專(zhuān)利名稱(chēng)：小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物模型的復(fù)制方法，具體地說(shuō)是涉及小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法。
背景技術(shù)：
痛風(fēng)是嘌呤代謝紊亂或(和)尿酸排泄減少所引起的一組異質(zhì)性疾病。臨床上以高尿酸血癥為主要特征，高尿酸血癥是痛風(fēng)的生化基礎(chǔ)，而痛風(fēng)必然伴有高尿酸血癥。從本質(zhì)上說(shuō)，高尿酸血癥與痛風(fēng)之間并無(wú)嚴(yán)格界限。近年來(lái)研究痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制及其藥物治療成為醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)之一，目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏有關(guān)痛風(fēng)的成熟動(dòng)物模型，而構(gòu)建高尿酸血癥動(dòng)物疾病模型則是痛風(fēng)研究的前提?，F(xiàn)存模型中還有很多不完善的地方，從而給痛風(fēng)的研究帶來(lái)了極大的不便。下面對(duì)一些有代表性的小鼠高尿酸血癥動(dòng)物模型做簡(jiǎn)要介紹。
1.昆明種小鼠，雄性，體重20±2g。使用黃嘌呤600mg/kg和乙胺丁醇250mg/kg，次黃嘌呤600mg/kg和煙酸100mg/kg，ig給藥連續(xù)5天，造成小鼠高尿酸血癥模型。(金沈銳，鄭軍，劉紹唐.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究-小鼠高尿酸血癥模型初探[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，22(1)49～50.)2.昆明種小鼠，雌雄均可，體重20±2g，次黃嘌呤1000mg/kg，ip注射，造成小鼠高尿酸血癥模型。(唐燦，楊奎.高尿酸血癥動(dòng)物模型初探[J].中藥新藥與臨床藥理，2000，11(5)292～294.)3.昆明種小鼠，雌雄各半，體重22±2g。使用尿酸150～1000mg/kg，ip注射，造成小鼠高尿酸血癥模型。(陳光亮，孫秀霞，王欽茂等.小鼠高尿酸血癥模型的研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2001，17(3)350.)4.昆明種小鼠，雄性，體重28±2g。使用尿酸酶抑制劑氧嗪酸300mg/kg，ip注射，造成小鼠高尿酸血癥模型。(Iris HH，Scoville JP，Davide J，etal.Substituted cyclic im ides as potencial anti-gout agents[J].LifeSciences，1990，46(26)1923～1927.)5.昆明種小鼠，雌雄各半。使用酵母膏以15～30g/kg/d灌胃，連續(xù)灌胃1～2wk，復(fù)制出小鼠高尿酸血癥模型。(陳光亮，張清林，馬曉芹等.酵母致小鼠高尿酸血癥模型[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2003，19(4)467.)6.通過(guò)采用首先破壞小鼠尿酸氧化酶基因，再用基因重組法，獲得尿酸酶缺乏的突變小鼠，從而造成高尿酸血癥模型小鼠。(Wu-X.Hyperuricemia and uratenephropahty in urate oxidase-deficient mice[J].Proc Natl Acad Sci U.S.A.1994，91(2)742.)
尿酸不能被人體利用或在體內(nèi)分解，在正常人體液pH7.4的環(huán)境中呈尿酸鈉形式，溶解度417μmol/L(7mg/dl)(尹濰.高尿酸血癥和痛風(fēng)[J].醫(yī)師進(jìn)修雜志，1998，21(11)573)，故尿酸濃度必須高于該值才能被沉淀于組織中。采用給予大劑量嘌呤物質(zhì)，同時(shí)給予抑制尿酸排泄的藥物，即通過(guò)增加體內(nèi)尿酸的來(lái)路，并抑制尿酸排出體外，使血尿酸含量增加，造成小鼠的高尿酸血癥模型。此種模型接近于人類(lèi)高尿酸血癥及痛風(fēng)的產(chǎn)生機(jī)理，為研究痛風(fēng)和高尿酸血癥及評(píng)估治療用藥提供可行的研究方法。該模型必須結(jié)合嘌呤物質(zhì)和抑制尿酸排泄的藥物使用，如果單純大劑量連續(xù)給予小鼠嘌呤物質(zhì)，血尿酸以5天為高，且10天血尿酸反而下降。而且該模型所形成的高尿酸水平遠(yuǎn)低于結(jié)晶沉積的濃度。一次直接注射次黃嘌呤，也可以復(fù)制高尿酸血癥動(dòng)物模型，受試動(dòng)物在1h血尿酸濃度達(dá)到631.5±72.99μmol/L(相當(dāng)于10.5mg/dl)，2h即迅速下降到飽和濃度以下，維持時(shí)間短。而腹腔注射尿酸也僅有1000mg/kg的劑量在40min可使小鼠尿酸水平達(dá)到450μmol/L(相當(dāng)于7.5mg/dl)左右，其余劑量在各點(diǎn)的尿酸值均不能達(dá)到尿酸沉積的飽和濃度，維持時(shí)間很短。這是由于哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在尿酸酶，可以將體內(nèi)尿酸進(jìn)一步分解，排出體外，故選用尿酸酶抑制劑氧嗪酸抑制尿酸酶活性，從而抑制尿酸分解。氧嗪酸可極顯著地提高小鼠血清尿酸水平，血尿酸值可達(dá)6.72±0.08mg/dl，造成小鼠高尿酸血癥模型，其血清高尿酸水平能維持5h。(喻志峰，楊澄，仇熙.瑞香苷對(duì)高尿酸血癥小鼠的影響[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，33(2)142～145)，該方法靈敏簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，在國(guó)際上已普遍用此評(píng)價(jià)藥物的抗高尿酸血癥和痛風(fēng)作用。(James J，Carroll，Holly Coburn，et al.Asimplified alkaline phosphotungstate assay for uric acid inserum[J].Clinical Chemistry，1997，17(3)158～160)，但氧嗪酸所致的高尿酸水平尚未超過(guò)7mg/dl，雖能維持5h，但是達(dá)不到尿酸鹽沉積的水平，因此還不能形成痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。使用基因突變法復(fù)制動(dòng)物模型，該方法使半數(shù)以上突變小鼠不能存活4周以上，且文獻(xiàn)對(duì)此法也未有定論，更見(jiàn)此模型的難度。
發(fā)明內(nèi)容
1.發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供一種更加符合臨床的小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法，并使該小鼠模型的高尿酸水平升高到飽和濃度并且能維持足夠的時(shí)間。
2.技術(shù)方案2.1動(dòng)物小鼠。種屬昆明種、ICR。體重16g以上。
2.2造模藥物名稱(chēng)嘌呤類(lèi)次黃嘌呤、黃嘌呤。尿酸酶抑制劑Oxonic acid，potassium salt(OA)、allantoxanamide。
給藥途徑灌胃、皮下注射、腹腔注射。
給藥劑量嘌呤類(lèi)100～1500mg·kg-1尿酸酶抑制劑10～1500mg·kg-1溶劑生理鹽水、液體石蠟、CMC-Na、油、可溶性淀粉。
配制要求混懸劑的配制一定要濃度均勻，使用時(shí)要搖勻。
2.3小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法，該方法是選取昆明種、ICR健康小鼠，雌性或雄性，體重18～35g，禁食、不禁食均可，于室溫下，用灌胃、皮下注射或腹腔注射方式對(duì)小鼠同時(shí)給予嘌呤類(lèi)和尿酸酶抑制劑，造模后可自由進(jìn)食、飲水。
上述的嘌呤類(lèi)為次黃嘌呤、黃嘌呤，其用量為100～1500mg·kg-1；上述的尿酸酶抑制劑為OA、allantoxanamide，其用量為10～1500mg·kg-1。
上述嘌呤類(lèi)的最佳用量為500 mg·kg-1，尿酸酶抑制劑的最佳用量為50mg·kg-1。
3.有益效果在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用尿酸酶抑制劑配合嘌呤類(lèi)，1h即可獲得穩(wěn)定的小鼠高尿酸血癥模型。動(dòng)物的血尿酸水平可顯著的提高，高于尿酸產(chǎn)生結(jié)晶的飽和濃度417μmol·L-1，該水平可維持7h以上。這與高尿酸血癥的發(fā)生機(jī)制吻合，增加動(dòng)物體內(nèi)嘌呤類(lèi)以增加生成尿酸的原料，同時(shí)使用尿酸酶抑制劑抑制對(duì)尿酸的分解，以此減少尿酸的去路，兩者協(xié)同，從而明顯提高血尿酸水平，且高尿酸水平維持時(shí)間明顯延長(zhǎng)。可見(jiàn)，嘌呤類(lèi)和尿酸酶抑制劑配合使用，是復(fù)制出高尿酸血癥模型的理想組合。為復(fù)制持續(xù)性高尿酸血癥模型進(jìn)而復(fù)制痛風(fēng)模型提供了有價(jià)值的參考。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法，其方法如下選用昆明種小鼠，雄性，20g±2g，在室溫下，用灌胃方式，灌次黃嘌呤1000mg·kg-1，用腹腔注射方式，注射OA 100mg·kg-1。
實(shí)施例2.小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法，其方法如下選用昆明種小鼠，雄性，20g±2g，在室溫下，用灌胃方式，灌次黃嘌呤1000mg·kg-1，用腹腔注射方式，注射OA 600mg·kg-1。
實(shí)施例3.小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法，其方法如下
選用昆明種小鼠，雄性，20g±2g，在室溫下，用灌胃方式，灌次黃嘌呤1000mg·kg-1，用皮下注射方式，注射OA 100mg·kg-1。
實(shí)施例4.小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法，其方法如下選用昆明種小鼠，雄性，20g±2g，在室溫下，用灌胃方式，灌次黃嘌呤1000mg·kg-1，用皮下注射方式，注射OA 600mg·kg-1。
實(shí)施例5.小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法，其方法如下選取昆明小鼠，雄性，20g±2g，在室溫下，用腹腔注射方式，注射次黃嘌呤1000mg·kg-1；用皮下注射方式，注射OA 1000mg·kg-1。
實(shí)施例6.小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法，其方法如下選取昆明小鼠，雄性，20g±2g，在室溫下，用腹腔注射方式，注射次黃嘌呤1000mg·kg-1；用皮下注射方式，注射OA 400mg·kg-1。
實(shí)施例7.小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法，其方法如下選取昆明小鼠，雄性，20g±2g，在室溫下，用腹腔注射方式，注射次黃嘌呤500mg·kg-1；用皮下注射方式，注射OA 400mg·kg-1。
實(shí)施例8.小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法，其方法如下選取昆明小鼠，雄性，20g±2g，在室溫下，用腹腔注射方式，注射次黃嘌呤500mg·kg-1；用皮下注射方式，注射OA 100mg·kg-1。
實(shí)施例9.小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法，其方法如下選取昆明小鼠，雄性，20g±2g，在室溫下，用腹腔注射方式，注射次黃嘌呤500mg·kg-1；用皮下注射方式，注射OA 50mg·kg-1。
實(shí)施例10.小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法，其方法如下選取昆明小鼠，雄性，20g±2g，在室溫下，用腹腔注射方式，注射次黃嘌呤250mg·kg-1；用皮下注射方式，注射OA 50mg·kg-1。
實(shí)施例11.小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法，其方法如下選取昆明種小鼠，雌雄各半，20g±2g，在室溫下，用腹腔注射方式，注射次黃嘌呤500mg·kg-1；用皮下注射方式，注射OA 50mg·kg-1。
實(shí)施例12.小鼠急性高尿酸血癥模型在抗痛風(fēng)藥研究中的運(yùn)用。
1.實(shí)驗(yàn)材料1.1動(dòng)物昆明種小鼠，雄性，20g±2g。由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)許可證號(hào)SYXK(蘇)2002-0002。
1.2藥物Oxonic acid，potassium salt(OA)，sigma-Aldrich公司；次黃嘌呤(Hypoxanthine，HX)，天津市北洋化工廠；均用油作為溶劑，配制時(shí)先加少許油，放入研缽研勻后，在將剩余油加入。加味四妙方(簡(jiǎn)稱(chēng)全方)，4g生藥/ml；加味四妙方有效部位群(簡(jiǎn)稱(chēng)A方)4g生藥/ml；由南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室提供。別嘌醇片100mg/片，配成2.75mg/ml的濃度，上海延安萬(wàn)象藥業(yè)股份有限公司。尿酸試劑盒，為Sysmex公司產(chǎn)品。
1.3儀器日立7020全自動(dòng)生化分析儀。
2.方法與結(jié)果2.1不同途徑、不同劑量(OA)對(duì)小鼠血尿酸水平的影響 將40只小鼠隨機(jī)分為5組，正常對(duì)照組、模型I組、模型II組、模型III組、模型IV組，每組8只。模型I組灌胃HX 1000 mg·kg-1+腹腔注射OA 100mg·kg-1，模型II組灌胃HX 1000mg·kg-1+腹腔注射OA 600mg·kg-1，模型III組灌胃HX 1000mg·kg-1+皮下注射OA100mg·kg-1，模型IV組灌胃HX 1000mg·kg-1+皮下注射OA 600mg·kg-1，分別于造模后2h、5h取血，離心取血清，測(cè)血尿酸值。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1不同途徑、不同劑量OA對(duì)小鼠血尿酸水平的影響(X±S)(n＝8)
與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型I組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
結(jié)果顯示，在造模后2h，模型IV組血尿酸值與正常對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.01)。模型I組、模型II組、模型III組與正常對(duì)照組血尿酸水平均無(wú)差異。說(shuō)明在不改變次黃嘌呤用量和給藥途徑的前提下，通過(guò)皮下注射途徑給予一定劑量OA，可升高小鼠血清尿酸水平，但維持時(shí)間較短。
2.2 HX與OA合用對(duì)小鼠血尿酸水平的影響 將64只小鼠隨機(jī)分為8組，正常對(duì)照組、模型I組、模型II組、模型III組、模型IV組、模型V組、模型VI組、模型VIII組，每組6只。HX采用腹腔注射，0A采用皮下注射。劑量見(jiàn)表2。分別于造模后1h、3h取血，離心取血清，測(cè)血尿酸值。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 HX與OA合用對(duì)小鼠血尿酸的影響(X±S)(n＝6)
與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型I組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
結(jié)果表明，在采用不同劑量造模1h、3h后，各組血尿酸水平均高于正常對(duì)照組，模型VII組在造模后1h、模型I組在造模后3h與對(duì)照組有一定的差異(P＜0.05)，其余各組在各點(diǎn)均與對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.01)；除了模型VII組，各組在造模后3h均與模型I組有顯著性差異(P＜0.01)。上述結(jié)果表明只給予HX雖可升高小鼠血清尿酸水平，但維持時(shí)間較短，給藥3h后血清尿酸水平已明顯降低，因此不利于進(jìn)行抗高尿酸血癥藥物的研究。而如果將HX和OA配合使用，則不僅可以升高小鼠的血尿酸水平，還可以維持3h以上。從表2來(lái)看，采用HX250mg·kg-1和OA 50mg·kg-1的劑量組即可獲得較為穩(wěn)定的小鼠高尿酸血癥模型。但如維持OA劑量不變，將HX劑量增加一倍，則可使小鼠尿酸值顯著提高，達(dá)到600μmol·L-1以上。因此，我們認(rèn)為采用HX500mg·kg-1和OA 50mg·kg-1的劑量組是復(fù)制穩(wěn)定的小鼠急性高尿酸血癥模型的最佳劑量組合。
2.3觀察加味四妙方有效部位群的降尿酸作用 將小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性組、全方組、A方組等5組，每組8只，分別灌胃給藥，空白組和模型組給予等體積生理鹽水。連續(xù)三天。第三天給藥后1h，除空白組外，給各組小鼠腹腔注射HX5mg/10g(0.2ml/10g)+皮下注射OA 0.5mg/10g(0.1ml/10g)?？瞻捉M腹腔和皮下給予等體積油。于造模后1h、3h，給小鼠取血0.3ml，離心，取血清，測(cè)血尿酸值。結(jié)果見(jiàn)表3。
表3加味四妙方有效部位群對(duì)小鼠血尿酸的影響(X±S)(n＝8)
與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
結(jié)果表明，在造模后1h、3h后，模型組血尿酸水平顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，造模1h尿酸值達(dá)到最高點(diǎn)，3h時(shí)血尿酸值仍遠(yuǎn)高于尿酸產(chǎn)生結(jié)晶的飽和濃度。陽(yáng)性組及加味四妙方有效部位群組在兩測(cè)試點(diǎn)處均有顯著的降尿酸作用(P＜0.01)。提示雖然在造模后，動(dòng)物血尿酸值可達(dá)到1000μmol·L-1以上，但該模型的血尿酸高度并非不可逆轉(zhuǎn)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，給予受試藥物后，能明顯看出藥物對(duì)模型動(dòng)物具有降尿酸的作用。表明該模型在藥理實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的可行性。
綜上所述，選擇適宜的造模藥物，制定出恰當(dāng)?shù)慕o藥劑量、給藥時(shí)間、給藥方式，復(fù)制出更接近于人類(lèi)嘌呤代謝障礙所形成的小鼠高尿酸血癥模型，將會(huì)使我們深入觀察受試藥物對(duì)模型動(dòng)物腎臟尿酸排出的影響、對(duì)嘌呤代謝的作用環(huán)節(jié)以及對(duì)尿酸鹽沉積于關(guān)節(jié)腔過(guò)程的影響成為可能，從而為抗痛風(fēng)藥物的篩選和作用機(jī)理的研究提供必要和可靠的動(dòng)物模型。
權(quán)利要求
1.一種小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法，其特征在于它是選取昆明種或ICR健康小鼠，雌性或雄性，體重16g-35g，禁食或不禁食，于室溫下，用罐胃，皮下注射或腹腔注射方式對(duì)小鼠同時(shí)給予嘌呤和尿酸酶抑制劑，造模后可自由進(jìn)食、飲水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)制方法，其特征在于所述的嘌呤類(lèi)為次黃嘌呤、黃嘌呤，所述的尿酸酶抑制劑為Potassium salt(OA)、allantoxanamide。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)制方法，其特征在于嘌呤類(lèi)的用量為100～1500mg·kg-1，尿酸酶抑制劑的用量為10～1500mg·kg-1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的復(fù)制方法，其特征在于嘌呤類(lèi)的最佳用量為500mg·kg-1，尿酸酶抑制劑的最佳用量為50mg·kg-1。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法，該方法是選取昆明種、ICR健康小鼠，雌性或雄性，體重16g－35g，禁食或不禁食，于室溫下，用罐胃，皮下注射或腹腔注射方式，對(duì)小鼠同時(shí)給予嘌呤類(lèi)，即次黃嘌呤或黃嘌呤100～1500mg·kg
文檔編號(hào)A61K49/00GK1698907SQ20051004039
公開(kāi)日2005年11月23日 申請(qǐng)日期2005年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月6日
發(fā)明者徐立, 時(shí)樂(lè) 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)