專利名稱：熱休克蛋白27在制備血清學(xué)判別、診斷肝癌藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種熱休克蛋白27的醫(yī)用用途，具體涉及熱休克蛋白27在制備血清學(xué)判別、診斷肝癌藥物中的用途。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是一種多基因參與的復(fù)雜疾病。其基因表達分析涉及轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組學(xué)方法。由于蛋白質(zhì)的表達或功能從轉(zhuǎn)錄到翻譯間有多點調(diào)控，轉(zhuǎn)錄的mRNA豐度與翻譯的蛋白質(zhì)數(shù)量間相關(guān)不明顯，因此用蛋白質(zhì)組學(xué)方法從整體上研究腫瘤地發(fā)病機制，尋找腫瘤診斷和預(yù)后地特異性標記以及藥物治療的靶標已成為近期研究的熱點(Lancet Oncol，2001，2(11)698-704；BMJ.2000，320424-7)。
腫瘤標志物通常是指腫瘤組織自身特有的可反映腫瘤存在和生長的物質(zhì)，可在腫瘤患者組織、體液和排泄物中檢出?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的腫瘤標志物包括腫瘤特異性抗原及相關(guān)抗原、激素類受體、酶類、癌基因、抗癌基因及其產(chǎn)物等。理想的腫瘤標志物應(yīng)具備1)唯腫瘤細胞所特有，不存在于正常或非癌組織中；2)與腫瘤的大小、分期及治療預(yù)后和轉(zhuǎn)歸有關(guān)；3)可采用高靈敏的方法可定性或定量地檢測。
肝癌已成為目前我國癌癥病人死亡第二位的原因，全世界45％的原發(fā)性肝癌發(fā)生在我國。目前仍以外科手術(shù)為首選和主要治療方案。術(shù)后總體5年生存率只有62.9％，大肝癌術(shù)后5年生存率僅為34.6％。目前臨床主要依靠定期復(fù)查AFP、異常凝血酶原、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和B超，加上CT等高分辨的影像學(xué)診斷。由于AFP的診斷陽性率僅為56％，故AFP異質(zhì)體、血清AFP mRNA、異常凝血酶原、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶均用于肝癌診斷的補充，同時涉及胃腸道腫瘤的相關(guān)抗原，如CEA、CA199的輔助診斷。近來的研究顯示，血清CK19、ICAM、E-selectin，VAGF等亦可用于AFP陰性病人的鑒別診斷。發(fā)現(xiàn)具有預(yù)測、診斷價值的新型原發(fā)性肝癌標志物的研究十分必要。
HCC常表現(xiàn)為早期的血管侵犯，包膜侵犯和肝內(nèi)、肝外的轉(zhuǎn)移。盡管采取了免疫治療、預(yù)防性TAE、中藥治療等手段來預(yù)防肝癌切除術(shù)后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，但總體術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍高達61.5％，即使是小肝癌術(shù)后5年復(fù)發(fā)率也高達45.5％。目前臨床主要依靠定期復(fù)查AFP、異常凝血酶原、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和B超來發(fā)現(xiàn)術(shù)后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，但應(yīng)用于肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測和判斷仍有相當?shù)睦щy。判斷腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的危險性和早期診斷轉(zhuǎn)移的發(fā)生，并采取有效的手段預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，誘發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移休眠狀態(tài)或延遲轉(zhuǎn)移的發(fā)生，成為當前肝癌研究的主要課題之一。
蛋白質(zhì)組學(xué)研究涉及蛋白質(zhì)表達模式研究和進一步的功能研究，目前以前者研究較為集中。高通量的蛋白質(zhì)表達研究技術(shù)主要有蛋白質(zhì)的分離、鑒定技術(shù)和生物信息學(xué)。蛋白質(zhì)的鑒定技術(shù)主要為質(zhì)譜法(MS)，即利用樣品離子化后，離子間的質(zhì)荷比(m/z)的差異來分析確定樣品的分子質(zhì)量。常用的有兩種，即電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)。生物技術(shù)的發(fā)展對新的腫瘤標志物的發(fā)現(xiàn)起了非常的作用，2D電泳結(jié)合MS、高壓液相分析(HPLC)、表面增強激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)，LC-MS-MS等技術(shù)使人們可以從蛋白質(zhì)水平分析潛在的腫瘤標志物，從而使新標志物的發(fā)現(xiàn)提升到一個更高的水平(DDT 2003，8(10)4411-44316；Lancet，2002，359(16)572-577；.Proteomics，2001，1，1205-1215)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的的目的是提供一種熱休克蛋白27的醫(yī)用用途，具體涉及熱休克蛋白27在制備血清學(xué)判別、診斷肝癌藥物中的用途。
本發(fā)明涉及的熱休克蛋白27(Heat shock protein 27)簡稱HSP27(王萬銀HSP27研究現(xiàn)狀.國外醫(yī)學(xué)生理病理科學(xué)與臨床分冊.2001，21467-469；KingKL，Li AF，Chau GY，et al.Prognostic significance of heat shock protein-27expression in hepatocellular carcinoma and its relation to histologic grading andsurvival.Cancer，2000，88(11)2464-2470)。
本發(fā)明應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對動物模型實驗，比較研究了不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌裸鼠模型LCID20和LCID35的全蛋白表達譜，結(jié)果表明HSP27高表達；免疫組織化學(xué)檢測有轉(zhuǎn)移的和未發(fā)生轉(zhuǎn)移的HCC組織蛋白，結(jié)果顯示HSP27定位于肝細胞胞漿內(nèi)，驗證了其表達水平的高低與肝癌轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)；血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在存在的差異性蛋白質(zhì)中，HSP27為肝癌特有；血清的WesternBlot鑒定結(jié)果顯示HCC病人血清有較強的HSP27(100％，20/20)；血清雙盲法驗證，正常人血清不顯示HSP27(0/10)，HCC患者陽性率為100％(30/30)。
結(jié)果證實，血清HSP27蛋白可以成為一種潛在的、有應(yīng)用價值的測定肝癌及其轉(zhuǎn)移的標志物蛋白。可用于制備包括AFP陰性HCC及其轉(zhuǎn)移的預(yù)測和診斷藥物。
圖1是非轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移HCC組織2-DE銀染圖，其中，N非轉(zhuǎn)移HCC組織；M轉(zhuǎn)移HCC組織(以下同)。
圖2是HSP27在6對N、M組織中的表達差異，圖3是HSP27在非轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移HCC組織中的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果(SP×400)，細胞核染成藍色，N2和N3胞漿呈現(xiàn)淡棕黃色，M2和M3為棕褐色。
圖4是Western blot分析檢測HSP27的表達差異。
圖5是RT-PCR檢測HSP27在非轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移HCC組織中的表達，其中A6對N、M組織HSP27的RT-PCR結(jié)果，L，100bp DNA ladder；HSP27片段長576bp，GAPDH長251bp；B以GAPDH為內(nèi)參，6對N、M組織的HSP27相對表達量比較。
圖6是血清蛋白質(zhì)的2DE圖譜(A血清B去白蛋白和球蛋白的血清)。
圖7是部分差異蛋白質(zhì)的2DE局部放大圖。
圖8是差異性蛋白質(zhì)在正常血清、HBV患者和HCC患者血清中相對含量，其中*p＜0.05 #p＜0.01。
圖9是60例血清的Western Blot鑒定結(jié)果(顯示HSP27)，其中，A、B行正常人血清，未顯示HSP27；C、D行HBV患者血清(僅1例顯示HSP27)E、F行HCC患者血清(全部顯示HSP27)。
具體實施例方式
實施例1
采用本領(lǐng)域常規(guī)方法，比較研究了不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌裸鼠模型LCID20和LCID35的全蛋白表達譜2D電泳圖譜顯示的蛋白質(zhì)數(shù)目高達2500-3000個，進行了差異蛋白的分析和驗證。發(fā)現(xiàn)HSP27高表達。
實施例2應(yīng)用雙向凝膠電泳(2-DE)對6例臨床和病理上均有轉(zhuǎn)移的HCC組織和6例未發(fā)生轉(zhuǎn)移的HCC組織蛋白進行分離，用Image Master軟件匹配分析兩組2-DE圖譜間異同性，尋找在3對及3對以上存在的差異蛋白點，應(yīng)用MALDI-TOF-MS和數(shù)據(jù)庫搜索鑒定出差異顯著的16個蛋白點。結(jié)果顯示這些蛋白為S100鈣結(jié)合蛋白(S100)、27KDa熱休克蛋白(HSP27)、角蛋白18(CK18)等，分別與細胞運動，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，能量代謝等有關(guān)。對在6例轉(zhuǎn)移性HCC組織中表達均顯著高于6例非轉(zhuǎn)移HCC組織的HSP27，應(yīng)用western blotting分析進一步驗證了2-DE結(jié)果，RT-PCR檢測的兩組間mRNA水平也存在差異，但不顯著，免疫組織化學(xué)檢測顯示HSP27定位于肝細胞胞漿內(nèi)(圖1、2、3)。驗證了HSP27的表達增高主要在蛋白質(zhì)表達水平，而并非mRNA轉(zhuǎn)錄水平。其表達水平的高低與肝癌轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)(圖4、圖5)實施例3進行血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究，在清除了高豐度的白蛋白和球蛋白后的血清蛋白的2DE圖譜上，采用二維電泳結(jié)合Maldi-TOF-MS方法比較研究正常人、HBV病人和肝癌病人的蛋白質(zhì)的差異性表達，發(fā)現(xiàn)至少8種差異性蛋白質(zhì)，Transferrin(轉(zhuǎn)鐵蛋白，TF)，Transthyretin(TTR)，α1-antitrypsin(抗胰蛋白酶α1)，Clusterin(CLU)，Haptoglobinchain(肝球蛋白α2鏈，HP)，Ceruloplasmin(CP)，Heat shockprotein 27(熱休克蛋白27，HSP27)，alpha-fetoprotein(甲胎蛋白)；半定量發(fā)現(xiàn)HSP27為肝癌特有。
對60例血清的Western Blot鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常人血清未發(fā)現(xiàn)HSP27(0/20)，HBV患者中僅1例發(fā)現(xiàn)HSP27(95％，1/20)；20例HCC病人血清全部有較強的HSP27(100％，20/20)。提示HSP27可用于HCC的診斷。
對80例血清進行雙盲法驗證，結(jié)果顯示，正常人血清不顯示HSP27(0/10)，HBV患者為95％不顯示(38/40)，假陽性率為5％(2/40)；HCC患者陽性率為100％(30/30)。
表1是差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)。
表1
權(quán)利要求
1.熱休克蛋白27在制備血清學(xué)判別肝癌藥物中的用途。
2.熱休克蛋白27在制備血清學(xué)診斷肝癌藥物中的用途。
3.熱休克蛋白27在制備血清學(xué)預(yù)測肝癌轉(zhuǎn)移藥物中的用途。
4.熱休克蛋白27在制備血清學(xué)診斷AFP陰性肝癌藥物中的用途。
5.熱休克蛋白27在制備血清學(xué)診斷AFP陰性肝癌轉(zhuǎn)移藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種熱休克蛋白27的醫(yī)用用途，本發(fā)明應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對動物模型實驗，結(jié)果表明HSP27高表達；免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示HSP27定位于肝細胞胞漿內(nèi)，驗證了其表達水平的高低與肝癌轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)；血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在差異性蛋白質(zhì)中，HSP27為肝癌特有；血清的Western Blot鑒定結(jié)果顯示HCC病人血清有較強的HSP27(100％，20/20)；血清雙盲法驗證，正常人血清不顯示HSP27(0/10)，HCC患者陽性率為100％(30/30)。結(jié)果證實，血清HSP27蛋白可成為有應(yīng)用價值的測定肝癌及其轉(zhuǎn)移的標志物蛋白。可用于制備包括AFP陰性HCC及其轉(zhuǎn)移的預(yù)測和診斷藥物。
文檔編號A61K39/00GK1851461SQ200510025340
公開日2006年10月25日 申請日期2005年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月22日
發(fā)明者劉銀坤, 馮鉅濤, 崔杰鋒, 宋海燕, 湯釗猷, 楊芃原 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院