專(zhuān)利名稱(chēng)：葡萄球菌腸毒素a基因及其編碼蛋白的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及葡萄球菌腸毒素A基因及其編碼蛋白的新用途，特別是涉及葡萄球菌腸毒素A基因在作為DNA疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑和該基因的編碼蛋白作為重組亞單位免疫原性增強(qiáng)佐劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葡萄球菌腸毒素A(staphylococcal enterotoxin A，SEA)是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的葡萄球菌腸毒素家族中的一員，是最有效的T細(xì)胞活化因子之一。SEA是含233個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)分子，富含絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)和天門(mén)冬氨酸(D)殘基。分子量較小，約27.8kD，等電點(diǎn)PI＝7.3，對(duì)酸和熱穩(wěn)定。SEA分子中心有一個(gè)由二硫鍵形成的環(huán)，該環(huán)的完整性是SEA活化T淋巴細(xì)胞所必需的。SEA具有超抗原所具有的兩個(gè)特點(diǎn)，一是SEA不需經(jīng)過(guò)抗原加工或蛋白酶解過(guò)程，可被直接呈遞給T淋巴細(xì)胞，而產(chǎn)生相應(yīng)的免疫效應(yīng)。該過(guò)程需要表達(dá)MHC II分子的輔佐細(xì)胞參與；二是SEA的呈遞不受MHC限制，人類(lèi)細(xì)胞可將SEA有效呈遞給鼠T淋巴細(xì)胞，反之亦然。微量(10-9～10-12g)SEA能有效激活免疫細(xì)胞，產(chǎn)生一系列淋巴因子，主要有IL-1，IL-1，IL-2，IL-6，TNF-α，TNF-β和INF-γ，這些淋巴因子可直接產(chǎn)生抗腫瘤作用，也可繼發(fā)激活NK細(xì)胞而產(chǎn)生LAK活性。更重要的是，SEA能高效激活某些含有特定TCR V的T細(xì)胞，主要是CTLs細(xì)胞，對(duì)MHC II+細(xì)胞產(chǎn)生SDCC(staphylococcal-enterotoxin-dependent cell-mediated cytotoxicity)作用。
DNA疫苗是指攜帶有抗原蛋白基因及表達(dá)必需的調(diào)控元件的質(zhì)粒DNA的表達(dá)載體。將其導(dǎo)入到宿主的有機(jī)體中，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，可達(dá)到免疫的目的。優(yōu)點(diǎn)是易于構(gòu)建；成本低廉；制劑穩(wěn)定；可組建多價(jià)復(fù)合疫苗聯(lián)合免疫。但是，有些抗原基因的免疫原性比較弱，單獨(dú)注射這些疫苗不能誘發(fā)足夠的保護(hù)性免疫。因此，尋找合適的DNA疫苗佐劑，有助于提高其免疫性及免疫效果。
重組亞單位疫苗是指重組抗原表達(dá)載體在原核或真核細(xì)胞表達(dá)的多肽抗原，經(jīng)純化后制成的蛋白疫苗，與死菌苗和減毒活疫苗相比，副作用減少的同時(shí)，其免疫原性較低，因此，需添加適當(dāng)?shù)拿庖咦魟?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供葡萄球菌腸毒素A基因在作為DNA疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑和該基因的編碼蛋白(rSEA)作為重組亞單位免疫原性增強(qiáng)佐劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，葡萄球菌腸毒素A基因能夠顯著改善動(dòng)物對(duì)DNA疫苗的反應(yīng)性，可以用作DNA疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑或重組亞單位；葡萄球菌腸毒素A基因的編碼蛋白能夠顯著改善動(dòng)物對(duì)重組亞單位疫苗的反應(yīng)性，可以用作重組亞單位疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑。
在實(shí)際應(yīng)用中，葡萄球菌腸毒素A基因與DNA疫苗的基因可以存在于不同的重組質(zhì)粒中，使用時(shí)聯(lián)合注射，也可以使葡萄球菌腸毒素A基因與DNA疫苗的基因融合，形成一個(gè)重組質(zhì)粒，使用起來(lái)會(huì)更方便。rSEA與重組亞單位疫苗的蛋白可獨(dú)立存在，在使用時(shí)聯(lián)合注射，也可以使rSEA與重組亞單位疫苗的蛋白融合，形成融合蛋白。當(dāng)然，在制備上述佐劑時(shí)，也不排除添加其它藥學(xué)上可接受的輔料及載體。
葡萄球菌腸毒素A基因可以使乙肝病毒表面抗原DNA疫苗、瘧疾多表位抗原DNA疫苗等各種DNA疫苗免疫原性均得到增強(qiáng)，具有廣譜性，是一種不可多得的DNA疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑，葡萄球菌腸毒素A可以使各種重組亞單位疫苗的免疫原性得到增強(qiáng)，是一種不可多得的重組亞單位疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑，葡萄球菌腸毒素A基因及其編碼蛋白在DNA疫苗及重組亞單位疫苗的生產(chǎn)和應(yīng)用中意義重大。
圖1為質(zhì)粒pmSEA的酶切鑒定圖譜圖2為質(zhì)粒pS2S的酶切鑒定圖譜具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、質(zhì)粒的制備1、含有葡萄球菌腸毒素A基因的重組質(zhì)粒pmSEA的構(gòu)建使用上游引物P15’-cgcggatccagcgagaaaagcgaagaaa-3’(帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶BamH I識(shí)別位點(diǎn))和下游引物P25’-atgaattcagaattcacttgtatataatatAGCaata tgcat-3’(帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I識(shí)別位點(diǎn))，以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 13565的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增SEA基因，反應(yīng)條件為(1)96℃ 10分鐘；(2)94℃ 60秒，50℃ 90秒，72℃ 90秒，共30個(gè)循環(huán)；(3)72℃ 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收702bp的目的片段，再用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和EcoRI對(duì)回收的基因片段酶切，將酶切產(chǎn)物克隆入經(jīng)同樣酶酶切的質(zhì)粒載體pcDNA3(Invitrogen，USA)上，得到重組質(zhì)粒，命名為pmSEA。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后挑選陽(yáng)性克隆，對(duì)其進(jìn)行DNA序列分析，分析結(jié)果表明所克隆的葡萄球菌腸毒素A基因序列正確(序列1)，其編碼的氨基酸殘基序列為序列表中的序列2。對(duì)該重組質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和EcoRI作進(jìn)一步酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖1所示(泳道1為Marker DL-2000；泳道2為pmSEA的BamHI和EcoRI酶切產(chǎn)物，小片段約700bp；泳道3為未酶切的pmSEA)，表明獲得了含有葡萄球菌腸毒素A基因的重組質(zhì)粒。
2、含有乙肝表面抗原基因的重組質(zhì)粒pS2S的構(gòu)建使用上游引物B25’-GGAAGATCTCAGGCCATG CAGTGGAATT-3’(帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶Bgl II識(shí)別位點(diǎn))和下游引物S35’-AGGGGGCCCAGCCCATGAAGTTTAGGGAA-3’(帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶Apa I識(shí)別位點(diǎn))，以質(zhì)粒HBV2(張彤等；中華微生物和免疫學(xué)雜志。1997，16(6)421-424)為模板，PCR擴(kuò)增乙肝表面抗原中蛋白preS2-S的基因片段，反應(yīng)條件為(1)95℃5分鐘；(2)95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 50秒，共25個(gè)循環(huán)；(3)72℃ 5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收回收843bp的目的片段，再用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Apa I對(duì)回收的基因片段酶切，將酶切產(chǎn)物克隆入質(zhì)粒載體pcDNA3(Invitrogen，USA)的多克隆位點(diǎn)BamHI和Apa I之間，得到重組質(zhì)粒，命名為pS2S。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后挑選陽(yáng)性克隆，對(duì)其進(jìn)行DNA序列分析，分析結(jié)果表明所克隆的乙肝表面抗原preS2-S基因序列正確(序列3)，其編碼的氨基酸殘基序列為序列表中的序列4。對(duì)該重組質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和Apa I作進(jìn)一步酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖2所示(泳道1為pS2S的BamHI和ApaI酶切產(chǎn)物，約843bp；泳道2為Marker DL-2000)，表明獲得了含有乙肝表面抗原基因的重組質(zhì)粒。
3、含有瘧疾多表位抗原基因的重組質(zhì)粒AWTE的構(gòu)建使用上游引物5’-cgcggatccatgaacgctaaccctgg tgat-3’(帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶BamH I識(shí)別位點(diǎn))，下游引物5’agggggcccttacgatggtaccacaacgtt-3’(帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶Apa I識(shí)別位點(diǎn))。以重組質(zhì)粒CTB-AWTE(鐘輝等。科學(xué)通報(bào).43(13)1417-1422.)為模板，PCR擴(kuò)增瘧疾多表位抗原AWTE基因片段，反應(yīng)條件為(1)95℃ 5分鐘；(2)45℃ 20秒，72℃ 30秒，共5個(gè)循環(huán)；(3)95℃ 30秒，55℃ 20秒，72℃ 30秒，共25個(gè)循環(huán)；(4)72℃ 5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收366bp的目的片段，再用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和Apa I對(duì)回收的基因片段酶切，將酶切產(chǎn)物克隆入質(zhì)粒載體pcDNA3的多克隆位點(diǎn)BamH I和Apa I之間，得到重組質(zhì)粒，命名為AWTE。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后挑選陽(yáng)性克隆，對(duì)其進(jìn)行DNA序列分析，分析結(jié)果表明所克隆的瘧疾多表位抗原AWTE基因序列正確(序列5)。
4、含有葡萄球菌腸毒素A和人表皮生長(zhǎng)因子融合基因EGF-SEA的重組質(zhì)粒pEGF-SEA的構(gòu)建利用引物15’-AACATATGAATTCCGACTCTGAATGCCC-3’和引物25’-AAGGATCCGGCCAGGAGGTCCGCATGCTCGCAGCGTGCACCAACGTAGCCAGAATGG-3’(帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶Nde I和BamH I識(shí)別位點(diǎn))，以重組質(zhì)粒pET22b(+)-Ang-EGF(許偉立，陳東立，馬清鈞。中國(guó)專(zhuān)利“抗腫瘤作用的融合蛋白及該蛋白的應(yīng)用”，申請(qǐng)?zhí)?1120099.5；授權(quán)號(hào)CN 1161467C)為模板，PCR擴(kuò)增人表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor，EGF)多肽編碼基因，反應(yīng)條件為(1)95℃ 5分鐘；(2)94℃ 60秒，64℃ 30秒，72℃ 30秒，72℃ 10分鐘，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收147bp的目的片段，克隆至原核表達(dá)載體pmTSA上(胥全彬，博士論文，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2003)，得到重組質(zhì)粒，命名為pEGF-SEA。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后挑選陽(yáng)性克隆，對(duì)其進(jìn)行DNA序列分析，分析結(jié)果表明所克隆的EGF基因序列(序列6)正確，其編碼的氨基酸殘基序列為序列表中的序列7。
實(shí)施例2、pmSEA對(duì)乙肝病毒表面抗原DNA疫苗免疫原性的增強(qiáng)作用小鼠Balb/c，雌性，4-6周齡。
分組(1)空載體組(pcDNA3)，10只；(2)乙肝蛋白疫苗組(rHBsAg)，10只；(3)pS2S組，10只；(4)pS2S+pmSEA佐劑組，10只。
免疫方案(1)空載體組(pcDNA3)200ug/只/次；(2)乙肝蛋白疫苗組(rHBsAg)400ng/只/次；(3)pS2S組100ug pS2S+100ug pcDNA3/只/次；(4)pS2S+pmSEA佐劑組100ug pS2S+100ug pmSEA/只/次。
在小鼠麻醉狀態(tài)下(75mg/kg sodium pentobarbital IP)，在小鼠的兩后肢的股四頭肌肉各注射50uL樣品，然后用活體基因?qū)雰x(浙江新芝公司)，在注射部位進(jìn)行電擊，電壓為120V/cm，時(shí)長(zhǎng)2ms，2次。
免疫次數(shù)共兩次，初次免疫后，在第14天加強(qiáng)免疫一次。初次免疫后，每隔2周，取血檢測(cè)抗HBsAg抗體產(chǎn)生的滴度。用ELISPOT法檢測(cè)IFN-γ產(chǎn)生情況。
結(jié)果表明，含有pmSEA質(zhì)粒佐劑的第4組初次免疫后2周的HBsAb陽(yáng)性率為37.5％，加強(qiáng)免疫后2周，HBsAb陽(yáng)性率為75％；而未加佐劑的第3組初次免疫后2周的HBsAb陽(yáng)性率為10％，加強(qiáng)免疫后2周，HBsAb陽(yáng)性率為27％。14周后，第4組的HBsAb陽(yáng)性率均為100％，而未加佐劑的第3組的HBsAb陽(yáng)性率僅為50％。ELISPOT檢測(cè)結(jié)果第4組產(chǎn)生的IFN-γ是第3組的2-3倍，表明pmSEA可顯著增強(qiáng)乙肝表面抗原質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)激發(fā)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
實(shí)施例3、pmSEA對(duì)瘧疾多表位抗原DNA疫苗免疫原性的增強(qiáng)作用小鼠Balb/c，雌性，4-6周齡。
分組(1)空載體組(pcDNA3)，6只；(2)AWTE質(zhì)粒組，6只；(3)AWTE質(zhì)粒+pmSEA質(zhì)粒佐劑組，6只。
免疫方案(1)空載體組(pcDNA3)200ug/只/次；(2)AWTE質(zhì)粒組100ugAWTE+100ug pcDNA3/只/次；(3)AWTE質(zhì)粒+pmSEA質(zhì)粒佐劑組100ug AWTE+100ugpmSEA/只/次。
在小鼠麻醉狀態(tài)下(75mg/kg sodium pentobarbital IP)，在小鼠的兩后肢的股四頭肌肉各注射50ul樣品，然后用活體基因?qū)雰x(浙江新芝公司)，在注射部位進(jìn)行電擊，電壓為120V/cm，時(shí)長(zhǎng)2ms，2次。
免疫次數(shù)共兩次，初次免疫后，在第14天加強(qiáng)免疫一次。初次免疫后，每隔2周，取血檢測(cè)抗AWTE抗體產(chǎn)生的滴度。末次免疫3周后，取脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行CTL細(xì)胞活性檢測(cè)。
結(jié)果表明，含有pmSEA質(zhì)粒佐劑的第3組初次免疫后2周的AWTE滴度為1∶400，加強(qiáng)免疫后2周，AWTE陽(yáng)性率為1∶5000；第2組初次免疫后2周的AWTE滴度檢測(cè)不到，加強(qiáng)免疫后2周，AWTE陽(yáng)性率為1∶100。CTL活性檢測(cè)在效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞為100∶1時(shí)，第3組為67％，第2組為20％，表明pmSEA可顯著增強(qiáng)瘧疾多表位抗原免疫原性，誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
實(shí)施例4、rSEA對(duì)重組亞單位疫苗EGF的佐劑作用小鼠C57BL/6，雌性，5周齡。
分組(1)EGF-SEA融合蛋白組，10只；(2)EGF多肽陽(yáng)性對(duì)照組，10只；(3)生理鹽水陰性對(duì)照組，10只。
免疫方案(1)EGF-SEA融合蛋白組10ug/只/次；(2)EGF多肽陽(yáng)性對(duì)照組10ug/只/次；(3)生理鹽水陰性對(duì)照組200uL/只/次。
免疫次數(shù)共四次，初次免疫前采血，然后連續(xù)免疫4次，每次間隔10天；免疫前均采小鼠尾血，ELISA檢測(cè)血清效價(jià)。
結(jié)果表明在EGF-SEA融合蛋白組檢測(cè)到高滴度的抗EGF的抗體(1∶32,000)，而單獨(dú)用EGF多肽免疫小鼠的血清，未檢測(cè)到抗EGF的抗體，表明EGF與SEA融合后，可顯著提高抗EGF的抗體滴度，證明SEA具有較強(qiáng)的免疫佐劑效應(yīng)。
序列表<160>7<210>1<211>702<212>DNA<213>金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureaus)<400>1agcgagaaaa gcgaagaaat aaatgaaaaa gatttgcgaa aaaagtctga attgcaggga 60acagctttag gcaatcttaa acaaatctat tattacaatg aaaaagctaa aactgaaaat120aaagagagtc acgatcaatt tttacagcat actatattgt ttaaaggctt ttttacagat180cattcgtggt ataacgattt attagtagat tttgattcaa aggatattgt tgataaatat240aaagggaaaa aagtagactt gtatggtgct tattatggtt atcaatgtgc gggtggtaca300ccaaacaaaa cagcttgtat gtatggtggt gtaacgttac atgataataa tcgattgacc360gaagagaaaa aagtgccgat caatttatgg ctagacggta aacaaaatac agtacctttg420gaaacggtta aaacgaataa gaaaaatgta actgttcagg agttggatct tcaagcaaga480cgttatttac aggaaaaata taatttatat aactctgatg tttttgatgg gaaggttcag540aggggattaa tcgtgtttca tacttctaca gaaccttcgg ttaattacga tttatttggt600gctcaaggac agtattcaaa tacactatta agaatatata gagataataa aacgattaac660tctgaaaaca tgcatattgc tatatattta tatacaagtt aa 702<210>2<211>243<212>PRT<213>金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureaus)<400>2Thr Leu Thr Thr Ser Pro Leu Val Asn Gly Ser Glu Lys Ser Glu Glu1 5 10 15Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu Gln Gly Thr Ala20 25 30Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Thr35 40 45
Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu Gln His Thr Ile Leu Phe50 55 60Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp Leu Leu Val Asp65 70 75 80Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys Gly Lys Lys Val Asp85 90 95Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn100 105 110Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His Asp Asn Asn Arg115 120 125Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu Trp Leu Asp Gly Lys130 135 140Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr Asn Lys Lys Asn Val145 150 155 160Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg Tyr Leu Gln Glu Lys165 170 175Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly Lys Val Gln Arg Gly180 185 190Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Asn Tyr Asp Leu195 200 205Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu Leu Arg Ile Tyr Arg210 215 220Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His Ile Ala Ile Tyr Leu225 230 235 240Tyr Thr Ser<210>3<211>843<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3atgcagtgga actccacgac attccaccaa gctctgctag atcccagagt gaggggccta 60tattttcctg ctggtggctc cagttccgga acagtaaacc ctgttccgac tactgcctca120cccatatcgt caatcttctc gaggactggg gaccctgcac cgaacatgga gagcacaaca180tcaggattcc taggacccct gctcgtgtta caggcggggt ttttcttgtt gacaagaatc240ctcacaatac cacagagtct agactcgtgg tggacttctc tcaattttct agggggagca300cccacgtgtc ctggccaaaa ttcgcagtcc ccaacctcca atcactcacc aacctcttgt360cctccaactt gtcctggcta tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat attcctcttc420atcctgctgc tatgcctcat cttcttgttg gttcttctgg actaccaagg tatgttgccc480gtttgtcctc tacttccagg aacatcaact accagcacgg gaccatgcaa gacctgcacg540attcctgctc aaggaacctc tatgtttccc tcttgttgct gtacaaaacc ttcggacgga600aactgcactt gtattcccat cccatcatcc tgggctttcg caagattcct atgggagtgg660gcctcagtcc gtttctcctg gctcagttta ctagtgccat ttgttcagtg gttcgtaggg720ctttccccca ctgtttggct ttcagttata tggatgatgt ggcattgggg gccaagtctg780tacaacatct tgagtccctt tttacctcta ttaccaattt tcttttgtct ctgggtatac840att 843<210>4<211>281<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>4Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Argl 5 10 15Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val20 25 30Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg35 40 45Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu Ser Thr Thr Ser Gly Phe Leu
50 55 60Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile65 70 75 80Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe85 90 95Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr100 105 110Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg115 120 125Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu130 135 140Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro145 150 155 160Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys165 170 175Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys180 185 190Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro195 200 205Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg210 215 220Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly225 230 235 240Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp His Trp245 250 255Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro260 265 270Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile275 280<210>5<211>366
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5atgaacgcta accctggtga tgaactggaa acccagaacg tgtacgcagc cccgaatgcg 60aatccgtaca gcctgttgca gaaagagaaa atggtgctgc cgaacgccaa cccgccggcg120aacaagaaga acgcgggtcc caacaagaac gatgataaca agaacgatga taacaagaac180gatgataaca agaacgatga taacaagaac gatgataaca agaacgatga taacaagaac240gatgataaca agaacgatga taacaagggg aaacctaaag acgaattaga ttatgaagat300attgaaaaga agatcgctaa gatggaaaag gctagcagtg ttttcaacgt tgtggtacca360tcgtaa 366<210>6<211>843<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6aattccgact ctgaatgccc gctgtctcac gacggttact gcctacacga tggtgtttgc 60atgtatatcg aagctctgga caaatacgcg tgcgtgtgcc attctggcta cgttggtgca120cgctgcgagc atgcggacct cctggcc147<210>7<211>49<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>7Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His1 5 10 15Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Val20 25 30Cys His Ser Gly Tyr Val Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu Leu35 40 45Ala
權(quán)利要求
1.葡萄球菌腸毒素A基因作為DNA疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述葡萄球菌腸毒素A基因與DNA疫苗的基因存在于不同的重組質(zhì)粒中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述DNA疫苗為乙肝病毒表面抗原DNA疫苗或瘧疾多表位抗原DNA疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述葡萄球菌腸毒素A基因與DNA疫苗的基因是融合基因，存在于同一重組質(zhì)粒中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述DNA疫苗為乙肝病毒表面抗原DNA疫苗或瘧疾多表位抗原DNA疫苗。
6.葡萄球菌腸毒素A基因在制備DNA疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑中的應(yīng)用。
7.葡萄球菌腸毒素A作為重組亞單位疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述葡萄球菌腸毒素A與重組亞單位疫苗的蛋白獨(dú)立存在。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述葡萄球菌腸毒素A與重組亞單位疫苗的蛋白融合成為融合蛋白。
10.葡萄球菌腸毒素A在制備重組亞單位疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了葡萄球菌腸毒素A基因及其編碼蛋白的新用途。本發(fā)明發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，葡萄球菌腸毒素A基因能夠顯著改善動(dòng)物對(duì)DNA疫苗的反應(yīng)性，可以用作DNA或重組亞單位疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑。葡萄球菌腸毒素A基因可以使乙肝病毒表面抗原DNA疫苗、瘧疾多表位抗原DNA疫苗等各種DNA疫苗免疫原性均得到增強(qiáng)，具有廣譜性，是一種不可多得的DNA疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑，葡萄球菌腸毒素A可以使各種重組亞單位疫苗的免疫原性得到增強(qiáng)，是一種不可多得的重組亞單位疫苗免疫原性增強(qiáng)佐劑，葡萄球菌腸毒素A基因及其編碼蛋白在DNA疫苗及重組亞單位疫苗的生產(chǎn)和應(yīng)用中意義重大。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1853731SQ20051006811
公開(kāi)日2006年11月1日 申請(qǐng)日期2005年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月26日
發(fā)明者馬清鈞, 靳彥文, 胥全彬, 曹誠(chéng) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所