專利名稱：一種倍半萜側扁軟柳珊瑚酮及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的倍半萜側扁軟柳珊瑚酮，還涉及其制備方法以及它在抑制癌細胞生長方面的應用。
背景技術：
側扁軟柳珊瑚Subergorgia suberosa中富含倍半萜，據(jù)文獻報道到目前為止國內(nèi)外科研工作者已從世界不同水域的側扁軟柳珊瑚中分離到12個倍半萜和5個甾醇，并開展了一系列細胞毒性的篩選，發(fā)現(xiàn)其中部分倍半萜對人肺腺癌細胞系P-388、A549、HT-29細胞株和宮頸癌HeLa細胞株顯示潛在的細胞毒性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于從側扁軟柳珊瑚中分離出一個新的對癌細胞有強抑制作用的倍半萜，另一個目的是提供該倍半萜的制備方法，進一步的目的是提供該倍半萜在制備抗癌藥物中的應用。
本發(fā)明通過多種常壓柱層析及一維、二維核磁共振波譜，從南海側扁軟柳珊瑚中分離得到一個新的倍半萜側扁軟柳珊瑚酮，這個倍半萜對人乳腺癌細胞株、肺癌和肝癌細胞株等都有不同程度的抑制作用，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的倍半萜側扁軟柳珊瑚酮由式(1)表示 式(1)結構鑒定通式(1)的化合物，其ESIMS譜在m/z 369[M-H]-處顯示準分子離子峰，結合高分辨HRESIMS和13C NMR(DEPT)譜，推出其分子式為C20H26N4O3。其13C NMR(DEPT)譜顯示20個碳信號，包括15個基本骨架碳[3個甲基(δc16.7，27.0，34.4)、5個亞甲基(δc40.8，41.3，27.0，27.9，48.5)、4個次甲基(δc44.0，52.4，36.6，49.7)、2個季碳(δc56.7，39.7)和一個酮基(δc216.5，s)]及5個低場碳[δc108.1(s)，140.6(d)，150.2(s)，151.9(s)，155.8(s)]。1H NMR譜顯示3個甲基[δH0.80(3H，d，J＝7.0Hz)，1.14(3H，s)，1.16(3H，s)]和一個烯氫[δH7.91(1H，s)]。這些NMR數(shù)據(jù)和參考文獻報道的化合物suberosenone和suberosanone(參考文獻1.Bokesch H R，McKee T C，Cardellina J H，BoydM R.Suberosenone，a new cytotoxin from Subergorgia suberosa.Tetrahedron Letters，1996，373259-3262；2.Sheu J H，Hung K C，Wang G H，Duh C Y.New cytotoxicsesquiterpenes from the gorgonian Isis hippuris.J Nat Prod，2000，631603-1607.)很相似，只是多出5個低場碳。以上數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的倍半萜側扁軟柳珊瑚酮是一個類似于suberosenone的倍半萜，同時連有一個五碳芳香含氮雜環(huán)化合物作為側鏈。
根據(jù)其HMBC譜、不飽和度、分子量以及與文獻(于德泉，楊峻山.分析化學手冊第七分冊.北京化學工業(yè)出版社，1999.)中的NMR數(shù)據(jù)對照，推測該五碳芳香含氮雜環(huán)化合物應是6′，8′-二羥基嘌呤。在HMBC譜中，δH4.46(1H，dd，J＝4.6，14.3Hz，H-6a)，4.25(1H，dd，J＝9.0，14.1Hz，H-6b)和δc150.2(s，C-4′)，151.9(s，C-8′)相關，這說明6′，8′-二羥基嘌呤通過C-N鍵和suberosenone部分上的C-6[δc41.3(t)]相連。在NOESY譜中，H-5和H-2及Me-7相關，但H-11不和H-12相關，這表明H-2，Me-7及H-11在六員環(huán)的同一面，并且為α-構型，因為C-12亞甲基在C-1的β-位置上。綜上所述，本發(fā)明的倍半萜側扁軟柳珊瑚酮的結構由式(1)表示。
本發(fā)明的倍半萜側扁軟柳珊瑚酮的制備方法，其特征是側扁軟柳珊瑚用有機溶劑提取，所述的有機溶劑可以是甲醇、乙醇、二氯甲烷、甲醇-二氯甲烷或乙醇-二氯甲烷等，將提取液減壓濃縮得粗提取物，將粗提取物懸溶于水，用氯仿或乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得氯仿層或乙酸乙酯層，將氯仿層或乙酸乙酯層進行常壓硅膠柱層析，用兩種有機溶劑的混合系統(tǒng)例如氯仿-丙酮、氯仿-乙酸乙酯、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯等溶劑系統(tǒng)為洗脫劑進行梯度洗脫，薄層層析TLC追蹤合并組分；將在TLC上能用體積比9∶1的氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)展開的組分用氯仿-甲醇或氯仿-丙酮溶劑系統(tǒng)梯度沖洗，得式(1)化合物的粗品，將該粗品純化得純的式(1)化合物，純化方法采用通常的方法，如重結晶、過柱等。該化合物在紫外燈254nm波長下有紫外吸收，用氯仿-甲醇體積比為9∶1的溶劑系統(tǒng)展開時Rf值約為0.65。
本發(fā)明的倍半萜側扁軟柳珊瑚酮在制備治療乳腺癌、白血病、口腔癌、肝癌和肺癌的抗癌藥物中的應用。
通過體外活性定量篩選，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的倍半萜側扁軟柳珊瑚酮對人乳腺癌細胞株MDA-MB-231的生長有強抑制作用，其半數(shù)抑制率IC50為8.87μg/mL，通過體外活性定性篩選，發(fā)現(xiàn)倍半萜側扁軟柳珊瑚酮在100μmol/L和50μmol/L濃度下對人乳腺癌細胞株MCF-7也具有明顯的抑制效應；此外，倍半萜側扁軟柳珊瑚酮對小鼠淋巴細胞白血病L1210、人口腔癌KB細胞系、肺癌和肝癌細胞株等也分別顯示不同程度的潛在的抑制作用。
圖1倍半萜側扁軟柳珊瑚酮對人乳腺癌細胞株MDA-mB-231的抑制作用，其中Qi4表示側扁軟柳珊瑚酮。
具體實施例方式
以下的實施例是對本發(fā)明的進一步說明，但本發(fā)明不限于下述實施例。
實施例1倍半萜側扁軟柳珊瑚酮的制備以濕重3Kg的側扁軟柳珊瑚為原料，冷凍干燥切碎后用乙醇和二氯甲烷(體積比2∶1)的混合有機溶劑(約20升)提取3次，將提取液減壓濃縮得粗提取物，將粗提取物懸溶于水，依次用氯仿萃取3次(每次600mL)，減壓濃縮得氯仿層50克。用氯仿和甲醇的混合溶劑將氯仿層溶解拌硅膠，用約2500毫升氯仿拌約900克硅膠進行濕法裝柱，以氯仿-丙酮(2000mL體積比從100∶0到0∶100變化)溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，薄層層析TLC(GF254)追蹤合并得8個組分。將在TLC(GF254)上能用氯仿-甲醇體積比9∶1溶劑系統(tǒng)展開的組分用氯仿-甲醇(800mL體積比從12∶1到10∶2變化)溶劑系統(tǒng)梯度沖洗，得式(1)化合物的粗品，將該粗品用氯仿-甲醇的混合溶劑重結晶，得純的式(1)化合物，該化合物在紫外燈254nm波長下有紫外吸收，用氯仿-甲醇體積比9∶1的溶劑系統(tǒng)展開時Rf值約為0.65。其光譜數(shù)據(jù)如下1H NMR(500MHz，CDCl3)δH2.40(1H，m，H-2)，2.50(2H，m，H-3)，3.32(1H，dd，J＝4.4，8.3Hz，H-5)，4.46(1H，dd，J＝4.6Hz，14.3，H-6a)，4.25(1H，dd，J＝9.0，14.1Hz，H-6b)，0.80(3H，d，J＝7.0Hz，H-7)，1.54(1H，m，H-8)，1.87，1.19(each1H，m，H-9)，1.59(2H，m，H-10)，1.77(1H，m，H-11)，1.69，1.65(each 1H，d，J＝14.7Hz，H-12)，1.14(3H，s，Me-14)，1.16(3H，s，Me-15)，7.91(1H，s，H-2’).13C NMR(125MHz，CDCl3)δC56.7(s，C-1)，44.0(d，C-2)，40.8(t，C-3)，216.5(s，C-4)，52.4(d，C-5)，41.3(t，C-6)，16.7(q，C-7)，36.6(d，C-8)，27.0(t，C-9)，27.9(t，C-10)，49.7(d，C-11)，48.5(t，C-12)，39.7(s，C-13)，27.0(q，C-14)，34.4(q，C-15)，140.6(d，C-2’)，150.2(s，C-4’)，108.1(s，C-5’)，155.8(s，C-6’)，151.9(s，C-8’).Negative-ion ESIMS m/z369[M-1]-，實施例2體外活性定性篩選實驗ER和PR雙陰性的人乳腺癌細胞株MDA-mB-231及ER和PR雙陽性的人乳腺癌細胞株MCF-7購自美國ATCC。將人乳腺癌細胞株MDA-mB-231細胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清、1×105U/L青霉素、100mg/L鏈霉素、2g NaHCO3和0.3g谷胺酰胺的RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)，人乳腺癌細胞株MCF-7細胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清、1×105U/L青霉素、100mg/L鏈霉素、2g NaHCO3和0.3g谷胺酰胺的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)液內(nèi)(DMEM；Gibeo BRL Grand Island，NY)，飽和濕度、37℃和5％CO2濃度下培養(yǎng)至對數(shù)生長期和80％融合度后，以0.25％胰酶溶液消化，用含10％新生牛血清(Gibeo BRL)的相應培養(yǎng)液制成單細胞懸液，進行細胞計數(shù)后，將細胞濃度調(diào)整為5×107個細胞/L，以每孔100μL接種于96孔板，培養(yǎng)24h。將已貼壁的細胞分組，每組3個平行孔。一組為不加藥組，其余組加入100.000μmol/L和50μmol/L的供試藥物，同時以不接種細胞、只加100μL培養(yǎng)液的孔作空白對照。然后將細胞置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48～72h。稀釋后顯微鏡下觀察加藥組有明顯的細胞生長抑制作用。
實施例3體外活性定量篩選實驗將人乳腺癌細胞株MDA-mB-231細胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清、1×105U/L青霉素、100mg/L鏈霉素、2g NaHCO3和0.3g谷胺酰胺的RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)，人乳腺癌細胞株MCF-7細胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清、1×105U/L青霉素、100mg/L鏈霉素、2g NaHCO3和0.3g谷胺酰胺的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)液內(nèi)(DMEM；Gibeo BRL Grand Island，NY)，飽和濕度、37℃和5％CO2濃度下培養(yǎng)至對數(shù)生長期和80％融合度后，以0.25％胰酶溶液消化，用含10％新生牛血清(Gibeo BRL)的相應培養(yǎng)液制成單細胞懸液，進行細胞計數(shù)后，將細胞濃度調(diào)整為5×104個細胞/mL，以每孔100μL接種于96孔板，培養(yǎng)24h。將已貼壁的細胞分組，每組2個平行孔。一組為不加藥組，其余組分別加入100.000μmol/L、33.333μmol/L、11.111μmol/L、3.704μmol/L、1.235μmol/L、0.412μmol/L、0.137μmol/L、0.046μmol/L的倍半萜側扁軟柳珊瑚酮，同時以不接種細胞、只加100μL培養(yǎng)液的孔作空白對照。然后將細胞置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48-72h。每孔加20μL 5mg/mL四氮唑(MTT)無血清培養(yǎng)液，37℃下培養(yǎng)4h后去掉上清液，加入100μL DMSO，在自動酶標儀(DYNEX Technologies，Chantilly，VA)上570nm波長處測定光吸收值(OD)，并按下式計算細胞生長率細胞生長率＝(實驗組OD÷對照組OD)×100％。實驗結果見表1和圖1。
表1 倍半萜側扁軟柳珊瑚酮對于人乳腺癌細胞株MDA-MB-231生長的抑制作用
權利要求
1.下述式(1)的化合物 式(1)
2.權利要求1的化合物的制備方法，其特征是側扁軟柳珊瑚用有機溶劑提取，將提取液減壓濃縮得粗提取物，將粗提取物懸溶于水，用氯仿或乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得萃取有機溶劑層，將有機溶劑層進行常壓硅膠柱層析，用兩種有機溶劑的混合系統(tǒng)為洗脫劑進行梯度洗脫，薄層層析追蹤合并組分；將在薄層層析上能用體積比9∶1的氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)展開的組分用氯仿-甲醇或氯仿-丙酮溶劑系統(tǒng)梯度沖洗，得式(1)化合物的粗品，將該粗品純化得純的式(1)化合物。
3.權利要求1的化合物在制備治療乳腺癌、白血病、口腔癌、肝癌和肺癌的抗癌藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及從南海側扁軟柳珊瑚分離得到的新的式(1)倍半萜側扁軟柳珊瑚酮。本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法，以及該化合物在治療乳腺癌、白血病、口腔癌、肝癌和肺癌中的應用。實驗證明本發(fā)明化合物對上述癌細胞生長有明顯的抑制作用。
文檔編號A61K31/519GK1837206SQ20051003370
公開日2006年9月27日 申請日期2005年3月24日 優(yōu)先權日2005年3月24日
發(fā)明者漆淑華, 張偲, 李翔 申請人:中國科學院南海海洋研究所