用作細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)目標(biāo)分子用載體的毛若考辛衍生多肽的制作方法

專利名稱：用作細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)目標(biāo)分子用載體的毛若考辛衍生多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能進(jìn)入細(xì)胞并將目標(biāo)分子轉(zhuǎn)運(yùn)至這些細(xì)胞中的毛若考辛(maurocalcine)衍生多肽。
背景技術(shù)：
某些物質(zhì)，尤其是具有藥理學(xué)特性的大分子，其穿越質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)問(wèn)題，以及其進(jìn)入各個(gè)細(xì)胞內(nèi)小室的問(wèn)題，尤其是進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)小室和細(xì)胞核小室的問(wèn)題，是生物技術(shù)研究和生物醫(yī)學(xué)研究、以及制藥工業(yè)的難點(diǎn)。
在目前已知的用于將物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法中，轉(zhuǎn)運(yùn)多肽，亦稱CPPs(細(xì)胞穿膜多肽)是特別好的載體(具體綜述特別參見(jiàn)Prochiantz，Curr.Opin.Cell.Biol.，2000，12，400-406；Lindgren等，Trends Pharmacol.Sci.，2000，21，99-102)。
實(shí)際上，這些小分子能夠以不依賴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和受體的方式穿越細(xì)胞膜，并能在體內(nèi)和體外于所有類型的細(xì)胞中以較低的濃度、不消耗能量、有效(100％的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo))、高速地(5～15分鐘的數(shù)量級(jí))轉(zhuǎn)運(yùn)大分子比如蛋白質(zhì)和核酸，而對(duì)這些大分子而言所述膜是非通透性的。此外，有顯示表明這些多肽中的一些能夠穿越血腦屏障(Schwarze和Dowdy，Science，1999，285，1569-1572)。
這些由以不依賴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和受體的方式穿越細(xì)胞膜的多肽所構(gòu)成的載體，不同于其他的包含糖肽或與PEG偶聯(lián)的多肽的載體，其中帶正電的多肽用于縮聚DNA，并且PEG或者糖類，特別是通過(guò)DNA/糖肽復(fù)合體與甘露糖受體或脫唾液酸糖蛋白受體相結(jié)合，允許靶向目標(biāo)細(xì)胞(多肽CWCK15CK、CW(CK3)4CK和CWK5CK5CK5C(SEQ ID Nos.26～28)Park等，Bioconjugate Chem.，2002，13，232-239；Kwok等，J.Pharm.Sciences，2003，92，1174-1185)。
目前已知的穿膜多肽分成兩種*由各種蛋白的膜易位信號(hào)序列衍生的多肽(卡波西瘤(Kaposi′s sarcoma)衍生的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(K-FGF)和免疫球蛋白輕鏈(Ig(v))；雖然這些多肽的穿越機(jī)理尚不清楚，但已知中間的疏水區(qū)參與了穿越過(guò)程，只是該區(qū)域的結(jié)構(gòu)隨蛋白質(zhì)的種類而變化(α-螺旋(K-FGF)或β-折疊(Ig(v))；*由細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白或“信使蛋白”衍生的多肽；這些蛋白能直接穿越進(jìn)入細(xì)胞并到達(dá)細(xì)胞核，從而在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控轉(zhuǎn)錄過(guò)程(HIV-1 Tat、HSV-1 VP22和同源異型蛋白)。
通過(guò)功能研究可以確定足以用于這些各個(gè)多肽易位所需要的最小序列- 能夠穿膜并用作其他蛋白或寡核苷酸的載體的最小同源異型蛋白片段是43-58位氨基酸的多肽，即與同源結(jié)構(gòu)域螺旋3相對(duì)應(yīng)的穿透蛋白(Derossi等，J.Biol.Chem.，1994，269，10444-10450和國(guó)際專利申請(qǐng)WO 97/12912)。對(duì)該序列的突變體的研究結(jié)果表明，α-螺旋結(jié)構(gòu)不參與細(xì)胞內(nèi)易位，但在核轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用。另一方面，在位置48處的W殘基對(duì)易位是重要的，并且多肽的兩親性特點(diǎn)是必需的，但尚不足以導(dǎo)致易位。相關(guān)的輔助性研究已經(jīng)證實(shí)了W48殘基的重要作用，并且證實(shí)了帶正電的氨基酸(賴氨酸和精氨酸)與帶負(fù)電的膜磷脂間相互作用的重要性?；谶@些研究，人們提出了反向微膠粒模型。根據(jù)該模型，穿透蛋白通過(guò)靜電作用而在細(xì)胞表面處保持穩(wěn)定，在位置48處的色氨酸迫使反向微膠粒形成，該反向微膠粒俘獲多肽并將其傳遞至細(xì)胞質(zhì)中；-VP22蛋白的267-300位片段與用于內(nèi)化的最小序列相對(duì)應(yīng)(Elliot和O′Hare，Cell，1997，88，223-233)；-Tat蛋白中最有效的片斷是48-60位片段，該片段對(duì)應(yīng)于整個(gè)堿性區(qū)，并且包括核定位信號(hào)。然而，較短的片斷(47-57位)能夠在體內(nèi)和體外于各種類型的細(xì)胞中以融合蛋白的形式將15～120kDa的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，并且能穿越血腦屏障。此外，不同于人類病毒中的Tat多肽，馬病毒中的Tat多肽具有類似于同源結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。
這些功能研究還不能闡明這些多肽穿越的一般機(jī)理，從而不能確認(rèn)尤其對(duì)這些多肽的易位起作用的共有序列和/或結(jié)構(gòu)元素。
毛若考辛(Maurocalcine，MCa)是從中東金蝎黃色亞種(Scorpio maurus palmatus)的蝎毒中分離出來(lái)的含33個(gè)氨基酸的毒素，其對(duì)應(yīng)于附后的序列表中的序列SEQ ID NO.1。對(duì)應(yīng)的cDNA編碼包含下述3個(gè)結(jié)構(gòu)域的66個(gè)氨基酸前體22個(gè)氨基酸的N端信號(hào)肽；緊鄰著的11個(gè)氨基酸的前肽，其富含帶負(fù)電的氨基酸并且其末端為具有卵裂信號(hào)特征的激素原(KR)；以及對(duì)應(yīng)于成熟肽的具有33個(gè)氨基酸的C端多肽(毛若考辛)。毛若考辛顯示出與下述兩種其他蝎毒有較強(qiáng)的同源性帝王蝎(Pandinus imperator)的帝王毒素(imperatoxin，IpTx A，SEQ ID NO.982％的同源性)和三色黃爪蝎(Opistophthalmus carinatis)的奧皮考辛(opicalcine)1和2(SEQ ID Nos.10和11分別為91％和88％的同源性見(jiàn)圖1A)。
毛若考辛還對(duì)6個(gè)氨基酸的基元顯示同源性，該基元包含一系列的堿性殘基，緊鄰著絲氨酸或蘇氨酸(K19K20-K22R23R24-T26)，其具有二氫吡啶受體(DHPR)的II-III環(huán)的活化區(qū)、L型取決于電壓的鈣通道。在骨骼肌中，位于質(zhì)膜上的二氫吡啶受體與位于肌質(zhì)網(wǎng)小囊泡中的羅納丹受體1(ryanodine receptor type 1，RyR1)形成了參與興奮收縮耦聯(lián)的鈣活化復(fù)合體中的一部分。毛若考辛是羅納丹受體1(RyR1)的最有效的效應(yīng)子之一；尤其已經(jīng)證明它能刺激羅納丹(ryanodine)與RyR1受體結(jié)合，從而導(dǎo)致鈣通道的開(kāi)口產(chǎn)生相當(dāng)大的修飾，其特點(diǎn)通過(guò)亞電導(dǎo)性周期延長(zhǎng)表現(xiàn)出來(lái)，并且證明將細(xì)胞外的毛若考辛添加到肌管培養(yǎng)物中會(huì)導(dǎo)致鈣從肌質(zhì)網(wǎng)釋放到細(xì)胞質(zhì)中(Fajloun等，F(xiàn)EBS Letters，2000，469，179-185；Estève等，J.Biol.Chem.，2003，278，37822-37831)。因此，建議使用毛若考辛或其包含KKCKKR基元的類似物作為活性成分，以誘發(fā)免疫抑制或治療與鈣通道機(jī)能障礙相關(guān)的疾病(PCT申請(qǐng)WO01/64724)。
毛若考辛的三維結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于根據(jù)ICK基元(抑制劑隆突基元)的折疊，存在于許多植物、動(dòng)物或真菌的肽中；ICK家族包括具有不同序列的多肽和具有不同生物活性的多肽，比如動(dòng)物毒素(蛇毒或蜘蛛毒)、以及來(lái)自植物的蛋白酶抑制劑，比如McoT I-II多肽(SGSDGGVCPKILKKCRRDSDCPGACICRGNGYCG(SEQ ID NO.29))(Zhu等，The FasebJournal，2003年7月3日；Heitz等，Biochemistry，2001，40，7973-7983)。
更具體地說(shuō)，毛若考辛的結(jié)構(gòu)由如下部分組成(i)致密核心，其由二硫鍵(C3-C17、C10-C21和C16-C32)連接并包括三個(gè)β-折疊(9-11、20-33和30-33；反向平行的折疊20-33和30-33)、以及(ii)在N末端處的突出環(huán)(Mobash等，Proteins，2000，40，436-442)。其表示為包含帶正電表面的分子，該表面是能與RyR1受體相互作用的表面(Mobash等，如上所述)。此外，毛若考辛突變體(K8A、K19A、K20A、K22A、R23A、R24A和T26A；SEQ ID NOs.2～8)的研究結(jié)果表明，R24殘基對(duì)于毛若考辛使羅納丹結(jié)合到RyR1受體上的作用效果而言是重要的(Estève等，如上所述)。
在研究毛若考辛對(duì)羅納丹受體1(RyR1)起效應(yīng)子作用的過(guò)程中，發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)，不屬于如上所述任何一種包含CPPs的蛋白種類的毛若考辛能在試管內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞并轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人現(xiàn)在試圖確定毛若考辛(maurocalcine)衍生氨基酸序列的最小特性，該序列能用作目標(biāo)物質(zhì)尤其是目標(biāo)大分子如蛋白和核酸、以及包含目標(biāo)化學(xué)分子顆粒的內(nèi)化和轉(zhuǎn)運(yùn)用載體。此外，由于毛若考辛是一種具有已知藥理學(xué)特性的毒素，故它不能用于體內(nèi)。因此，發(fā)明人致力于獲得毛若考辛的衍生多肽載體，優(yōu)選其在體內(nèi)是無(wú)毒的，即，其對(duì)于RyR1受體不具有藥理學(xué)活性，特別是因?yàn)槠洳慌c所述RyR1受體結(jié)合。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是用于細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)目標(biāo)物質(zhì)的多肽載體的用途，其特征在于，所述載體主要由符合下述序列(I)的毛若考辛衍生多肽構(gòu)成Z-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25-X26-Z′(I)，其中-X1和X26各自代表半胱氨酸，-X2～X25各自代表氨基酸或者缺失，X7、X10、X11、X12、X13、X14、X15和X16則始終存在，以及-X10、X11、X13和X14各自代表賴氨酸或精氨酸，以及-Z和/或Z′缺失或者各自代表1～35個(gè)氨基酸的序列，除了具有如附后的序列表中的序列SEQ ID NO.1的所示多肽之外。
本發(fā)明特別包括毛若考辛衍生多肽比如天然毛若考辛或其合成變體例如毛若考辛類似物的用途。本發(fā)明還包括在毛若考辛與包含ICK基元的毒素的嵌合體例如奧皮考辛(1或2)和帝王毒素A的用途。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指天然氨基酸或合成氨基酸，即通常存在于蛋白中的20種天然α氨基酸(A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V)；很少存在于蛋白中的某些氨基酸(羥脯氨酸、羥基賴氨酸、甲基賴氨酸、二甲基賴氨酸等)；不存在于蛋白中的氨基酸，例如β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、同型半胱氨酸、鳥(niǎo)氨酸、瓜氨酸、刀豆氨酸、己氨酸或環(huán)乙基丙氨酸；以及上述氨基酸的對(duì)映體和非對(duì)映異構(gòu)體。
如本發(fā)明所述的多肽能夠進(jìn)入體內(nèi)和體外任何類型的細(xì)胞中，并且將目標(biāo)物質(zhì)比如非細(xì)胞通透性大分子(蛋白、核酸)、以及包含目標(biāo)化學(xué)分子的顆粒轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞小室中，尤其是細(xì)胞質(zhì)小室和細(xì)胞核小室中。例如，根據(jù)本發(fā)明的多肽與分子量至少達(dá)到60kDa的物質(zhì)比如蛋白之間的復(fù)合體和納米顆粒被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。
通過(guò)在所述細(xì)胞中培養(yǎng)結(jié)合了所述物質(zhì)的所述多肽，并采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何技術(shù)，尤其是顯微鏡，尤其是通過(guò)分析所述多肽和/或所述物質(zhì)的特定標(biāo)記，來(lái)檢測(cè)細(xì)胞中是否存在所述多肽和/或所述物質(zhì)，能較容易地證實(shí)多肽的上述特性。
因此，所述多肽可以用作載體，用于細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)能與細(xì)胞內(nèi)靶基因相互作用的物質(zhì)。這些物質(zhì)特別是指靶位點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)的藥理學(xué)活性物質(zhì)；這些藥物尤其是指藥劑或植物保護(hù)產(chǎn)品。這些物質(zhì)也可以是待檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi)組分的配體(內(nèi)源分子或病原分子)，尤其是能用作細(xì)胞內(nèi)分子探針的抗體或抗體片斷(Fab、Fv或scFv)。所述物質(zhì)包括化學(xué)分子，尤其是大分子蛋白質(zhì)、多肽、多肽核酸(PNAs)、核酸(質(zhì)粒、寡核苷酸、反義核酸、siRNAs)；以及顆粒，特別是納米顆粒，或者包含、包埋或接合(耦聯(lián))目標(biāo)化學(xué)分子的脂質(zhì)體顆粒。
因此，所述多肽廣泛用于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是納米生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于診斷并治療人類或動(dòng)物的各種疾病(生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用)并作為這些領(lǐng)域的研究工具。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，用任何已知的合適方法將待轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)耦聯(lián)到多肽載體上，使多肽與物質(zhì)(多肽、蛋白、核酸或其它的化學(xué)分子)相結(jié)合。
當(dāng)待轉(zhuǎn)運(yùn)的所述物質(zhì)是多肽或蛋白時(shí)，優(yōu)選其用肽鍵與多肽載體耦聯(lián)。
所述物質(zhì)也能以非共價(jià)鍵方式與多肽載體耦聯(lián)，尤其是通過(guò)鏈霉親和素-生物素(streptavidin-biotin)復(fù)合體形式，例如當(dāng)多肽載體發(fā)生生物素化時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)耦聯(lián)到鏈霉親和素上。
所述物質(zhì)和所述多肽載體還可以結(jié)合在相同的顆粒中；它們尤其能與納米顆?；蛑|(zhì)體耦聯(lián)。
此外，當(dāng)所述載體用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)組分時(shí)(細(xì)胞內(nèi)分子探針)，優(yōu)選其與合適的標(biāo)記、帶有標(biāo)記的顆粒、或帶有標(biāo)記的物質(zhì)耦聯(lián)。標(biāo)記尤其選用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的能使用任何技術(shù)(熒光顯微鏡分析、流式細(xì)胞分析、核磁共振成像分析)檢測(cè)到的熒光標(biāo)記或磁性標(biāo)記。
這種細(xì)胞內(nèi)分子探針已應(yīng)用于體內(nèi)和體外細(xì)胞成像技術(shù)中，特別是實(shí)時(shí)成像。它們尤其可以用作診斷遺傳性疾病或后天性疾病或微生物感染疾病的試劑、或用作研究工具。
根據(jù)所述用途的優(yōu)選實(shí)施方式，X15不是精氨酸或賴氨酸；這種突變可以防止所述多肽與RyR1受體結(jié)合從而消除由上述結(jié)合所產(chǎn)生的藥理學(xué)效應(yīng)。
根據(jù)所述用途的另一優(yōu)選實(shí)施方式，X7和/或X12代表半胱氨酸。
根據(jù)所述用途的另一優(yōu)選實(shí)施方式，X2、X3、X4、X5、X6、X8、X23、X24和X25缺失。
根據(jù)所述用途的一種優(yōu)選方案，X17～X22存在，X21和/或X22代表精氨酸或賴氨酸，優(yōu)選X21代表賴氨酸。
根據(jù)所述用途的另一優(yōu)選實(shí)施方式，Z′代表精氨酸或賴氨酸。
根據(jù)所述用途的另一優(yōu)選實(shí)施方式，Z符合下述序列(II)Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14-Z15-Z16-Z17-Z18-Z19-Z20-Z21-Z22-Z23-Z24-Z25-Z26-Z27-Z28-Z29-Z30-Z31-Z32-Z33-Z34-Z35(II)，其中Z1～Z35各自代表氨基酸或缺失，Z29、Z30、Z32與Z31或Z33則始終存在。
根據(jù)本實(shí)施方式的一種優(yōu)選方案，Z21和/或Z29代表半胱氨酸；優(yōu)選當(dāng)Z21代表半胱氨酸時(shí)，X7也代表半胱氨酸，當(dāng)Z29代表半胱氨酸時(shí)，X12也代表半胱氨酸。優(yōu)選X7、X12、Z21和Z29各自代表半胱氨酸。
根據(jù)本實(shí)施方式的另一優(yōu)選方案，至少一種選自Z30、Z31、Z32、Z33、Z34和Z35中的氨基酸是賴氨酸或精氨酸；優(yōu)選Z30和/或Z34代表精氨酸或賴氨酸。
根據(jù)本實(shí)施方式的另一優(yōu)選方案，至少一種選自Z22、Z23、Z24、Z25、Z26、Z27和Z28中的氨基酸是賴氨酸或精氨酸；優(yōu)選Z27和/或Z28代表精氨酸或賴氨酸。
優(yōu)選選自Z22、Z23、Z24、Z25、Z26、Z27、Z28、Z30、Z31、Z32、Z33、Z34和Z35中的至少三種氨基酸各自代表賴氨酸或精氨酸。進(jìn)一步優(yōu)選Z27和Z30各自代表賴氨酸，并且Z28或Z34各自代表賴氨酸或精氨酸。
根據(jù)本實(shí)施方式的另一優(yōu)選方案，至少Z1～Z18、Z22和Z31或Z34缺失。優(yōu)選缺失下述殘基Z1～Z18、Z22和Z31或Z34；Z1～Z19、Z22和Z31或Z34；Z1～Z20、Z22和Z31或Z34；Z1～Z26和Z31或Z34；Z1～Z28和Z31或Z34。
例如，存在下述氨基酸序列中的一種Z19～Z21、Z23～Z30和Z32～Z35；Z19～Z21、Z23～Z33和Z35；Z20、Z21、Z23～Z30和Z32～Z35；Z20、Z21、Z23～Z33和Z35；Z21、Z23～Z30和Z32～Z35；Z21、Z23～Z33和Z35。
根據(jù)所述用途的另一優(yōu)選實(shí)施方式，具有序列(I)的多肽由D-氨基酸組成。
根據(jù)本發(fā)明的多肽，其典型的例子如下a)毛若考辛與帝王毒素的嵌合體或者毛若考辛與奧皮考辛的嵌合體，例如序列為SEQ IDNos.24和25的多肽，b)具有33個(gè)氨基酸的毛若考辛衍生多肽，其中-X1、X7、X12、X26、Z21和Z29代表C，-X10、X11、X13、X14、X21、X22、Z27、Z30、以及Z28或Z34代表K或R；優(yōu)選至少X10、X11、X13、X21、Z27和Z30代表K，進(jìn)一步優(yōu)選X10、X11、X13、X21、Z27和Z30代表K，并且Z28或Z34代表K或R，優(yōu)選Z28代表R或Z34代表K，-X2、X3、X4、X5、X6、X8、X23、X24、X25、Z1～Z18、Z22、以及Z31或Z34缺失，-X9代表S或G，-X15代表R，-X17代表T、S或A，-X19代表選自A、V、L、I、P、W、F和M中的疏水性氨基酸，-X16、X18、X20、Z19、Z20、Z23、Z24、Z25、Z26、Z32、Z33、Z35、Z′、以及可選的Z28、Z31、Z34代表A、C、D、E、F、G、K、L、M、P或N，優(yōu)選其代表A或F；例如Z19代表G，Z′代表R或K，
c)在b)中所限定的對(duì)應(yīng)于毛若考辛中16～32位或16～33位的多肽片段，d)在b)中所限定的對(duì)應(yīng)于毛若考辛中10～32位或10～33位的多肽片段，e)在b)中所限定的對(duì)應(yīng)于毛若考辛中8～32位或8～33位的多肽片段；以及f)由在b)、c)、d)和e)中所限定的多肽衍生的多肽，其中X15不是R或K。
在這些多肽中，應(yīng)注意那些具有序列SEQ ID Nos.2～23的多肽。
根據(jù)所述用途的另一優(yōu)選實(shí)施方式，所述多肽載體與合適的標(biāo)記特別是熒光染料耦聯(lián)；該耦聯(lián)可以是共價(jià)的也可以是非共價(jià)的，特別優(yōu)選使用帶標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素復(fù)合體或帶標(biāo)記的顆粒進(jìn)行耦聯(lián)。
根據(jù)所述用途的另一優(yōu)選實(shí)施方式，將如上限定的多肽載體與顆粒特別是納米顆粒耦聯(lián)；優(yōu)選所述顆粒被貼標(biāo)簽并且/或者所述顆粒包含尤其能用作藥劑或植物保護(hù)產(chǎn)品的目標(biāo)物質(zhì)，例如藥理學(xué)活性物質(zhì)，或者包含作為待檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi)組分配體的物質(zhì)，其能用作細(xì)胞內(nèi)分子探針。
根據(jù)所述用途的另一優(yōu)選實(shí)施方式，如上限定的多肽載體的序列(I)與目標(biāo)異源多肽或多肽序列融合，從而形成嵌合多肽或嵌合蛋白。
術(shù)語(yǔ)“異源的”是指在毛若考辛或毛若考辛類似物的序列中不直接緊鄰序列(I)的序列。
所述嵌合多肽或所述嵌合蛋白優(yōu)選與合適的標(biāo)記和/或顆粒耦聯(lián)，所述顆?？梢员蝗我鈽?biāo)記。
在NH2端或COOH端或在合適的內(nèi)部位點(diǎn)，將序列(I)插入到目標(biāo)多肽或目標(biāo)蛋白中，該插入位點(diǎn)根據(jù)所述蛋白或所述多肽的結(jié)構(gòu)來(lái)選擇。
本發(fā)明還涉及包括靶位點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)的藥理學(xué)活性物質(zhì)和如上所述多肽載體的組合物，其中多肽載體作為細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)所述物質(zhì)的載體。
根據(jù)所述組合物的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述藥理學(xué)活性物質(zhì)和所述多肽載體呈現(xiàn)如上所述的嵌合多肽或嵌合蛋白的形式。
根據(jù)所述組合物的一種優(yōu)選實(shí)施方式，它包括含有所述藥理學(xué)活性物質(zhì)和所述多肽載體的顆粒。
根據(jù)所述組合物的另一優(yōu)選實(shí)施方式，所述藥理學(xué)活性物質(zhì)是用于給藥于人或動(dòng)物個(gè)體的藥劑。
本發(fā)明還涉及如上所述用作藥劑的組合物。
本發(fā)明還涉及如上所述的組合物的用途，該組合物用于制備治療人類或動(dòng)物疾病的藥劑。
本發(fā)明還涉及一種組合物，其包括待檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)組分的配體(細(xì)胞內(nèi)探針)和如上所述作為細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)所述配體的載體的多肽載體。
根據(jù)所述組合物的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述多肽載體按如上所述與合適的標(biāo)記、帶標(biāo)記的納米顆粒、和/或所述配體(嵌合蛋白或嵌合多肽)耦聯(lián)。
根據(jù)所述組合物的另一優(yōu)選實(shí)施方式，所述配體是抗所述組分的抗體或抗體的功能性片斷。
本發(fā)明還涉及如上所述用作診斷劑的組合物。
本發(fā)明還涉及治療疾病的方法，其特征在于，該方法包括用任何合適的方法將如上所述的組合物給藥于個(gè)體。
本發(fā)明還涉及一種體外檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)組分的方法，其特征在于，該方法包括-使細(xì)胞樣品與上述檢測(cè)試劑接觸，以及-用任何合適的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記。
根據(jù)本發(fā)明，所述細(xì)胞樣品包括更高級(jí)的可能感染了微生物的真核生物細(xì)胞、或微生物細(xì)胞(細(xì)菌、酵母、真菌、寄生蟲(chóng))。
本發(fā)明還涉及一種體內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)組分的方法，其特征在于，該方法包括-將如上所述的檢測(cè)試劑導(dǎo)入到有機(jī)體中，以及-用任何合適的方法原位檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記。
根據(jù)所述方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述檢測(cè)試劑是如上所述的帶標(biāo)記的試劑。所述試劑，例如，與熒光染料、或耦聯(lián)了熒光染料的顆粒耦聯(lián)。
根據(jù)本發(fā)明，所述有機(jī)體是更高級(jí)的真核生物，特別是人類、動(dòng)物或植物。
本發(fā)明還涉及如上所述的嵌合多肽或嵌合蛋白，所述嵌合多肽或所述嵌合蛋白被任意標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及如上所述的符合序列(I)的多肽，但不包括序列SEQ ID Nos.1～11和SEQID Nos.26～29的多肽；優(yōu)選所述多肽被標(biāo)記。
本發(fā)明涉及與如上所述的多肽載體耦聯(lián)的顆粒；優(yōu)選所述顆粒和/或所述載體被標(biāo)記。所述顆粒優(yōu)選為納米顆粒。
本發(fā)明還涉及編碼如上所述的多肽載體、或融合多肽或融合蛋白的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，所述多核苷酸(DNA或RNA)的序列與編碼所述多肽載體或編碼所述融合多肽或所述融合蛋白的cDNA的序列相對(duì)應(yīng)。所述多核苷酸的序列可以包括用于轉(zhuǎn)位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的信號(hào)肽，從而產(chǎn)生能分泌到胞外培養(yǎng)基內(nèi)的多肽載體/融合多肽或融合蛋白。所述信號(hào)肽尤其可以是毛若考辛衍生肽或任何能分泌到胞外培養(yǎng)基中的多肽或蛋白。此外，所述多核苷酸的序列還包括毛若考辛前肽或ICK家族中另一多肽中的11個(gè)氨基酸序列，該11個(gè)氨基酸的序列插入在編碼所述多肽載體的cDNA序列的5′末端。
所述序列優(yōu)選用一種方式進(jìn)行修飾，使得在表達(dá)該序列的宿主中密碼子的使用最佳。
本發(fā)明特別包括a)包括至少一種如上所述多核苷酸的表達(dá)盒，其在合適的調(diào)節(jié)序列的控制下用于轉(zhuǎn)錄、以及任選地用于翻譯(啟動(dòng)子、活化劑、內(nèi)含子、起始密碼子(ATG)、終止密碼子、聚腺苷酸化信號(hào))、以及b)包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的重組載體。優(yōu)選這些載體是包含至少一個(gè)如上所述表達(dá)盒的表達(dá)載體。
本發(fā)明還涉及原核寄主細(xì)胞或真核寄主細(xì)胞，該細(xì)胞用如上所述的至少一種多核苷酸或一種重組載體修飾。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因的非人類哺乳動(dòng)物，其特征在于，該哺乳動(dòng)物的所有細(xì)胞或部分細(xì)胞用如上所述的多核苷酸或重組載體修飾。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因的植物，其特征在于，該植物的所有細(xì)胞或部分細(xì)胞用如上所述的多核苷酸或重組載體修飾。
許多核酸載體本身是已知的，在這些核酸載體內(nèi)可以插入目標(biāo)核酸分子以將核酸分子導(dǎo)入并保持在真核寄生細(xì)胞或原核寄生細(xì)胞內(nèi)；如何選擇合適的載體取決于該載體的可預(yù)見(jiàn)的用途(例如，目標(biāo)序列的復(fù)制、該序列的表達(dá)、該序列以染色體外的形式的保持、或整合入寄主的染色體材料)、并且也取決于寄主細(xì)胞的自然屬性。例如，尤其可以使用其內(nèi)已預(yù)先插入目標(biāo)序列的病毒載體，比如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、AAVs和桿狀病毒；也可以將所述序列(分離的或插入到質(zhì)粒載體中)與允許穿越寄主細(xì)胞膜的物質(zhì)結(jié)合，該物質(zhì)比如是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，例如納米轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或脂質(zhì)體制品或陽(yáng)離子聚合物制品，或可以用物理方法如電穿孔或微量注射法將所述序列導(dǎo)入所述寄主細(xì)胞中。此外，優(yōu)選組合使用這些方法，例如使用結(jié)合了脂質(zhì)體的電穿孔方法。
如上所述的多核苷酸、重組載體和轉(zhuǎn)化細(xì)胞尤其能用于生產(chǎn)本發(fā)明的融合多肽和融合蛋白。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案比如《分子生物學(xué)常用方法》(Current Protocols in Molecular Biology，F(xiàn)rederick M.AUSUBEL，2000，Wiley and son有限公司，Library of Congress，USA)的描述，用傳統(tǒng)的已知方法可獲得本發(fā)明中的多核苷酸。例如，通過(guò)用PCR或RT-PCR擴(kuò)增核酸序列，或用與同源探針雜交法篩選DNA基因文庫(kù)，或者通過(guò)全化學(xué)合成或部分化學(xué)合成，來(lái)獲得多核苷酸。用傳統(tǒng)的DNA重組方法和遺傳工程方法構(gòu)建重組載體，并將其導(dǎo)入寄生細(xì)胞中，這些方法本身都是已知的。
多肽和它們的衍生物(融合多肽和融合蛋白)用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的傳統(tǒng)技術(shù)制備-毛若考辛衍生多肽和融合多肽可以根據(jù)最早由Merrifield等人描述的Fmoc技術(shù)(J.Am.Chem.Soc.，1964，852149-)進(jìn)行固相合成，并用反相高效液相色譜法純化，-毛若考辛衍生多肽以及融合多肽和融合蛋白可以由相應(yīng)的cDNAs制備，該cDNAs用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法獲得；接著將cDNA克隆到真核表達(dá)載體或原核表達(dá)載體中，然后用任何合適的方法，特別是親合色譜法純化在經(jīng)重組載體修飾的寄主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白或片斷。
除上述方案之外，本發(fā)明還包括其他方案，下面我們將結(jié)合本發(fā)明的多肽用途的實(shí)施例、表格、所用序列的匯總、以及附圖來(lái)進(jìn)行說(shuō)明。


-圖1顯示了毛若考辛的序列和結(jié)構(gòu)。其中圖1A顯示了毛若考辛的序列和兩種其他在羅納丹受體上也具有活性的類似毒素的序列排列奧皮考辛和帝王毒素A。所有的毒素都具有相同數(shù)量的帶正電氨基酸或堿性氨基酸(在總數(shù)為33個(gè)的氨基酸中有12個(gè)帶正電的氨基酸)。圖1B顯示了用WebLab ViewerProTM軟件構(gòu)建的毛若考辛的三維空間結(jié)構(gòu)。左面包含帶正電殘基(G1、K8、K11、K14、Ki9、K20、K22和K30)的堿性面。右面在分子的相反面上不含帶正電殘基的疏水面。多肽主鏈顯示為帶狀，帶正電氨基酸的側(cè)鏈用顯示至一定大小的球形和桿來(lái)指示；-圖2顯示了MCab/Strept-Cy3復(fù)合體有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)各種不同的培養(yǎng)細(xì)胞。CA1海馬神經(jīng)元、HEK293細(xì)胞和未分化型L6細(xì)胞的培養(yǎng)物用100nM生物素化并與花青苷-3標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合的毛若考辛(MCab/Strept-Cy3)孵育30分鐘，然后將該細(xì)胞固定并用共焦顯微鏡分析。用類似的方法處理分化型L6細(xì)胞。用縮小四倍的圖片顯示對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其中細(xì)胞用未生物素化的MCa和Strept-Cy3的混合物處理；-圖3顯示了生物素化毛若考辛變體R24A和L7A與花青苷標(biāo)記的鏈霉親和素的復(fù)合體可以有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)物。HEK293細(xì)胞培養(yǎng)物用333nM變體R24A或L7A或333nM生物素化并與花青苷-3標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合的毛若考辛(MCab/Strept-Cy3)孵育30分鐘，然后將該細(xì)胞固定并用聚焦顯微鏡分析；-圖4顯示了MCab/Strept-Cy3復(fù)合體的穿透能力依賴于劑量。其中圖4A代表不同濃度的MCab/Strept-Cy3復(fù)合體(10nM、33nM、100nM、333nM和1μM)穿透情況的流式細(xì)胞分析。在進(jìn)行流式細(xì)胞分析之前，細(xì)胞用胰蛋白酶(1mg/ml)處理。圖4B所示為細(xì)胞的平均熒光值與MCab/Strept-Cy3復(fù)合體濃度的函數(shù)關(guān)系。該數(shù)值符合下列等式y(tǒng)＝y(tǒng)0+aX(1-exp(-bXx))，其中y0＝-3.8，a＝199，b＝1.5×10-3。圖4C顯示了用各種濃度的MCab/Strept-Cy3復(fù)合體孵育1小時(shí)的HEK293細(xì)胞的聚焦免疫熒光圖像。細(xì)胞核用To-PRO-3染色；-圖5顯示生物素化毛若考辛變體與花青苷標(biāo)記的鏈霉親和素的復(fù)合體的穿透情況依賴于劑量。其中圖5A顯示生物素化變體R24A或L7A或毛若考辛與Strept-Cy3的復(fù)合體的穿透情況的流式細(xì)胞分析。在進(jìn)行流式細(xì)胞分析之前，細(xì)胞用胰蛋白酶(1mg/ml)處理。圖5B顯示了細(xì)胞平均熒光值與復(fù)合體濃度的函數(shù)關(guān)系；-圖6所示為MCab/Strept-Cy3復(fù)合體在1小時(shí)周期內(nèi)于未分化型L6細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)動(dòng)力學(xué)。其中(A)所示為添加了100nM的MCab/Strept-Cy3后3sec、3min和12min以及復(fù)合體清洗后23min(總共35min)時(shí)，未分化型L6細(xì)胞的Cy3熒光聚焦圖像。(B)所示為細(xì)胞發(fā)射的光學(xué)圖像(差示干擾對(duì)照(differential interference contrast)，上側(cè))上各種目標(biāo)區(qū)域(ROI)的位置，以及與Cy3熒光聚焦圖像相對(duì)應(yīng)的位置。(C)所示為在各個(gè)L6細(xì)胞的小室中，目標(biāo)區(qū)域表面積單位歸一化的Cy3熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的函數(shù)。在t＝0時(shí)，MCab/Strept-Cy3復(fù)合體在培養(yǎng)基中的濃度為100nM，然后在t＝12min時(shí)，經(jīng)清洗5分鐘后將復(fù)合體從培養(yǎng)基中被除去?！盎綬OI”相當(dāng)于細(xì)胞外培養(yǎng)基的熒光強(qiáng)度。數(shù)值顯示了5種不同細(xì)胞的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。在制備的三種不同的細(xì)胞中觀察到類似的結(jié)果；-圖7所示為用聚焦顯微鏡免疫熒光分析的MCab/Strept-Cy5的亞細(xì)胞定位，(A)所示為其與伴刀豆球蛋白A(concanavalin A)的定位的比較，(B)所示為其與α-微管蛋白(alpha-tubulin)的定位的比較，(C)所示為其與時(shí)間的函數(shù)關(guān)系。其中A所示為與質(zhì)膜標(biāo)記進(jìn)行對(duì)比的HEK293細(xì)胞中MCab-Strept-Cy5復(fù)合體的亞細(xì)胞定位。細(xì)胞在有MCab-Strept-Cy5復(fù)合體(333nM)存在下孵育1小時(shí)。細(xì)胞膜用伴刀豆球蛋白標(biāo)記并且細(xì)胞核用碘化丙錠標(biāo)記。所示圖像為單聚焦平面。B中，如同(A)所示，只是其與細(xì)胞骨架標(biāo)記(抗α-微管蛋白抗體)進(jìn)行對(duì)比。C所示為在細(xì)胞轉(zhuǎn)位后，MCab-Strept-Cy5復(fù)合體的細(xì)胞分布變化。用333nM復(fù)合體分別孵育2小時(shí)、4小時(shí)和24小時(shí)的HEK293細(xì)胞的Cy3(MCab-Strept-Cy3復(fù)合體)聚焦熒光圖像和To-PRO(細(xì)胞核)聚焦熒光圖像。觀察到用MCab-Strept-Cy5復(fù)合體逐步標(biāo)記的細(xì)胞核；-圖8顯示MCab/Strept-Cy3復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞不需要能量。其中(A)為MCab/Strept-Cy3復(fù)合體進(jìn)入HEK293細(xì)胞的對(duì)照情況。在100nM復(fù)合體存在下，細(xì)胞于22℃下孵育1h。然后固定細(xì)胞并用聚焦顯微鏡獲得圖像。(B)所示為溫度對(duì)MCab/Strept-Cy3復(fù)合體穿透情況的影響。在22℃下，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下孵育并觀察細(xì)胞。(C)代表制霉菌素(50μM)對(duì)MCab/Strept-Cy3復(fù)合體進(jìn)入HEK293細(xì)胞的穿透情況的影響。制霉菌素是胞飲抑制劑。條件與(A)相同。(D)顯示了氨氯吡嗪脒(3mM)對(duì)MCab/Strept-Cy3復(fù)合體進(jìn)入HEK293細(xì)胞的穿透情況的影響。氨氯吡嗪脒是小窩胞吞(caveolar endocytosis)抑制劑。條件與(A)相同。
-圖9所示為用肝素和/或胰蛋白酶處理對(duì)復(fù)合體細(xì)胞穿透情況影響的流式細(xì)胞分析(A)及對(duì)復(fù)合體的細(xì)胞毒性影響的流式細(xì)胞分析(B)。其中(A)顯示用10μg/ml的肝毒素孵育細(xì)胞和MCab-Strept-Cy5復(fù)合體，降低了復(fù)合體的穿透能力(左面)。未經(jīng)肝毒素處理的Cy5平均熒光值是307，而經(jīng)肝毒素處理后，其值跌到78。用10μg/ml的肝毒素處理細(xì)胞和MCab-Strept-Cy5復(fù)合體，同時(shí)用胰蛋白酶(1mg/ml)處理細(xì)胞，進(jìn)一步使平均熒光值降低到64。經(jīng)Strept-Cy5單獨(dú)處理后，對(duì)照熒光值達(dá)到3.1，并且不受胰蛋白酶或肝毒素處理的影響。對(duì)濃度為1μM的MCab-Strept-Cy5復(fù)合體的穿透情況進(jìn)行測(cè)試。(B)所示為用結(jié)合了碘化丙錠的細(xì)胞分析1μM Stept-Cy5或MCab-Strept-Cy5復(fù)合體的細(xì)胞毒性的情形。碘化丙錠標(biāo)記的細(xì)胞的比例用百分比表示；- 圖10顯示了胞外K+濃度的增加對(duì)MCab-Strept-Cy3復(fù)合體的細(xì)胞穿透情況的影響(A，B)。其中(A)所示為KCl濃度的增加對(duì)MCab-Strept-Cy3復(fù)合體的細(xì)胞穿透情況影響的流式細(xì)胞分析。右面對(duì)應(yīng)于在有145mM KCl時(shí)的對(duì)照情況(無(wú)復(fù)合體(頂端)以及有Strept-Cy3(底部))。KCl的濃度梯度不影響對(duì)照值。左面分別顯示了5mM KCl(頂部，平均熒光值為145)、125mM KCl(中間，平均熒光值為40)和145mM KCl(底部，平均熒光值為17)的影響。(B)所示為平均熒光值隨KCl濃度變化的函數(shù)。用等式y(tǒng)＝y(tǒng)0+aXx線性回歸熒光值，其中最大的熒光值y0＝139.5，斜率a＝-0.72；-圖11顯示了MCa與膜脂質(zhì)的相互作用(A，B)。圖11A所示為GD3和DPPC的單分子膜表面壓力的測(cè)定。通過(guò)使用1μM MCa，誘使表面壓力發(fā)生動(dòng)力學(xué)變化。該結(jié)果表明MCa與GD3而不是與DPPC發(fā)生相互作用。初始表面壓力數(shù)量級(jí)為10mN.m-1。測(cè)定結(jié)果按照等式y(tǒng)＝y(tǒng)0+aX(1-exp(-bXx))以S形增加直至達(dá)到最大值，其中初始表面壓力y0＝11.6mN.m-1，表面壓力的最大增加量a＝22.9mN.m-1，用于表面壓力改變的時(shí)間常數(shù)b+3×10-4sec-1。圖11B所示為GD3膜的表面壓力隨MCa濃度變化的函數(shù)。測(cè)定結(jié)果為符合等式y(tǒng)＝a/(1+exp(-(x-x0)/b))的S形函數(shù)，其中表面壓力的最大增加量a＝22.1mN.m-1，斜率b＝0.006，并且在X0＝0.49μM的濃度處獲得50％的最大效果；
-圖12顯示了MCab/Strept-Cy3復(fù)合體對(duì)RyR1受體的影響。其中圖12A顯示了用100nM的MCab/Strept-Cy3復(fù)合體對(duì)[3H]-羅納丹結(jié)合的促進(jìn)情況。用如上所述的材料和方法測(cè)定粉化的羅納丹與肌質(zhì)網(wǎng)小囊泡的特異性結(jié)合；(-)代表無(wú)MCa或MCab/Strept-Cy3復(fù)合體的結(jié)合情況。圖12B顯示了用100nM的MCab/Strept-Cy3復(fù)合體對(duì)肌質(zhì)網(wǎng)小囊泡的鈣釋放的誘導(dǎo)情況。1和2分別代表添加50μM的CaCl2和20μM的CaCl2(最終濃度)，而3和4則代表連續(xù)添加20μM的CaCl2。當(dāng)最終濃度為4μM時(shí)，添加A23187；-圖13所示為生物素化并與Strept-Cy3復(fù)合的毛若考辛變體L7A和R24A對(duì)RyR1受體的影響。測(cè)定復(fù)合體濃度的增加對(duì)[3H]-羅納丹結(jié)合性的促進(jìn)作用。用如上所述的材料和方法測(cè)定粉化的羅納丹與肌質(zhì)網(wǎng)的特異性結(jié)合；-圖14所示為用于納米顆粒細(xì)胞穿越的毛若考辛的用途。其中A所示為HEK293細(xì)胞培養(yǎng)物用100nM與納米顆粒(Qdot，QUANTUMDOT公司)耦聯(lián)的毛若考辛孵育1小時(shí)，接著固定細(xì)胞并用聚焦顯微鏡分析。作為對(duì)照，在相同的條件下，用與鏈霉親和素耦聯(lián)的Qdots處理細(xì)胞培養(yǎng)物。
表I序列表Identifier number序列號(hào)；NCBI accession numberNCBI入藏登記號(hào)；Peptide 多肽；Sequence 序列；Mutant 突變體；Imperatoxin 帝王毒素；Chimera 嵌合體；Compaction Peptide 縮合肽maurocalcine 毛若考辛；opicalcine 奧皮考辛；plant植物


1中東金蝎黃色亞種的毒素；2帝王蝎的毒素；3和4三色黃爪蝎的毒素具體實(shí)施方式
實(shí)施例1帶標(biāo)記的鏈霉親和素與根據(jù)本發(fā)明的生物素化毛若考辛或生物素化衍生多肽形成復(fù)合體，對(duì)該復(fù)合體的細(xì)胞穿透情況進(jìn)行分析。
1)材料和方法a)多肽合成使用一臺(tái)自動(dòng)合成器(型號(hào)433A，APPLIED BIOSYSTEMS)，通過(guò)固相多肽合成(Merrifield，科學(xué)，1986，232，341-347)制備根據(jù)本發(fā)明的毛若考辛、毛若考辛衍生多肽以及它們的生物素化衍生物。N-α-Fmoc-L-賴氨酸(生物素)-OH由NEOSYSTEM提供(SNPEGroup)。用于合成多肽的N-α-Fmoc-L-氨基酸衍生物、4-羥甲基苯氧樹(shù)脂和其他試劑由PERKIN ELMER LIFE SCIENCES提供。用1mmol的N-α-Fmoc-L氨基酸衍生物，將肽鏈順序地組裝在0.25meq羥甲基苯氧樹(shù)脂上(1％交聯(lián)度，0.89meq氨基/g)。用于側(cè)鏈的保護(hù)基如下用于保護(hù)半胱氨酸殘基和天門冬酰胺殘基的三苯甲基、用于保護(hù)絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基、谷氨酸殘基和天冬氨酸殘基的叔丁基、用于保護(hù)精氨酸殘基的五丁基色烷(pentamethylchromane)、以及用于保護(hù)賴氨酸殘基的叔丁基氧羰基基團(tuán)。
N-α-氨基經(jīng)哌啶/N-甲基吡咯烷酮(18％和20％v/v)分別處理3分鐘和8分種后脫保護(hù)。Fmoc氨基酸衍生物，如它們的羥基苯并三唑活性酯一樣，在N-甲基吡咯烷酮中(過(guò)量4倍)耦聯(lián)20分鐘。在組裝完肽鏈后，將包含多肽的樹(shù)脂(約1.8mg)與含苯酚晶體(2.25g)的三氟乙酸/H2O/苯硫基甲烷/乙二硫醇(88/5/5/2，v/v)的混合物一起，于室溫下連續(xù)攪動(dòng)，處理2～3小時(shí)。接著過(guò)濾多肽混合物，并通過(guò)添加冷的丁基甲醚來(lái)沉淀濾液。用離心法沉淀粗肽(3000g，10分鐘)，并除去上層清液。然后將還原型肽溶解在200mM、pH8.3的Tris-HCl緩沖液中，溶液的最終濃度為2.5mM，接著在空氣中、室溫下混合50～72h，使所述多肽發(fā)生氧化和折疊。
之后，用反相高壓液相色譜法(HPLC；C18 Aquapore ODS柱，20μm，250×10mm，PerkinElmer Life Sciences)對(duì)制品進(jìn)行第一步純化以形成均一體，該方法通過(guò)經(jīng)時(shí)60分鐘、由三氟乙酸水溶液(0.08％v/v)到含有0～30％乙腈的0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液的線性梯度而進(jìn)行純化，其中流速為6ml/min(λ＝230nm)。接著在羧甲基纖維素基體上，用離子交換色譜對(duì)本發(fā)明的毛若考辛、毛若考辛衍生多肽、以及它們的生物素化衍生物進(jìn)行第二步純化，該方法中使用10mM、pH 9.0的磷酸鹽緩沖液液(緩沖液A)和590mM、pH 9.0的磷酸鹽緩沖液(緩沖液B)(經(jīng)時(shí)1小時(shí)、流速1ml/min、0～60％緩沖液B的線性梯度)。根據(jù)本發(fā)明的毛若考辛、毛若考辛衍生多肽以及它們的生物素化衍生物的均一性和同一性由如下過(guò)程確定(i)C18分析的反相高壓液相色譜(C18 LiChrospher，5μm，4×20mm，Merck公司)，其使用流速1ml/min、經(jīng)時(shí)60min、0.08％v/v的三氟乙酸水溶液/含有0～60％乙腈的0.1％v/v三氟乙酸水溶液的線性梯度；(ii)通過(guò)酸解作用的氨基酸分析(6N HCl/2％(W/V)的苯酚，20h，118℃，氮?dú)獗Ｗo(hù))和(iii)用質(zhì)譜(MALDI公司)分析法確定質(zhì)量。
b)形成與耦聯(lián)了花青苷3的鏈霉親和素的復(fù)合體在磷酸鹽緩沖液((PBS，按mM計(jì)136 NaCl，1.47 Na2HPO4，2.6 KCl，1 CaCl2，0.5 MgCl2，pH 7.2)中，將可溶解的鏈霉親和素-花青苷3和鏈霉親和素-花青苷5(Strept-Cy3和Strept-Cy5，AMERSHAM公司)與4摩爾當(dāng)量的生物素化毛若考辛(1mM)或生物素化毛若考辛衍生多肽在37℃下避光混合2小時(shí)。
c)細(xì)胞培養(yǎng)在添加了15％胎牛血清(LIFE TECHNOLOGIES公司)和1％青霉素-鏈霉素(invitrogen公司)的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)L6鼠成肌細(xì)胞系(L6 rat myogenic cell line)(C5克隆株，EACC公司)。
通過(guò)用分化培養(yǎng)基(DMEM+5％馬血清)代替培養(yǎng)基來(lái)誘導(dǎo)L6細(xì)胞系分化，此時(shí)細(xì)胞形成匯聚。
從新出生的小鼠海馬結(jié)構(gòu)(分娩后1～2天)中制得海馬CA1區(qū)域的神經(jīng)元，將其分割、脫離腦膜并置于HBSS緩沖液中(INVITROGEN公司)。接著在解離培養(yǎng)基(HBSS，1％的青霉素/鏈霉素(GIBCO)，2000IU/ml的DNase和1％(w/v)的胰蛋白酶/EDTA)中，在37℃下培養(yǎng)該神經(jīng)元7min。經(jīng)沉淀后，除去上層清液，并用含1％青霉素/鏈霉素的HBSS培養(yǎng)基清洗細(xì)胞組織。用塑料吸管將HBSS培養(yǎng)基中的細(xì)胞組織逐漸粉化，加入1％的青霉素/鏈霉素、10％的胎兒牛血清、2000IU/ml的DNase I，直至獲得均勻懸浮物。在100g下離心1min后，細(xì)胞粒再懸浮于包含0.5mML-谷氨酰胺和1％青霉素/鏈霉素的Neurobasal/B27培養(yǎng)基(GIBCO公司)中。在經(jīng)20μg/ml的聚-L-賴氨酸于37℃下預(yù)先處理2小時(shí)的培養(yǎng)皿中，以105個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種細(xì)胞培養(yǎng)物。在培養(yǎng)了2天后，將阿糖胞苷(3μM)添加到培養(yǎng)物中，以限制非神經(jīng)元細(xì)胞的繁殖，在24小時(shí)后，更換一半的培養(yǎng)基。然后，培養(yǎng)基每隔2天就更換。
人胚腎細(xì)胞(human embryonic kidney cells)(HEK 293細(xì)胞系，ATCC)在匯聚前經(jīng)胰蛋白酶(1％)處理進(jìn)行分散，接著將其放入CO2培養(yǎng)箱(5％)中，用含10％失活性胎牛血清(INVITROGEN公司)和1％青霉素/鏈霉素(INVITROGEN公司)的DMEM培養(yǎng)基(INVITROGEN公司)維持培養(yǎng)。培養(yǎng)基每隔2天就更換。
d)免疫細(xì)胞化學(xué)d1)固定細(xì)胞在PBS中，用最終濃度為100nM的生物素化并與鏈霉親和素-花青苷3或鏈霉親和素-花青苷5復(fù)合的毛若考辛和其衍生多肽，在室溫下避光孵育細(xì)胞30min～1h。在用PBS清洗細(xì)胞3次之后，用多聚甲醛溶液(4％)在室溫下固定細(xì)胞10min，接著用PBS避光清洗細(xì)胞，并用結(jié)合了FITC的伴刀豆球蛋白(分子探針，5μg/ml)保溫1小時(shí)以標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)膜，并用TO-PRO-3碘化物(分子探針，1μM)標(biāo)記細(xì)胞核。為標(biāo)記細(xì)胞骨架，用冰冷的甲醇固定并透化細(xì)胞10min，接著用PBS清洗細(xì)胞兩次，并用小鼠抗α-微管蛋白抗體(1∶1000，SIGMA公司)孵育細(xì)胞2小時(shí)。在用PBS清洗細(xì)胞兩次之后，用結(jié)合了Alexa 488的小鼠抗IgG二次抗體(1∶1000，分子的探針)孵育細(xì)胞1小時(shí)。然后將培養(yǎng)物封閉在Vectashield封閉劑(VECTORLABORATORIES公司)中。用Leica TCS-SP2控制系統(tǒng)，通過(guò)聚焦顯微鏡觀察制備品。順序地激發(fā)并記錄Alexa-488和Cy3或碘化丙錠(PI)的熒光。用543nm的氦氖激光器光束激發(fā)Cy3熒光，接著記錄在554nm和625nm之間的發(fā)射熒光。然后將圖像導(dǎo)入Adobe Photoshop 7.0中。
d2)活細(xì)胞在垂直顯微鏡(Nikon Eclipse 600 FN，配有浸水物鏡(×40)，孔徑0.8)和共焦鏡頭(NikonPCM 2000)、或根據(jù)“XYZt”模式配有物鏡(×100)的LeicaTCS-SP2顯微鏡的平臺(tái)上，在PBS中，以100nM的終濃度，用生物素化并與鏈霉親和素-花青苷3復(fù)合的毛若考辛和其衍生多肽在新更換的培養(yǎng)基中，于室溫下培養(yǎng)活細(xì)胞。
生物素化并與鏈霉親和素-Cy3復(fù)合的毛若考辛和其衍生多肽的穿透動(dòng)力學(xué)研究起始于將100nM復(fù)合體注入培養(yǎng)基中。用543nm波長(zhǎng)的氬激光器激發(fā)Cy3熒光。發(fā)射光被過(guò)濾(595±35nm濾片)。用EZ2000軟件(Nikon公司)記錄并分析圖像。用適當(dāng)?shù)能浖?Leica公司)定量分析所有細(xì)胞總信號(hào)的相對(duì)熒光值。
e)流式細(xì)胞分析在PBS中，以100nM的終濃度，用生物素化并與鏈霉親和素-花青苷5復(fù)合的毛若考辛和其衍生多肽(MCab-Strept-Cy5復(fù)合體)在室溫下避光培養(yǎng)細(xì)胞30min～1h。在用PBS(PBS，以mM計(jì)0.15 NaCl，6.84 Na2HPO4，3.16 NaH2PO4，pH 7.2)清洗細(xì)胞兩次之后，接著用胰蛋白酶(1mg/ml，INVITROGEN公司)在37℃下處理細(xì)胞10min，以除去胞外復(fù)合體和質(zhì)膜上結(jié)合的復(fù)合體。在用胰蛋白酶保溫后，在500g下離心懸浮細(xì)胞，接著在包含1μg/ml碘化丙錠(SIGMA公司)的PBS中再懸浮細(xì)胞。在不包括碘化丙錠處理步驟的實(shí)驗(yàn)中(劑量-反應(yīng)曲線)，用MCab-Strept-Cy3復(fù)合體代替MCab-Strept-Cy5復(fù)合體。用流式細(xì)胞儀(FACScalibur，BECTONDICKINSON公司)對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行分析。用合適的軟件(CellQuest，BD BIOSCIENCES公司)記錄并分析數(shù)據(jù)。根據(jù)細(xì)胞的大小和粒團(tuán)(正向/側(cè)向散射)分選活細(xì)胞，總發(fā)生次數(shù)高于10000。
2)結(jié)果a)穿透情況分析合成毛若考辛變體(SEQ ID Nos.2～8和12～23)，以及毛若考辛與帝王毒素(SEQ IDNo.24)或奧皮考辛(SEQ ID No.25)的兩個(gè)嵌合體-GDCLPHLKRCKADNDCCSKKCKRAGTNIEKRCR(SEQ ID No.24)和-GDCLPHLKRCKENNDCCSKKCKRAGTNIEKRCR(SEQ ID No.25)。
各個(gè)嵌合體均包含替換毛若考辛序列中第24位(R24A)的精氨酸或替換式(I)中第15位(X15＝A)的精氨酸的丙氨酸。
根據(jù)本發(fā)明的毛若考辛衍生多肽轉(zhuǎn)導(dǎo)各種類型的細(xì)胞和轉(zhuǎn)運(yùn)大分子的能力是通過(guò)用生物素化的多肽與花青苷-3-耦聯(lián)鏈霉親和素的復(fù)合體來(lái)研究的。生物素化的毛若考辛-鏈霉親和素-Cy3復(fù)合體(MCab/Strept-Cy3)用作對(duì)照。
用100nM或者333nM生物素化并與鏈霉親和素-Cy3復(fù)合的毛若考辛衍生多肽、或者100nM或333nM的MCab/Strept-Cy3作為對(duì)照，在室溫下孵育初級(jí)小鼠海馬神經(jīng)元和HEK293細(xì)胞系以及L6細(xì)胞系(分化前和分化后)30min。然后固定細(xì)胞并用聚焦顯微鏡觀察熒光。
用MCab/Strept-Cy3復(fù)合體獲得的結(jié)果(圖2)驗(yàn)證了用于分析生物素化并與鏈霉親和素-Cy3復(fù)合的毛若考辛衍生多肽的細(xì)胞穿透情況的實(shí)驗(yàn)方法。事實(shí)上，觀察到所有細(xì)胞的質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)均被較強(qiáng)地標(biāo)記，而細(xì)胞核則標(biāo)記較弱。另一方面，用100nM非生物素化毛若考辛或等當(dāng)量濃度的Strept-Cy3孵育的細(xì)胞未顯示有任何標(biāo)記，這說(shuō)明單獨(dú)的Strept-Cy3不能轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。為使熒光性復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞，Strept-Cy3必須與生物素化毛若考辛結(jié)合，這說(shuō)明了毛若考辛在此過(guò)程中的活性作用。這些結(jié)果表明，毛若考辛不只表現(xiàn)為細(xì)胞穿透多肽(CPP)，而是類似于其他的CPPs，它也能將高分子量的蛋白轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中(鏈霉親和素的分子量大于毛若考辛分子量的14.6倍)。
毛若考辛變體也能進(jìn)入細(xì)胞并將物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到這些細(xì)胞中(圖3)。
定量分析(圖4和5)表明該穿透是不飽和的，這與毛若考辛和衍生多肽的擴(kuò)散機(jī)制是一致的。毛若考辛和其衍生多肽的穿透是高效的，這是因?yàn)樗鼈兡茉跐舛鹊椭?0 nM的情況下進(jìn)入細(xì)胞。某些變體(例如L7A，見(jiàn)圖5)相對(duì)于毛若考辛具有明顯增加的穿透活性(L7A變體的活性因子為5)，而其他變體的穿透能力近似于或甚至略低于毛若考辛的穿透能力(例如R24A變體，見(jiàn)圖5)。
b)穿透動(dòng)力學(xué)b1)經(jīng)1小時(shí)的分析對(duì)未分化的L6型活細(xì)胞經(jīng)時(shí)1小時(shí)的熒光動(dòng)力學(xué)的聚焦顯微鏡分析表明，在將MCab/Strept-Cy3添加到胞外培養(yǎng)基(100nM)中后3min開(kāi)始出現(xiàn)標(biāo)記(圖6A)。確定三個(gè)分別對(duì)應(yīng)于質(zhì)膜(ROI-1)、細(xì)胞質(zhì)(ROI-2)和細(xì)胞核(ROI-3)的目標(biāo)區(qū)域。通過(guò)分析被觀察細(xì)胞發(fā)射的光學(xué)圖像，可便利地定位各個(gè)目標(biāo)區(qū)域(圖6B)。對(duì)各個(gè)ROIs中的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的函數(shù)進(jìn)行分析(圖6C)。
在剛將100nMMCab/Strept-Cy3復(fù)合體添加到培養(yǎng)基時(shí)，所有小室中的熒光強(qiáng)度均增加，但它們的增加速度不同。最快、最強(qiáng)的變化發(fā)生在質(zhì)膜中(ROI-1)，其在10min處具有峰值。還觀察到熒光在細(xì)胞質(zhì)小室(ROI-2)中增加得較慢但數(shù)值相當(dāng)大，而在細(xì)胞核(ROI-3)中觀察到熒光增加得更小，但大于背景噪聲。
熒光在各個(gè)小室中增加的速度和相對(duì)強(qiáng)度與細(xì)胞中復(fù)合體的前進(jìn)方向相一致，即從細(xì)胞間隙到細(xì)胞質(zhì)膜，接著從細(xì)胞質(zhì)膜到細(xì)胞質(zhì)，然后從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核。由于受到位于細(xì)胞質(zhì)中探針的熒光的污染，ROI-1小室中記錄的信號(hào)可能被高估。另一方面，細(xì)胞質(zhì)熒光的相對(duì)強(qiáng)度應(yīng)更為精確。此外，從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的通道非常小，這說(shuō)明該轉(zhuǎn)移相對(duì)其他的兩種轉(zhuǎn)移更加困難。在通過(guò)清洗除去MCab/Strept-Cy3復(fù)合體之后，對(duì)熒光的變化也進(jìn)行測(cè)定細(xì)胞用MCab/Strept-Cy3復(fù)合體孵育12min，接著清洗5min(圖6C)。
在這些條件下，ROI-1區(qū)的熒光強(qiáng)度降低，而ROI-2區(qū)的熒光強(qiáng)度增加，ROI-3區(qū)的熒光強(qiáng)度保持不變。細(xì)胞質(zhì)小室中的熒光增加是由于復(fù)合體恒定地從細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。
b2)經(jīng)時(shí)24小時(shí)的分析在用333 nM的MCab/Strept-Cy3復(fù)合體孵育細(xì)胞1小時(shí)后，用聚焦顯微鏡分析HEK 293細(xì)胞中復(fù)合體的細(xì)胞性分布(圖7A)。HEK 293細(xì)胞表面用伴刀豆球蛋白A標(biāo)記，細(xì)胞的細(xì)胞核用碘化丙錠標(biāo)記(圖7A)。比較這些標(biāo)記與MCab/Strept-Cy5復(fù)合體的標(biāo)記，結(jié)果清楚表明，在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均存在該復(fù)合體。接著還比較了具有細(xì)胞骨架標(biāo)記的微管蛋白的分布和MCab/Strept-Cy5復(fù)合體的分布(圖7B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們不存在共位，這清楚地表明，細(xì)胞骨架對(duì)復(fù)合體的分布沒(méi)有貢獻(xiàn)。接著分析MCab/Strept-Cy3復(fù)合體的細(xì)胞分布隨時(shí)間的變化。在孵育2小時(shí)后，復(fù)合體主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。在孵育4和24小時(shí)之間時(shí)，復(fù)合體主要在核周圍分布并與細(xì)胞核共位。毛若考辛的生物學(xué)標(biāo)靶是嚴(yán)格地位于細(xì)胞質(zhì)中的RyR受體。
因而毛若考辛在細(xì)胞核中的局域化不能歸因于其與RyR1的結(jié)合。
實(shí)施例2關(guān)于毛若考辛及其衍生多肽的細(xì)胞穿透機(jī)制的分析a)毛若考辛和衍生多肽的穿透是非能量依賴性的且對(duì)胞化抑制劑不敏感研究了能量依賴性過(guò)程對(duì)MCab/Strept-Cy3復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞的可能貢獻(xiàn)(圖8)。降低溫度對(duì)MCab/Strept-Cy3復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞的影響結(jié)果表明，復(fù)合體在4℃處仍能進(jìn)入細(xì)胞(圖8B)。在該溫度，復(fù)合體用類似的方法標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)。胞飲/胞吞抑制劑的效果也被測(cè)試。氨氯吡嗪脒和制霉菌素均不影響復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞的相對(duì)分布或者復(fù)合體在質(zhì)膜上和細(xì)胞質(zhì)中的相對(duì)分布，這進(jìn)一步證實(shí)毛若考辛進(jìn)入細(xì)胞的基本機(jī)理是非能量依賴性的。
b)毛若考辛及其衍生多肽通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜擴(kuò)散b1)實(shí)驗(yàn)方案如實(shí)施例1所述進(jìn)行分析。在肝素處理實(shí)驗(yàn)中，在用復(fù)合體進(jìn)行孵育之前和之后，在肝素溶液(牛腸肝素鈉鹽，SIGMA公司)中制備復(fù)合體，并用肝素溶液清洗細(xì)胞兩次。
b2)結(jié)果用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞穿透情況，該細(xì)胞先用MCab/Strept-Cy3復(fù)合體孵育，接著經(jīng)胰蛋白酶處理，以除去通過(guò)脂類、特異性受體或硫酸乙酰肝素氨基多糖(HPSG)而結(jié)合在質(zhì)膜上的復(fù)合體。已經(jīng)證實(shí)該方法可以有效地研究透膜多肽進(jìn)入細(xì)胞的情況(Richard等，J.Biol.Chem.，2003，278，585-590)。
由圖9A可知，肝素通過(guò)阻止毛若考辛與硫酸乙酰肝素糖胺聚糖的相互作用、或通過(guò)減弱毛若考辛與帶負(fù)電脂類的相互作用的特性，而通過(guò)與毛若考辛堿性面結(jié)合來(lái)降低其進(jìn)入細(xì)胞的穿透能力。由圖9A中還可以看出，結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)膜外表面上的MCab/Strept-Cy3比例、特別是結(jié)合到硫酸乙酰肝素上的MCab/Strept-Cy3的份額是最小的，這是由于胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞穿透的影響較弱(比較左面和右面)。這些結(jié)果表明，毛若考辛及其衍生多肽的穿透不需要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或硫酸乙酰肝素，從而不涉及胞吞機(jī)制。
圖4也表明，MCab/Strept-Cy3復(fù)合體的穿透不會(huì)飽和，這與毛若考辛和其衍生多肽的擴(kuò)散機(jī)理是一致的。
此外，圖9B表明，碘化丙錠與用MCab/Strept-Cy5復(fù)合體(復(fù)合體濃度為1μM)孵育的活細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合；未進(jìn)行結(jié)合表明，有鏈霉親和素-Cy5，毛若考辛的細(xì)胞毒性顯著地消失。
c)毛若考辛及其衍生多肽的穿透對(duì)膜電位敏感。
c1)實(shí)驗(yàn)方案在具有各種NaCl/KCl比例的溶液(組合物以mM計(jì)145～5NaCl，5～145KCl，2.5CaCl2，1.2MgCl2，10葡萄糖，10 HEPES，pH 7.4)中制備MCab-Strept-Cy5復(fù)合體。
用被用于制備復(fù)合體的NaCl/KCl溶液清洗細(xì)胞兩次，接著在相同的NaCl/KCl溶液中，用最終濃度為100nM的生物素化并與鏈霉親和素-3復(fù)合的毛若考辛和衍生多肽(MCab-Strept-Cy3復(fù)合體)在室溫下避光孵育細(xì)胞1小時(shí)。在用相同的NaCl/KCl緩沖液清洗細(xì)胞2次后，用流式細(xì)胞儀(FACScalibur，BECTON DICKINSON公司)對(duì)活細(xì)胞上花青苷3的熒光進(jìn)行分析。用合適的軟件(CellQuest，BD BIOSCIENCES公司)記錄并分析數(shù)據(jù)。根據(jù)細(xì)胞的大小和粒團(tuán)(正向/側(cè)向散射)分選活細(xì)胞，共發(fā)生次數(shù)為10000。
c2)結(jié)果因細(xì)胞外KCl濃度的增加而導(dǎo)致的細(xì)胞去極化將毛若考辛的穿透性限制為約50％(圖10A和10B)。定量分析結(jié)果(圖10B)表明，細(xì)胞膜的去極化導(dǎo)致熒光強(qiáng)度線性下降。該結(jié)果表明，膜電位對(duì)堿性分子即毛若考辛的穿透起驅(qū)動(dòng)力的作用。
d)毛若考辛與脂類的相互作用d1)實(shí)驗(yàn)方案二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(disialoganglioside)NeuAcα2-8NeuAca2-3Galbl-aGlcbl-Cer(GD3)和二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC)分別由MATREYA公司和SIGMA公司提供。
用自動(dòng)測(cè)微張力計(jì)(μTHROUGH SX，KIBRON公司)測(cè)定表面壓力。該裝置使用一系列適當(dāng)?shù)腡eflon探針，可以記錄配體與單分子膜相互作用的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。所有的實(shí)驗(yàn)均在20±1的控制氣壓中進(jìn)行。結(jié)果表明，使用正己烷∶氯仿∶乙醇(11∶5∶4，v/v/v)使脂類的分子膜如先前描述的那樣(Mahfoud等，J.Biol.Chem.，2002，277，11292-11296)沉積在超純水(800μl)的液相上。在該膜擴(kuò)張后，觀察到所耗用時(shí)間的最小周期為5min，從而允許溶劑被蒸發(fā)掉。為測(cè)定MCa與脂類單層的相互作用，用10ml的Hamilton注射器將各種濃度的多肽注入單分子膜層中，接著記錄單分子膜層因結(jié)合了多肽而產(chǎn)生的壓力增加，直至達(dá)到平衡為止(表面壓力的最大增加量一般在保溫100～150min后達(dá)到)。對(duì)于劑量依賴性的MCa與GD3之間的相互作用，在初始表面壓力(pi)為10mN.m-1下制備GD3的單分子膜層。用Filmware 2.5軟件(KIBRON公司)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。用于測(cè)定表面壓力的系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)條件下精確到0.25mN.m-1。
d2)結(jié)果為確定毛若考辛是否能與特定的膜脂相互作用，將DPPC和GD3神經(jīng)節(jié)苷脂的單分子膜擴(kuò)展在氣-水界面處。然后以1μM的濃度將毛若考辛添加到液相中。連續(xù)地記錄膜的表面壓力隨時(shí)間變化的函數(shù)(圖11A)。結(jié)果表明，毛若考辛能夠穿透GD3單層，這可由GD3薄膜的表面壓力有相當(dāng)大的增加來(lái)證明。另一方面，毛若考辛沒(méi)有使DPPC薄膜的表面壓力發(fā)生顯著地變化，這說(shuō)明毛若考辛不能識(shí)別甘油磷脂。圖11B表明，毛若考辛與GD3的相互作用依賴于劑量。在毛若考辛濃度為100nM時(shí)該相互作用是檢測(cè)得到的，并且在毛若考辛濃度為750nM時(shí)達(dá)到最大值。在濃度為500nM時(shí)，產(chǎn)生最大效果的50％。
這些結(jié)果表明，毛若考辛(MCa)與細(xì)胞質(zhì)膜相互作用的初始點(diǎn)位于神經(jīng)節(jié)苷脂富集的區(qū)域。表面靜電勢(shì)結(jié)果表明，毛若考辛具有包括G1和所有賴氨酸的堿性面和疏水面，從而表明毛若考辛是具有較大偶極矩的高荷電分子(圖1B)。因此，可以預(yù)見(jiàn)GD3/MCa的相互作用中和了MCa的堿性面，從而促進(jìn)其疏水面與細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)部部分的相互作用。GD3可以瞬時(shí)地從細(xì)胞膜的外表面轉(zhuǎn)位到其內(nèi)表面以釋放MCa，從而因更強(qiáng)的負(fù)電荷環(huán)境而形成新的與其他帶負(fù)電脂類或蛋白的靜電作用。
實(shí)施例3生物素化MCa衍生多肽/Strept-Cy3復(fù)合體對(duì)RyR1受體的生物活性的影響分析
1)材料和方法a)重肌質(zhì)網(wǎng)小囊泡的制備根據(jù)Kim等人(J.Biol.Chem.，1983，258，9662-9668)對(duì)Marty等所描述的方法(J.Biol.Chem.，2000，275，8206-8212)的改進(jìn)，制備重肌質(zhì)網(wǎng)小囊泡(heavy sarcoplasmic reticulumvesicle)。蛋白濃度用Biuret方法測(cè)定。
b)氚標(biāo)記羅納丹結(jié)合試驗(yàn)在37℃下，在包含5nM[3H]-羅納丹、150mM NaCl、2mM EGTA、2mM Ca2+(pCa＝5)和20mM Hepes、pH 7.4的反應(yīng)緩沖液中孵育重肌質(zhì)網(wǎng)小囊泡(1mg/ml)2小時(shí)30分。在添加重肌質(zhì)網(wǎng)小囊泡之前，添加毛若考辛、毛若考辛衍生多肽和它們的生物素化衍生物。通過(guò)用Whatmann GF/B過(guò)濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾，接著用5ml的冰冷的清洗緩沖液(150mM NaCl，20mMHepes，pH 7.4)清洗三次，測(cè)定結(jié)合到重肌質(zhì)網(wǎng)小囊泡上的[3H]-羅納丹。用液體閃爍法測(cè)定保留在濾膜上的[3H]-羅納丹。非特異性結(jié)合用標(biāo)記的羅納丹(20μM)測(cè)定。以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式給出結(jié)果。各個(gè)實(shí)驗(yàn)一式三份地進(jìn)行，并至少重復(fù)兩次c)Ca2+釋放的測(cè)定用Ca2+敏感染料、安替吡啉偶氮III(antipyrylazo III)測(cè)定由重肌質(zhì)網(wǎng)小囊泡的Ca2+釋放。用二極管陣列分光光度計(jì)(MOS-200，Optical System，BIOLOGIC公司)測(cè)定在710nm處的吸光度。將250μM的安替吡啉偶氮III、1mM的ATP/MgCl2、5mM的磷酸肌酸和12μg/ml的肌酸磷酸激酶添加到2ml包含100mMKCl、7.5mM焦磷酸鈉、20mMMOPS、pH為7.0的緩沖液中，在37℃下，用該緩沖液使重肌質(zhì)網(wǎng)小囊泡(50μg)主動(dòng)地荷載Ca2+(Palade，J.Biol.Chem.，1987，262，6142-6148)。
鈣的荷載開(kāi)始于連續(xù)添加50μM的CaCl2和20μMCaCl2。
在此荷載條件下，鈣誘導(dǎo)的鈣釋放并不干擾觀察結(jié)果。在各個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)尾，通過(guò)添加4μM的Ca2+離子載體A231287(Sigma公司)來(lái)測(cè)定保留在小囊泡中的Ca2+，并通過(guò)連續(xù)兩次添加20 μM的CaCl2來(lái)校準(zhǔn)吸光信號(hào)。
2)結(jié)果圖12表明，MCab/Strept-Cy3復(fù)合體保持了其促進(jìn)[3H]-羅納丹與重肌質(zhì)網(wǎng)小囊泡結(jié)合的能力(圖12A)以及其誘導(dǎo)Ca2+從這些小囊泡中釋放的能力(圖12B)。
與毛若考辛單獨(dú)誘導(dǎo)Ca2+釋放相比，MCab/Strept-Cy3復(fù)合體誘導(dǎo)Ca2+釋放的動(dòng)力學(xué)速度變慢，這表明其效率略微降低(圖12B)。該差異可能是出于下述原因MCab/Strept-Cy3復(fù)合體因Strept-Cy3的阻礙而在活性毛若考辛與RyR1受體結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)入能力降低(與4108Da的MCab相比，鏈霉親和素的分子量為60000Da)。
用MCab/Strept-Cy3復(fù)合體獲得的結(jié)果驗(yàn)證了用于鑒定毛若考辛衍生多肽對(duì)RyR1受體沒(méi)有任何藥理學(xué)作用的實(shí)驗(yàn)方法。
圖13表明，在能進(jìn)入細(xì)胞并轉(zhuǎn)運(yùn)目標(biāo)物質(zhì)的毛若考辛變體中，L7A突變體對(duì)RyR1受體的活性低于MCab/Strept-Cy3的活性，而R24A突變體無(wú)活性。
實(shí)施例4用于使納米顆粒穿透細(xì)胞的毛若考辛及其衍生多肽的用途根據(jù)供應(yīng)商推薦的方案，將生物素化毛若考辛與結(jié)合了鏈霉親和素的納米顆粒(Qdot，QUANTUMDOT公司)耦聯(lián)。單獨(dú)耦聯(lián)了鏈霉親和素的納米顆粒(Qdot鏈霉親和素結(jié)合體，QUANTUMDOT公司)作為對(duì)照。納米顆粒的直徑為10～15nM，并且各自與5～6個(gè)鏈霉親和素分子耦聯(lián)。用100nM、與納米顆粒耦聯(lián)的(Qdot，QUANTUMDOT公司)毛若考辛或單獨(dú)耦聯(lián)了鏈霉親和素的納米顆粒孵育HEK293細(xì)胞培養(yǎng)物1小時(shí)，接著固定細(xì)胞，并用如實(shí)施例1所述的聚焦顯微鏡分析。圖14表明毛若考辛使得納米顆粒穿透了細(xì)胞。
序 列 表<110>法國(guó)原子能總署法國(guó)國(guó)家衛(wèi)生及醫(yī)療研究院米歇爾·朗沙米歇爾·德瓦特<120>用作細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)目標(biāo)分子用載體的毛若考辛衍生多肽<130>HLPclg263PCT123<160>29<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>33<212>PRT<213>Scorpio maurus<400>1Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Leu Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>2<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine K8A mutant<400>2Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Ala Leu Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30
Arg<210>3<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine K19A mutant<400>3Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Leu Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Ala Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>4<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine K20A mutant<400>4Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Leu Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Ala Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>5<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine K22A mutant
<400>5Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Leu Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Ala Arg Arg Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>6<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine R23A mutant<400>6Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Leu Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Ala Arg Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>7<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine R24A mutant<400>7Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Leu Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Ala Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg
<210>8<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine T26A mutant<400>8Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Leu Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Ala Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>9<211>33<212>PRT<213>Pandinus imperator<400>9Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Arg Cys Lys Ala Asp Asn Asp Cys1 5 10 15Cys Gly Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ala Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>10<211>33<212>PRT<213>Opistophtalmus carinatis<400>10Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Arg Cys Lys Glu Asn Asn Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Pro Glu Lys Arg Cys20 25 30
Arg<210>11<211>33<212>PRT<213>Opistophtalmus carinatis<400>11Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Arg Cys Lys Glu Asn Asn Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Ala Asn Pro Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>12<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine D2A mutant<400>12Gly Ala Cys Leu Pro His Leu Lys Leu Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>13<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine L4A mutant<400>13
Gly Asp Cys Ala Pro His Leu Lys Leu Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>14<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine P5A mutant<400>14Gly Asp Cys Leu Ala His Leu Lys Leu Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>15<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine H6A mutant<400>15Gly Asp Cys Leu Pro Ala Leu Lys Leu Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>16
<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine L7A mutant<400>16Gly Asp Cys Leu Pro His Ala Lys Leu Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>17<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine L9A mutant<400>17Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Ala Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>18<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine El2A mutant<400>18Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Leu Cys Lys Ala Asn Lys Asp Cys1 5 10 15
Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>19<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine N13A mutant<400>19Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Leu Cys Lys Glu Ala Lys Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>20<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine D15A mutant<400>20Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Leu Cys Lys Glu Asn Lys Ala Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>21<211>33<212>PRT
<213>人T合成序列<220>
<223>maurocalcine G25A mutant<400>21Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Leu Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Ala Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>22<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine N27A mutant<400>22Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Leu Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Ala Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>23<211>30<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine E29A mutant<400>23Leu Pro His Leu Lys Leu Cys Lys Glu Asn Lys Asp Cys Cys Ser Lys1 5 10 15Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ile Ala Lys Arg Cys Arg
20 25 30<210>24<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine/imperatoxin A chimera<400>24Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Arg Cys Lys Ala Asp Asn Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Ala Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>25<211>33<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>maurocalcine/opicalcine 1 chimera<400>25Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Arg Cys Lys Glu Asn Asn Asp Cys1 5 10 15Cys Ser Lys Lys Cys Lys Arg Ala Gly Thr Asn Ile Glu Lys Arg Cys20 25 30Arg<210>26<211>20<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>合成多肽
<400>26Cys Trp Cys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys1 5 10 15Lys Lys Cys Lys20<210>27<211>20<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>合成多肽<400>27Cys Trp Cys Lys Lys Lys Cys Lys Lys Lys Cys Lys Lys Lys Cys Lys1 5 10 15Lys Lys Cys Lys20<210>28<211>20<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>合成多肽<400>28Cys Trp Lys Lys Lys Lys Lys Cys Lys Lys Lys Lys Lys Cys Lys Lys1 5 10 15Lys Lys Lys Cys20<210>29<211>34<212>PRT<213>Momordica cochinchinensis<400>29Ser Gly Ser Asp Gly Gly Val Cys Pro Lys Ile Leu Lys Lys Cys Arg
1 5 10 15Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Ala Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr20 25 30Cys Gly
權(quán)利要求
1.一種用于在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)目標(biāo)物質(zhì)的多肽載體的用途，其特征在于，所述載體主要由符合下述序列(I)的毛若考辛衍生多肽構(gòu)成Z-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25-X26-Z′(I)，其中-X1和X26各自代表半胱氨酸，-X2～X25各自代表氨基酸或者缺失，X7、X10、X11、X12、X13、X14、X15和X16則始終存在，以及-X10，X11，X13和X14各自代表賴氨酸或精氨酸，以及-Z和/或Z′缺失或各自代表1～35個(gè)氨基酸的序列，但具有如附后的序列表中序列SEQID NO.1所示的多肽除外。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，X15不同于精氨酸也不同于賴氨酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，X7和/或X12代表半胱氨酸。
4.如權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，X2、X3、X4、X5、X6、X8、X23、X24和X25缺失。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，X17～X22存在，X21和/或X22代表精氨酸或賴氨酸，優(yōu)選X21代表賴氨酸。
6.如權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，Z′代表精氨酸或賴氨酸。
7.如權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，Z符合下述序列(II)Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14-Z15-Z16-Z17-Z18-Z19-Z20-Z21-Z22-Z23-Z24-Z25-Z26-Z27-Z28-Z29-Z30-Z31-Z32-Z33-Z34-Z35(II)，其中Z1～Z35各自代表氨基酸或缺失，Z29、Z30、Z32和Z31或Z33則始終存在。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，Z21和/或Z29代表半胱氨酸。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，當(dāng)Z21代表半胱氨酸時(shí)，X7也代表半胱氨酸，當(dāng)Z29代表半胱氨酸時(shí)，X12也代表半胱氨酸。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，X7、X12、Z21和Z29各自代表半胱氨酸。
11.如權(quán)利要求7～10中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，至少一種選自Z30、Z31、Z32、Z33、Z34和Z35中的氨基酸是賴氨酸或精氨酸。
12.如權(quán)利要求11所述的用途，其特征在于，Z30和/或Z34代表精氨酸或賴氨酸。
13.如權(quán)利要求7～12中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，至少一種選自Z22、Z23、Z24、Z25、Z26、Z27和Z28中的氨基酸是賴氨酸或精氨酸。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于，Z27和/或Z28代表精氨酸或賴氨酸。
15.如權(quán)利要求11～14中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，選自Z22、Z23、Z24、Z25、Z26、Z27、Z28、Z30、Z31、Z32、Z33、Z34和Z35的至少三種氨基酸各自代表賴氨酸或精氨酸。
16.如權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于，Z27和Z30各自代表賴氨酸，Z28或Z34各自代表賴氨酸或精氨酸。
17.如權(quán)利要求7～16中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，至少Z1～Z18、Z22、以及Z31或Z34缺失。
18.如權(quán)利要求17所述的用途，其特征在于，Z1～Z26、以及Z31或Z34缺失。
19.如權(quán)利要求17所述的用途，其特征在于，Z1～Z28、以及Z31或Z34缺失。
20.如權(quán)利要求17所述的用途，其特征在于，Z1～Z18、Z22、以及Z31或Z34；Z1～Z19、Z22和Z31或Z34；Z1～Z20、Z22和Z31或Z34缺失。
21.如權(quán)利要求1～20中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述序列(I)所示的多肽選自由序列SEQ ID Nos.2～25所構(gòu)成的序列組。
22.如權(quán)利要求1～20中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述多肽載體由D-氨基酸構(gòu)成。
23.如權(quán)利要求1～22中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述多肽載體與一種合適的標(biāo)記耦聯(lián)。
24.如權(quán)利要求1～23中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，如上所述序列(I)所示的多肽載體與異源目標(biāo)多肽或多肽序列融合，從而形成嵌合蛋白或嵌合多肽。
25.如權(quán)利要求1～24中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，如權(quán)利要求1～24中任一項(xiàng)所述的多肽載體與顆粒耦聯(lián)。
26.如權(quán)利要求25所述的用途，其特征在于，所述顆粒包含目標(biāo)物質(zhì)。
27.如權(quán)利要求1～26中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述目標(biāo)物質(zhì)是標(biāo)靶在細(xì)胞內(nèi)的藥理學(xué)活性物質(zhì)。
28.如權(quán)利要求1～26中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述目標(biāo)物質(zhì)是待檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)組分的配體。
29.如權(quán)利要求28所述的用途，其特征在于，所述配體是抗所述細(xì)胞內(nèi)組分的抗體或抗體的功能性片斷。
30.一種組合物，其包括標(biāo)靶在細(xì)胞內(nèi)的藥理學(xué)活性物質(zhì)和如權(quán)利要求1～27中任一項(xiàng)所述的多肽載體。
31.一種能用作細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)試劑的組合物，其包括待檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi)組分的配體和如權(quán)利要求1～26、28和29中任一項(xiàng)所述的多肽載體。
32.如權(quán)利要求30所述的組合物，其特征在于，其用作藥劑。
33.如權(quán)利要求30所述的組合物的用途，其特征在于，所述組合物用于制備治療人類或動(dòng)物疾病的藥劑。
34.如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，其用作診斷試劑。
35.一種治療疾病的方法，其特征在于，所述方法包括用任何適當(dāng)?shù)姆椒▽⑷鐧?quán)利要求30所述的組合物給藥于個(gè)體。
36.一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)組分的體外方法，其特征在于，包括-使細(xì)胞樣品與如權(quán)利要求31所述的檢測(cè)試劑接觸，以及-用任何適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記。
37.一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)組分的體內(nèi)方法，其特征在于，包括-將如權(quán)利要求31所述的檢測(cè)試劑導(dǎo)入有機(jī)體，以及-用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ粰z測(cè)細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記。
38.如權(quán)利要求24所述的嵌合多肽或嵌合蛋白。
39.如權(quán)利要求1～22中任一項(xiàng)所述的如序列(I)所示的多肽，其特征在于，不包括如序列SEQ ID Nos.1～11和26～29所示的多肽。
40.由如權(quán)利要求39所述的多肽衍生的經(jīng)標(biāo)記的多肽。
41.一種耦聯(lián)到如權(quán)利要求1～22中任一項(xiàng)所述的如序列(I)所示的多肽上或耦聯(lián)到如權(quán)利要求38所述的嵌合多肽或嵌合蛋白上的顆粒。
42.一種多核苷酸，其特征在于，其編碼如權(quán)利要求39所述的多肽，或編碼如權(quán)利要求38所述的嵌合多肽或嵌合蛋白。
43.一種包含如權(quán)利要求42所述多核苷酸的重組載體。
44.一種用如權(quán)利要求42所述的多核苷酸或如權(quán)利要求43所述的載體修飾的真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。
45.一種轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物，其特征在于，所述非人類哺乳動(dòng)物的所有細(xì)胞或部分細(xì)胞用如權(quán)利要求42所述的多核苷酸或用權(quán)利要求43所述的載體修飾。
46.一種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述植物的所有細(xì)胞或部分細(xì)胞用如權(quán)利要求42所述的多核苷酸或用權(quán)利要求43所述的載體修飾。
全文摘要
用于細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)目標(biāo)物質(zhì)的多肽載體的用途，所述載體主要包括由符合下述序列(I)的毛若考辛(maurocalcine)衍生的多肽Z－X
文檔編號(hào)A61K38/17GK101094863SQ200580045708
公開(kāi)日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2005年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月12日
發(fā)明者米歇爾·朗沙, 米歇爾·德瓦特 申請(qǐng)人:法國(guó)原子能總署, 法國(guó)國(guó)家衛(wèi)生及醫(yī)療研究院