蛋白印跡中觀察到2個(gè)條帶(圖33B)。在抗-elF5Al蛋白 印跡中上面的條帶(~20kDa)對(duì)應(yīng)在抗-HA蛋白印跡中觀察到的 單個(gè)條帶的大小(圖33C)，從而表明雙聯(lián)體的上面的條帶是HA-標(biāo)記形式的elF5Al，而雙聯(lián)體的下面的條帶(~17 kDa) —定是內(nèi) 源性elF5Al。有趣的是內(nèi)源性形式的elF5Al由抗-HA抗體免疫沉 淀，因?yàn)檫@表明內(nèi)源性elF5Al與HA-標(biāo)記的elF5Al結(jié)合并共沉 淀，從而提示elF5Al在細(xì)胞內(nèi)可能通常作為多聚體存在。圖30A中 17 kDa [3印-標(biāo)記的條帶因此一定是8-羥-2，7，10-三氨基癸酸化 形式的內(nèi)源性elF5Al蛋白。因?yàn)樵?0 kDa處沒有觀察到對(duì)應(yīng)的條 帶，所以似乎導(dǎo)入細(xì)胞中的HA-標(biāo)記的elF5Al是非8 -羥-2，7，10 —三氨基癸酸化的或8 -羥-2，7，10 —三氨基癸酸化的程度比內(nèi)源性 elF5Al低很多。HA-標(biāo)記的elF5Al在體外不是8 -羥-2，7，10 -三氨基癸酸化的事實(shí)是具有重要意義的，因?yàn)檫@種構(gòu)建體的超表達(dá)能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞 系細(xì)胞凋亡。我們實(shí)驗(yàn)室以前的工作已證實(shí)癌細(xì)胞系中人elF5Al的 超表達(dá)與提高的細(xì)胞凋亡有關(guān)，從而提示elF5Al是能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞 細(xì)胞凋亡的促細(xì)胞凋亡蛋白。用pHM6-elF5Al轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞 系RKO和RKO-E6導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生率提高了超過200 0/。(圖5A 和5B)，所述pHM6-elF5Al是表達(dá)HA-標(biāo)記形式的elF5Al的構(gòu) 建體。這些結(jié)果強(qiáng)烈支持非8 -羥-2，7，10 _三氨基癸酸化的elF5Al能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞系細(xì)胞凋亡的觀點(diǎn)。elF5Al的表達(dá)似乎在DNA損傷-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中與p53 平行上調(diào)(圖30B)，和elF5Al表達(dá)的阻抑部分地保護(hù)了 HT - 29 細(xì)胞不受放線菌素D的細(xì)胞毒性作用(圖31A)的觀察，增加了 elF5Al 和p53之間有關(guān)聯(lián)的可能性。為了確定elF5Al是否是DNA損傷-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中p53正確表達(dá)所必需的，檢查了轉(zhuǎn)染的RKO 細(xì)胞中放線菌素D-誘導(dǎo)的p53的上調(diào)。RKO細(xì)胞是人結(jié)腸直腸癌 細(xì)胞系并用于這個(gè)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗鼈円阎哂泄δ苄詐53肺瘤抑制蛋白 18。發(fā)現(xiàn)在這些細(xì)胞中的p53蛋白水平通常在檢測(cè)之下，但在用放線 菌素D處理后迅速積累(圖43A)。用elF5Al siRNA轉(zhuǎn)染明顯減少 了 elF5Al蛋白水平(圖43A)并還阻抑了響應(yīng)于放線菌素D處理的 p53的積累(圖43A和43B)。在放線菌素D處理后8小時(shí)后通過 siRNA轉(zhuǎn)染阻抑elF5Al使p53蛋白水平相對(duì)于對(duì)照siRNA降低了 58 %，并在24小時(shí)時(shí)降低了 68% (圖43B),從而表明elF5Al是響 應(yīng)于DNA損傷的正確p53表達(dá)所必需的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證elF5Al在細(xì)胞凋亡中的作用，檢查了 RKO細(xì) 胞對(duì)elF5Al超表達(dá)的細(xì)胞凋亡應(yīng)答。使用RT - PCR從RKO細(xì)胞克 隆人elF5Al并亞克隆到在強(qiáng)CMV啟動(dòng)子控制下的表達(dá)載體pHM6 中。發(fā)現(xiàn)得到的PCR產(chǎn)物具有與先前報(bào)告的人elF5Al相同的氨基酸 序列。用pHM6-LacZ或pHM6-elF5Al瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RKO細(xì)胞，并 在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、TUNEL-染色和通過流式細(xì)胞術(shù) 進(jìn)行分析(圖44)。通常得到30% _40%的轉(zhuǎn)染效率。TUNEL染色 表明用包含elF5Al的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有29.3%經(jīng)歷細(xì)胞凋亡，而用 pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染的細(xì)胞只有12.8%是細(xì)胞凋亡的(圖44 )。因此， elF5Al超表達(dá)誘導(dǎo)RKO細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。已提出elF5Al的C末端基于其與寡核苷酸結(jié)合折疊的相似性而 參與RNA結(jié)合2G。為了確定C末端結(jié)構(gòu)域?qū)τ诩?xì)胞凋亡是否重要， 構(gòu)建包含截短的elF5Al cDNA的質(zhì)粒(pHM6 - elF5Al △ 37 )，其 中缺失C末端的最后37個(gè)氨基酸。通過TUNEL使用熒光顯微鏡術(shù) 評(píng)分瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的RKO細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡(圖45A)。發(fā)現(xiàn)用截短的 elF5Al構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具有與用對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相似的 細(xì)胞凋亡水平。相反，用pHM6-elF5Al轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示出為用對(duì) 照載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的超過2倍的細(xì)胞凋亡水平(圖45A)。考慮到elF5Al似乎調(diào)節(jié)p53的表達(dá)的觀察(圖43 )，檢查了缺 乏功能性p53的細(xì)胞系對(duì)elF5Al超表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的易感性。 來源于RKO的細(xì)胞系RKO-E6用于這個(gè)目的，所述RKO包含穩(wěn) 定整合的人乳頭瘤病毒E6癌基因并缺乏可察覺的功能性p53。 RKO -E6中elF5Al的超表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的細(xì)胞數(shù)目與用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞相比提高超過3倍(圖45B)，從而提示elF5Al 的超表達(dá)可以不依賴于p53而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與用RKO細(xì)胞系獲得 的結(jié)果相似，用截短的elF5Al轉(zhuǎn)染的RKO-E6細(xì)胞的細(xì)胞凋亡水 平與用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒有明顯不同，從而表明eIFSAl的 最后37個(gè)氨基酸是其細(xì)胞凋亡活性所必需的(圖45b)。假定認(rèn)為 elF5Al的C末端參與RNA結(jié)合2、那么這些結(jié)果支持eIFSAl在細(xì) 胞凋亡過程中發(fā)揮核質(zhì)穿梭蛋白功能的觀點(diǎn)。盡管用pHM6 - elF5Al 轉(zhuǎn)染的RKO-E6細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡水平平均為用pHM6-LacZ轉(zhuǎn) 染的相應(yīng)細(xì)胞的>3倍，但通過配對(duì)t檢驗(yàn)確定這種差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不 顯著(圖45b)。這反映了轉(zhuǎn)染的RKO-e6中誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡程度 在實(shí)驗(yàn)中的變化。然而，當(dāng)在實(shí)驗(yàn)中通過將用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染的 對(duì)照細(xì)胞的細(xì)胞凋亡水平設(shè)定為1標(biāo)準(zhǔn)化這種變化時(shí)，相對(duì)于這些標(biāo) 準(zhǔn)化的對(duì)照值用pHM6-elF5Al轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡平均提高 3.25倍，對(duì)于圖45b中舉例說明的數(shù)據(jù)顯著性概率<0.03。elF5Al作為核質(zhì)穿梭蛋白的作用已常被質(zhì)疑，因?yàn)樗阎貜?fù)被 發(fā)現(xiàn)位于細(xì)胞質(zhì)和核周區(qū)域21 —25,并且這種定位隨細(xì)胞周期而改變 21。如果elF5Al參與來自核的mRNA的募集，那么人們可以預(yù)期它 至少短暫地位于核中。根據(jù)elF5Al參與細(xì)胞凋亡而不是細(xì)胞分裂的 發(fā)明人以前發(fā)現(xiàn)(圖31和45)，進(jìn)行研究以確定elF5Al的亞細(xì)胞定位是否在已知誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的試劑處理后改變。通過在用ifn- y 26-30致敏后與tnf- ot—起溫育在ht - 29細(xì)胞中可以誘導(dǎo)細(xì)胞 凋亡。ifn - y -預(yù)處理的ht-29細(xì)胞的tunel染色證實(shí)大約30 %的細(xì)胞在用tnf- oc刺激24小時(shí)后經(jīng)歷細(xì)胞凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。 共刺激是細(xì)胞凋亡所必需的，因?yàn)閕fn- y和tnf- oc都不能獨(dú)立地 誘導(dǎo)這種細(xì)胞類型的細(xì)胞凋亡26 —29。因此，用IFN- y將HT-29細(xì) 胞預(yù)處理16小時(shí)并隨后用tnf- ot處理。在tnf- oc處理開始后10 分鐘-8小時(shí)的時(shí)間間隔用曱醛固定細(xì)胞，并通過間接免疫熒光使用 商品化的抗-elF5Al抗體觀察elF5Al的定位。與以前的才艮告一致， elF5Al主要定位在未處理細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中[圖19A (i) 、 6b (i)， 并且這種定位不由單獨(dú)IFN- y處理改變[圖19A (ii) 1。然而，在 ifn- y -預(yù)處理的細(xì)胞中在tnf- oc處理10分鐘內(nèi)elF5Al的定位 從占優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞質(zhì)動(dòng)態(tài)移向最初的核[圖19A (iii)。細(xì)胞的IFN-y敏化是響應(yīng)于tnf- oc處理的elF5Al轉(zhuǎn)運(yùn)所必需的，因?yàn)閑lF5Al 不定位在用tnf- oc刺激但沒有ifn- y -預(yù)處理的細(xì)胞的核內(nèi)(數(shù) 據(jù)未顯示)。elF5Al在IFN - y/TNF - a處理后至少8小時(shí)保留其 核定位[圖19A(vi)。為了確定elF5Al定位中的移動(dòng)是否也響應(yīng)于 遺傳毒性應(yīng)激而發(fā)生，將HT - 29細(xì)胞與放線菌素D —起溫育增加的 時(shí)間段(圖19B)。與放線菌素D溫育24小時(shí)誘導(dǎo)大約10%的HT -29細(xì)胞凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。在這種情況下，elF5Al在放線菌素 D處理開始后至少30分鐘保留其細(xì)胞質(zhì)分布[圖19B (ii)，但在卯 分鐘內(nèi)[圖19B(iii)發(fā)現(xiàn)在核中占優(yōu)勢(shì)并且在那里保持至少16小時(shí) [圖19B(vi)]。當(dāng)固定的細(xì)胞只與第二抗體溫育時(shí)沒有觀察到熒光 信號(hào)，從而表明觀察到的熒光(圖19)是由于第一抗體對(duì)elF5Al的 識(shí)別(數(shù)據(jù)未顯示)。這些觀察支持了 elF5Al在由死亡受體活化以 及遺傳毒性應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中真正發(fā)揮核質(zhì)穿梭蛋白功 能，并且elF5Al的定位在細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中可能起作用(圖32)。 elF5Al的獨(dú)特在于它是唯一已知的包含罕見氨基酸8-羥-2，7，10 —三氨基癸酸的蛋白質(zhì)。8 -羥-2，7，10 —三氨基癸酸殘基在由 脫氧8 -羥-2，7，10 —三氨基癸酸合酶(DHS )催化的2次酶促反應(yīng) 中翻譯后形成，并且elF5Al的功能仍未被闡明，已提出它發(fā)揮核質(zhì) 穿梭蛋白功能5，1() —u，2。，31。眾多DHS抑制劑(例如在本研究中使用的 GC7)的研究，已證實(shí)這些抑制劑阻斷細(xì)胞增殖的能力，從而引起8 -幾-2，7，10 -三氨基癸酸化的elF5Al促進(jìn)細(xì)胞分裂中涉及的 mRNA翻譯的觀點(diǎn)3，6，8，19。這種提議進(jìn)一步得到酵母實(shí)驗(yàn)的支持，所 述酵母實(shí)驗(yàn)證實(shí)elF5Al同工型或DHS的滅活阻斷細(xì)胞分裂2，4，7，9。 然而，這種觀點(diǎn)與本研究中報(bào)告的數(shù)據(jù)不一致，因?yàn)槲覀冇^察到 siRNA-介導(dǎo)的elF5Al的阻抑對(duì)結(jié)腸腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞生存力或增 殖沒有作用。此外，在關(guān)于白血病細(xì)胞系的早期研究中，發(fā)現(xiàn)用反義 寡核苷酸抑制elF5Al的表達(dá)實(shí)際上增強(qiáng)了 GM-CSF對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的 刺激作用24。在2種肺腺癌細(xì)胞系中也已觀察到elF5Al表達(dá)和增殖 之間明顯缺乏關(guān)聯(lián)32。此外，在本研究中我們觀察到作為用GC7處 理結(jié)果的細(xì)胞增殖的減少，但其中elF5Al蛋白水平已耗盡>90 %的細(xì) 胞能夠正常增殖。盡管在用siRNA轉(zhuǎn)染后保留的殘余量的elF5Al蛋 白可能不足以支持生長(zhǎng)，但這些數(shù)據(jù)似乎挑戰(zhàn)下述觀點(diǎn)DHS抑制 劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用與8-羥-2,7,10-三氨基癸酸-修飾的 elF5Al水平中的減少相關(guān)。實(shí)際上，這些發(fā)現(xiàn)與表明新型DHS抑制
劑對(duì)細(xì)胞生存力或生長(zhǎng)沒有作用的近期報(bào)告33—致，并提示先前研究中使用的DHS抑制劑的抗增殖作用不依賴其抑制elF5Al的8-輕-2，7，10-三氨基癸酸化的能力并且可能歸因于對(duì)細(xì)胞代謝的無關(guān)作 用。幾項(xiàng)近期研究已表明elF5Al可能參與細(xì)胞凋亡途徑。例如，針 對(duì)eIFSAl的siRNA保護(hù)人篩板細(xì)胞免于TNF- a -誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 12。在另一項(xiàng)研究中，本發(fā)明人證實(shí)elF5Al的超表達(dá)導(dǎo)致肺癌細(xì)胞 系的細(xì)胞凋亡提高13。當(dāng)前研究的結(jié)果還支持了 elF5Al在細(xì)胞凋亡 中的作用。首先，elF5Al蛋白的表達(dá)與由放線菌素D誘導(dǎo)的p53積 累相關(guān)，并且siRNA-介導(dǎo)的elF5Al阻抑減少了放線菌素D對(duì)HT -29細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。這與在由細(xì)胞因子IFN- a19和TNF-a"誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中elF5Al表達(dá)增強(qiáng)的先前報(bào)告一致。其次， 不管人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的p53狀態(tài)，elF5Al的超表達(dá)都誘導(dǎo)人結(jié)腸 直腸癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。這與elF5Al的超表達(dá)誘導(dǎo)H460( p53+/+) 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡但不誘導(dǎo)p53-無效的H1299細(xì)胞的細(xì)胞凋亡近期報(bào) 告13相反，并且可以反映所使用的細(xì)胞類型中的差異。我們還觀察到 elF5Al的C末端結(jié)構(gòu)域是其細(xì)胞凋亡活性所必需的，已提出所述結(jié) 構(gòu)域包含寡核苷酸-結(jié)合折疊，這些結(jié)果提示RNA的結(jié)合，可能 是細(xì)胞凋亡所需的mRNA,在elF5Al的促細(xì)胞凋亡功能中可能是重 要的。事實(shí)上，在本研究中我們證實(shí)了在RKO細(xì)胞中響應(yīng)于由放線 菌素D造成的DNA損傷的p53正確表達(dá)中對(duì)elF5Al的需求。關(guān)于 COS-7細(xì)胞的p53表達(dá)對(duì)elF5Al的依賴性也已得到報(bào)告13。此夕卜， 已發(fā)現(xiàn)在肺腺癌中elF5Al蛋白表達(dá)與p53的核積累正相關(guān)32。另一 種RNA結(jié)合蛋白，HuR，已顯示結(jié)合p53轉(zhuǎn)錄物并在RKO細(xì)胞中 增強(qiáng)響應(yīng)于紫外線34的p53表達(dá)。因此，似乎很可能響應(yīng)于遺傳毒性 應(yīng)激的p53的表達(dá)需要一種或多種RNA結(jié)合蛋白。認(rèn)為響應(yīng)于遺傳 毒性應(yīng)激(例如y輻射)觀察到的p53蛋白質(zhì)的增強(qiáng)表達(dá)歸因于其 3'UTR的抑制作用解除造成的p53轉(zhuǎn)錄物的翻譯增強(qiáng)，可能作為一 種或多種RNA結(jié)合蛋白相互作用的結(jié)果17，35。本發(fā)明人的數(shù)據(jù)提示 elF5Al可能是負(fù)責(zé)響應(yīng)于遺傳毒性應(yīng)激增強(qiáng)p53翻譯的RNA結(jié)合蛋 白之一。所提出的elF5Al作為核質(zhì)穿梭蛋白的作用已被定位研究混淆。
盡管存在elF5Al分布遍及細(xì)胞質(zhì)和核的少數(shù)報(bào)告36_38，但大部分研 究表明elF5Al位于細(xì)胞質(zhì)和核周區(qū)域，并且很大程度上不在核中21 _25。 Shi等(1996b)在elF5Al亞細(xì)胞定位的特別詳細(xì)的研究中報(bào)告該蛋白質(zhì)很大程度上局限在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核周區(qū)域，在核中少于1 % 。他們還發(fā)現(xiàn)elF5Al的亞細(xì)胞定位在細(xì)胞周期變化期間或在病毒 癌基因轉(zhuǎn)化后沒有改變。這種定位模式與elF5Al發(fā)揮細(xì)胞生長(zhǎng)所需 轉(zhuǎn)錄物的核質(zhì)穿梭機(jī)制功能的提議不一致4_5。在本研究中，elF5Al 表達(dá)在正常生長(zhǎng)條件下局限于HT-29細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核周區(qū)域。然 而，當(dāng)已用IFN- y敏化的HT-29細(xì)胞用TNF - oc處理時(shí)，觀察到 elF5Al蛋白非常快速地轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入核，所述TNF- oc處理是已知誘導(dǎo) 這種細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡的處理26 —3()。在刺激的前IO分鐘內(nèi)發(fā)生這種 到核的轉(zhuǎn)運(yùn)，表明死亡受體信號(hào)傳導(dǎo)啟動(dòng)elF5Al蛋白從細(xì)胞質(zhì)快速 轉(zhuǎn)運(yùn)至核。類似地，該結(jié)果顯示放線菌素D刺激elF5Al轉(zhuǎn)運(yùn)至核， 盡管不如TNF- ct—樣快速。先前的研究已報(bào)告elF5Al定位不受放 線菌素D影響22，38。盡管關(guān)于這種差異的原因不明，但細(xì)胞系和用于 刺激細(xì)胞的放線菌素D濃度(4-5 pg/mL對(duì)本研究中使用的1 yig/mL)的差異可以解釋不同的發(fā)現(xiàn)。已報(bào)告elF5Al只通過被動(dòng)擴(kuò) 散進(jìn)入核31，38_39。然而，本文提供了在與死亡受體激活或遺傳毒性應(yīng) 激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)的條件下elF5Al的調(diào)節(jié)性核輸入的證據(jù)。非8 -羥-2，7，10 -三氨基癸酸化的elF5Al的水平提高已與細(xì)胞 凋亡的誘導(dǎo)相關(guān)2，19，24，4D_43。這些觀察已導(dǎo)致未修飾的elF5Al的積累 可能在某些類型的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)中起作用的提示24。還已報(bào)告只有 未修飾的elF5Al能夠核定位，從而提示未修飾形式的elF5Al可能 具有細(xì)胞凋亡功能，這發(fā)生在核中24。在正常生長(zhǎng)條件下，事實(shí)上所 有的細(xì)胞elF5Al蛋白幾乎緊在合成后進(jìn)行8 -羥-2，7，10 -三氨基癸 酸化\因此，似乎很可能elF5Al是8-羥-2，7，10-三氨基癸酸化 的并且保留在細(xì)胞質(zhì)中直至細(xì)胞凋亡刺激觸發(fā)其轉(zhuǎn)運(yùn)至核，在核中它 可能具有促細(xì)胞凋亡功能。盡管認(rèn)為8-羥-2，7，10-三氨基癸酸化 是不可逆的修飾"，但可以想象具有脫8 -羥-2,7,10 -三氨基癸酸化 活性的蛋白質(zhì)在正常生理?xiàng)l件下可能是滅活的?？傊?，elF5Al在由死亡受體激活和遺傳毒性應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋 亡過程中似乎是具有核功能的促細(xì)胞凋亡蛋白。這種獨(dú)特蛋白質(zhì)的細(xì)
胞凋亡功能的更多理解可以導(dǎo)致用于治療癌癥的新治療性介入。本發(fā)明的反義多核苷酸或siRNA可以用于制備藥物以減少哺乳 動(dòng)物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物組織中細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A 的表達(dá)。通過減少細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞的 細(xì)胞凋亡減少?？商娲兀景l(fā)明的方法和組合物通過使用編碼細(xì)胞凋亡-特異 性的elF-5A的多核苷酸以引起細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的表 達(dá)提高來提高哺乳動(dòng)物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物組織中細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá)，可以用于治療患有肺瘤或癌癥的受試者。另夕卜，編碼細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的多核苷酸可以用于制 備藥物以提高哺乳動(dòng)物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物組織中細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá)。通過提高細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A 的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞的細(xì)胞凋亡提高。因此，該藥物通過減少癌細(xì)胞或 肺瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞凋亡可以用于治療癌 癥。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)本發(fā)明的反義核酸和siRNA在動(dòng)物中用于預(yù)防或 治療目的時(shí)，它們將以另外含有藥學(xué)上可接受的載體的組合物的形式 施用。合適的藥學(xué)上可接受的載體包括，例如水、鹽水、磷酸緩沖鹽 水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一種或多種，以及它們的組合。藥學(xué) 上可接受的栽體還可以含有小量的輔助物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑或乳化劑、 防腐劑或緩沖劑，其能增強(qiáng)結(jié)合蛋白的保存期限或有效性。如本領(lǐng)域 熟知的，可以配制成注射組合物，從而在施用給哺乳動(dòng)物后提供活性 成分的快速的、持續(xù)的或延遲的釋放。本發(fā)明的組合物可以是多種形式。它們包括，例如，固體、半固 體和液體劑量型式，例如片劑、丸劑、粉末、液體溶液、分散體或懸 浮液、脂質(zhì)體、栓劑、可注射的和可輸注的溶液。優(yōu)選的形式取決于 預(yù)期的施用模式和治療用途。這樣的組合物可以以制藥領(lǐng)域熟知的方式制備。在制備組合物 中，通常將活性成分與載體混合，或用載體稀釋，和/或包封在載體 中，其可以是例如膠嚢、嚢劑、紙或其它容器的形式。當(dāng)載體用作稀 釋劑時(shí)，它可以是固體、半固體或液體材料，其作為活性成分的載體、 賦形劑或介質(zhì)。因而，組合物可以是片劑、錠劑、嚢劑、膠質(zhì)嚢 (cachet)、酏劑、懸浮液、氣溶膠(作為固體或在液體介質(zhì)中)、 含有例如按重量計(jì)算最高達(dá)10%的活性化合物的軟膏、軟和硬明膠 膠嚢、栓劑、注射液、懸浮液、無菌包裝的粉末和局部貼劑?，F(xiàn)在，已經(jīng)一般地描述了本發(fā)明，通過參考下面的用作說明的實(shí) 施例，可以更容易地理解本發(fā)明。提出的實(shí)施例用于輔助理解本發(fā) 明，但是無意于、也不應(yīng)當(dāng)理解為以任何方式限制其范圍。實(shí)施例不 包括常規(guī)方法的詳細(xì)描述。這樣的方法是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知 的，并且在許多文獻(xiàn)中有所記載?？梢詮脑S多文獻(xiàn)得到常規(guī)方法的詳 細(xì)說明，例如在構(gòu)建載體和質(zhì)粒、將編碼多肽的核酸插入這樣的載體 和質(zhì)粒、將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞和表達(dá)和確定基因和基因產(chǎn)物時(shí)采用的 方法，所述文獻(xiàn)包括Sambrook， J.等，(1989 ) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press。 所有提及的文獻(xiàn)在本文中都整體引作參考。實(shí)施例實(shí)施例1遞i^DA^錄*44^^^義薦#伴一W勿^源亡通過DNA斷裂成梯測(cè)定了細(xì)胞凋亡的程度。根據(jù)生產(chǎn)商的說明 書，使用QIAamp DNA血液試劑盒(Qiagen )，從分散的黃體細(xì)胞 或從切斷的黃體組織分離出了基因組DNA。在用PGF - 2 ot處理誘導(dǎo) 細(xì)胞凋亡之前、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后1和24小時(shí)，切斷了黃體組織。通 過將500 ng DNA與0.2 p Ci [ ot - 32PdCTP、 1 mM Tris、 0.5 mM EDTA、 3單位克列諾酶和各0.2 pM的dATP、 dGTP和dTTP在室 溫溫育30分鐘，對(duì)分離的DNA進(jìn)行末端標(biāo)記。根據(jù)Sambrook等的 方法，通過使樣品穿過l ml Sepadex G-50柱，去除未整合的核苷 酸。然后通過Tris-乙酸鹽-EDTA( 1.8% )凝膠電泳分離樣品。在 室溫下真空干燥凝膠30分鐘，并在-801C曝光于x-射線膠片24小 時(shí)。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，注射PGF-2oc后0、 l或24小時(shí)，檢查超排卵 的大鼠黃體中的細(xì)胞凋亡的程度。在0小時(shí)的對(duì)照中，取出的卵巢沒 有注射PGF-2ot。在用PGF-2oc處理之前切斷的對(duì)照黃體組織中， 反映與細(xì)胞凋亡有關(guān)的核酸酶活性的低分子量DNA片段的斷裂成梯 不明顯，但是在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后1小時(shí)內(nèi)是可辨別的，且在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后24小時(shí)是顯著的，如圖14所示。在該圖中，上圖是使用大鼠 黃體細(xì)胞凋亡-特異性的DHS cDNA的32P-dCTP標(biāo)記的3'-非翻 譯區(qū)探測(cè)的RNA印跡的放射自顯影圖。下圖是總RNA的溴化乙錠 染色的凝膠。每泳道含有10ugRNA。數(shù)據(jù)表明，撤出血清后，存在 細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A轉(zhuǎn)錄物的下調(diào)。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用鹽水代替PGF-2oc處理了對(duì)應(yīng)的對(duì)照動(dòng) 物。用鹽水或PGF-2oc處理后15分鐘，從動(dòng)物取出黃體。在從動(dòng)物 取出組織后3小時(shí)和6小時(shí)，從黃體分離基因組DNA。從PGF-2 a —處理的動(dòng)物取出組織后6小時(shí)，基因組DNA的DNA斷裂成梯和 增加的末端標(biāo)記是明顯的，但是在取出組織后3小時(shí)卻不明顯。參見 圖15。當(dāng)用PGF-2a處理后15分鐘切斷黃體并在體外條件下在 EBSS(Gibco)中維持6小時(shí)時(shí)，反映細(xì)胞凋亡的DNA斷裂成梯也 是明顯的。從基因組DNA更大程度的末端標(biāo)記看出，與細(xì)胞凋亡有 關(guān)的核酸酶活性也是明顯的。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通過皮下注射500Mg PGF-2oc誘導(dǎo)了超排 卵。用等體積的鹽水溶液處理了對(duì)照大鼠。15-30分鐘后，取出卵 巢，并用膠原酶切碎。將來自用PGF-2cx處理的大鼠的分散細(xì)胞在 10 mm谷氨酰胺+ 10 mm亞精胺中溫育1小時(shí)，再在無亞精胺的 10 mm谷氨酰胺中溫育5小時(shí)(泳道2),或在10 mm谷氨酰胺+ 10 mm亞精胺中溫育1小時(shí)，并再在10 mm谷氨酰胺+ 1 mm亞 精胺中溫育5小時(shí)(泳道3)。用膠原酶分散來自鹽水處理的大鼠的 對(duì)照細(xì)胞，溫育1小時(shí)，再僅在谷氨酰胺中溫育5小時(shí)(泳道1)。 使用克列諾酶，用[a - 32P-dCTP標(biāo)記來自每個(gè)樣品的500納克 DNA，在1.8%瓊脂糖凝膠上分離，并曝光于膠片24小時(shí)。結(jié)果如圖 16所示。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在皮下注射500pg PGF-2ot之前的24、 12 和2小時(shí)，使用以3個(gè)相同劑量0.333 mg/100g體重送遞的1 mg/100 g體重的亞精胺對(duì)超排卵的大鼠進(jìn)行皮下注射。將對(duì)照大鼠分成3 組無注射；3次注射亞精胺，但是無PGF-2a;和3次在PGF - 2 a處理之前注射等體積的鹽水。前列腺素處理后1小時(shí)35分鐘或3 小時(shí)45分鐘，從大鼠取出卵巢，并用于分離DNA。使用克列諾酶，
用[oc -32PI-dCTP標(biāo)記來自每個(gè)樣品的500納克DNA，在1.8 %瓊 脂糖凝膠上分離，并膝光于膠片24小時(shí)(見圖17):泳道l，無注 射(動(dòng)物與泳道3-5的同時(shí)處死)；泳道2，3次注射亞精胺(動(dòng)物與 泳道3-5的同時(shí)處死)；泳道3， 3次注射鹽水，隨后注射PGF-2a(用PGF - 2 oc處理后1小時(shí)35分鐘處死動(dòng)物)；泳道4， 3次注射亞 精胺，隨后注射PGF-2cc (用PGF-2ot處理后1小時(shí)35分鐘處死 動(dòng)物)；泳道5，3次注射亞精胺，隨后注射PGF-2a (用PGF - 2oc處理后1小時(shí)35分鐘處死動(dòng)物)；泳道6，3次注射亞精胺，隨后注 射PGF - 2 oc (用PGF - 2 oc處理后3小時(shí)45分鐘處死動(dòng)物)；泳道7， 3次注射亞精胺，隨后注射PGF-2a (用PGF-2a處理后3小時(shí) 45分鐘處死動(dòng)物)。及AC4為、庠在PGF-2ot誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后的各個(gè)時(shí)間，從由大鼠取出的黃體 組織分離出總RNA。簡(jiǎn)而言之，將組織(5g)在液氮中磨碎。將磨 碎的粉末與30 ml胍緩沖液(4 M異硫氰酸胍，2.5 mM NaOAc pH 8.5， 0.8%|3-巰基乙醇)相混合。穿過4層Miracloth過濾混合物，并在4 n 、 10，000g離心30分鐘。然后在11，200g對(duì)上清液進(jìn)行氯化銫密度 梯度離心20小時(shí)。用75%乙醇沖洗沉淀的RNA，重新懸浮在600 ml DEPC-處理過的水中，并用1.5 ml 95%乙醇和60 ml 3M NaOAc在 -70X:沉淀RNA。差窗逸DAU》、庠々錄*4'#根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用QIAamp DNA血液試劑盒 (Qiagen)，從提取的黃體組織或分散的黃體細(xì)胞中分離基因組 DNA。通過將500 ngDNA與0.2juCi[oc -32PdCTP、 1 mM Tris、 0.5 mM EDTA、3單位克列諾酶和各0.2 pM的dATP、dGTP和dTTP 在室溫溫育30分鐘，對(duì)DNA進(jìn)行末端標(biāo)記。才艮據(jù)Maniatis等描述 的方法，通過使樣品穿過lmlSepadexG-50柱，去除未整合的核苷 酸。然后通過Tris-乙酸鹽-EDTA (2% )凝膠電泳分離樣品。在 室溫下真空干燥凝膠30分鐘，并在-80lC曝光于x-射線膠片24小 時(shí)。 j在"A^》、l "7VJ潛使用上述的Sambrook等描述的堿裂解方法，分離質(zhì)粒DNA。 使用雙脫氧測(cè)序法，對(duì)全長(zhǎng)陽性cDNA克隆進(jìn)行了測(cè)序。Sanger等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 74: 5463- 5467。編輯了可讀框，使用 BLAST搜索(GenBank， Bethesda， MD )進(jìn)行了分析，并使用BCM Search Launcher: Multiple Sequence Alignments Pattern - Induced Multiple Alignment Method(見，F(xiàn). Corpet， Nuc. Acids Res.， 16: 10881 -10890,( 1987)，進(jìn)行了序列比對(duì)。序列和序列比對(duì)如圖5-11所 示。義扃黃伴及A^ ^及A^在1%變性的曱醛瓊脂糖凝膠上分離了在各個(gè)細(xì)胞凋亡階段從大 鼠黃體分離出的20 mg總RNA,并固定化到尼龍膜上。使用隨機(jī)引 物試劑盒(Boehringer)、以32P - dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A cDNA ( SEQ ID NO: 1)用于探測(cè)膜7 x 107?；?者，使用隨機(jī)引物試劑盒(Boehringer)、以32P - dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng) 大鼠DHS cDNA ( SEQ ID NO: 6 )用于探測(cè)膜(7 x 107cpm )。在室 溫用lxSSC，0.1%SDS洗滌膜1次，并在65"C用0.2x SSC， 0.1 % SDS 洗滌3次。干燥膜，并在-7ox:曝光于X-射線膠片過夜。如可以看到的，細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A和DHS都在細(xì)胞 凋亡的黃體組織中上調(diào)。用PGF-2oc -處理誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后的細(xì)胞 凋亡-特異性的eIF-5A的表達(dá)顯著增強(qiáng)在0時(shí)刻低，在處理的1 小時(shí)內(nèi)相當(dāng)大地增加，在處理的8小時(shí)內(nèi)仍然增加，且在處理的24 小時(shí)內(nèi)輕微增加(圖12) 。 DHS的表達(dá)在0時(shí)刻較低，在處理的1 小時(shí)內(nèi)相當(dāng)大地增加，在處理的8小時(shí)內(nèi)仍然增加，且在處理的24 小時(shí)內(nèi)又輕微增加(圖13)。炎^差f ^母、真,希乂 "F序/i/辨f/參j,鈿應(yīng)源zi"^義扃:^謬及r-pc及,參使用一對(duì)從酵母、真菌和人細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A序列設(shè) 計(jì)的寡核苷酸引物，通過RT-PCR，從細(xì)胞凋亡的大鼠黃體RNA
模板生成了與基因的3，端相對(duì)應(yīng)的部分長(zhǎng)度的細(xì)胞凋亡-特異性的 eIF-5A序列(SEQ ID NO: 11)。用于分離大鼠細(xì)胞凋亡-特異性 的eIF-5A基因的3'端的上游引物是20個(gè)核苷酸的簡(jiǎn)并引物 5'TCSAARACHGGNAAGCAYGG 3， ( SEQ ID NO: 9 )，其中S選 自C和G; R選自A和G; H選自A、 T和C; Y選自C和T;且N 是任意的核酸。用于分離大鼠elF-5A基因的3'端的下游引物含有 42 個(gè) 核 苷 酸 5'GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTT 3'(SEQIDNO: 10)。進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。 簡(jiǎn)而言之，使用5mg下游引物，合成了cDNA的第一鏈。然后將第 一鏈用作使用上游和下游引物的RT 一 PCR的模板。RT - PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的分離揭示存在900堿基對(duì)的片 段，使用平端連接，將其亞克隆進(jìn)pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems, LaJolla， CA )中，并測(cè)序(SEQ ID NO: 11) 。 3'端的cDNA 序列是SEQIDNO: 11，且3'端的氨基酸序列是SEQ ID NO: 12。 見圖1 —2。通過RT-PCR，從細(xì)胞凋亡的大鼠黃體RNA模板生成了與基 因的5'端相對(duì)應(yīng)且與3'端相重疊的部分長(zhǎng)度的細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A序列(SEQ ID NO: 15) 。 5'引物是具有序列5'CAGGTCT AGAGTTGGAATC GAAGC 3， ( SEQ ID NO: 13 )的24 -聚物，該 序列是從人eIF - 5A序列設(shè)計(jì)的。3'引物是具有序列5，ATATCTCGA GCCTTGATTGCAACAGCT GCC 3' ( SEQ ID NO: 14 )的30 -聚 物，該序列是根據(jù)3'端RT-PCR片段設(shè)計(jì)的。進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄酶-聚 合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。簡(jiǎn)而言之，使用5mg下游引物，合成了 cDNA的第一鏈。然后將第一鏈用作使用上游和下游引物的RT - PCR 的模板。RT - PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的分離揭示存在500堿基對(duì)的片 段，使用分別存在于上游和下游引物中的Xbal和Xhol克隆位點(diǎn)， 將其亞克隆進(jìn)pBluescriptTM ( Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA)中，并測(cè)序(SEQ ID NO: 15)。5'端的cDNA序列是SEQ ID NO: 15,且5'端的氨基酸序列是SEQIDNO: 16。見圖2。 大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的3'和5'端的序列(分別是 SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 15)是重疊的，且產(chǎn)生全長(zhǎng)cDNA 序列(SEQ ID NO: 1)。將該全長(zhǎng)序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的序 列進(jìn)行了比對(duì)和對(duì)比。見，圖1-2。 cDNA克隆編碼154個(gè)氨基酸的 多肽(SEQ ID NO: 2),其具有計(jì)算的分子量16.8 KDa。通過RT -PCR得到的大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的黃體elF-5A基因的全長(zhǎng) cDNA核苷酸序列SEQIDNO: l如圖3所示，且對(duì)應(yīng)的衍生的氨基 酸序列是SEQIDNO: 9。將elF - 5A的衍生的全長(zhǎng)氨基酸序列與人 和小鼠elF-5a序列進(jìn)行了比對(duì)。見，圖7 - 9。炎^差f乂"^y^WWf/參JZ勿^源7f^M:扃黃沐/ r-戶o Z參使用 一對(duì)從人DHS序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，通過RT - PCR， 從細(xì)胞凋亡的大鼠黃體RNA模板生成了與基因的3'端相對(duì)應(yīng)的部分 長(zhǎng)度的DHS序列(SEQ ID NO: 6)。 5'引物是具有序列5' GTCTGTG TATTATTGGGCCC 3' ( SEQ ID NO: 17 )的20 —聚物；且3，引物是 具 有 序 列5'GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTT3'( SEQ ID NO: 18 )的42 -聚物。進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT -PCR)。簡(jiǎn)而言之，使用5mg下游引物，合成了 cDNA的第一鏈。 然后將笫一鏈用作使用上游和下游引物的RT - PCR的模板。RT-PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的分離揭示存在606堿基對(duì)的片 段，使用平端連接，將其亞克隆進(jìn)pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems, LaJolla， CA )中，并測(cè)序(SEQ ID NO: 6 )。通過RT - PCR 得到的大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的黃體DHS基因的部分長(zhǎng)度的cDNA 核苷酸序列(SEQIDNO: 6)如圖4所示，且對(duì)應(yīng)的衍生的氨基酸 序列是SEQIDNO: 7。從切斷的大鼠卵巢中分離出了用于DNA印跡的基因組DNA。將 約100 mg卵巢組織分成小塊，并置于15ml管中。通過輕輕振蕩組 織懸浮液，用1 ml PBS洗滌組織2次，然后使用吸管去除PBS。將
組織重新懸浮到2.06 ml DNA-緩沖液(0.2 M Tris - HCl pH 8.0和 0.1 mM EDTA)中，并加入240 p 1 10%SDS和100 |i 1蛋白酶K (Boehringer Manheim; 10 mg/ml)。將組織置于振蕩的45*C水浴 中過夜。次日，加入另外lOOjiil蛋白酶K ( 10 mg/ml)，并將組織 懸浮液在451C水浴中溫育另外的4小時(shí)。溫育后，用等體積的苯酚: 氯仿:異戊醇(25: 24: 1 )提取組織懸浮液一次，且用等體積的氯仿: 異戊醇(24: l)提取一次。提取后，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH 5.2)和2體積的乙醇。使用以本生煤氣噴燈密封的且形成鉤的玻璃 吸管，從溶液中拉出DNA絲，并將DNA轉(zhuǎn)移到清潔的微量離心管 中。在70%乙醇中洗滌DNA—次，并風(fēng)干10分鐘。將DNA沉淀溶 解到500 jli 110 mM Tris - HCl( pH 8.0 )中，加入10 y 1 RNA酶A( 10 mg/ml )，然后在371C溫育DNA 1小時(shí)。用苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1 ) 提取DNA —次，并通過加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH 5.2 )和2 體積的乙醇，沉淀DNA。通過在41C、 13，000xg離心10分鐘，沉淀 DNA。在70°/。乙醇中洗滌DNA沉淀一次，并通過在4*€旋轉(zhuǎn)DNA 過夜，將其溶解在200nll0mMTris-HCl (pH8.0)中。為了進(jìn)行DNA印跡分析，使用不切割內(nèi)源基因或僅僅切割一次 的各種限制酶，消化了從大鼠卵巢分離出的基因組DNA。為此目的， 在200)il的總反應(yīng)體積中，使lOjug基因組DNA、 20nl IOX反應(yīng) 緩沖液和100 U限制酶反應(yīng)5至6小時(shí)。將消化的DNA加載到0.7 %瓊脂糖凝膠上，且在40伏電泳6小時(shí)或在15伏電泳過夜。電泳后， 在0.2 N HC1中，將凝膠脫嘌呤IO分鐘，隨后在變性溶液(0.5 M NaOH， 1.5 M NaCl)中洗滌2次，每次15分鐘，并在中和緩沖液(1.5 M NaCl， 0.5 M Tris - HCl pH 7.4 )中洗滌2次，每次15分鐘。將DNA轉(zhuǎn)移 到尼龍膜上，該膜在雜交溶液(40%曱酰胺，6 X SSC, 5 X Denhart氏 溶液(1 X Denhart氏溶液是0.02 % Ficoll， 0.02 % PVP和0.02 % BSA )， 0.5。/。SDS和1.5mg變性的鮭精DNA)中預(yù)雜交。通過隨機(jī)引發(fā)，用 [oc - 32P-dCTP標(biāo)記了大鼠eIF - 5A cDNA的3' UTR的700堿基對(duì) 的PCR片段(3，UTR的650堿基對(duì)和編碼的50堿基對(duì))，并以1 X 106 cpm/ml加到膜上。類似地，用[oc - 32p-dCTP隨機(jī)引發(fā)地標(biāo)記了大鼠DHScDNA 的606堿基對(duì)的PCR片段(編碼的450堿基對(duì)和3'UTR的156堿基
對(duì))，并以1X10 6cpm/ml加到第2個(gè)相同的膜上。印跡在""C雜 交過夜，然后用2XSSC和0.ly。SDS在421C洗滌2次，并用1 X SSC 和0.1。/。SDS在42'C洗滌2次。然后將印跡曝光于膠片3-IO天。如圖18所示，用限制酶切割了大鼠黃體基因組DNA，并用32P -dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)elF-5AcDNA進(jìn)行探測(cè)。在高嚴(yán)格性條件下的 雜交揭示了全長(zhǎng)cDNA探針與每種限制酶消化的DNA樣品的幾個(gè)限 制片段的雜交，從而表明存在elF-5A的幾個(gè)同工型。特別指出，當(dāng) 用EcoRV (它具有在細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的可讀框內(nèi)的限 制位點(diǎn))消化大鼠基因組DNA時(shí)，在DNA印跡中可以檢測(cè)到細(xì)胞 凋亡-特異性的eIF-5A的同工型的2個(gè)限制片段。在圖18中用兩 個(gè)箭標(biāo)指示了這2個(gè)片段。在用EcoRl和BamHl (可讀框中沒有剪 切位點(diǎn)的限制酶)標(biāo)記的泳道中，通過一個(gè)箭標(biāo)指示了與細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A的同工型相對(duì)應(yīng)的限制片段。這些結(jié)果暗示，細(xì)胞 凋亡-特異性的elF-5A在大鼠中是單拷貝基因。如圖5至11所示， elF-5A基因在物種之間是高度保守的，因此可以預(yù)期任何物種內(nèi)的 同工型之間存在顯著量的保守。圖18顯示了大鼠基因組DNA的DNA印跡，它是用32P - dCTP -標(biāo)記的部分長(zhǎng)度的大鼠黃體DHScDNA探測(cè)的。用EcoRV切割了 基因組DNA，所述EcoRV是不切割用作探針的部分長(zhǎng)度的cDNA的 限制酶。2個(gè)限制片段是明顯的，從而表明，存在2個(gè)拷貝的基因， 或者基因含有帶有EcoRV位點(diǎn)的內(nèi)含子。實(shí)施例2本實(shí)施例證實(shí)了細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A的調(diào)節(jié)(用有義方向的 細(xì)胞凋亡—特異性的eIF — 5A增強(qiáng)細(xì)胞凋亡)COS1 - 7勿^邦潛^和及AC4 "#岸將COS-7 (用編碼野生型T抗原的SV40突變體轉(zhuǎn)化的非洲綠 猴腎成纖維樣細(xì)胞系)用于所有基于轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)。在含有0.584 g/LL -谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖和0.37%碳酸氫鈉的Dulbecco氏改良的 Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)了 COS-7細(xì)胞。該培養(yǎng)基補(bǔ)加了 10%胎牛血清(FBS)和100單位青霉素/鏈霉素。在5%<:02和95%空氣的濕潤(rùn)環(huán)境下，在371C培養(yǎng)細(xì)胞。通過用0.25%胰蛋白酶和1 mM EDTA的溶液使貼壁細(xì)胞脫附，每3至4天傳代培養(yǎng)細(xì)胞一次。 以1: IO的分離比，將脫附的細(xì)胞分散在含有新鮮培養(yǎng)基的新培養(yǎng)皿 中。在150 — mm組織培養(yǎng)物處理的皿(Corning )中，培養(yǎng)要用于分 離RNA的COS-7細(xì)胞。通過用胰蛋白酶-EDTA溶液脫附它們， 來收獲細(xì)胞。將脫附的細(xì)胞收集在離心管中，并通過在3000 rpm離 心5分鐘，沉淀細(xì)胞。取出上清液，將細(xì)胞沉淀在液氮中瞬間冷凍， 根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用GenElute哺乳動(dòng)物總RNA Miniprep試 劑盒(Sigma)，從冷凍的細(xì)胞分離出RNA。:Ti^r在COS - 7勿應(yīng)付掙染使用如圖19所示的哺乳動(dòng)物附加表位表達(dá)載體pHM6 (Roche Molecular Biochemicals )，構(gòu)建了在有義方向攜帶大鼠細(xì)胞凋亡-特 異性的elF-5A的全長(zhǎng)編碼序列、且在反義方向攜帶大鼠細(xì)胞凋亡 -特異性的elF-5A的3'非翻譯區(qū)(UTR)的重組質(zhì)粒。該載體包 含下述部分CMV啟動(dòng)子-人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子； HA-來自流感血凝素的九肽附加表位；BGH pA -牛生長(zhǎng)激素多腺苷 酸化信號(hào)；flori-fl起始點(diǎn)；SV40 ori - SV40早期啟動(dòng)子和起始點(diǎn)； 新霉素-新霉素抗性(G418)基因；SV40 pA - SV40多腺苷酸化信 號(hào)；ColEl-ColEl起始點(diǎn)；氨千青霉素-氨千青霉素抗性基因。通 過PCR，從pBluescript中的原始大鼠eIF - 5A RT - PCR片段(SEQ ID NO: 1)擴(kuò)增了大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的全長(zhǎng)編碼序 列和大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的3'UTR。為了擴(kuò)增全長(zhǎng)eIF-5A ， 使 用 的 引 物 如 下 正 向 5'GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG 3' ( SEQ ID NO: 59 )(Hind3 ),和反向5'CTGAA11CCAGTTATTTTGCCATGG 3'( SEQ ID NO: 60) (EcoRI)。為了擴(kuò)增大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的elF - 5A 的3，UTR ， 使用的引物如下正向5' AATGAAX1CCGCC ATGACAGAGGAGGC 3' ( SEQ ID NO: 61) (EcoRI),和反向5' GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3'(SEQ ID NO: 62) ( Hind3 )。
瓊脂糖凝膠電泳后，分離的全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5APCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度是430堿基對(duì)，而3'UTR大鼠細(xì)胞凋亡-特異性 的elF-5APCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度是697堿基對(duì)。將2個(gè)PCR產(chǎn)物亞克隆 進(jìn)pHM6的Hind 3和EcoRl位點(diǎn)中，以生成pHM6-全長(zhǎng)細(xì)胞凋亡 -特異性的elF - 5A和pHM6 -反義3'UTR eIF - 5A。將全長(zhǎng)大鼠細(xì) 胞凋亡-特異性的elF-5A PCR產(chǎn)物在框內(nèi)與位于多克隆位點(diǎn)上游 的來自流感血凝素(HA)的九肽附加表位進(jìn)行亞克隆，以使得能夠 使用抗-HA]—過氧化物酶抗體檢測(cè)重組蛋白。表達(dá)由人巨細(xì)胞病毒 立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)，以確保在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中高水平表 達(dá)。該質(zhì)粒的特征還在于新霉素-抗性(G418)基因，其使得能夠 對(duì)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子進(jìn)行篩選，以及SV40早期啟動(dòng)子和起始點(diǎn)，其使得 能夠在表達(dá)SV40大T抗原的細(xì)胞(例如COS-7)中進(jìn)行附加型復(fù) 制。在用于蛋白提取的細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning)中，或在 用于染色的細(xì)胞的4室培養(yǎng)載玻片(Falcon)中，培養(yǎng)了要用在轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)中的COS-7細(xì)胞。在補(bǔ)加了 10%FBS、但是缺少青霉素/鏈霉 素的DMEM培養(yǎng)基中，使細(xì)胞生長(zhǎng)至50~70°/。匯合。通過將0.32 ji g質(zhì)粒DNA稀釋在42.5pl無血清的DMEM中，并將混合物在室溫 溫育15分鐘，制備了足夠24-孔板或培養(yǎng)載玻片的一個(gè)孔的轉(zhuǎn)染培 養(yǎng)基。將1.6 ju 1轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE ( Gibco， BRL )稀釋在42.5 Jul無血清的DMEM中，并在室溫溫育5分鐘。5分鐘后，將 LipofectAMINE混合物加入DNA混合物中，并在室溫一起溫育30 至60分鐘。在覆蓋轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基之前，用無血清的DMEM洗滌要轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞一次，并將細(xì)胞放回生長(zhǎng)室中4小時(shí)。溫育后，將0.17mlDMEM + 20。/。FBS加入細(xì)胞中。在染色前誘 導(dǎo)進(jìn)行細(xì)胞凋亡或收獲用于蛋白印跡分析之前，再培養(yǎng)細(xì)胞40小 時(shí)。作為對(duì)照，還進(jìn)行了模擬轉(zhuǎn)染，其中轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不含有質(zhì)粒 DNA。蛋^炎承^蛋々伊遊通過在PBS ( 8 g/L NaCl， 0.2 g/L KC1， 1.44 g/L Na2HP04和0.24 g/LKH2P04)中洗滌細(xì)胞2次，然后加入150pl熱SDS凝膠加樣緩
沖液(50 mM Tris - HC1 pH 6.8， 100 mM 二硫蘇糖醇，2 % SDS， 0.1 % 溴酚藍(lán)和10%甘油)，從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中分離了用于蛋白印跡的蛋白。 將細(xì)胞裂解物收集到微量離心管中，在9S1C加熱10分鐘，然后在 13,000 xg離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新的微量離心管中，在-20x:貯存至準(zhǔn)備使用。對(duì)于蛋白印跡，在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離了 2.5或5 jig總蛋白。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride)膜上。然后將膜在封閉溶液(5%脫脂奶粉，0.02%疊氮化 鈉，溶于PBS中)中溫育1小時(shí)，并在PBS - T ( PBS + 0.05% Tween -20 )中洗滌3次進(jìn)行15分鐘。將膜在PBS - T中、在4<C貯存過夜。 次日，升至室溫后，將膜在lpg/ml聚乙烯醇中封閉30秒。在去離 子水中沖洗膜5次，然后在5%乳的PBS溶液中封閉30分鐘。在與 膜溫育之前，將第一抗體在5%乳的PBS溶液中預(yù)溫育30分鐘。使用了幾種第一抗體?？?HA1 -過氧化物酶抗體(Roche Molecular Biochemicals )以1: 5000的稀度4吏用，以檢測(cè)重纟且蛋白的 表達(dá)。由于該抗體能與過氧化物酶綴合，所以無需第二抗體，且洗滌 印跡，并通過化學(xué)發(fā)光顯影。使用的其它第一抗體是來自O(shè)ncogene 的i只另'J p53 ( Ab - 6 ) 、 Bcl - 2 ( Ab — 1)和c - Myc ( Ab - 2 )的單 克隆抗體。p53的單克隆抗體以0.1ng/ml的稀度使用，且Bcl-2和 c-Myc的單克隆抗體均以0.83pg/ml的稀度使用。與第一抗體溫育 60至90分鐘后，在PBS-T中洗滌膜3次進(jìn)行15分鐘。然后在1% 乳的PBS溶液中稀釋第二抗體，并與膜溫育60至90分鐘。當(dāng)p" (Ab - 6 )用作第一抗體時(shí)，使用的第二抗體是1:1000稀度的山羊抗 —小鼠IgG ( Rockland ),其與堿性磷酸酶綴合。當(dāng)Bcl - 2 ( Ab - 1) 和c-Myc ( Ab-2)用作第一抗體時(shí)，以1: 5000的稀度使用與過氧 化物酶綴合的兔抗-小鼠IgG (Sigma )。與第二抗體溫育后，在PBS -T中洗滌膜3次。使用2種檢測(cè)方法來對(duì)印跡顯影， 一種比色方法和一種化學(xué)發(fā)光 方法。只有當(dāng)p53 (Ab-6)用作與堿性磷酸酶-綴合的第二抗體相 結(jié)合的第一抗體時(shí)，才使用比色方法。通過在黑暗中、在0.33mg/mL 氮藍(lán)四唑、0.165 mg/mL 5 -溴-4 -氯-3 -丐l咮磷酸、100 mM NaCl、 5mMMgCl2和100 mM Tris - HC1 ( pH 9.5 )的溶液中溫育印跡，顯現(xiàn)結(jié)合的抗體。通過在2mMEDTA的PBS溶液中溫育印跡， 終止顏色反應(yīng)?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)方法用于所有其它的第一抗體，包括抗 - [HA-過氧化物酶、Bcl - 2 ( Ab - 1 )和c - Myc ( Ab - 2 ) 。 ECL Plus蛋白印跡檢測(cè)試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech )用于檢測(cè)過氧化物酶-綴合的結(jié)合抗體。簡(jiǎn)而言之，輕輕地吸干膜，然后在暗 處與試劑A和試劑B的40: 1混合物溫育5分鐘。吸干膜，置于乙 酸鹽片之間，并曝光于X-射線膠片IO秒至IO分鐘的時(shí)間段。
2種方法用于誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，血清喪失和 用鏈霉菌屬物種(5^r印/0/i^ces sp )的放線菌素D (Calbiochem)處 理。對(duì)兩種處理而言，轉(zhuǎn)染后40小時(shí)去除培養(yǎng)基。在血清饑餓實(shí)驗(yàn) 中，將培養(yǎng)基替換為不含血清和抗生素的DMEM。將在補(bǔ)加了 10% FBS的、不含抗生素的DMEM中生長(zhǎng)的細(xì)胞用作對(duì)照。在細(xì)胞凋亡 的放線菌素D誘導(dǎo)中，將培養(yǎng)基替換為補(bǔ)加了 10 % FBS和1 n g/ml溶 解在甲醇中的放線菌素D的、不含抗生素的DMEM。在補(bǔ)加了 10% FBS和等體積曱醇的、不含抗生素的DMEM中，培養(yǎng)對(duì)照細(xì)胞。在 2個(gè)方法中，48小時(shí)后，通過用Hoescht或膜聯(lián)蛋白V-Cy3染色， 確定了細(xì)胞凋亡細(xì)胞的百分比。還通過RNA印跡分析確認(rèn)了細(xì)胞凋 亡的誘導(dǎo)，如圖20所示。flWsc/^襲逸用核染料(Hoescht)來標(biāo)記轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的核，以基于 形態(tài)特征(例如核碎裂和凝聚)鑒別細(xì)胞凋亡的細(xì)胞。緊在使用之前， 制備由無水甲醇和水醋酸的3:1混合物組成的固定劑。將等體積的固 定劑加入到在培養(yǎng)載玻片上生長(zhǎng)的COS-7細(xì)胞的培養(yǎng)基中，并溫育 2分鐘。從細(xì)胞取出培養(yǎng)基/固定劑混合物，并拋棄，給細(xì)胞加入lml 固定劑。5分鐘后，拋棄固定劑，給細(xì)胞加入lml新鮮的固定劑，并 溫育5分鐘。拋棄固定劑，在加入1 ml Hoescht染料(0.5 jn g/ml Hoescht 33258,溶于PBS中)之前，將細(xì)胞風(fēng)干4分鐘。在暗處溫 育10分鐘后，拋棄染色溶液，并用去離子水洗滌載玻片3次進(jìn)行1 分鐘。洗滌后，給細(xì)胞加入1 ml Mcllvaine氏緩沖液(0.021 M檸檬
酸，0.058 M Na2HP04 . 7H20; pH 5.6 )，并將它們?cè)诎堤帨赜?0分 鐘。拋棄緩沖液，在暗處將細(xì)胞風(fēng)干5分鐘，取出分隔培養(yǎng)栽玻片各 孔的室。向載玻片加幾滴用于熒光的Vectashield封固劑(Vector Laboratories)，并覆蓋上蓋玻片。使用紫外線濾色片，在熒光顯微 鏡下觀察染色的細(xì)胞。將具有明亮地染色的或碎裂的核的細(xì)胞記作細(xì) 胞凋亡的。處聯(lián)f ^ F-C)^染^使用膜聯(lián)蛋白V-Cy3細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Sigma)來熒光地 標(biāo)記在細(xì)胞凋亡細(xì)胞上的外化的磷脂酰絲氨酸。根據(jù)生產(chǎn)商的方案、 但進(jìn)行了下述修改，使用試劑盒。簡(jiǎn)而言之，用PBS洗滌在4室培 養(yǎng)栽玻片上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞2次，用IX結(jié)合緩沖液洗滌 3次。加入150y 1染色溶液(1 yg/ml AnnCy3，溶于IX結(jié)合緩沖液 中)，并在暗處溫育細(xì)胞IO分鐘。然后取出染色溶液，用IX結(jié)合 緩沖液洗滌細(xì)胞5次。從培養(yǎng)載玻片取出室壁，給細(xì)胞加幾滴1X結(jié) 合緩沖液，并覆蓋蓋玻片。使用綠色濾色片，以顯現(xiàn)陽性染色的(細(xì) 胞凋亡的)細(xì)胞的紅熒光，在熒光顯微鏡下分析染色的細(xì)胞。通過在 可見光下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目，確定總細(xì)胞群體。實(shí)施例3本實(shí)施例示范了細(xì)胞凋亡-特異性的eIF- 5A的調(diào)節(jié)。 使用在前面實(shí)施例所述的一般過程和方法，圖21是說明瞬時(shí)轉(zhuǎn) 染COS-7細(xì)胞的過程的流程圖，其中將無血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞在質(zhì) 粒DNA (在lipofectAMINE中)中溫育4小時(shí)，加入血清，并將細(xì) 胞再溫育40小時(shí)。然后，在分析前在含有血清的正常培養(yǎng)基中溫育 細(xì)胞另外48小時(shí)(即沒有進(jìn)一步的處理)，在分析前除去血清48小 時(shí)以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，或者在分析前用放線菌素D處理48小時(shí)以誘導(dǎo) 細(xì)胞凋亡。圖22是說明在用pHM6轉(zhuǎn)染后外來蛋白在COS-7細(xì)胞中瞬時(shí) 表達(dá)的蛋白印跡。在模擬轉(zhuǎn)染、或用pHM6-LacZ、 pHM6 -反義3' rF5A (pHM6-反義3'UTR大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A )或 pHM6-有義rF5A ( pHM6 -全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，從COS-7細(xì)胞分離出了蛋白。通過SDS-PAGE，將來自每個(gè)樣品的5pg蛋白分級(jí)分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上， 并用抗-[HA1 -過氧化物酶進(jìn)行蛋白印跡。通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)了結(jié)合 的抗體，并膝光于x-射線膠片30秒。LacZ (泳道2)和有義大鼠 細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A (泳道4)的表達(dá)清晰可見。如上所述，模擬轉(zhuǎn)染了 COS-7細(xì)胞，或者用pHM6-有義rF5A (pHM6-全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A)進(jìn)行了轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn) 染后40小時(shí)，通過撤去血清48小時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。使用 熒光均質(zhì)的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶測(cè)定試劑盒(Roche Diagnostics)，測(cè)量了轉(zhuǎn)染的細(xì)胞提取物中的天冬氨酸特異性半胱氨 酸蛋白酶蛋白水解活性。還使用FragEL DNA斷裂細(xì)胞凋亡檢查試 劑盒(Oncogene ),測(cè)量了DNA斷裂，該試劑盒用熒光素標(biāo)記的脫 氧核苷酸標(biāo)記暴露的DNA片段的3'-OH端。模擬轉(zhuǎn)染了或用pHM6 -有義rF5A( pHM6 -全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡 -特異性的eIF-5A)轉(zhuǎn)染了其它的COS-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后40小時(shí)， 使細(xì)胞在含有血清的正常培養(yǎng)基中生長(zhǎng)另外的48小時(shí)(無進(jìn)一步的 處理)，通過撤去血清48小時(shí)誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞凋亡，或者通過用0.5 Mg/ml放線菌素D處理48小時(shí)誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞凋亡。細(xì)胞用Hoescht 33258染色，它說明了伴隨細(xì)胞凋亡的核碎裂，或者用膜聯(lián)蛋白V-Cy3染色，它說明了伴隨細(xì)胞凋亡的磷脂酰絲氨酸暴露。還使用綠色 濾色片，通過熒光顯微鏡術(shù)觀察了染色的細(xì)胞，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，以確定 發(fā)生細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的百分比。在可見光下計(jì)數(shù)了總細(xì)胞群體。圖46說明了當(dāng)用在有義方向含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS - 7細(xì)胞時(shí)，如通過提高的天冬氨酸 特異性半胱氨酸蛋白酶活性反映的增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡。大鼠細(xì)胞凋亡— 特異性的elF-5A的表達(dá)導(dǎo)致天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活性 提高了 60%。圖47說明了當(dāng)用在有義方向含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的 eIF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞時(shí)，如通過提高的DNA斷 裂反映的增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡。大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的表達(dá) 導(dǎo)致DNA斷裂提高了 273%。圖48說明了當(dāng)用在有義方向含有全長(zhǎng) 大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS - 7細(xì)胞
時(shí)，如通過提高的核碎裂反映的細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。表達(dá)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的細(xì)胞中，存在更高的碎裂的核的發(fā)生率。圖 49說明了當(dāng)用在有義方向含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞時(shí)，如通過提高的核碎裂反映的 增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡。大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的eIF — 5A的表達(dá)導(dǎo)致核碎 裂分別比無血清饑餓的和血清饑餓的對(duì)照樣品提高了 27%和63%。圖50說明了當(dāng)用在有義方向含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞時(shí)，如通過磷脂酰絲氨酸暴 露反映的細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。圖51說明了當(dāng)用在有義方向含有全長(zhǎng)大 鼠細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞時(shí)， 如通過提高的磷脂酰絲氨酸暴露反映的增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡。大鼠細(xì)胞凋 亡-特異性的elF-5A的表達(dá)導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸暴露分別比無血清 饑餓的和血清饑餓的對(duì)照樣品提高了 140 %和198%。圖52說明了當(dāng)用在有義方向含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的 elF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞時(shí)，如通過提高的核碎裂反 映的增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡。大鼠細(xì)胞凋亡—特異性的eIF — 5A的表達(dá)導(dǎo)致 核碎裂分別比未處理的和處理的對(duì)照樣品提高了 115%和62%。圖53 對(duì)比了特定條件下的增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡，其中對(duì)用在有義方向含有全長(zhǎng) 大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的COS - 7細(xì) 胞沒有進(jìn)行進(jìn)一步的處理，或者進(jìn)行處理以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。實(shí)施例4本實(shí)施例示范了施用細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A后，對(duì)細(xì)胞凋 亡活性的調(diào)節(jié)。模擬轉(zhuǎn)染了、用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染了、或用pHM6-有義rF5A (pHM6-全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A)轉(zhuǎn)染了 COS - 7 細(xì)胞，并溫育40小時(shí)。通過SDS-PAGE，將來自每個(gè)樣品的5pg 蛋白提取物樣品分級(jí)分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用識(shí)別Bcl-2的 單克隆抗體進(jìn)行蛋白印跡。使用與過氧化物酶綴合的兔抗-小鼠IgG 作為第二抗體，通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)了結(jié)合的抗體，并曝光于x-射線 膠片。結(jié)果如圖54所示。該圖說明了當(dāng)用在有義方向包含全長(zhǎng)大鼠 細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS - 7細(xì)胞時(shí)，Bcl-2的下調(diào)。上圖說明考馬斯藍(lán)染色的蛋白印跡；下圖說明了相應(yīng) 的蛋白印跡。與用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，在用pHM6 -有 義rF5A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中檢測(cè)到的Bcl-2更少；因而表明了 Bcl - 2受 到pHM6-有義rF5A構(gòu)建體的下調(diào)。模擬轉(zhuǎn)染了、用pHM6-反義3'rF5A(pHM6-大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的反義3'UTR)轉(zhuǎn)染了或用pHM6-有義rF5A (pHM6-全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A)轉(zhuǎn)染了其它的 COS-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后40小時(shí)，通過撤去血清48小時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生 細(xì)胞凋亡。通過SDS-PAGE,將來自每個(gè)樣品的5pg蛋白提取物 樣品分級(jí)分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用識(shí)別Bcl-2的單克隆抗體 進(jìn)行蛋白印跡。使用與過氧化物酶綴合的兔抗-小鼠IgG作為第二抗 體，通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)了結(jié)合的抗體，并曝光于x-射線膠片。見圖 55。該圖中，當(dāng)用在反義方向包含細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的3， 末端的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞時(shí)上調(diào)Bcl-2。上圖說明考馬 斯藍(lán)染色的蛋白印跡；下圖說明了相應(yīng)的蛋白印跡。與那些模擬轉(zhuǎn)染 的或那些用pHM6-有義rF5A轉(zhuǎn)染的相比，在用pHM6 -反義3， rF5A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中檢測(cè)到的Bcl-2更多。另外，模擬轉(zhuǎn)染了、用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染了或用pHM6-有義 rF5A(pHM6-全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A)轉(zhuǎn)染了 COS -7細(xì)胞，并溫育40小時(shí)。通過SDS-PAGE,將來自每個(gè)樣品的5 Hg蛋白提取物樣品分級(jí)分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用識(shí)別p53的 單克隆抗體進(jìn)行蛋白印跡。使用與堿性磷酸酶綴合的山羊抗-小鼠 IgG作為第二抗體，通過比色法檢測(cè)了結(jié)合的抗體。見圖56。該圖顯 示了當(dāng)用在有義方向包含全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的 pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞時(shí)，c-Myc的上調(diào)。上圖說明考馬斯 藍(lán)染色的蛋白印跡；下圖說明了相應(yīng)的蛋白印跡。與用pHM6-LacZ 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或模擬對(duì)照相比，在用pHM6-有義rF5A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中 檢測(cè)到的c-Myc水平更高。最后，模擬轉(zhuǎn)染了、用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染了或用pHM6-有義 rF5A(pHM6-全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A)轉(zhuǎn)染了 COS -7細(xì)胞，并溫育40小時(shí)。通過SDS-PAGE，將來自每個(gè)樣品的5 Mg蛋白提取物樣品分級(jí)分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用識(shí)別p53的
單克隆抗體進(jìn)行探測(cè)。使用抗-[HA-過氧化物酶探測(cè)了對(duì)應(yīng)的蛋白 印跡，以確定大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A的表達(dá)水平。使用與 堿性磷酸酶綴合的山羊抗-小鼠IgG作為第二抗體，通過化學(xué)發(fā)光檢 測(cè)了結(jié)合的抗體。見圖57。該圖顯示了當(dāng)用在有義方向包含全長(zhǎng)大 鼠細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A的pHM6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS - 7細(xì)胞時(shí)， p53的上調(diào)。上圖說明考馬斯藍(lán)染色的蛋白印跡；下圖說明了相應(yīng)的 蛋白印跡。與用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或模擬對(duì)照相比，在用 pHM6-有義rF5A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中檢測(cè)到的p53水平更高。圖58-A-E說明了 COS-7細(xì)胞中的p53上調(diào)對(duì)pHM6-全長(zhǎng) 大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A的表達(dá)的依賴性。與笫二次轉(zhuǎn)染相 比，第一次轉(zhuǎn)染中存在更多的可檢測(cè)的大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的eIF -5A。在用抗-p53探測(cè)的蛋白印跡中，所述圖說明了對(duì)應(yīng)的考馬斯 藍(lán)染色的蛋白印跡，且所述圖說明了應(yīng)用p53的蛋白印跡。關(guān)于第一 次轉(zhuǎn)染，與用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或模擬對(duì)照相比，在用pHM6 -有義rF5A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中存在更多的可檢測(cè)的p53。關(guān)于第二次轉(zhuǎn) 染，其中更少地表達(dá)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A,用pHM6-有義rF5A、 pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或模擬對(duì)照之間沒有可檢測(cè)的 p53水平的差異。實(shí)施例5將心臟組織暴露于正常氧水平并測(cè)量細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A和增殖elF-5A的表達(dá)水平。隨后，降低送遞到心臟組織的氧量， 由此誘導(dǎo)缺氧和缺血，并最終誘導(dǎo)了心臟組織中的心臟病發(fā)作。測(cè)量 細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A和增殖elF-5A的表達(dá)水平并與被缺 血損傷之前的心臟組織的表達(dá)水平相比較。將在瓣膜換置術(shù)過程中取出的人心臟組織切片鉤到電極上。將小 砝碼附著到心臟組織上，以使得對(duì)心臟搏動(dòng)強(qiáng)度的測(cè)量較容易。電極 提供電刺激，以使組織開始搏動(dòng)。在誘導(dǎo)缺血之前，測(cè)量心臟組織中 細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A和增殖elF-5A的基因表達(dá)水平。見 圖61。在缺血前的心臟組織中，生成了低水平的細(xì)胞凋亡-特異性 的eIF — 5A和增殖eIF 一 5A，且它們的水平相對(duì)平衡。在這個(gè)時(shí)間中， 將氧和二氧化碳分別在緩沖液中以92.5%和7.5%送遞給心臟。然 后，降低氧水平，并增加氮水平，以誘導(dǎo)缺血，和最后的"心臟病發(fā) 作"。心臟組織停止搏動(dòng)。然后將氧水平恢復(fù)至正常，用電刺激再次 使心臟組織產(chǎn)生脈動(dòng)，以使心臟再次開始搏動(dòng)。"心臟病發(fā)作"后，再次測(cè)量細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A和增殖elF-5A的表達(dá)水 平。這時(shí)，細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A的表達(dá)水平有了顯著提高， 而增殖elF-5A的表達(dá)水平的提高則顯著較小。見圖61。"心臟病發(fā)作"后，心臟搏動(dòng)不能同樣有力，如更少所附砝碼的 壓迫/運(yùn)動(dòng)所示的，從而表明由于細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的存 在，迅速殺死了心臟組織細(xì)胞。實(shí)施例6下面的實(shí)施例提供了細(xì)胞培養(yǎng)條件。乂謬我々j承魔#勿^潛#從加拿大目艮庫安大略省分部(Eye Bank of Canada, Ontario Division)得到了死后48小時(shí)內(nèi)的成對(duì)的人眼。取出視神經(jīng)乳頭(具 有附加的極)，并置于Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM) 中3小時(shí)，所述培養(yǎng)基中補(bǔ)加了抗生素/抗真菌劑、谷氨酰胺和10% FBS。從每個(gè)組織樣品中回收視神經(jīng)乳頭(ONH)鈕，并用細(xì)解剖剪 刀切成4小片。在12.5 cm2塑料培養(yǎng)燒瓶中，在DMEM培養(yǎng)基中培 養(yǎng)外植塊。在1個(gè)月內(nèi)，在存活的外植塊中觀察到了生長(zhǎng)。 一旦細(xì)胞 達(dá)到了 90%匯合，則用胰蛋白酶消化它們，并進(jìn)行有差異的傳代培 養(yǎng)，以生產(chǎn)篩板(LC)和星形膠質(zhì)細(xì)胞群體。具體地，在25cn^燒 瓶中，在補(bǔ)加了慶大霉素、谷氨酰胺和10%FBS的DMEM中，傳代 培養(yǎng)LC細(xì)胞，而在裝有不含有FBS的EBM完全培養(yǎng)基(Clonetics ) 的25cii^燒瓶中擴(kuò)增星形膠質(zhì)細(xì)胞。傳代培養(yǎng)10天后，將FBS加入 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物。按照該方案，維持和傳代培養(yǎng)細(xì)胞。使用有差異的熒光抗體染色，在8孔培養(yǎng)載玻片上，對(duì)通過有差異的傳代培養(yǎng)得到的細(xì)胞群體表征了特性和群體純度。將細(xì)胞固定 在10%福爾馬林溶液中，并用Dulbecco氏磷酸緩沖鹽水(DPBS)洗 滌3次。用溶于DPBS中的2%脫脂乳封閉后，將抗體稀釋到溶于 DPBS中的1%BSA中，并施用給6個(gè)孔中的細(xì)胞。剩下的2個(gè)孔只 用1%牛血清清蛋白(BSA)溶液處理且不用第一抗體處理，以作為 對(duì)照。將細(xì)胞與第一抗體在室溫溫育1小時(shí)，然后用DPBS洗滌3次。 將適當(dāng)?shù)牡诙贵w稀釋到溶于DPBS中的1%BSA中，加入每個(gè)孔 中，并溫育1小時(shí)。用DPBS洗滌后，從載玻片取出分隔培養(yǎng)載玻片 的各孔的室，將載玻片浸入重蒸餾水中，然后進(jìn)行風(fēng)干。將 Fluoromount (Vector Laboratories)應(yīng)用到每個(gè)栽玻片上，并覆蓋 22x60 mm蓋玻片。用適當(dāng)?shù)臑V色片，在熒光顯微鏡下觀察了免疫熒光染色，并與沒 有用第一抗體處理的對(duì)照孔進(jìn)行了對(duì)比。除非另作說明，所有第一抗 體都購自Sigma。所有第二抗體都購自Molecular Probes。用于鑒別 LC細(xì)胞的第一抗體是抗-膠原1、抗-膠原IV、抗-層粘連蛋白、 抗-細(xì)胞纖連蛋白。用于鑒別星形膠質(zhì)細(xì)胞的第一抗體是抗-半乳 糖腦普月旨 (Chemicon International )、 抗一 A2B5 ( Chemicon International)、抗-NCAM、抗-人Von willebrand因子。用于2 種細(xì)胞群體的其它抗體包括抗-膠質(zhì)細(xì)胞原纖維(GFAP)和抗- a -平滑肌肌動(dòng)蛋白。如果細(xì)胞群體對(duì)于膠原I、膠原IV、層粘連蛋 白、細(xì)胞纖連蛋白、a平滑肌肌動(dòng)蛋白是陽性染色的，且對(duì)于膠質(zhì) 細(xì)胞原纖維(GFAP)是陰性染色的，則確定該細(xì)胞群體由LC細(xì)胞 組成。如果細(xì)胞群體對(duì)于NCAM、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維(GFAP)是陽性 染色的，且對(duì)于半乳糖腦苷脂、A2BS、人Vonwillebrand因子和a平 滑肌肌動(dòng)蛋白是陰性染色的，則確定該細(xì)胞群體由星形膠質(zhì)細(xì)胞組 成。在該初步研究中，使用了 3組人眼來開始培養(yǎng)。分別從83-歲 男性、17-歲男性和26-歲女性的視神經(jīng)乳頭，確立了 LC細(xì)胞系# 506、 #517和#524。已經(jīng)充分表征了所有LC細(xì)胞系，且發(fā)現(xiàn)其含 有超過90。/。LC細(xì)胞。皿ORKO(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CRL-2577)是表達(dá)野生型p53 的人結(jié)腸癌細(xì)胞系，使用它來測(cè)試反義寡核苷酸阻抑細(xì)胞凋亡-特異 性的eIF-5A蛋白表達(dá)的能力。在含有非必需氨基酸、Earle氏鹽和 L 一谷氨酰胺的最小必需培養(yǎng)基(Minimum Essential Medium ) Eagle
(MEM)中，培養(yǎng)了 RKO。培養(yǎng)基補(bǔ)加了 10°/。胎牛血清(FBS)和 100單位青霉素/鏈霉素。使細(xì)胞在371C、在5%<:02和95%空氣的 濕潤(rùn)環(huán)境下生長(zhǎng)。通過用0.25%胰蛋白酶和1 mMEDTA的溶液使貼 壁細(xì)胞脫附，每3至4天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。以1:10至1:12的分 離比，將脫附的細(xì)胞分散在含有新鮮培養(yǎng)基的新培養(yǎng)皿中。鄉(xiāng)02H印G2是一種人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系，使用它來測(cè)試針對(duì)人細(xì)胞凋 亡 一 特異性的eIF 一 5A的反義寡核苷酸阻斷IL — 1 P處理引起的TNF —oc生產(chǎn)的能力。在補(bǔ)加了慶大霉素、谷氨酰胺和10%FBS的DMEM 中，培養(yǎng)了HepG2細(xì)胞，并使其在371C、在5 % C02和95 %空氣的 濕潤(rùn)環(huán)境下生長(zhǎng)。實(shí)施例7iy應(yīng)源亡W謬,分別使用放線菌素D (RNA聚合酶抑制劑)和喜樹堿(拓樸異 構(gòu)酶抑制劑)，在RKO和篩板細(xì)胞中誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。以0.25jig/ml 的濃度，使用了放線菌素D，且以20、 40或50pM的濃度，使用了 喜樹堿。還使用喜樹堿(50jiM)和TNF- oc (10ng/ml)的組合， 在篩板細(xì)胞中誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。發(fā)現(xiàn)喜樹堿和TNF-ot的組合比單 獨(dú)的喜樹堿或TNF- oc更有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由Molecula Research Labs設(shè)計(jì)并從那里購買了耙向人細(xì)胞凋亡 -特異性的eIF — 5A的一組3個(gè)反義寡核普酸。第一個(gè)靶向人細(xì)胞凋 亡-特異性的eIF-5A的反義寡核苷酸的序列(弁1)是5'CCTGTC TCG AAG TCC AAG TC 3， ( SEQ ID NO: 63 )。第二個(gè)耙向人細(xì)胞 凋亡-特異性的eIF - 5A的反義寡核苷酸的序列(#2 )是5'GGA CCT TGG CGT GGC CGT GC 3' ( SEQ ID NO: 64 )。第三個(gè)把向人細(xì)胞 凋亡-特異性的eIF - 5A的反義寡核苷酸的序列(#3 )是5'CTC GTA CCT CCC CGC TCT CC 3' ( SEQ ID NO: 65 )。對(duì)照寡核苷酸具有 序列5'CGT ACC GGT ACG GTT CCA GG 3' ( SEQ ID NO: 66 )。使用異硫氰酸熒光素(FITC)-標(biāo)記的反義寡核苷酸(Molecula Research Labs)來監(jiān)控轉(zhuǎn)染效率，且其具有序列5'GGA CCT TGG CGT GGC CGT GCX 3' ( SEQ ID NO: 67 )，其中X是FITC標(biāo)記。所有的反義寡核苷酸都是完全硫代磷酸酯化的。^乂慕祐芬^W脊染在RKO細(xì)胞中，測(cè)試了細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A反義寡核 苷酸阻斷細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A蛋白表達(dá)的能力。使用轉(zhuǎn)染試 劑Oligofectamine (Invitrogen )，用反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染了 RKO細(xì)胞。 在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，以157,000 /孔，將細(xì)胞分入24孔平板中的補(bǔ)加 了 10%FBS、但是缺少青霉素/鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中。24小時(shí)后， 細(xì)胞一般已經(jīng)達(dá)到了大約50%的匯合。模擬轉(zhuǎn)染了、或用100 nM或 200 nM反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染了 RKO細(xì)胞。通過用無血清的MEM稀釋 0、 1.25或2.5 lil20^M反義寡核苷酸原液至42.5nl的終體積，并 將混合物在室溫溫育15分鐘，制備了足夠24孔平板中的一個(gè)孔的 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。將1.5 jnl Oligofectamine稀釋在6 m 1無血清的MEM 中，并在室溫溫育7.5分鐘。5分鐘后，將稀釋的Oligofectamine混 合物加入DNA混合物中，并一起在室溫溫育20分鐘。用無血清的 MEM洗滌細(xì)胞1次，然后向細(xì)胞加入200pl MEM,并覆蓋50 p 1 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。將細(xì)胞放回生長(zhǎng)室4小時(shí)。溫育后，將125plMEM + 30 。/oFBS加入細(xì)胞中。然后，將細(xì)胞另外培養(yǎng)48小時(shí)，用0.25jig/ml放 線菌素D處理24小時(shí)，然后收獲細(xì)胞提取物，以進(jìn)行蛋白印跡分析。使用與關(guān)于RKO細(xì)胞所述相同的方法，還使用100和200 nM反 義寡核苷酸和Oligofectamine測(cè)試了篩板細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。但是，通過簡(jiǎn) 單地將在無血清的培養(yǎng)基中從1 pM至10 jiM稀釋的反義寡核苷酸加 入細(xì)胞中24小時(shí)，然后每24小時(shí)將培養(yǎng)基替換為新鮮的稀釋在含血 清的培養(yǎng)基中的反義寡核苷酸，共進(jìn)行2-5天，實(shí)現(xiàn)了篩板細(xì)胞的 有效轉(zhuǎn)染。通過用具有與細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A反義寡核苷酸#2 (SEQIDNO: 64)相同的序列、但是在3'端綴合了 FITC的FITC -標(biāo)記的反義寡核苷酸進(jìn)行轉(zhuǎn)染，最優(yōu)化和監(jiān)控了反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染 的效率。在8-孔培養(yǎng)載玻片上，用FITC-標(biāo)記的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)
染了 RKO和篩板細(xì)胞。48小時(shí)后，用PBS洗滌細(xì)胞，并在溶于PBS 中的3.70/。甲醛中固定10分鐘。取出孔，加入封固劑(Vectashield )， 然后覆蓋蓋玻片。然后，使用熒光素濾色片(Green H546，濾色片組 48915)，在熒光顯微鏡中心上，在紫外線下顯現(xiàn)細(xì)胞，并確定發(fā)出 明亮綠色熒光的細(xì)胞已經(jīng)攝入了寡核苷酸。在用反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染篩板細(xì)胞和用喜樹堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后，確 定了用對(duì)照反義寡核苷酸或細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的反義寡 核苷酸SEQ ID NO: 26處理的細(xì)胞中經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞百分比。 使用了 2種方法來檢測(cè)凋亡的篩板細(xì)胞-Hoescht染色和DeadEndTM 熒光TUNEL。使用核染料Hoescht來標(biāo)記篩板細(xì)胞核，以基于形態(tài) 學(xué)特征(例如核碎裂和凝聚)來鑒定細(xì)胞凋亡的細(xì)胞。緊在使用之前， 制備了由無水曱醇和冰醋酸的3: 1混合物組成的固定劑。將等體積的 固定劑加給生長(zhǎng)在培養(yǎng)載玻片上的細(xì)胞的培養(yǎng)基，并溫育2分鐘。從 細(xì)胞去除并拋棄培養(yǎng)基/固定劑混合物，并將1 ml固定劑加給細(xì)胞。5 分鐘后，拋棄固定劑，將l ml新鮮的固定劑加給細(xì)胞，并溫育5分 鐘。拋棄固定劑，使細(xì)胞風(fēng)干4分鐘，然后加入1 ml Hoescht染料(0.5 jig/ml Hoescht 33258，溶于PBS中)。在黑暗中溫育10分鐘后，拋棄染色溶液，取出分隔培養(yǎng)載玻片的各孔的室，用去離子水洗滌載玻 片3次、l分鐘。洗滌后，將幾滴Mcllvaine氏緩沖液(0.021 M檸 檬酸，0.058 M Na2HP04 . 7H20; pH5.6)加給細(xì)胞，并覆蓋蓋玻片。 使用紫外線濾色片，在熒光顯微鏡下觀察染色的細(xì)胞。將具有明亮染 色的或破碎的核的細(xì)胞記作細(xì)胞凋亡的。每孔計(jì)數(shù)了最小200個(gè)細(xì) 胞。使用DeadEndTM熒光TUNEL ( Promega )來檢測(cè)DNA斷裂， 后者是細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的特征。Hoescht染色后，用蒸餾水簡(jiǎn)單地洗 滌培養(yǎng)載玻片，并通過將載玻片浸入PBS( 137mM NaCl， 2.68mM KC1， 1.47mM KH2P04， 8.1 mM Na2HP04 )中2次、5分鐘進(jìn)行進(jìn)一步洗滌， 在2次洗滌之間，在紙巾上吸干載玻片。通過將細(xì)胞浸入溶于PBS 中的0.2% Triton X-100中5分鐘，使所述細(xì)胞透化。然后，通過將 載玻片浸入PBS中2次、5分鐘再次洗滌細(xì)胞，在2次洗滌之間，在
紙巾上吸干栽玻片。向每孔加入25jal平衡緩沖液[200mM 二曱胂酸 鐘(pH 6.6 ) ， 25 mM Tris — HC1 ( pH 6.6 ) ， 0.2 mM 二硫蘇糖醇，0.25 mg/ml牛血清清蛋白和2.5mM氯化鈷],并溫育5-10分鐘。在平 衡過程中，通過以45: 5: 1的比率分別混合平衡緩沖液、核苷酸混合 物[50 jtM熒光素-12 - dUTP， 100 pM dATP， 10 mM Tris - HCl( pH 7.6 )和1 mM EDTA]和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Tdt， 25 U/jU )，為 每個(gè)孔制備了 30nl反應(yīng)混合物。在平衡緩沖液中溫育后，將30jnl 反應(yīng)混合物加入每個(gè)孔中，并覆蓋蓋玻片。在黑暗中在371C進(jìn)行反 應(yīng)1小時(shí)。通過將載玻片浸入2XSSC
,并溫育5-10分鐘。在平 衡過程中，通過以45: 5: 1的比率分別混合平衡緩沖液、核苷酸混合 物[50 jiM熒光素-12 - dUTP， 100 fiM dATP， 10 mM Tris - HCl( pH 7.6 )和1 mM EDTA和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Tdt， 25 U/jU )，為 每個(gè)孔制備了 30jLil反應(yīng)混合物。在平衡緩沖液中溫育后，將30m1 反應(yīng)混合物加入每個(gè)孔中，并覆蓋蓋玻片。在黑暗中在3 1C進(jìn)行反 應(yīng)1小時(shí)。通過將栽玻片浸入2XSSC
漠費(fèi)
圖149和150顯示在Balb/C小鼠中的測(cè)試結(jié)果。所有小鼠于48 小時(shí)接受致死劑量的LPS。第1組的小鼠于0和24小時(shí)接受siRNA， 并且5只小鼠中有3只存活。第2組的小鼠于0、 24和48小時(shí)接受 siRNA，并且5只小鼠中有5只存活。第3組的小鼠于48小時(shí)接受 siRNA,并且5只小鼠中有5只存活。第4組的小鼠于50、 56、 64 和72小時(shí)接受siRNA，并且5只小鼠中有4只存活。第5組的小鼠 于48、 56、 64和72小時(shí)接受siRNA,并且5只小鼠中有2只存活。 第6組的小鼠，對(duì)照組，不接受siRNA并且零只小鼠存活，并且所 有5只小鼠在LPS處理48小時(shí)內(nèi)死亡(第4天)。
C575丄/6 V、扃模費(fèi)
圖151和152顯示了在C57BL/6小鼠中的測(cè)試結(jié)果。所有小鼠 于48小時(shí)接受致死劑量的LPS。第1組的小鼠于0和24小時(shí)接受 siRNA，并且5只小鼠中有1只存活。第2組的小鼠于0、 24和48 小時(shí)接受siRNA，并且5只小鼠中有2只存活。第3組的小鼠于48 小時(shí)接受siRNA，并且5只小鼠中有2只存活。第4組的小鼠于50、 56、 64和72小時(shí)接受siRNA，并且5只小鼠中有2只存活。第5組 的小鼠于48、 56、 64和72小時(shí)接受siRNA，并且5只小鼠中有2只 存活。第6組的小鼠，對(duì)照組，不接受siRNA并且零只小鼠存活， 并且所有5只小鼠在LPS處理48小時(shí)內(nèi)死亡(第4天)。
實(shí)施例22
Nl -脒基- 1，7 - 二氨基庚烷(GC7; Biosearch Technologies )， DHS的有效抑制劑，使用濃度為50jiM。使用0.5或1.0ng/ml的放 線菌素D ( Calbiocbem )。
勿^潛#和^理
人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系，HT-29，用于細(xì)胞增殖和elF-5A定位研 究,并且是來自Anita Antes ( University of Medicine and Dentistry of New Jersey)的友好饋贈(zèng)。HT - 29細(xì)胞維持在補(bǔ)加有1 mM丙酮酸 鈉、10 mM HEPES和10 %胎牛血清(FBS )的RPMI 1640中。所有 其他細(xì)胞系都得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
CCD112Co是正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞系。RKO是包含野生型p53 的人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系(CRL-2577) 。 RKO-E6細(xì)胞系(CRL-2578)來源于RKO細(xì)胞系。它包含穩(wěn)定整合的人乳頭瘤病毒E6癌 基因并因此缺乏可察覺的功能性p53腫瘤抑制蛋白18。 RKO、 RKO - E6和細(xì)胞系CCD112Co生長(zhǎng)在含2mM L -谷氨酰胺和Earle氏平 衡鹽溶液的改良的Eagle極限必需培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基調(diào)整至包含 1.5g/L碳酸氫鈉、O.lmM非必需氨基酸、lmM丙酮酸鈉并補(bǔ)加有 10%FBS。將細(xì)胞維持在37"C、包含5。/。C02的濕潤(rùn)環(huán)境中。
#在^^/^和游建
使用GenEhite哺乳動(dòng)物RNA miniprep試劑盒(Sigma )根據(jù)生 產(chǎn)商關(guān)于貼壁細(xì)胞的方案，通過RT-PCR從RKO細(xì)胞中分離出的 總RNA來克隆人elF5Al 。使用的引物是正向，5， -CGAGTTGGAATCGAAGCCTC-3';和反向，5， - GGTTCAGAGG ATCACTGCTG-3，。將得到的532堿基對(duì)的產(chǎn)物亞克隆到pGEM -T Easy ( Promega )中并進(jìn)行測(cè)序。使用得到的質(zhì)粒作為使用下列引 物 的 PCR 的 模 板 正 向 ， 5， -GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG - 3'; 和反向，5' -CCTGAATTCCAGTTATTTTGCCATGG-3'，并且將PCR產(chǎn)物亞 克隆到pHM6 (血凝素[HA標(biāo)記的；Roche Molecular Biochemicals ) 的好/"WI1和五coRl位點(diǎn)，以產(chǎn)生pHM6 - elF5Al載體。通過PCR 使用下列引物產(chǎn)生elF5Al的C末端截短的構(gòu)建體(pHM6-elF5Al △ 37):正向，5,-GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG —3'; 和反向，5'-GCCGAATTCTCCCTCAGGCAGAGAAG-3'。將得到 的PCR產(chǎn)物亞克隆到pHM6載體中。使用pHM6 - LacZ載體(Roche Molecular Biochemicals )以最優(yōu)化轉(zhuǎn)染并用作對(duì)細(xì)胞凋亡的轉(zhuǎn)染作用 的對(duì)照。
RKO細(xì)胞在6孔板上生長(zhǎng)至匯合并用1.0 ng/ml放線菌素D處理 0、 1、 4或8小時(shí)。4吏用GenElute哺乳動(dòng)物RNA miniprep試劑盒 (Sigma)從細(xì)胞中分離出總RNA，并且在1.2 %瓊脂糖/甲醛凝膠上 分級(jí)分離5將RNA。根據(jù)確立的方法用"P-標(biāo)記的、與elF5Al的 3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)同源的cDNA探測(cè)膜。通過RT - PCR使 用下列引物從RKO細(xì)胞中克隆用于蛋白印跡的elF5Al 3'- UTR cDNA :正向，5'-GAGGAATTCGCTGTTGCAATCAAGGC-3'; 和反向，5' - TTTAAGCTTTGTGTCGGGGAGAGAGC - 3'。
灰在付脊染;^勿^游亡W發(fā)浙
使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen )根據(jù)生產(chǎn)商推薦的方案用 質(zhì)粒DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RKO和RKO-E6細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，根據(jù) 生產(chǎn)商的方案，通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶-介導(dǎo)的dUTP-洋地黃
1
毒苷切口末端標(biāo)記(TUNEL )使用DNA斷裂檢測(cè)試劑盒(Oncogene Research Products)檢測(cè)包含斷裂的如DNA的細(xì)胞凋亡的細(xì)胞。隨 后通過流式細(xì)胞術(shù)或通過熒光顯微術(shù)鏡分析標(biāo)記的細(xì)胞。對(duì)于流式細(xì) 胞術(shù)分析，將收獲的細(xì)胞用溶于PBS的4%曱醛固定，通過TUNEL 標(biāo)記并在有488nm氬激光器源和用于熒光素檢測(cè)的濾色片的流式細(xì) 胞儀(Coulter Epics XL - MCL )上進(jìn)行分析。對(duì)于熒光顯微鏡術(shù)分 析，細(xì)胞在8孔培養(yǎng)栽玻片上轉(zhuǎn)染，用4%曱醛固定，隨后通過TUNEL 標(biāo)記，并用Hoescht 33258根據(jù)Taylor等(2004 )描述的方法進(jìn)行染 色。
siRNA的轉(zhuǎn)染
所有siRNA都得自Dharmacon。 elF5Al siRNA具有下列序列 有義鏈，5'-GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3';和反義鏈，3' -dTdTCGACCUGAGGAGGAUGUGU - 5'。使用的對(duì)照siRNA具有 elF5Al-特異性的siRNA的反向序列，并且與任何已知的人基因產(chǎn) 物沒有同 一 性。對(duì)照siRNA具有下列序列有義鏈，5' -ACACAUCCUCCUCAGGUCGdTdT - 3，；和反義鏈，3' - dTdTUGUG UAGGAGGAGUCCAGC-5'。使用Lipofectamine 2000用siRNA12 轉(zhuǎn)染細(xì)胞并將其用于增殖研究或蛋白印跡。
蛋白印跡
使用沸騰的裂解緩沖液[2y。SDS， 50 mM Tris - HC1 ( pH 7.4)
分離用于蛋白印跡的蛋白質(zhì)。使用雙金雞寧酸試劑盒(Sigma)測(cè)定 蛋白質(zhì)的濃度。對(duì)于蛋白印跡，在12y。SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離5 叫總蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。使用的第一抗體是抗-elF5Al (BD Transduction Laboratories;小鼠IgG )和抗-p -肌動(dòng) 蛋白(Oncogene;小鼠IgM) ， 二者都為在5%乳中1:20,000的稀度。 第二抗體是與辣根過氧化物酶(HRP; Sigma)綴合的抗-小鼠IgG 和抗小鼠IgMHRP (Oncogene)。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法(ECL， Amersham Biosciences)顯現(xiàn)抗體-蛋白質(zhì)復(fù)合物。在elF5Al檢測(cè) 后，根據(jù)ECL +蛋白印跡檢測(cè)系統(tǒng)提供的方案剝離印跡，并用抗-P -肌動(dòng)蛋白抗體再探測(cè)以確定等量裝載。
增顛定
使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen )在96孑L板上用siRNA轉(zhuǎn) 染HT-29細(xì)胞。4吏用XTT細(xì)胞增殖試劑盒(Roche Applied Science) 來測(cè)量增殖細(xì)胞的代謝活性。使用BrdU細(xì)胞增殖試劑盒(Roche Applied Science)根據(jù)生產(chǎn)商的方案測(cè)量DNA的合成。
在聚-L-賴氨酸-包被的玻璃蓋玻片上培養(yǎng)HT-29細(xì)胞。分 匯合的細(xì)胞與200單位干擾素y (ifn - y ; Roche Applied Science ) 溫育16小時(shí)，隨后為與TNF- a (100ng/ml; Leinco Technologies ) 溫育10分鐘-8小時(shí)的時(shí)間?？商娲?，用1.0ng/ml放線菌素D處 理細(xì)胞，處理時(shí)間長(zhǎng)度從30分鐘漸增至16小時(shí)。將處理的細(xì)胞用3 %的曱醛(不含曱醇；Polysciences Inc.)固定20分鐘，用PBS洗滌 2次5分鐘，并用包含100mM甘氨酸的PBS洗滌1次5分鐘，并用 溶于PBS的0.2 % Triton X - 100透化4分鐘。細(xì)胞隨后使用標(biāo)準(zhǔn)方 案進(jìn)行標(biāo)記以用于免疫熒光。第一抗體是以1:250稀度溫育1小時(shí)的 抗一 elF5Al ( BD Transduction Laboratories;小鼠IgG )。 第二抗體 是以1:200的稀度使用1小時(shí)的抗小鼠IgG - AlexaFluor 488 (Molecular Probes )。抗體標(biāo)記后，用Hoescht 33258對(duì)核進(jìn)行染色， 并通過熒光顯微鏡術(shù)觀察標(biāo)記的細(xì)胞。
S -在-2,7，M -三^差癸^夢(mèng)謬W^^
COS-7細(xì)胞維持在包含10。/。FBS和青霉素/鏈霉素的Dulbelcco 氏改良的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)中。COS - 7細(xì)胞在T25燒瓶中 培養(yǎng)至90- 95%匯合。在用0，25Q/o胰蛋白酶-EDTA (37TC3分鐘) 脫附后收獲COS-7細(xì)胞，在包含10%FBS的DMEM中稀釋，并且 在1000RPM離心5分鐘。將沉淀重懸浮于lml DMEM中并且用血 細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞用DMEM稀釋至1.5x106細(xì)胞/ml 的濃度，并且使用650 nL稀釋的細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。在50 pL Opti-MEM ( Gibco )中稀釋15微克質(zhì)粒DNA ( pHM6 - elF5Al ),加入 到650 稀釋的COS-7細(xì)胞中并轉(zhuǎn)移至杯中。細(xì)胞使用T820
ElectroSquarePorator在下列條件下進(jìn)行電穿孔
i. 模式高電壓模式(HV) ， 99psec;
ii. 電壓1.5 kV;
iii. 脈沖長(zhǎng)度90 jisec;
iv. 脈沖數(shù)目1或2;
在電穿孔后，細(xì)胞從杯中轉(zhuǎn)移至6孔板的一個(gè)孔中并在37TC溫 育，所述6孔板的每個(gè)孔預(yù)裝栽有1.2 ml包含16%FBS的DMEM。 轉(zhuǎn)染后6小時(shí)，向每個(gè)孔中加入100 jtL包含10%FBS和50 pCi [3H
亞精胺的DMEM。電穿孔后48小時(shí)，細(xì)胞用冷PBS洗滌并置于冰 上。向每個(gè)孔中加入200孩￡升冷裂解緩沖液[150 mM NaCl， 1 %NP40， 50 mM Tris - HC1 {pH 8.0}，蛋白酶抑制劑混合物l并在搖床上在冰上 溫育30分鐘。從板上刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管并在13，000rpm在4 匸離心10分鐘。15.將裂解物轉(zhuǎn)移至新鮮管中并加入20nl抗-HA 抗體(Roche Applied Science )。在旋轉(zhuǎn)的同時(shí)將混合物在4"C溫育2 小時(shí)。加入50微升A蛋白瓊脂糖(Roche Applied Science)并且將 混合物在旋轉(zhuǎn)器上在4"C溫育1小時(shí)，并隨后在4TC在13000rpm離 心15秒。取出上清液，向珠加入800nl冷裂解緩沖液并通過渦旋重 懸浮。將珠再洗滌2次并隨后重懸浮于80|il的1XSDSPAGE加樣 緩沖液中。珠于851C加熱IO分鐘并在13000rpm離心15秒。在15 % SDS - PAGE凝膠上分離上清液并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。膜在Amplify 熒光顯影試劑(Amersham)中溫育30分鐘以提高3H檢測(cè)效率，并 隨后在顯影前在-80iC曝光于Hyperfilm (Amersham) 10天。膜隨 后用于用抗一 HA ( Roche Applied Science )和抗-elF5A ( BD Transduction Laboratories )抗體進(jìn)行蛋白印跡。
蛋冷伊逐
通過將細(xì)胞在PBS ( 8 g/L NaCl、 0.2 g/L KCl、 1.44 g/L Na2HP04 和0.24 g/L KH2P04)中洗滌2次并隨后加入50jil沸騰的裂解緩沖 液[2。/。SDS、 50mMTris-HCl (pH7.4)]，從生長(zhǎng)在24孔板上的正 常結(jié)腸成纖維細(xì)胞分離出蛋白質(zhì)用于蛋白印跡。將細(xì)胞裂解物收集在 微量離心管中，煮沸5分鐘并貯存于-20X:。使用雙金雞寧酸試劑盒 (BCA; Sigma)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。對(duì)于蛋白印跡，在12 % SDS -聚
丙烯酰胺凝膠上分級(jí)分離5jug總蛋白。將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏 二氟乙烯膜。使用的第一抗體是在5%乳中分別為1:20，000或1:5000 稀度的抗-elF5A ( BD Transduction Laboratories;小鼠IgG )和抗一 HA ( Roche Applied Science )。膜在PBS - T中洗滌3次并與合適的 HRP-綴合的第二抗體溫育1小時(shí)，所述第二抗體在溶于PBS的1 %乳中1:5000稀釋。使用ECL +蛋白印跡檢測(cè)試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech )檢領(lǐng)'J抗體 一 結(jié)合的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例23
因?yàn)閑lF-5A在所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞中都是保守的蛋白，并且在細(xì) 胞存活中起作用，所以在體內(nèi)測(cè)試前必須確立siRNA在體外減少 elF5A的組成型表達(dá)的有效性。見實(shí)施例23。將L929接種在24孔 板上。第二天用elF5Al siRNA或?qū)φ栈祀ssiRNA ( CsiRNA)轉(zhuǎn)染細(xì) 胞。轉(zhuǎn)染后3天，通過蛋白印跡用抗elF5A抗體測(cè)定細(xì)胞裂解物。在 用針對(duì)鼠elF5A的siRNA轉(zhuǎn)染而不是Cs股NA轉(zhuǎn)染后實(shí)現(xiàn)了 elF5A 蛋白的組成型表達(dá)的特異性抑制。
因?yàn)槿硌装Y導(dǎo)致胸腺細(xì)胞凋亡，所以研究了鼻內(nèi)LPS在誘導(dǎo) 胸腺細(xì)胞的細(xì)胞凋亡中的作用。小鼠鼻內(nèi)接受LPS并在24小時(shí)后顯 示出比未處理或載體處理的小鼠數(shù)目低的胸腺細(xì)胞24小時(shí)。胸腺細(xì) 胞的數(shù)目在LPS施用后48-72小時(shí)回到基線水平。因?yàn)樾叵偌?xì)胞數(shù) 目的減少可能是細(xì)胞凋亡造成的，所以如根據(jù)膜聯(lián)蛋白-V和PI分 析測(cè)量的，測(cè)定了胸腺細(xì)胞的早期和晚期細(xì)胞凋亡。
在LPS后24小時(shí)觀察到峰胸腺細(xì)胞的細(xì)胞凋亡并在48-72小 時(shí)時(shí)回到細(xì)胞凋亡的生理速度。這個(gè)觀察支持下述想法發(fā)生在用 LPS處理的小鼠胸腺中的萎縮是胸腺細(xì)胞的細(xì)胞凋亡造成的。在由靜 脈內(nèi)伴刀豆凝集素A造成的全身炎癥模型中報(bào)告了胸腺細(xì)胞數(shù)目的 類似減少以及PI和膜聯(lián)蛋白-V的提高。
鼻內(nèi)siRNA施用阻止了 LPS-誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。因 為在鼻內(nèi)LPS處理后24小時(shí)時(shí)觀察到峰胸腺細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，所以 我們研究了在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)上針對(duì)elF5A的siRNA對(duì)LPS-誘導(dǎo)的胸 腺細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的作用。在載體-處理的對(duì)照小鼠中siRNA elF5A 的施用既沒有明顯改變胸腺細(xì)胞的數(shù)目也沒有明顯改變細(xì)胞調(diào)亡事
件。然而，在LPS之前施用siRNA elF5A保護(hù)小鼠免于胸腺細(xì)胞萎 縮和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，而CsiRNA沒有明顯作用。
將L929細(xì)胞維持在極限必需培養(yǎng)基(Eagle )中，所述培養(yǎng)基補(bǔ) 加有2mML-谷氨酰胺、10%胎牛血清、調(diào)整至包含1.Sg/L碳酸氫 鈉的Eagle氏BSS、 0.1 mM非必需氨基酸和1.0 mM丙酮酸鈉(所有 培養(yǎng)基組分均購自Sigma - Aldrich， St. Louis， MO )。使用1: 5的傳 代培養(yǎng)比率將L929細(xì)胞每周傳代培養(yǎng)2次。
4吏用由 Ambion 建i義的i殳i十方針(htto:〃www.ambion.com/ techlib/tb/tb506.html )鑒定了人elF5A轉(zhuǎn)錄物(登記號(hào)NM - 001970 ) 中siRNA的耙序列。使用SHencerTM siRNA構(gòu)建試劑盒(Ambion Inc.)通過體外轉(zhuǎn)錄生成siRNA，所述siRNA用于在L929細(xì)胞中通 過蛋白印跡確i人elF5A阻抑。對(duì)于體內(nèi)j吏用，通過Dharmacon， Lafayette, CO.合成具有相同序列的siRNA。 elF5A和對(duì)照siRNA的 序列分別是5'CGGAAUGACUUCCAGCUGAdTdT3，和 5'AGUCGACCUUCAGUA AGGCdTdT3'。
wT A^脊染^蛋々伊遊
如先前所述(29)使用Lipofectamine 2000 ( Invitrogen Life Technologies, Carlsbad， CA )利用150 nM siRNA轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，收集細(xì)胞裂解物用于蛋白印跡。將蛋白質(zhì)收獲在熱 裂解緩沖液[2。/。SDS, 50mMTris-HC1 (pH7.4)]中，煮沸5分鐘并 j^存于-20lC。使用雙金雞寧酸試劑盒(BCA; Sigma)測(cè)定蛋白濃 度。對(duì)于蛋白印跡，在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分級(jí)分離了 5ja
g總蛋白。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。使用的第一抗體 是抗一 elF5A ( BD Transduction Laboratories;小鼠IgG )和抗一 13 -肌動(dòng)蛋白(Oncogene;小鼠IgM)，其各自為在5%脫脂奶粉中的 1:20,000稀度。使用ECL +蛋白印跡檢測(cè)試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech )檢測(cè)抗體—結(jié)合的蛋白。結(jié)合的抗體通過電化學(xué)
發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)并曝光于x-射線膠片。elF5A檢測(cè)后，根據(jù)ECL +蛋 白印跡檢測(cè)系統(tǒng)提供的方案剝離印跡，并用肌動(dòng)蛋白抗體重新印跡以 確定等量裝載。
動(dòng)參希A理
使用8周大的C57BL/6小鼠(購自Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)。在無病原體條件下飼養(yǎng)小鼠。方案由克羅拉多大學(xué) 健康科學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及使用委員會(huì)(University of Colorado Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committees)批準(zhǔn)。使用小吸管通過放置在輕微麻醉小鼠的鼻孔上鼻 內(nèi)施用包含75 pi g LPS (大腸桿菌K - 234， Sigma )的15微升鹽水。 對(duì)照小鼠鼻內(nèi)接受等量PBS (載體)或未處理。在某些實(shí)驗(yàn)中，在 LPS滴注前48小時(shí)用50jLig siRNA或?qū)φ誷iRNA鼻內(nèi)預(yù)處理小鼠。 在LPS后各個(gè)時(shí)間，取出胸腺并如下所述分離胸腺細(xì)胞。
r勿^》、庠^勿應(yīng)源zi"W趁^
胸腺細(xì)胞是新鮮的并如先前所述(7)使用100 細(xì)胞濾過器 (strainer) ( Fisher Scientific, Pittsburgh, PA )進(jìn)行分離。細(xì)胞維持在 完全細(xì)胞培養(yǎng)基(補(bǔ)加有10%熱滅活的胎牛血清(FCS) 、 2mML -谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、和100ng/ml鏈霉素的RPMI 1640， Invitrogen)中。將胸腺細(xì)胞洗滌一次并4吏用光學(xué)顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行 計(jì)數(shù)。洗滌被分離的胸腺細(xì)胞(105)并懸浮于190pl結(jié)合緩沖液(0.1 M Hepes/NaOH(pH 7.4)、 1.4 mM NaCl、 25mM CaCl2)中。細(xì)胞與 10 jn 1膜聯(lián)蛋白-V和5 ji 1碘化丙咬(PI X BD Pharmingen， San Jose, CA)在室溫下溫育IO分鐘并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。
鍵^夢(mèng)為、浙
數(shù)據(jù)表示為平均值士估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。通過因子方差分析 (ANOVA)確定處理和對(duì)照組之間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。使用 XLStat軟件(Addinsoft， Brooklyn, NY， USA )進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
實(shí)施例24
小鼠-VEGF測(cè)定的方法
如下文實(shí)施例25中所述收集來自每只小鼠的小鼠肺并冷凍于-70X:。切下部分肺組織并使用研缽和研杵在液氮中研磨。將肺組織的 細(xì)粉轉(zhuǎn)移至干凈管中并重懸浮于包含1 % NP - 40和蛋白酶抑制劑的1 xTBS緩沖液中。渦旋后，將肺組織懸浮液在41C、 l:3，000xg離心15
分鐘。將包含小鼠肺蛋白的懸浮液轉(zhuǎn)移至新管并貯存于-7or;。使用
Bradford方法利用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定樣品中的蛋白濃度。
使用R&D Systems Inc.( Minneapolis, MN， USA )提供的ELISA 試劑盒(Cat#MMV00)定量測(cè)定小鼠-VEGF。簡(jiǎn)言之，在每個(gè)孔 中測(cè)試溶于50jLil測(cè)定稀釋RDlN的50pg蛋白，每個(gè)樣品均為一式 兩份。根據(jù)生產(chǎn)商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例25 肺癌研究
B16F10鼠黑素瘤細(xì)胞購自ATCC并培養(yǎng)于DMEM-10%FBS 中。將細(xì)胞單層進(jìn)行胰蛋白酶消化并用MEM-10%FBS進(jìn)行中和。 將細(xì)胞用PBS洗滌2次并通過錐蟲藍(lán)染色測(cè)定生存力。B16F10細(xì)胞 在PBS中稀釋至lxl(^存活細(xì)胞/ml。將200ul細(xì)胞經(jīng)由尾靜脈注射 到每只小鼠中。
5 - 7周大的C57BL/6NCRL小鼠購自Charles River, Quebec,
加拿大。
e/F-5^47戎謬^種建,
缺乏CpG 二核苷酸的pCpG-lacZ載體購自InvivoGen， San Diego， USA。為了將elF5Al和elF5Al突變體亞克隆到pCpG - lacZ 載體中，用Ncol和Nhel消化pCpG-lacZ質(zhì)粒DNA,分離出不含 lacZ基因編碼序列的3.1kb pCpG栽體主鏈并與PCR擴(kuò)增的elF5Al 或elF5Al突變體連接，所述PCR擴(kuò)增使用elF5Al正向引物5， -GCTCCATGGCAGATGATTTGGACTTCG - 3，和elF5Al反向引 物5，-CGCGCTAGCCAGTTATTTTGCCATCGCC-3，。在大腸桿 菌GT115中擴(kuò)增構(gòu)建的pCpG-elF5Al和pCpG - elF5Al突變體，
所述大腸桿菌在包含25 p g/ml zeocin的LB或2XYT培養(yǎng)基中進(jìn)行培 養(yǎng)。使用相同策略利用HA - 5A1正向引物5， - GCTCCATGGATGT ACCCATACGACGTCCC - 3，和elF5Al反向引物構(gòu)建pCpG - HA -elF5Al。
通過QIAGEN Endofree質(zhì)粒Giga試劑盒提取和純化質(zhì)粒。通過 在260nm處的UV吸收和瓊脂糖凝膠電泳測(cè)量DNA濃度。
在第2、 4、 7、 11、 16、 21、 26、 31天時(shí)將溶于lxPBS的質(zhì)粒 dna(基于體重大約200 m I )注射到組3-8的每只小鼠中并將lxPBS 注射到組1 - 2的每只小鼠中。質(zhì)粒DNA濃度為對(duì)于2x ( 6.6mg/kg ) 的660ng/|il、對(duì)于lx (3.3mg/kg)的330ng/|il、和對(duì)于O.lx (0.33mg/kg)的33ng/jil。
責(zé)；
每周一和周五在尾靜脈注射前測(cè)量體重。當(dāng)小鼠達(dá)到發(fā)病(昏 睡、呼吸窘迫)時(shí)，用c02對(duì)其實(shí)施安死術(shù)，并取出肺、稱重、照 相、冷凍并貯存于-701c。
哺乳動(dòng)物DNA與細(xì)菌DNA的不同之處在于其包含低頻率的通常 是甲基化的胞苷—磷酸—鳥苷(CpG ) 二核苷酸。另 一方面細(xì)菌DNA 包含常見的、未曱基化的CpG二核苷酸，所述CpG二核苷酸當(dāng)存在 于特異性的序列背景中時(shí)可以刺激脊推動(dòng)物免疫系統(tǒng)。細(xì)菌DNA中 未曱基化的CpG由Toll-樣受體(TLR) 9識(shí)別并啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí) 聯(lián)，這導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子例如IL-6和IL-121，2的產(chǎn)生。因?yàn)橘|(zhì)粒 在大腸桿菌中生產(chǎn)，所以質(zhì)粒中存在的任何CpG基序?qū)⒈３治磿趸?化，并且，如果導(dǎo)入體內(nèi)那么將是潛在免疫刺激性的。免疫刺激性 CpG還已顯示導(dǎo)致體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)迅速下降。傳統(tǒng)的基因治療載體 的另一局限性是巨細(xì)胞病毒早期基因啟動(dòng)子(CMV)的轉(zhuǎn)錄活性在 體內(nèi)幾周內(nèi)喪失3， 4， 5，因此限制了其重復(fù)施用并且維持轉(zhuǎn)基因表 達(dá)的用途。
為了避開傳統(tǒng)DNA質(zhì)?；蛑委煹哪承┱系K，我們現(xiàn)在選擇使 用來自Invivogen稱為pCpG的質(zhì)粒，它完全缺乏CpG 二核苷酸。
該載體還利用強(qiáng)細(xì)胞啟動(dòng)子(具有小鼠CMV增強(qiáng)子的人延伸因子1 oc核心啟動(dòng)子)替代廣泛使用的CMV啟動(dòng)子，所述CMV啟動(dòng)子在 CpG -減少的主鏈的背景中，這應(yīng)增加轉(zhuǎn)基因體內(nèi)表達(dá)的持續(xù)時(shí)間以 及減少對(duì)質(zhì)粒DNA的炎性應(yīng)答。對(duì)照質(zhì)粒CpG - LacZ完全缺乏CpG 二核苷酸，而包含elF5Al的栽體在elF5A cDNA中具有14個(gè)CpG 二核苷酸，所述elF5A cDNA可能是也可能不是免疫刺激性的。
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權(quán)利要求
1.減少哺乳動(dòng)物細(xì)胞中細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A表達(dá)的方法，所述方法包括給細(xì)胞或哺乳動(dòng)物提供針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A的反義多核苷酸，其中所述多核苷酸減少細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A的內(nèi)源表達(dá)。
2. 減少細(xì)胞凋亡-特異性的eIF-5A表達(dá)的方法，所述方法包 括提供針對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNRA，其中所述多核 苷酸減少細(xì)胞凋亡—特異性的eIF - 5A的內(nèi)源表達(dá)。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細(xì)胞凋亡-特異性的eIF -5A表達(dá)的減少導(dǎo)致下列應(yīng)答，所述應(yīng)答選自TLR4、 IFN- yRa、 TNF- oc、 IL-8、 TNFR-1、 p53、 iNOS和IL-1、 IL-12、 IFN -Y、 IL-6和IL-18的表達(dá)減少，STATloc和JAK1應(yīng)答的磷酸 化減少，NF- KBp50活化的減少，髓過氧化物酶水平的降低，MIP 一 1 oc水平的降低和Bcl — 2表達(dá)的提高。
4，權(quán)利要求3的方法，其中所述方法用于預(yù)防青光眼、缺血性 組織損傷、膿毒癥和促炎相關(guān)的病癥。
5. 權(quán)利要求3的方法，其中所述細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A 表達(dá)的減少導(dǎo)致細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的減少。
6. 提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞中細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A表達(dá)的方 法，所述方法包括給細(xì)胞或提供編碼細(xì)胞凋亡-特異性的eIF - 5A的 外源多核苷酸，其中所述多核苷酸導(dǎo)致細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A 的內(nèi)源表達(dá)提高。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A 的內(nèi)源表達(dá)的提高導(dǎo)致細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的提高。
8. 權(quán)利要求6的方法，其中所述細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A 的內(nèi)源表達(dá)的提高導(dǎo)致VEGF表達(dá)的減少。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述VEGF表達(dá)的減少導(dǎo)致腫瘤血 管發(fā)生的減少。
10..權(quán)利要求7的方法，其中所述方法用于治療癌細(xì)胞或腫瘤生長(zhǎng)。
11.權(quán)利要求6的方法，其中所述多核苷酸是突變的細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A，其中所述突變阻止經(jīng)由DHS的活化。
12. 細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的siRNA，其中所述siRNA 阻抑細(xì)胞中細(xì)胞凋亡-特異性的elF-5A的內(nèi)源表達(dá)并具有3， -GCC UUA CUG AAG GUC GAC U - 5'的序列。
13. 在有義反向具有下列序列的siRNA用于誘導(dǎo)或提高癌細(xì)胞 的細(xì)胞凋亡的藥物的用途5， GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT 3，。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞凋亡特異性的真核起始因子5A(eIF-5A)，其稱作細(xì)胞凋亡特異性的eIF-5A或eIF-5A1，還涉及核酸和多肽，以及用于提高或減少細(xì)胞凋亡特異性的eIF-5A的表達(dá)的方法。本發(fā)明還涉及增加或減少細(xì)胞凋亡的方法。
文檔編號(hào)A61K31/713GK101115834SQ200580045766
公開日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2005年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月3日
發(fā)明者A·布恩, B·C·加爾頓, C·泰勒, C·迪納爾洛, J·E·湯普森, L·雷茲尼科夫, M·霍普金斯 申請(qǐng)人:森尼斯科技術(shù)公司