專利名稱：非酰胺化ω－芋螺毒素M ⅦA 及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程，涉及構(gòu)建ω-芋螺毒素M VIIA(ω-CTX M VIIA)基因真核表達質(zhì)粒，制備非酰胺化ω-CTX M VIIA的方法，以及在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用。
背景技術(shù)：
芋螺毒素(conotoxin，CTX)是從海洋腹足綱軟體動物芋螺(conus)中得到的一類具有生物活性的肽類毒素，至今已有50000余種。一般含10～30個氨基酸，大多富含二硫鍵，按其作用靶位及藥理學活性，可分為α，ω，μ等家族。ω-芋螺毒素(ω-CTX)是由24～29個氨基酸、3對二硫鍵構(gòu)成的剛性小肽，是芋螺毒素中最重要的毒素。由于ω-CTX具有高親和力、高度專一性的特點，它能特異性地阻斷電壓敏感型鈣離子通道(Voltage sensitive calciumchannel，VSCC)，在離子通道亞型鑒定、神經(jīng)疾病治療方面發(fā)揮重要作用，已成為神經(jīng)生物學、分子生物學、多肽化學、藥物藥理學等領(lǐng)域的研究熱點。
目前研究的最多的ω-CTX是M VIIA，由25個氨基酸組成，其中羧基端的Cys為酰胺化的結(jié)構(gòu)，其氨基酸序列為CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC-NH2*(含6個半胱氨酸殘基，形成三對交叉二硫鍵，即二硫鍵連接方式為C1-C16，C8-C20，C15-C25；*羧基端的Cys為酰胺化)；研究證明它具雙重效應，一方面阻斷痛覺傳遞而具鎮(zhèn)痛效應，另一方面抑制刺激毒性(excitotoxic)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，阻止神經(jīng)元細胞病理性鈣內(nèi)流而有神經(jīng)保護作用。因其直接作用于鈣通道，無需第二信使或G蛋白，故不成癮，可用于治療慢性重癥疼痛(如晚期惡性腫瘤和AIDS病等引起的頑痛)。
目前，化學合成的ω-CTX M VIIA，已在美國由FDA批準上市，但由于ω-CTX M VIIA的分子結(jié)構(gòu)復雜，分子中有6個半胱氨酸(Cys)需要準確配對形成二硫鍵，需要20多步反應，得率很低，工藝十分困難，質(zhì)量不穩(wěn)定，而且成本很高。因此，尋找一種合適的方法獲得ω-芋螺毒素M VIIA成為需要。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供多肽有機化合物非酰胺化ω-芋螺毒素M VIIA，具有SEQ ID NO1的氨基酸序列Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys 25該多肽分子中Cys1與Cys16、Cys8與Cys20、Cys15與Cys25分別形成三對二硫鍵；C-端為非酰胺化Cys。
本發(fā)明的另一個目的是利用基因工程方法構(gòu)建ω-芋螺毒素M VIIA(ω-CTX M VIIA)基因真核表達質(zhì)粒，制備非酰胺化ω-CTX M VIIA的方法，直接獲得目的小肽，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)(1)編碼ω-CTX M VIIA的DNA片段的設(shè)計與合成根據(jù)已知的ω-CTXM VIIA氨基酸序列，按畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計寡核苷酸片斷(CTX1和CTX2)，5’端添加Xho I酶切位點及編碼Lys-Arg的序列并磷酸化，3’端添加TAA終止密碼子及EcoR I酶切位點；(2)表達載體的構(gòu)建對畢赤酵母表達載體pPIC9進行Xho I/EcoR I雙酶切，將退火生成的編碼非酰胺化的ω-CTX M VIIA的基因片段連接到pPIC9上，構(gòu)建成重組表達質(zhì)粒pPIC9-CTX。對其分別進行PCR和雙酶切，用瓊脂糖電泳鑒定(參見圖2、3)，對克隆2 pPIC9-CTX測序結(jié)果表明編碼非酰胺化的ω-CTX M VIIA的DNA序列已正確的插入到pPIC9中。
(3)畢赤酵母中表達載體的轉(zhuǎn)化取5～10μg去除了RNA的重組表達載體，經(jīng)Sal I單酶切線性化，乙醇沉淀回收后以電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，在MD和MM平板上篩選轉(zhuǎn)化子，所用電轉(zhuǎn)儀為Bio-Rad GenePulser，轉(zhuǎn)化條件為電壓1500V，電容25μF，電阻200Ω；(4)基因表達畢赤酵母基因表達宿主菌選用GS115，挑取單克隆Mut+型菌落，按照Invitrogen公司提供的操作手冊的GS115(Mut+)所介紹的發(fā)酵方法進行搖瓶發(fā)酵，定期取樣，以18％SDS-PAGE檢測目的基因的表達水平。
本發(fā)明的又一個目的是提供的非酰胺化ω-CTX M VIIA在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用。
本發(fā)明的特點是用基因工程技術(shù)，在畢赤酵母中成功地表達了非酰胺化的ω-CTX M VIIA；這種方法可以生產(chǎn)新型的非酰胺化的ω-CTX M VIIA，制備工藝簡單穩(wěn)定，每升發(fā)酵液可得到約36mg非酰胺化的ω-CTX M VIIA，生產(chǎn)成本較低；動物實驗證明這種新型的非酰胺化的ω-CTX M VIIA具有很高的鎮(zhèn)痛活性，其鎮(zhèn)痛效力大概是嗎啡的900倍(按摩爾鎮(zhèn)痛強度比較)，可用于鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)。
圖1、真核表達載體pPIC9-CTX的構(gòu)建。
圖2、PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析圖。
圖3、重組子的雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析圖。
圖4、克隆2測序結(jié)果。
圖5、PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖。
圖6、用SDS-PAGE篩選高表達菌株的電泳圖。
圖7、非酰胺化的ω-CTX M VIIA離子交換純化圖。
圖8、非酰胺化的ω-CTX M VIIA純化組分的SDS-PAGE圖。
圖9、ELISA鑒定目的蛋白非酰胺化的ω-CTX M VIIA。
圖10、MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析鑒定非酰胺化的ω-CTX M VIIA。
圖11、小鼠熱板鎮(zhèn)痛試驗用藥時間-痛域提高百分率折線圖。
圖12、大鼠熱尾試驗用藥時間-痛域提高百分率折線圖。
具體實施例方式
本發(fā)明結(jié)合實施例及附圖作進一步說明。
1.材料與方法1.1材料與試劑1.1.1菌株與質(zhì)粒畢赤酵母GS115、真核表達載體pPIC9購自Invitrogen公司。
1.1.2工具酶與化學試劑各種限制性內(nèi)切酶及其他工具酶購自上海生工公司，其他各種試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.1.3動物雌性NIH小鼠、雄性Sprague-Dawley大鼠均購自浙江省醫(yī)學科學院動物中心。
1.2方法1.2.1編碼ω-CTX M VIIA的DNA片段的設(shè)計與合成根據(jù)已知的ω-CTXMVIIA氨基酸序列，按畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計寡核苷酸片斷(CTX1和CTX2)，5’端添加Xho I酶切位點且磷酸化及編碼Lys-Arg的序列，3’端添加TAA終止密碼子及EcoR I酶切位點，由上海生工生物工程公司合成(見表1)。
表1、斜體有下劃線的序列為Xho I和EcoR I酶切位點，黑體為編碼Lys-Arg的序列，taa是終止密碼子。
將CTX1與CTX2等摩爾混合，加熱至90℃，自然冷卻至室溫，即形成編碼ω-CTX M VIIA的DNA片段。
1.2.2表達載體的構(gòu)建對畢赤酵母表達載體pPIC9進行Xho I/EcoR I雙酶切，將退火生成的編碼ω-CTX M VIIA的DNA片段連接到pPIC9上，構(gòu)建成重組表達質(zhì)粒pPIC9-CTX(參見圖1)，對其分別進行PCR和雙酶切鑒定。
1.2.3DNA測序送樣上海生工生物工程公司測定。
1.2.4畢赤酵母中表達載體的轉(zhuǎn)化取5～10μg去除了RNA的重組表達載體，經(jīng)Sal I單酶切線性化，乙醇沉淀回收后以電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，在MD和MM平板上篩選轉(zhuǎn)化子，所用電轉(zhuǎn)儀為Bio-Rad GenePulser，轉(zhuǎn)化條件為電壓1500V，電容25μF，電阻200Ω。
1.2.5重組轉(zhuǎn)化子的PCR法鑒定以重組酵母的基因組為模板，用AOX1-up和AOX1-down為引物，按照Invitrogen公司提供的操作手冊進行PCR。
1.2.6基因表達及高產(chǎn)菌株的篩選畢赤酵母基因表達宿主菌選用GS115，挑取單克隆Mut+型菌落，按照Invitrogen公司提供的操作手冊的GS115(Mut+)所介紹的發(fā)酵方法進行搖瓶發(fā)酵，定期取樣，以18％SDS-PAGE檢測目的基因的表達水平。
1.2.7表達產(chǎn)物濃度的測定按照Bradford法測定蛋白質(zhì)含量。
1.2.8表達產(chǎn)物的純化發(fā)酵液離心取上清，相對分子質(zhì)量為1000的透析袋對pH6.0的0.02M的乙酸鈉透析，透析液采用弱陽離子交換柱層析，收集分離峰進行電泳測定純度。
1.2.9 ELISA鑒定目的蛋白由于目的蛋白是小肽，分子量較小，故用常規(guī)的包被方法不能包被到酶標板上，故我們采用PLL交聯(lián)的方法包被極性小分子蛋白[4]。共設(shè)空白對照組、樣品組(高、中、低三個濃度)四組，每組含5個復孔。一抗為本實驗室自己制備的特異性抗ω-CTX MVIIA多抗，二抗則是辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗血清。TMB顯色系統(tǒng)顯色10min，0.5mol/LH2SO4終止反應，雙波長(450nm，630nm)測定OD值。
1.2.10非酰胺化的ω-CTX M VIIA的質(zhì)譜鑒定 將純化收集液凍干送至中科院上海生化細胞所，通過MALDI-TOF-MS做分子量鑒定。
1.2.11生物活性的檢測①經(jīng)典熱板鎮(zhèn)痛法檢測其生物學活性。健康雌性NIH小鼠，體重18～22g，調(diào)節(jié)恒溫水浴55±0.5℃，將小鼠置熱板上，挑選5～20s內(nèi)有舔后足動作或抬后足并回頭(痛覺反應)的動物為合格動物，該反應時間為藥前正常痛域值，挑選合格動物60只，隨機分成6組，采用側(cè)腦室給藥?？瞻讓φ战M給予等量生理鹽水，陽性對照組分別給予低劑量的嗎啡(25μg/kg)和高劑量的嗎啡(125μg/kg)，實驗組1、2、3分別給予1.5μg/kg、0.75μg/kg、0.25μg/kg的非酰胺化的ω-CTX M VIIA蛋白。藥后0.5h、1h、2h、3h重復上述測定，記錄痛覺反應時間。按公式計算痛域提高的百分率痛域提高百分率＝(用藥后平均痛域值T2-用藥前平均痛域值T1)/用藥前平均痛域值T1*100％。
②大鼠熱尾法(Hot-tail flick)檢測生物學活性。健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重250±20g，側(cè)腦室埋管，每日注射青霉素，飼養(yǎng)一周后進行藥理試驗。調(diào)節(jié)恒溫水浴55±0.5℃，給藥半小時測痛域。正常鼠痛域一般為2s，痛域5s為完全鎮(zhèn)痛。挑選合格動物30只，隨機分成6組，通過套管給藥。空白對照組給予等量生理鹽水，陽性對照組分別給予低劑量的嗎啡(25μg/kg)和高劑量的嗎啡(125μg/kg)，實驗組1、2、3分別給予2.0μg/kg、1.2μg/kg、0.4μg/kg的非酰胺化的ω-CTX M VIIA蛋白。給藥后0.5h、1h、2h、3h重復上述測定，記錄痛覺反應時間，按公式計算痛域提高的百分率，計算方法同前。
2結(jié)果2.1表達載體的構(gòu)建對畢赤酵母表達載體pPIC9進行Xho I/EcoR I雙酶切，將退火生成的編碼非酰胺化的ω-CTX M VIIA的基因片段連接到pPIC9上，構(gòu)建成重組表達質(zhì)粒pPIC9-CTX。對其分別進行PCR和雙酶切，用瓊脂糖電泳鑒定(參見圖2、3)，圖2中，1代表克隆1 PCR產(chǎn)物，2代表克隆2 PCR產(chǎn)物，3代表克隆3 PCR產(chǎn)物，4代表pPIC9 PCR產(chǎn)物，5代表pPIC9，M、小分子DNA分子量標準。圖3中1為克隆1雙酶切產(chǎn)物；2為克隆2雙酶切產(chǎn)物；3為克隆3雙酶切產(chǎn)物；4為pPIC9雙酶切產(chǎn)物；M為小分子DNA分子量標準。對克隆2 pPIC9-CTX測序結(jié)果表明編碼非酰胺化的ω-CTX MVIIA的DNA序列已正確的插入到pPIC9中，參見圖4，圖4為克隆2測序結(jié)果。DNA序列317 to 391，TGT AAA GGT AAA GGT GCT AAA TGT TCT CGT CTT ATGTAT GAT TGT TGT ACT GGT TCT TGT CGT TCT GGT AAA TGT，為編碼非酰胺化ω-CTX M VIIA的結(jié)構(gòu)基因。
2.2表達載體的轉(zhuǎn)化和鑒定通過電穿孔的方法共得到107個克隆，先后涂于MM、MD平板篩選Mut+型，有102個克隆在兩種平板上長勢較好，用來篩選高表達菌株。由PCR結(jié)果可知重組轉(zhuǎn)化子1、2均有一條帶與質(zhì)粒pPIC9-CTX一致，且還有一個在2200bp左右處的條帶，充分說明目的基因CTX已經(jīng)同源重組整合到酵母GS115基因組中為Mut+型，但是重組轉(zhuǎn)化子3在2200bp處沒有條帶，說明在轉(zhuǎn)化過程中，載體中AOX1的存在破壞了野生型AOX1基因，即為Muts型，參見圖5，圖5是PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖，左起1為質(zhì)粒pPIC9-CTX；2為重組轉(zhuǎn)化子1；3為重組轉(zhuǎn)化子2；4為重組轉(zhuǎn)化子3；M為DNA分子量標準。
2.3基因表達及高表達菌株的篩選各Mut+轉(zhuǎn)化子經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)96h后的上清經(jīng)18％SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)第6號克隆表達產(chǎn)物條帶顏色相對較深，初步定為高表達菌株，參見圖6，圖6是用SDS-PAGE篩選高表達菌株的電泳圖，左起1為重組轉(zhuǎn)化子1表達上清；2為重組轉(zhuǎn)化子2表達上清；3為重組轉(zhuǎn)化子3表達上清；4為重組轉(zhuǎn)化子4表達上清；5為重組轉(zhuǎn)化子5表達上清；6為重組轉(zhuǎn)化子6表達上清。采用Bradford法測定表達的非酰胺化的ω-CTXMVIIA蛋白產(chǎn)量，約為每升發(fā)酵液36mg。
2.4表達產(chǎn)物的純化電泳圖譜經(jīng)計算機灰度掃描，非酰胺化的ω-CTXMVIIA表達量約占畢赤酵母分泌總蛋白量的60％左右。表達上清經(jīng)透析除鹽后過弱陽離子交換柱，收集洗脫峰，參見圖7，其中——代表280nm的檢測曲線，-----為215nm的檢測曲線，……代表電導值檢測曲線。18％SDS-PAGE鑒定純化效果參見圖8，左起1為純化的非酰胺化的ω-CTX MVIIA；2為克隆6表達上清穿透液；3為克隆6表達上清；M為小分子蛋白分子量標準。
2.5 ELISA鑒定目的蛋白 純化產(chǎn)物經(jīng)ELISA分析其中含有目的蛋白非酰胺化的ω-CTX MVIIA(參見圖9)。隨著包被非酰胺化的ω-CTX M VIIA濃度的增高(設(shè)置低、中、高三種劑量)，OD值呈上升趨勢。
2.6 MALDI-TOF-MS分析結(jié)果 MALDI-TOF-MS結(jié)果顯示，通過酵母表達純化的非酰胺化的ω-CTX M VIIA分子量為2638.89Da(參見圖10)，與理論分子量2639.22Da符合，提示非酰胺化的ω-CTX M VIIA的6個巰基均被氧化成二硫鍵，且沒有被糖基化修飾。
2.7生物活性的檢測小鼠熱板鎮(zhèn)痛實驗及大鼠熱尾法均證實由酵母表達的非酰胺化的ω-CTX M VIIA具鎮(zhèn)痛效應(圖11，12)，圖11中Saline為生理鹽水組；Morphine(L)為低劑量嗎啡組(25μg/kg)；Morphine(H)為高劑量嗎啡組(125μg/kg)；CTX(L)為低劑量非酰胺化的ω-CTX M VIIA組(0.25μg/kg)；CTX(M)為中劑量非酰胺化的ω-CTX M VIIA組(0.75μg/kg)；CTX(H)為高劑量非酰胺化的ω-CTX M VIIA組(1.5μg/kg)。圖12中Saline為生理鹽水組；Morphine(L)為低劑量嗎啡組(25μg/kg)；Morphine(H)為高劑量嗎啡組(125μg/kg)；CTX(L)為低劑量非酰胺化的ω-CTX M VIIA組(0.4μg/kg)；CTX(M)為中劑量非酰胺化的ω-CTX M VIIA組(1.2μg/kg)；CTX(H)為高劑量非酰胺化的ω-CTX M VIIA組(2.0μg/kg)，且具有劑量依賴性。從上述動物實驗的劑量曲線估計，按摩爾鎮(zhèn)痛強度比較，這種非酰胺化的ω-CTX M VIIA的鎮(zhèn)痛效力是嗎啡的900倍(嗎啡分子量為285，非酰胺化ω-CTX M VIIA的分子量為2639)。
ω-CTX M VIIA作用于神經(jīng)組織N-型VSCC，具“低分子量，高活性，高專一性”特點，是神經(jīng)科學十分有效的探針，通過調(diào)節(jié)鈣濃度影響許多細胞過程，如神經(jīng)傳遞，激素分泌，離子通道與酶活性等。其無癮鎮(zhèn)痛和神經(jīng)保護的雙重效應使之在新一代鎮(zhèn)痛藥及神經(jīng)保護藥領(lǐng)域具廣闊應用前景。
ω-CTX M VIIA是由25個氨基酸組成的小肽，含三對二硫鍵，人工合成成本高、使三對二硫鍵正確配對的方法繁瑣；若采用基因工程方法直接真核表達則會大大降低成本，由于畢赤酵母存在翻譯后的修飾能力，在分泌過程中可以形成正確的二硫鍵配對。本實驗采用畢赤酵母表達體系利用了其相對于原核表達體系所無法比擬的優(yōu)點①用畢赤酵母體系，可以得到直接分泌的小肽；由于畢赤酵母自身分泌到培養(yǎng)基的蛋白很少，高分泌的外源蛋白易于分離純化；②具有翻譯后的修飾功能，可以直接得到活性產(chǎn)物；③具有完備的發(fā)酵方法，可以高密度連續(xù)培養(yǎng)，表達蛋白產(chǎn)量高。另外，我們實驗中還有一個大膽的嘗試將載體pPIC9信號肽切割位點后的GAGGCTGAAGCTTACGTA切掉而直接連接上目的基因，這樣表達出來的目的蛋白將不會帶任何多余的氨基酸，實踐證明該嘗試是成功的。
ω-CTX M VIIA在畢赤酵母中的表達至今尚未見報道，因為天然的ω-CTXM VIIA的羧基端是酰胺化的，而目前的基因工程方法所采用的原核或真核表達體系缺乏酰胺化的功能，因而無人進行這方面的嘗試。我們的發(fā)明表明用畢赤酵母直接分泌表達的非酰胺化的ω-CTX M VIIA，同樣具有強烈的鎮(zhèn)痛活性，其鎮(zhèn)痛效力是嗎啡的900倍(按摩爾鎮(zhèn)痛強度比較)；而且表達產(chǎn)量高，本研究采用搖瓶發(fā)酵已獲得較高的表達量，如果采用發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，其表達量將會達到更高的水平。
綜上所述，我們用基因工程技術(shù)，在畢赤酵母中成功地表達了非酰胺化的ω-CTX M VIIA；這種方法可以生產(chǎn)新型的非酰胺化的ω-CTX M VIIA，制備工藝簡單，每升發(fā)酵液可得到約36mg非酰胺化的ω-CTX M VIIA，生產(chǎn)成本較低；動物實驗證明這種新型的非酰胺化的ω-CTX M VIIA具有很高的鎮(zhèn)痛活性，可用于鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)。
無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應用本發(fā)明。因此，前面的實施方案應理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.非酰胺化ω-芋螺毒素M VIIA，其特征是具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，分子量為2639，該多肽分子中Cys1與Cys16、Cys8與Cys20、Cys15與Cys25分別形成三對二硫鍵，C-端為非酰胺化Cys。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非酰胺化ω-芋螺毒素M VIIA的制備方法，其特征是利用基因工程方法構(gòu)建ω-芋螺毒素MVIIA基因真核表達質(zhì)粒并發(fā)酵表達，通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)(1)編碼ω-CTX M VIIA的DNA片段的設(shè)計與合成根據(jù)已知的ω-CTXM VIIA氨基酸序列，按畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計寡核苷酸片斷CTX1和CTX2，5’端添加Xho I酶切位點及編碼Lys-Arg的序列并磷酸化，3’端添加TAA終止密碼子及EcoR I酶切位點；(2)表達載體的構(gòu)建對畢赤酵母表達載體pPIC9進行Xho I/EcoR I雙酶切，將退火生成的編碼非酰胺化的ω-CTX M VIIA的基因片段連接到pPIC9上，構(gòu)建成重組表達質(zhì)粒pPIC9-CTX，對其分別進行PCR和雙酶切，用瓊脂糖電泳鑒定，對克隆2pPIC9-CTX測序結(jié)果表明編碼非酰胺化的ω-CTX M VIIA的DNA序列已正確的插入到pPIC9中；(3)畢赤酵母中表達載體的轉(zhuǎn)化取5～10μg去除了RNA的重組表達載體，經(jīng)Sal I單酶切線性化，乙醇沉淀回收后以電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，在MD和MM平板上篩選轉(zhuǎn)化子，所用電轉(zhuǎn)儀為Bio-Rad GenePulser，轉(zhuǎn)化條件為電壓1500V，電容25μF，電阻200Ω；(4)基因表達畢赤酵母基因表達宿主菌選用GS115，挑取單克隆Mut+型菌落，按照Invitrogen公司提供的操作手冊所介紹的發(fā)酵方法進行搖瓶發(fā)酵，定期取樣，以18％SDS-PAGE檢測目的基因的表達水平。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非酰胺化的ω-芋螺毒素M VIIA在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供非酰胺化ω－芋螺毒素M VIIA(ω－CTX M VIIA)，是根據(jù)已知的ω－CTX M VIIA氨基酸序列，設(shè)計并合成編碼非酰胺化ω－CTX M VIIA的DNA片段，對表達載體pPIC9進行Xho I/EcoR I雙酶切，經(jīng)連接構(gòu)建成重組表達質(zhì)粒pPIC9－CTX，用電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母，經(jīng)篩選得到高產(chǎn)菌株，并由甲醇誘導表達。本發(fā)明在畢赤酵母中成功表達了非酰胺化的ω－CTX M VIIA，生產(chǎn)新型的非酰胺化的ω－CTX M VIIA，制備工藝簡單穩(wěn)定，生產(chǎn)成本較低。動物實驗證明具有很高的鎮(zhèn)痛活性，其鎮(zhèn)痛效力是嗎啡的900倍，可用于鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)。
文檔編號A61K38/17GK1740193SQ20051006078
公開日2006年3月1日 申請日期2005年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月15日
發(fā)明者詹金彪, 王峰 申請人:浙江大學