伴有組織破壞的疾病的預(yù)防劑和/或治療劑的制作方法

專利名稱：伴有組織破壞的疾病的預(yù)防劑和/或治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑，其含有具有粒細(xì)胞集落刺激因子(以下稱為“G-CSF”)活性的多肽作為活性成分，還涉及調(diào)動多能干細(xì)胞從組織進(jìn)入外周血的藥物，該藥物含有具有G-CSF活性的多肽作為活性成分。
背景技術(shù)：
G-CSF是一種使中性粒細(xì)胞的前體細(xì)胞增殖或分化，以及激活成熟的中性白細(xì)胞的多肽。在骨髓移植、腫瘤化療導(dǎo)致的中性白細(xì)胞減少癥、骨髓增生異常綜合征、再生不良性貧血、先天性或突發(fā)性中性白細(xì)胞減少癥、人免疫缺陷病毒(HIV)感染等情況中，G-CSF主要用于加速中性白細(xì)胞的增生(Shorei ni Manabu G-CSF no Rinsho(Clinic ofG-CSF Learned from Cases)，Yasuo Ikeda主編，Iyaku Journal，Osaka發(fā)行，第64-92頁(1999))。最近有報道G-CSF令外周血中的干細(xì)胞增加(Shorei ni Manabu G-CSF no Rinsho(Clinic of G-CSF Learned fromCases)，Yasuo Ikeda主編，Iyaku Journal，Osaka發(fā)行，第139-168頁(1999))。就干細(xì)胞而言，造血干細(xì)胞、成體干細(xì)胞(組織干細(xì)胞)等為人們所熟知。
已經(jīng)顯示，通過G-CSF的作用轉(zhuǎn)移到外周血的造血干細(xì)胞包括不同的亞型(Blood，84，2795-2801(1994))。包括G-CSF、細(xì)胞粘附分子、趨化因子、金屬蛋白酶等的血細(xì)胞生成因子，相互間與干細(xì)胞從骨髓到外周血的轉(zhuǎn)移相關(guān)(Experimental Hematology，30，973-981(2002))。趨化因子受體CXCR4和它的配體CXCL12(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1，SDF-1)，通過G-CSF而與干細(xì)胞從骨髓到外周血的轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且除了G-CSF，環(huán)磷酰胺也具有同等的生理活性(The Journal of ClinicalInvestigation，111，187-196(2003))。
已知趨化因子CXCR4抑制劑AMD-3100(美國專利5,612,478)也具有將造血干細(xì)胞從骨髓轉(zhuǎn)移到外周血的活性(American Society ofHematology(美國血液學(xué)協(xié)會)，Philadelphia，USA，2002年6月6日-10日)。
作為調(diào)動造血干細(xì)胞進(jìn)入外周血的方法之一，給予粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的方法已為人們所知(Blood，90，903-908(1997))。
而且，據(jù)報道，在將通過G-CSF調(diào)動而從細(xì)胞中分離出來進(jìn)入人外周血的CD34+細(xì)胞移植到心肌梗塞模型上時，引起了血管再生并且改善了心臟功能(Nature Medicine，7，430-436(2001)，WO2001/94420)。
并且，由于梗死區(qū)域的心肌和血管的再生是通過在造成心肌梗塞前，施予小鼠G-CSF和干細(xì)胞因子(SCF)而引起的，因而也認(rèn)為，造血干細(xì)胞是在G-CSF的作用下流出到外周血中，從而使梗死的心肌得到再生(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，10344-10349(2001))。
Corti等報道了通過對小鼠施予G-CSF和SCF，腦內(nèi)骨髓源性神經(jīng)元的數(shù)量增加(Experimental Neurology，173(2)，433-452(2002))。
而且，在人體中，當(dāng)移植通過給予G-CSF而調(diào)動到外周血的細(xì)胞時，在人體接受者的肝臟、消化道上皮和皮膚(N.England J.Med.，346，738-746(2002))以及口腔上皮(Lancet，361，1084-1088(2003))內(nèi)檢測到供體源性細(xì)胞(donor-derived cell)。
但是，除了造血系統(tǒng)，組織中尚未發(fā)現(xiàn)通過施予G-CSF而調(diào)動的哪種類型的干細(xì)胞導(dǎo)致組織分化。更進(jìn)一步，除了血細(xì)胞系統(tǒng)和循環(huán)器官系統(tǒng)的疾病外，尚未發(fā)現(xiàn)是否有其他疾病可以通過施予G-CSF或移植通過G-CSF調(diào)動的干細(xì)胞來進(jìn)行治療。
伴有肺組織破壞的嚴(yán)重疾病包括肺氣腫、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病(下文稱為“COPD”)、囊性纖維化、突發(fā)性間質(zhì)性肺炎(肺纖維化)、彌漫性肺纖維化、結(jié)核、哮喘等。特別是在肺氣腫和COPD中，肺泡的破壞是顯著的(Shoji Kudo，Kokyuki Shikkan no Chiryo toKango(Treatment and Nursing of Respiratory Organ Disease)，Nankodo2002年3月發(fā)行，和Shorei ni Manabu G-CSF no Rinsho(Clinic of G-CSFLearned form Cases)，Yasuo Ikeda主編，Iyaku Journal，Osaka發(fā)行，第64頁-92頁(1999))。肺氣腫、慢性支氣管炎和COPD是在支氣管、細(xì)支氣管或肺泡中產(chǎn)生炎性病變的疾病，并且當(dāng)肺泡破裂進(jìn)展時可導(dǎo)致呼吸困難。由于目前沒有治療肺組織破壞的有效方法，因此需要開發(fā)高效的預(yù)防藥物、治療藥物和治療方法。
已知視黃酸與胎兒期肺的成熟有關(guān)。據(jù)報道，將視黃酸施予肺泡被彈性蛋白酶破壞的大鼠后，其肺泡被修復(fù)(Nature Medicine，3，675-677(1997))。另據(jù)報道，視黃酸衍生物RO444753(Journal ofMedicinal Chemistry，31，2182-2192(1988))對肺氣腫也有同樣的治療效果(American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，165(8)，A825(2002))。盡管已有用視黃酸治療伴有肺泡破裂的疾病的各種病例的報道，但他們中的任何一個都沒有獲得高效。
近年來，作為干細(xì)胞移植試驗(yàn)的結(jié)果，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肺泡頻繁地從干細(xì)胞分化出來(Cell，105，369-377(2001))。
包括肝硬化在內(nèi)的慢性肝臟，位于導(dǎo)致30歲到64歲年齡組死亡的原因的前列。同樣，包括在死亡原因第一位的惡性腫瘤(癌)之內(nèi)的是由于肝硬化之類的肝臟疾病所導(dǎo)致的肝癌，其造成22,900名男性死亡(排在肺癌和胃癌之后而位居第三)和9,400名女性死亡(排在胃癌、肺癌和結(jié)腸癌之后而位居第四)。肝炎病毒是導(dǎo)致肝炎的主要原因，其感染人數(shù)中感染乙型肝炎病毒的為1,500,000人，而感染丙型肝炎病毒的為2,500,000人。盡管施予干擾素作為這些病毒性肝炎的抗病毒藥物，但是仍然無法完全阻止其轉(zhuǎn)化到肝硬化。而且，根據(jù)Ministry ofHealth and Welfare in Japan(日本厚生省)進(jìn)行的調(diào)查，目前大約2,200,000人每天飲5gou(相當(dāng)于0.9升)或更多的酒，例如精制的清酒。在這些成問題的飲酒者中，經(jīng)常會出現(xiàn)例如脂肪肝、酒精性肝炎和肝硬化等肝病患者。每年大約有300,000人新發(fā)展成為肝硬化，包括病毒性和酒精性肝硬化。然而，目前實(shí)在沒有治療肝硬化的方法。近來，據(jù)報道，將骨髓細(xì)胞移植到可以作為酒精性肝炎模型的四氯化碳肝病模型中，通過肝纖維消失和肝細(xì)胞再生而改善肝功能(The SecondMeeting of the Japanese Society for Regenerative Medicine，Kobe，2003年3月11日至12日)。
在日本由于目前需要透析的人數(shù)接近170,000，對能夠完全治愈腎功能不全的腎臟再生藥物有著巨大的臨床需求，但除了腎移植，實(shí)在沒有其他有效的治療手段。最近，據(jù)報道，腎小球和腎小管上皮細(xì)胞是從骨髓細(xì)胞分化而來的，還發(fā)現(xiàn)腎組織是從骨髓干細(xì)胞分化而來的(Kidney International，62，1285-1290(2002))。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑，其含有具有G-CSF活性的多肽作為活性成分，或者提供調(diào)動多能干細(xì)胞從組織進(jìn)入外周血的藥物，該藥物含有具有G-CSF活性的多肽作為活性成分。
本發(fā)明涉及到以下(1)到(35)項(xiàng)。
(1)一種用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑，其含有具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽作為活性成分。
(2)根據(jù)(1)所述的藥劑，其中所述的多肽含有SEQ ID NO1代表的氨基酸序列。
(3)根據(jù)(1)所述的藥劑，其中所述的多肽由SEQ ID NO1代表的氨基酸序列中至少一個氨基酸殘基被刪除、取代和/或增加的氨基酸序列組成，并且具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性。
(4)根據(jù)(1)所述的藥劑，其中所述的多肽由與SEQ ID NO1代表的氨基酸序列有80％或更多的同源性的氨基酸序列組成，并且具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性。
(5)根據(jù)(1)到(4)中任意一項(xiàng)所述的藥劑，其中所述的多肽是具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的化學(xué)修飾多肽。
(6)根據(jù)(5)所述的藥劑，其中所述的多肽用聚亞烷基二醇修飾。
(7)一種用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑，其含有(a)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽和(b)視黃酸或視黃酸衍生物，其中(a)和(b)可同時給藥，間隔一段時間而分別給藥，或作為含有(a)和(b)兩者的單一藥物給藥。
(8)一種用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑，其含有(a)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽和(b)CXCR4抑制劑，其中(a)和(b)可同時給藥，間隔一段時間而分別給藥，或作為含有(a)和(b)兩者的單一藥物給藥。
(9)根據(jù)(8)所述的藥劑，其中所述的CXCR4抑制劑是AMD-3100或其衍生物。
(10)根據(jù)(1)到(9)中任意一項(xiàng)所述的藥劑，其中伴有組織破壞的疾病選自神經(jīng)疾病、循環(huán)器官系統(tǒng)疾病、肝臟疾病、胰腺疾病、消化道系統(tǒng)疾病、腎臟疾病、皮膚疾病和肺疾病。
(11)根據(jù)(10)所述的藥劑，其中所述的神經(jīng)疾病選自腦梗塞、腦血管意外、帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈病、脊髓損傷、抑郁癥和躁狂抑郁性精神病。
(12)根據(jù)(10)所述的藥劑，其中所述的循環(huán)器官系統(tǒng)疾病選自阻塞性血管疾病、心肌梗塞、心臟衰竭和冠狀動脈疾病。
(13)根據(jù)(10)所述的藥劑，其中所述的肝臟疾病選自乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝炎、肝硬化和肝功能不全。
(14)根據(jù)(10)所述的藥劑，其中所述的胰腺疾病選自糖尿病和胰腺炎。
(15)根據(jù)(10)所述的藥劑，其中所述的消化道系統(tǒng)疾病選自克朗氏病和潰瘍性結(jié)腸炎。
(16)根據(jù)(10)所述的藥劑，其中所述的腎臟疾病選自IgA腎病、腎小球腎炎和腎功能不全。
(17)根據(jù)(10)所述的藥劑，其中所述的皮膚疾病選自褥瘡、燒傷、縫合傷、撕裂傷、切割傷、咬傷、皮炎、阿利貝爾氏瘢痕瘤、瘢痕瘤、糖尿病性潰瘍、動脈性潰瘍和靜脈性潰瘍。
(18)根據(jù)(10)的所述藥劑，其中所述的肺疾病選自肺氣腫、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、囊性纖維化、突發(fā)性間質(zhì)性肺炎(肺纖維化)、彌漫性肺纖維化、結(jié)核或哮喘。
(19)一種調(diào)動多能干細(xì)胞從組織進(jìn)入外周血的藥物，其含有具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽作為活性成分。
(20)根據(jù)(19)所述的藥物，其中所述的多肽含有SEQ ID NO1代表的氨基酸序列。
(21)根據(jù)(19)所述的藥物，其中所述的多肽由SEQ ID NO1代表的氨基酸序列中至少一個氨基酸殘基被刪除、取代和/或增加的氨基酸序列組成，并且具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性。
(22)根據(jù)(19)所述的藥物，其中所述的多肽由與SEQ ID NO1代表的氨基酸序列有80％或更多的同源性的氨基酸序列組成，并且具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性。
(23)根據(jù)(19)到(22)中任意一項(xiàng)所述的藥物，其中所述的多肽是具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的化學(xué)修飾多肽。
(24)根據(jù)(23)所述的藥物，其中所述的多肽用聚亞烷基二醇修飾。
(25)一種調(diào)動多能干細(xì)胞從組織進(jìn)入外周血的藥物，其含有(a)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽和(b)視黃酸或視黃酸衍生物，其中(a)和(b)可同時給藥，間隔一段時間而分別給藥，或作為含有(a)和(b)兩者的單一藥物給藥。
(26)一種調(diào)動多能干細(xì)胞從組織進(jìn)入外周血的藥物，其含有(a)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽和(b)CXCR4抑制劑，其中(a)和(b)可同時給藥，間隔一段時間而分別給藥，或作為含有(a)和(b)兩者的單一藥物給藥。
(27)根據(jù)(26)所述的藥物，其中所述的CXCR4抑制劑是AMD-3100或其衍生物。
(28)一種用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的方法，包括施予具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽。
(29)一種用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的方法，包括同時施予或間隔一段時間而分別施予(a)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽和(b)視黃酸或視黃酸衍生物。
(30)一種用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的方法，包括同時施予或間隔一段時間而分別施予(a)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽和(b)CXCR4抑制劑。
(31)一種調(diào)動多能干細(xì)胞從組織進(jìn)入外周血的方法，包括施予具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽。
(32)一種調(diào)動多能干細(xì)胞從組織進(jìn)入外周血的方法，包括同時施予或間隔一段時間而分別施予(a)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽和(b)視黃酸或視黃酸衍生物。
(33)一種調(diào)動多能干細(xì)胞從組織進(jìn)入外周血的方法，包括同時施予或間隔一段時間而分別施予(a)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽和(b)CXCR4抑制劑。
(34)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽在制造用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑中的用途。
(35)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽在制造用于調(diào)動多能干細(xì)胞從組織進(jìn)入外周血的藥物中的用途。
1.用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑在本發(fā)明中，伴有組織破壞的疾病包括神經(jīng)疾病、循環(huán)器官系統(tǒng)疾病、肝臟疾病、胰腺疾病、消化道系統(tǒng)疾病、腎臟疾病、皮膚疾病和肺疾病等。
神經(jīng)疾病包括腦梗塞、腦血管意外、帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈病、脊髓損傷、抑郁癥和躁狂抑郁性精神病等。
循環(huán)器官系統(tǒng)疾病包括阻塞性血管疾病、心肌梗塞、心臟衰竭和冠狀動脈疾病等。
肝臟疾病包括乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝炎、肝硬化和肝功能不全等。
胰腺疾病包括糖尿病、胰腺炎等。
消化道系統(tǒng)疾病包括克朗氏病和潰瘍性結(jié)腸炎等。
腎臟疾病包括IgA腎病、腎小球腎炎和腎功能不全等。
皮膚疾病包括褥瘡、燒傷、縫合傷、撕裂傷、切割傷、咬傷、皮炎、阿利貝爾氏瘢痕瘤、瘢痕瘤、糖尿病性潰瘍、動脈性潰瘍和靜脈性潰瘍等。
肺疾病包括肺氣腫、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、囊性纖維化、突發(fā)性間質(zhì)性肺炎(肺纖維化)、彌漫性肺纖維化、結(jié)核、哮喘等。
具有G-CSF活性的多肽包括含有SEQ ID NO1代表的氨基酸序列的多肽，或由SEQ ID NO1代表的氨基酸序列中至少一個氨基酸殘基被刪除、取代和/或增加的氨基酸序列所組成的、并且具有G-CSF活性的多肽。
實(shí)例包括那托司亭(nartograstim)(商品名Neu-up，Kyowa HakkoKogyo Co.，Ltd.制造)、非格司亭(filgrastim)(商品名Gran，SANKYO制造；商品名Granulokine，Hoffmann-La Roche制造；商品名Neupogen，Amgen制造)、來格司亭(1enograstim)(商品名Neutrogin，Chugai Pharmaceutical制造；商品名Granocyte，Aventis制造)、聚乙二醇化非格司亭(pegfilgrastim)(商品名Neulasta，Amgen制造)、沙格司亭(sargramostim)(商品名Leukine，Schering制造)等。
同時，具有G-CSP活性的多肽包括如下多肽，當(dāng)用BLAST(BasicLocal Alignment Search Tool)檢測其氨基酸序列與含有SEQ ID NO1所代表的氨基酸序列的G-CSF的同源性時，優(yōu)選同源性為60％或更多，更優(yōu)選80％或更多，進(jìn)一步優(yōu)選90％或更多，并且最優(yōu)選95％或更多。其中由SEQ ID NO1所代表的氨基酸序列中至少一個氨基酸殘基被取代、并具有G-CSF活性的多肽的實(shí)例在表1中示出。
表1

*未取代的氨基酸進(jìn)一步地，具有G-CSF活性的多肽可以被化學(xué)修飾。
化學(xué)修飾的方法包括WO00/51626中所描述的方法等，并且包括具有G-CSF活性的多肽，舉例來說，用諸如聚乙二醇(PEG)的聚亞烷基二醇修飾。
本發(fā)明含有具有G-CSF活性的多肽作為活性成分的藥物，可以作為治療藥物而單獨(dú)給藥，但通常優(yōu)選作為藥物制劑而提供，該藥物制劑通過將本發(fā)明的藥物與至少一種藥學(xué)上可接受的載體混合，并通過制藥領(lǐng)域已知的任何方法制造。
優(yōu)選采用治療上最有效的給藥途徑，實(shí)例包括口服給藥和胃腸外給藥，例如口腔、氣道、直腸、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)和靜脈給藥。其中，優(yōu)選肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、靜脈或氣道給藥。
劑型包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑、軟膏劑、膠帶劑、干粉劑、例如氣霧劑的吸入劑等。
舉例來說，在諸如片劑的固體制劑的制備中，可以使用賦形劑，例如乳糖；崩解劑，例如淀粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂；粘合劑，例如羥丙基纖維素；表面活性劑，例如脂肪酸酯；增塑劑，例如甘油；和類似物。
適合于肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、靜脈或氣道給藥的藥物制劑包括注射劑、噴霧劑等。
舉例來說，在注射劑的制備中，可使用水、鹽水、例如大豆油的植物油、溶劑、增溶劑、張度劑(tonicity agent)、防腐劑、抗氧化劑等。
同樣，吸入劑是通過單獨(dú)使用具有G-CSF活性的多肽或與載體等一起而制備的，該載體不會刺激接受者的口腔和氣道粘膜，并且能夠通過將具有G-CSF活性的多肽分散成微細(xì)顆粒而促進(jìn)其吸收。該載體包括乳糖、甘油等。根據(jù)具有G-CSF活性的多肽和要使用的載體的特性，可以制成例如氣霧劑和干粉劑的制劑。此外，也可以將例如口服制劑的添加劑的成分加入到這些胃腸外制劑中。
盡管劑量和給藥頻率根據(jù)預(yù)期的治療效果、給藥方法、治療周期、年齡、體重等變化，但通常，優(yōu)選的給藥劑量是每個成人每天0.01μg/kg到10mg/kg。
2.粒細(xì)胞集落刺激因子和其他藥物的組合使用本發(fā)明所使用的具有G-CSF活性的多肽的活性，可通過將視黃酸、視黃酸衍生物或CXCR4抑制劑組合使用而增強(qiáng)。
可以使用任意視黃酸衍生物，只要它們能與視黃酸受體結(jié)合，實(shí)例包括視黃酸衍生物如棕櫚視黃醇、視黃醇、視黃醛、3-脫氫視黃酸(3-dehydroretinoic acid)、3-脫氫視黃醇和3-脫氫視黃醛；原維生素A如α-胡羅卜素、β-胡羅卜素、γ-胡羅卜素、β-隱黃質(zhì)和海膽酮；和類似物。其他實(shí)例包括莫維A胺(商品名Tasmaderm，Hoffmann-La Roche制造，見美國專利4,105,681)、在WO 02/04439中描述的化合物、他扎羅汀(Tazaroten)(商品名Tazorac，Allergan制造，見EP284288)、AGN-194310和AGN-195183(Allergan制造，見WO 97/09297)，視黃酸TopiCare(商品名Avita，Mylan Laboratories制造)、UAB-30(CAS號205252-59-1，UAB Research Foundaion制造)等。
CXCR4抑制劑包括AMD-3100等。
本發(fā)明所使用的具有G-CSF活性的多肽和視黃酸、視黃酸衍生物或CXCR4抑制劑可以以單一劑型(混合型劑型)或以多種劑型的組合來使用或給藥，只要各自的活性成分包含在內(nèi)。當(dāng)以多種劑型的組合來使用時，它們可以同時使用或給藥，或者間隔一段時間使用或給藥。同樣，這些藥物制劑可以以例如片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑、軟膏劑、膠帶劑、例如干粉劑和氣霧劑的吸入劑等形式使用。
本發(fā)明所使用的具有G-CSF活性的多肽與視黃酸、視黃酸衍生物或CXCR4抑制劑的優(yōu)選劑量比例(重量/重量)，可以根據(jù)視黃酸、視黃酸衍生物或CXCR4抑制劑的組合以及視黃酸、視黃酸衍生物或CXCR4抑制劑的功效任選地調(diào)整。例如，使用的比例可以是1/50,000(粒細(xì)胞集落刺激因子/視黃酸、視黃酸衍生物或CXCR4抑制劑)到100/1，優(yōu)選從1/10,000到20/1，并且更優(yōu)選從1/1,000到10/1。
當(dāng)以多種藥物制劑的組合給藥時，例如，(a)含有具有G-CSF活性的多肽的第一組分和(b)含有視黃酸、視黃酸衍生物或CXCR4抑制劑的第二組分，能夠如上所述分別配方而制備藥盒，并且各個組分能夠通過同時使用該藥盒或間隔一段時間使用該藥盒而給藥，從而經(jīng)過相同或不同路徑而到達(dá)相同受體。
可使用的藥盒是包括兩個或更多容器(例如小瓶、袋子等)和內(nèi)容物的藥盒，其中容器的材料、形狀等沒有特別的限制，只要該容器在儲存過程中，作為內(nèi)容物的組分不會由于外界溫度和光而變性，或者來自容器的化學(xué)組分不會分解，并且它也具有以下的樣式，作為內(nèi)容物的第一組分和第二組分能夠通過不同途徑(如管子等)給藥，或同樣的途徑給藥。實(shí)例包括片劑藥盒、注射劑藥盒、吸入劑藥盒等。
上述藥物制劑能夠根據(jù)傳統(tǒng)的方法，通過使用藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、粘合劑、表面活性劑、水、鹽水、植物油增溶劑、張度劑、防腐劑、抗氧化劑等而制備。
在制備片劑時，舉例來說，可以使用例如乳糖的賦形劑；例如淀粉的崩解劑；例如硬脂酸鎂的潤滑劑；例如羥丙基纖維素的粘合劑；例如脂肪酸酯的表面活性劑；例如甘油的增塑劑；和類似物。
在制備注射劑時，可使用例如水、鹽水、植物油如大豆油、溶劑、增溶劑、張度劑、防腐劑、抗氧化劑等。
同樣，吸入劑是通過將具有G-CSF活性的多肽單獨(dú)使用，或與不會刺激接受者的口腔和氣道粘膜，并能夠使具有G-CSF活性的多肽分散成微細(xì)顆粒而促進(jìn)其吸收的載體或類似物一起使用而制備的。載體包括乳糖、甘油等。而且，也可以在這些胃腸外制劑中加入諸如口服制劑添加劑的組分。
盡管劑量和給藥頻率根據(jù)期望的治療效果、給藥方法、治療周期、年齡、體重等變化，但通常，優(yōu)選每個成人每天給與具有G-CSF活性的多肽的劑量是0.01μg/kg到10mg/kg，或者視黃酸、視黃酸衍生物或CXCR4抑制劑的劑量是0.1mg/kg到100mg/kg。
3.調(diào)動多能干細(xì)胞進(jìn)入外周血的藥物如上述第1或第2項(xiàng)所述的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑，能夠調(diào)動多能干細(xì)胞進(jìn)入外周血，并通過調(diào)動多能干細(xì)胞使損傷的組織再生。
4.使用本發(fā)明的藥物治療疾病的方法當(dāng)使用本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑來作為治療疾病的方法時，可以采用任何方法，例如通過直接給予患者上述第1項(xiàng)中所述的本發(fā)明的藥劑而使損傷區(qū)域得到修復(fù)，或者回收通過上述第3項(xiàng)所述的藥物而調(diào)動到外周血的多能干細(xì)胞，并將回收的多能干細(xì)胞直接移植到損傷區(qū)域內(nèi)，或?qū)⑵湓隗w外分化成為細(xì)胞或組織后再移植到損傷區(qū)域。
當(dāng)治療中使用多能干細(xì)胞或分化細(xì)胞時，通過采用例如Hemonetics制造的Hemolite 2 Plus用鹽水洗滌多能干細(xì)胞或分化細(xì)胞。使用的裝置包括那些在一個完全密閉的系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞的濃縮、洗滌和回收的裝置，并且優(yōu)選能接近100％地清除例如在培養(yǎng)和分化中所使用的細(xì)胞因子等物質(zhì)的裝置。由此回收的多能干細(xì)胞或由此分化的細(xì)胞，在治療中能通過常規(guī)的滴注法靜脈注射，或直接注射到病變區(qū)域。
5.評估本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑的方法(1)腦或神經(jīng)系統(tǒng)組織例如，根據(jù)下述方法能夠證實(shí)本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑可以用于治療伴有腦或神經(jīng)系統(tǒng)組織破壞的疾病。
將上述本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑施予實(shí)驗(yàn)動物，例如小鼠、大鼠或猴子，并且如果觀察到伴有破壞的癥狀的緩解，或者鑒別出分化的腦或神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞，就可以證實(shí)該藥物對于治療伴有腦或神經(jīng)系統(tǒng)組織破壞的疾病有效。優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)動物是由局部缺血、施予6-羥多巴胺(6-OHDA)、施予紅藻氨酸等而造成腦損傷的動物。本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑的給藥途徑包括皮下給藥。
例如，腦內(nèi)分化的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞可以通過以下的方法檢測。
預(yù)先照射致死劑量的放射線后，制作骨髓嵌合體(chimeric)小鼠，其移植了取自同一品系能夠組成表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓，并將該骨髓嵌合體小鼠的腦用上述方法造成損傷，然后施予本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑。通過測定GFP的熒光強(qiáng)度可以鑒別出分化的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞。
(2)肝臟組織例如，根據(jù)下述方法能夠證實(shí)，本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑可以用于治療伴有肝臟組織破壞的疾病。
將上述本發(fā)明用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑施與肝細(xì)胞破壞的小鼠模型，并且如果觀察到伴有破壞的癥狀的緩解或肝臟內(nèi)新細(xì)胞增殖的加速，可以證實(shí)該藥劑對于治療伴有肝臟組織破壞的疾病有效。表現(xiàn)出伴有肝細(xì)胞破壞的疾病的動物模型包括主要將四氯化碳酯酶注入腹腔的模型(American Journal of Pathology，161，2003-2010(2002))、肝臟部分切除的模型(Arch.Pathol.，12，186-202(1931))等。進(jìn)一步地，具有肝臟破壞病態(tài)的基因修飾動物包括富馬酰乙酸鹽(酯)水解酶(FAH)-缺乏小鼠(Nature Medicine，6，1229-1234(2000))等。
肝細(xì)胞的破壞可通過測定血漿中或血清中的GPT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)、GOT(谷草轉(zhuǎn)氨酶)、膽紅素、γ-GTP等的濃度進(jìn)行評估。
肝臟內(nèi)肝細(xì)胞的分化可以通過以下方法檢測。
預(yù)先照射致死劑量的放射線后，制作骨髓嵌合體小鼠，其移植了取自同一品系能夠組成表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓，將該骨髓嵌合體小鼠的肝臟用上述方法造成損傷，然后施予本發(fā)明的具有G-CSF活性的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑作為活性成分?；贕FP的熒光可以鑒別出分化的肝細(xì)胞。
(3)胰腺組織例如，根據(jù)下述方法能夠證實(shí)，本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑可以用于治療伴有胰腺組織破壞的疾病。
將上述本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑施予胰腺細(xì)胞破壞的小鼠模型，如果觀察到伴有破壞的癥狀的緩解或胰腺內(nèi)新細(xì)胞增殖的加速，可以證實(shí)該藥劑對于治療伴有胰腺組織破壞的疾病有效。
表現(xiàn)出伴有胰腺β細(xì)胞破壞的疾病的動物模型包括主要將鏈脲霉素注入腹腔的模型(The Journal of Clinical Investigation，48，2129-2139(1969))、胰腺部分切除的模型(The Journal of Clinical Investigation，71，1544-1553(1983))等。能自發(fā)產(chǎn)生具有胰腺β細(xì)胞破壞病態(tài)的疾病的動物包括非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠(Exp.Animal，29，1-13(1980))、BioBreeding(BB)大鼠(Diabetes，31，Suppl.1，7-13(1982))等。
胰腺β細(xì)胞破壞癥狀的改善情況可通過測定血漿中或血清中的胰島素、葡萄糖等的濃度，以及葡萄糖耐量試驗(yàn)時的葡萄糖耐量等進(jìn)行評估。進(jìn)一步地，改善情況也可以通過基于體重改變、進(jìn)食量、尿糖水平的測定等與疾病相關(guān)的變化來檢測。
胰腺內(nèi)胰腺細(xì)胞的分化可以通過以下方法進(jìn)行檢測。
預(yù)先照射致死劑量的放射線后，制作骨髓嵌合體小鼠，其移植了取自同一品系能夠組成表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓，將該骨髓嵌合體小鼠的胰腺用上述方法造成損傷，并隨后施予本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑。基于GFP的熒光可以鑒別出分化的胰腺細(xì)胞。
(4)腎臟組織例如，根據(jù)下述方法能夠證實(shí)，本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑可以用于治療伴有腎臟組織破壞的疾病。
將上述本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑施予腎臟細(xì)胞破壞的小鼠模型，如果觀察到伴有破壞的癥狀的緩解或腎臟內(nèi)新細(xì)胞增殖的加速，可以證實(shí)該藥劑能有效用于治療伴有腎臟組織破壞的疾病。至于腎臟破壞模型，優(yōu)選各種腎小球腎炎模型。表現(xiàn)出類似于腎小球腎炎的病態(tài)的動物模型包括通過靜脈注射抗-Thy-1抗體而導(dǎo)致的抗-Thy-1腎小球腎炎模型(Kidney and Dialysis，1991年特刊，腎病模型，Tokyo Igaku-sha發(fā)行)、通過腎小球基底膜抗體誘導(dǎo)的Masugi腎小球腎炎模型(Kidney and Dialysis，1991年特刊，腎病模型，Tokyo Igaku-sha發(fā)行)等，并且表現(xiàn)出類似于腎功能不全的病態(tài)的動物模型包括將牛血清白蛋白(BSA)注入腹腔的模型(KidneyInternational，55，890-898(1999))。
腎臟細(xì)胞破壞癥狀的改善可通過測定尿蛋白排出量等進(jìn)行評估。
腎臟內(nèi)腎臟細(xì)胞的分化可以通過以下方法進(jìn)行檢測。
預(yù)先照射致死劑量的放射線后，制作骨髓嵌合體小鼠，其移植了取自同一品系能夠組成表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓，將該骨髓嵌合體小鼠的腎臟用上述方法造成損傷，然后施予本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑?；贕FP的熒光可以鑒別出分化的腎臟細(xì)胞。
(5)肺組織例如，根據(jù)下述方法能夠證實(shí)，本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑可以用于治療伴有肺組織破壞的疾病。
將上述本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑施予肺細(xì)胞破壞的小鼠模型，如果觀察到伴有破壞的癥狀的緩解或肺內(nèi)新細(xì)胞增殖的加速，可以證實(shí)該藥劑對于治療伴有肺組織破壞的疾病有效。至于肺破壞模型，優(yōu)選類似肺氣腫的模型。表現(xiàn)出類似于肺氣腫的病態(tài)的動物模型包括將主要含有酯酶的蛋白酶制劑注入肺內(nèi)的模型(Environment Research，33，454-472(1984))、吸煙模型(Chest，121，增刊，188S-191S(2002))等。表現(xiàn)出肺組織破壞病態(tài)的轉(zhuǎn)基因動物包括白介素13轉(zhuǎn)基因小鼠(The Journal of Clinical Investigation，106，1081-1093(2000))、腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)基因小鼠(American Journal ofPhysiologyLung Cellular Molecular Physiology，280，L39-L49(2001))等。
肺細(xì)胞破壞癥狀的改善可通過分析肺切片的組織影像、測定肺濕重和體積等進(jìn)行評估。肺切片的組織影像可以通過測定平均線性截取長度、肺泡面積等進(jìn)行分析。平均線性截取長度可以通過在肺切片樣本的顯微圖像上畫一預(yù)定長度的方格，測量與線性線交叉的肺泡壁和毗鄰的與線性線交叉的肺泡壁之間的距離，計算其平均值而獲得。進(jìn)一步地，非侵入性測量方法包括肺的X射線成像、X射線計算機(jī)體層成像(X射線CT)、磁共振成像(MRI)等。盡管不是直接的，但是肺的組織破壞也可以通過基于以下與疾病相關(guān)的變化的測定來評估，即體重和呼吸功能的測定、在預(yù)定時間內(nèi)運(yùn)動量和移動距離的測定、運(yùn)動耐量試驗(yàn)、血氧分壓的測定、作為肺泡彈性蛋白降解產(chǎn)物的鎖鏈素的尿濃度和血濃度的測定、或類似測定。
肺內(nèi)細(xì)胞的分化可以通過以下方法進(jìn)行檢測。
預(yù)先照射致死劑量的放射線后，制作骨髓嵌合體小鼠，其移植了取自同一品系能夠組成表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓，將該骨髓嵌合體小鼠的肺用上述方法造成損傷，然后施予本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑?；贕FP的熒光可以鑒別出分化的肺細(xì)胞。
(6)骨骼肌組織例如，根據(jù)下述方法能夠證實(shí)，本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑可以用于治療伴有骨骼肌組織破壞的疾病。
將上述本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑施予骨骼肌破壞的小鼠模型，如果觀察到伴有破壞的癥狀的緩解或骨骼肌內(nèi)新細(xì)胞增殖的加速，可以證實(shí)該藥劑對于治療伴有骨骼肌組織破壞的疾病有效。表現(xiàn)出類似于骨骼肌組織破壞的病態(tài)的動物模型包括主要將例如心臟毒素的肌毒性蛇毒或例如鹽酸丁哌卡因的局部麻醉劑注入骨骼肌的模型(Igaku-no Ayumi (Advance in Medical Science)，179，276-280(199))等。具有骨骼肌破壞病態(tài)的轉(zhuǎn)基因動物包括營養(yǎng)障礙基因缺陷mdx小鼠(Shinkei Shinpo(Advance in Nerves)，45，54-62(2001))等。
骨骼肌組織破壞癥狀的改善可通過基于骨骼肌纖維的直徑和數(shù)量以及肌肉纖維化和脂肪變化的形態(tài)學(xué)觀察進(jìn)行評估。而且，非侵入性測量方法包括肌肉計算機(jī)體層成像(肌肉CT)、磁共振成像(MRI)等。盡管不是直接的，但是這種改善也可以通過基于血清肌酸激酶(CK)值的測定等與疾病相關(guān)的變化來評估。
骨骼肌內(nèi)細(xì)胞的分化可以通過以下方法進(jìn)行檢測。
預(yù)先照射致死劑量的放射線后，制作骨髓嵌合體小鼠，其移植了取自同一品系能夠組成表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓，將該骨髓嵌合體小鼠的骨骼肌用上述方法造成損傷，然后施予本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑。基于GFP的熒光可以鑒別出分化的和成形的骨骼肌細(xì)胞。
(7)皮膚組織例如，根據(jù)下述方法能夠證實(shí)，本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑可以用于治療伴有皮膚組織破壞的疾病。
將上述本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑施予皮膚破壞的小鼠模型，如果觀察到伴有破壞的癥狀的緩解或皮膚內(nèi)新細(xì)胞增殖的加速，可以證實(shí)該藥劑對于治療伴有皮膚組織破壞的疾病有效。表現(xiàn)出類似于皮膚組織破壞的病態(tài)的動物模型包括主要在難處理的模型動物上，例如遺傳性糖尿病小鼠(db/db)、遺傳性肥胖小鼠(ob/ob)、用類固醇治療的小鼠或肝病大鼠等，人為制作成皮膚全層缺失傷、燒傷、缺血性潰瘍(褥瘡)或感染傷的皮膚損傷模型(TanpakushitsuKakusan koso(Protein，Nucleic acid Enzyme)，45，1145-1151(2000))。
皮膚組織損傷癥狀的改善可通過傷口面積的測定、皮膚撕裂張力的測定、滲出液量的測定、白細(xì)胞浸潤數(shù)量的測定、血管生成數(shù)量的測定、肉芽內(nèi)產(chǎn)生的細(xì)胞和膠原數(shù)目的測定等進(jìn)行評估。
皮膚內(nèi)細(xì)胞的分化可以通過以下方法進(jìn)行檢測。
預(yù)先照射致死劑量的放射線后，制作骨髓嵌合體小鼠，其移植了取自同一品系能夠組成表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓，將該骨髓嵌合體小鼠的皮膚用上述方法造成損傷，然后施予本發(fā)明的用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑?；贕FP的熒光可以鑒別出分化的皮膚細(xì)胞。
6.評估調(diào)動多能干細(xì)胞進(jìn)入外周血的藥物的方法對于本發(fā)明調(diào)動多能干細(xì)胞進(jìn)入外周血的藥物的評估如下。
從同一品系能組成表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因小鼠上收集藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞，或收集藥物調(diào)動的細(xì)胞，并將能夠標(biāo)記細(xì)胞的基因，例如綠色熒光蛋白(GFP)導(dǎo)入這些細(xì)胞，再將這些細(xì)胞通過靜脈或心室內(nèi)施用。基于GFP的熒光可以鑒別出分化的細(xì)胞。
下面基于參考實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)實(shí)施例對本發(fā)明預(yù)防劑和/或治療劑的效果進(jìn)行詳細(xì)描述。
參考實(shí)施例1通過施予具有G-CSF活性的多肽增加外周血中的單核細(xì)胞將那托司亭(商品名Neu-up，Kyowa Hakko Kogyo有限公司制造)以100μg/kg的劑量連續(xù)5天皮下注射到3只9周齡的雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠(Charles River Japan)，給藥開始后的第6天從腹主動脈收集外周血。用NycoPrep 1.077Animal(Axis-Shield制造)通過密度梯度離心濃縮單核細(xì)胞部分，并測定細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果，單核細(xì)胞從(2.32±0.16)×106細(xì)胞/ml(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)增加到(4.29±0.93)×106細(xì)胞/ml(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。其中包含干細(xì)胞。
參考實(shí)施例2通過施予G-CSF調(diào)動到外周血的細(xì)胞的特性(1)調(diào)動到通過施用G-CSF而調(diào)動的外周血的細(xì)胞，移植到經(jīng)過X射線照射的小鼠通過施予G-CSF而調(diào)動進(jìn)入外周血的細(xì)胞的特性，通過將該細(xì)胞移植到小鼠進(jìn)行分析。
將10周齡、體內(nèi)所有細(xì)胞都整合了GFP基因并表達(dá)GFP蛋白的小鼠(F4，C57BL/6×129系)分成包括3只小鼠的F組和包括1只小鼠的G組，并將下述藥劑施予每只小鼠。具體地，F(xiàn)組每只小鼠連續(xù)5天每天皮下注射10μg的G-CSF(Kyowa Hakko Kogyo有限公司制造，商品名Neu-up)。G組每只小鼠連續(xù)5天每天皮下注射200μl的PBS(磷酸鹽緩沖液)(pH7.4)(Life Technologies制造)。
在最后一次給藥的后一天，將F組和G組的每只小鼠用乙醚麻醉，并從眼靜脈收集外周血，收集在預(yù)先裝有肝素鈉(Takeda ChemicalIndustries有限公司制造)的管內(nèi)，令所收集的外周血經(jīng)過100-μm的細(xì)胞濾器(Becton Dickinson制造)。至于G組的小鼠，切下股骨，用剪刀切除附著在股骨上的肌肉以使整個股骨暴露，然后用剪刀剪除股骨兩端，將裝有Terumo公司制造的27G針頭并含有PBS的注射針的前端插入股骨的膝關(guān)節(jié)側(cè)的切割端，通過將PBS吹入試管而收集骨髓細(xì)胞，并令所收集的骨髓細(xì)胞經(jīng)過100-μm的細(xì)胞濾器(Becton Dickinson制造)。
這樣所收集到的外周血或骨髓細(xì)胞按照如下方式從尾靜脈注入到C57BL/6小鼠進(jìn)行移植。
首先，準(zhǔn)備8周齡的C57BL/6小鼠(CLEA Japan)，在從尾靜脈注射的前一天，預(yù)先用X射線照射裝置(Hitachi Medico制造)照射12Gy劑量的X射線。這些小鼠被分成H組、I組、J組和K組。H組每一只小鼠的尾靜脈內(nèi)移植入300μl的取自F組小鼠的外周血；I組每一只小鼠的尾靜脈內(nèi)移植入300μl的取自G組小鼠的外周血；J組每一只小鼠的尾靜脈內(nèi)移植入3.0×106個取自G組小鼠的骨髓細(xì)胞；K組小鼠不進(jìn)行移植。
結(jié)果，I組和K組的所有小鼠在移植的7到10天內(nèi)死亡，而H組和J組的小鼠在移植8周后仍然存活。但是，在移植骨髓的J組的一些小鼠中，觀察到外表和行為的異常，例如，毛脫落和皮膚潰瘍和歪著頭行走以及步態(tài)不自然。在移植施予G-CSF的小鼠的外周血的H組中，沒有觀察到外表和行為的異常。
結(jié)果表明具有分化為例如皮膚的組織的能力的干細(xì)胞，通過施予G-CSF而調(diào)動進(jìn)入小鼠的外周血中。
(2)解剖經(jīng)過細(xì)胞移植的小鼠將(1)中獲得的H組小鼠解剖并將其灌注和固定，切下每一個器官。
具體地，小鼠通過腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(DainipponPharmaceutical有限公司制造)進(jìn)行麻醉，用70％的乙醇潤濕整個身體，剝除大腿的皮膚，用剪刀將從膝到大腿根部區(qū)域切開以暴露股動脈和股靜脈。它們用絲制縫合線(Natsume Seisakusho有限公司制造)綁扎，從綁扎處將大腿切斷。切除其上的脛骨，用剪刀去除附著在脛骨上的肌肉以暴露整個脛骨，用剪刀剪除脛骨兩端，將裝有Terumo公司制造的23G針頭并含有PBS的注射針的前端插入脛骨的膝關(guān)節(jié)側(cè)的切端，通過將PBS吹入試管而收集骨髓細(xì)胞。
另一方面，通過剖腹術(shù)和開胸術(shù)使小鼠的心臟暴露，將Terumo公司制造的帶翼(wing)的25G靜脈注射針插入左心室，切除右心耳，20ml的PBS流入并灌注整個身體。將此時從心臟溢出的血液作為外周血收集在分配有100單位肝素鈉(Takeda Chemical Industries有限公司制造)的管內(nèi)。
當(dāng)所有的PBS流盡后，20ml的固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]通過同樣的操作流入進(jìn)行固定。
然后，將肺連同氣管一起切下，將裝有與Terumo公司制造的surflow留置針(20G)相連的導(dǎo)管并含有用PBS稀釋兩倍的OCT(最佳切除溫度，optimum cutting temperature)化合物(Miles制造)的20-ml的注射器插入氣管，用絲制縫合線(Natsume Seisakusho有限公司制造)將導(dǎo)管的前端與氣管連接起來，經(jīng)過氣管將10ml的用PBS稀釋兩倍的OCT溶液注入肺內(nèi)。注射完畢后，將肺切成幾個平方毫米的小塊，用OCT化合物包埋并用經(jīng)過干冰冷卻的異戊烷進(jìn)行冷凍。
同樣切下小鼠的其他器官，浸入4℃的固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]2小時，用PBS沖洗，浸入高糖溶液[20％蔗糖，PBS]，允許在4℃靜置過夜，第二天，將其切成幾個平方毫米的的小塊，用OCT化合物包埋并用經(jīng)過干冰冷卻的異戊烷進(jìn)行冷凍。
這樣經(jīng)過冷凍的組織用恒冷切片機(jī)切成厚度10μm的切片，粘附在涂有APS(Matsunami制造)的載玻片上，充分干燥后制成冰凍切片。
上述操作制得的外周血細(xì)胞用等量的0.9％的NaCl稀釋，在1.4ml的Nyco Prep 1.077Animal(Daiichi Pure Chemicals有限公司制造)上分層，室溫下以600×g離心30分鐘。收集界面上的一層單核細(xì)胞懸液，與1ml的PBS混合，室溫下以400×g離心15分鐘。棄去上清液，沉淀的單核細(xì)胞懸浮于0.5ml的PBS中，用FACS Calibur(BectonDickinson制造)測定外周單核細(xì)胞中GFP陽性細(xì)胞的數(shù)目比率。結(jié)果，GFP陽性細(xì)胞的數(shù)目比率是90.3％。
至于骨髓細(xì)胞，也通過同樣的方式用FACS Calibur測定GFP陽性細(xì)胞的數(shù)目比率，而GFP陽性細(xì)胞占87.3％。
將切下的每個器官所制成的冰凍切片用Zeiss制造的熒光顯微鏡Axiophot 2進(jìn)行觀察，證實(shí)在體內(nèi)的幾乎所有器官中都存在許多GFP陽性細(xì)胞，例如在肺、心臟、肝臟、腦、胃、皮膚、小腸、大腸、骨骼肌、胰腺、脾臟、腎臟和氣管內(nèi)。尤其在腦內(nèi)，在例如嗅球和脈絡(luò)叢的區(qū)域內(nèi)觀察到許多GFP陽性細(xì)胞。結(jié)果表明，通過施予G-CSF而調(diào)動進(jìn)入小鼠外周血的干細(xì)胞起著修復(fù)機(jī)體各種組織的作用。
(3)通過免疫染色鑒定GFP陽性細(xì)胞的特性將(2)中制備的冰凍切片用下面的各種抗體進(jìn)行染色，來研究GFP陽性細(xì)胞的特性。
首先，將各種器官的組織切片用抗-細(xì)胞角蛋白(anti-cytokeratin)抗體進(jìn)行免疫染色。細(xì)胞角蛋白是上皮細(xì)胞的標(biāo)記物。
將切下的皮膚所制備的冰凍切片放到載玻片上，將該玻片浸入PBS 5分鐘3次。洗滌玻片后，將其浸入用PBS稀釋到終濃度為10mg/ml的蛋白酶K(Gibco BRL制造)15分鐘。用PBS洗滌一次后，將其與固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]在室溫下反應(yīng)15分鐘。PBS洗滌兩次后，將其在室溫下浸入封閉液[10％豬血清(Dako制造)，PBS]1小時，在室溫下與由含有1.5％豬血清的PBS稀釋50倍的一抗[單克隆鼠抗人細(xì)胞角蛋白，Clones AE1/AE3](Dako制造)溶液反應(yīng)1小時。用PBS洗滌四次后，在室溫下與由含有1.5％豬血清的PBS稀釋800倍的二抗[Cy3-conjugated Affini Pure 山羊抗鼠IgG(H+L)](Seikagaku公司制造)溶液反應(yīng)1小時。用PBS洗滌四次后，將含有DAPI的Vectashield Mounting Medium(Vector Laboratories制造)滴加到切片上，用蓋玻片封片，在Zeiss制造的熒光顯微鏡Axiophot 2下進(jìn)行觀察。由于觀察到GFP陽性細(xì)胞和細(xì)胞角蛋白陽性細(xì)胞，這表明，在用于移植的、由G-CSF調(diào)動的外周血細(xì)胞內(nèi)，含有具有被帶到皮膚并分化為上皮細(xì)胞的能力的干細(xì)胞。
大腸的冰凍切片同樣用抗細(xì)胞角蛋白抗體染色，并在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果，觀察到GFP陽性細(xì)胞和細(xì)胞角蛋白陽性細(xì)胞。該結(jié)果表明，在用于移植的、由G-CSF調(diào)動的外周血細(xì)胞內(nèi)，含有具有被帶到大腸并分化為上皮細(xì)胞的能力的干細(xì)胞。
小腸的冰凍切片同樣用抗細(xì)胞角蛋白抗體和作為血細(xì)胞標(biāo)記物的CD 45抗體染色。當(dāng)在熒光顯微鏡下觀察時，觀察到GFP陽性細(xì)胞和CD 45陰性細(xì)胞。該結(jié)果表明，在用于移植的、由G-CSF調(diào)動的外周血細(xì)胞內(nèi)，含有具有被帶到小腸并分化為不同于血細(xì)胞的細(xì)胞的能力的干細(xì)胞。
接著，用抗-CD 45抗體對各種器官進(jìn)行免疫染色。
將載有切下的肺所制備的冰凍切片的載玻片，通過浸入PBS 5分鐘3次來洗滌，將該載玻片在室溫下浸入Dako生物素封閉系統(tǒng)(BiotinBlocking System)(1)溶液(Dako制造)10分鐘，用PBS洗滌兩次，在室溫下浸入Dako生物素封閉系統(tǒng)(2)溶液(Dako制造)10分鐘，再用PBS洗滌兩次。
接著，將其在室溫下浸入封閉液[10％豬血清(Dako制造)，PBS]1小時，再在室溫下與由含有1.5％豬血清的PBS稀釋100倍的一抗[生物素抗鼠CD 45(LCA，Ly 5)](BD Pharmingen制造)溶液反應(yīng)1小時。用PBS洗滌四次后，在室溫下與由含有1.5％豬血清的PBS稀釋到終濃度為5μg/ml的二抗(細(xì)菌蛋白，Alexa Fluor 594軛合物(conjugate))(Molocular Probe制造)溶液反應(yīng)1小時。用PBS洗滌四次后，將含有DAPI的Vectashield Mounting Medium(VectorLaboratories制造)滴加到切片上，用蓋玻片封片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。結(jié)果，觀察到GFP陽性細(xì)胞和CD 45陰性細(xì)胞。該結(jié)果表明，在用于移植的、由G-CSF調(diào)動的外周血細(xì)胞內(nèi)，含有具有被帶到肺并分化為不同于血細(xì)胞的細(xì)胞的能力的干細(xì)胞。
肝臟的冰凍切片同樣用抗-CD 45抗體進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察，并觀察到GFP陽性細(xì)胞和CD 45陰性細(xì)胞。該結(jié)果表明，在用于移植的、由G-CSF調(diào)動的外周血細(xì)胞內(nèi)，含有具有被帶到肝臟并分化為不同于血細(xì)胞的細(xì)胞的能力的干細(xì)胞。
心臟、腦、胃、皮膚、小腸、大腸、骨骼肌和胰腺的冰凍切片也同樣用抗-CD 45抗體進(jìn)行染色。當(dāng)在熒光顯微鏡下觀察時，每個組織內(nèi)都觀察到GFP陽性細(xì)胞和CD 45陰性細(xì)胞。該結(jié)果表明，在用于移植的、由G-CSF調(diào)動的外周血細(xì)胞內(nèi)，含有具有被帶到心臟、腦、胃、皮膚、小腸、大腸、骨骼肌和胰腺并分化為不同于血細(xì)胞的細(xì)胞的能力的干細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1具有G-CSF活性的多肽對經(jīng)過X射線照射的小鼠的腸上皮的治療效果經(jīng)過X射線照射的小鼠的腸上皮、骨髓等不會產(chǎn)生新一代的細(xì)胞(Nature Review Cancer，3，117-129(2003))。因此，將用X射線照射的小鼠制成腸上皮破壞模型來檢測通過那托司亭調(diào)動進(jìn)入外周血的細(xì)胞是否有助于修復(fù)。
(1)將通過施予那托司亭而調(diào)動進(jìn)入外周血的細(xì)胞，移植到經(jīng)過X射線照射的小鼠將每只8周齡、體內(nèi)所有細(xì)胞都整合了GFP基因并表達(dá)GFP蛋白的小鼠(C57BL/6×129系)，連續(xù)5天每天皮下注射10μg的那托司亭。至于那托司亭，使用Neu-up 100(Kyowa Hakko Kogyo有限公司制造)，將其溶解于PBS(磷酸鹽緩沖液)(pH7.4)(Life Technologies制造)使其濃度為100μg/ml。
在最后一次施用那托司亭的后一天，將每只小鼠用乙醚麻醉，從眼靜脈收集外周血，收集在一個預(yù)先裝有肝素鈉(Takeda ChemicalIndustries有限公司制造)的管內(nèi)，并令所收集的外周血經(jīng)過100-μm的細(xì)胞濾器(Becton Dickinson制造)。
將由此收集的外周血，如下所述通過從尾靜脈注入到小鼠而移植。
首先，準(zhǔn)備8周齡的C57BL/6小鼠(CLEA Japan)，在移植的前一天，預(yù)先用X射線照射裝置(Hitachi Medico制造)以12Gy劑量的X射線進(jìn)行照射。第二天，從每只小鼠的尾靜脈移植入300μl收集的外周血。其后，檢查由此所得的嵌合體小鼠能否存活至少4周(下文稱為“外周血嵌合體小鼠”)。
(2)通過具有G-CSF活性的多肽在外周血嵌合體小鼠的腸上皮細(xì)胞中調(diào)動的新生外周血源性細(xì)胞將第(1)項(xiàng)中制備的每一只外周血嵌合體小鼠解剖并灌注和固定，以切下小腸和大腸。具體地，每只外周血嵌合體小鼠通過腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(Dainippon Pharmaceutical制造)進(jìn)行麻醉，打開胸腔和腹腔，暴露心臟，將Terumo公司制造的帶翼的25G靜脈注射針插入左心室，切除右心耳，20ml的PBS流入并灌注整個身體。當(dāng)所有的PBS流盡以后，20ml的固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]通過同樣的操作流入進(jìn)行固定。
然后，切下被固定的小鼠的小腸和大腸，浸泡到4℃的固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]中2小時，用PBS沖洗，浸泡到4℃的高糖溶液(20％蔗糖，PBS)中過夜，第二天，將其切成幾個平方毫米的小塊，用OCT化合物包埋并用經(jīng)過干冰冷卻的異戊烷進(jìn)行冷凍。
這樣經(jīng)過冷凍的組織用恒冷切片機(jī)切成厚度10μm的切片，粘附在涂有APS(Matsunami制造)的載玻片上，充分干燥后制成冰凍切片。
將由此從小腸和大腸制成的冰凍組織切片用抗-細(xì)胞角蛋白抗體進(jìn)行免疫染色。細(xì)胞角蛋白是上皮細(xì)胞的標(biāo)記物。
將載有冰凍切片的載玻片浸入PBS 5分鐘3次。在洗滌玻片后，將其浸入用PBS稀釋到終濃度為10mg/ml的蛋白酶K(Gibco BRL制造)15分鐘。用PBS洗滌一次后，將其與固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]在室溫下反應(yīng)15分鐘。用PBS洗滌兩次后，將其在室溫下浸入封閉液[10％豬血清(Dako制造)，PBS]1小時，在室溫下與由含有1.5％豬血清的PBS稀釋50倍的一抗[單克隆鼠抗人細(xì)胞角蛋白，ClonesAE1/AE3(Dako制造)]溶液反應(yīng)1小時。用PBS洗滌四次后，在室溫下與由含有1.5％豬血清的PBS稀釋800倍的二抗[Cy3-conjugatedAffini Pure山羊抗鼠IgG(H+L)(Seikagaku公司制造)]溶液反應(yīng)1小時。用PBS洗滌四次后，將含有DAPI的Vectashield Mounting Medium(Vector Laboratories制造)滴加到切片上，用蓋玻片封片，并在Zeiss制造的熒光顯微鏡Axiophot 2下進(jìn)行觀察。結(jié)果，觀察到GFP陽性細(xì)胞和細(xì)胞角蛋白陽性細(xì)胞。因此證實(shí)，在被X射線照射破壞的小腸和大腸內(nèi)，各種組織的上皮細(xì)胞從用于移植的、由那托司亭調(diào)動到外周血的細(xì)胞中分化出來。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2具有G-CSF活性的多肽對四氯化碳給藥小鼠模型的肝臟的治療效果使用通過施予四氯化碳使其肝臟破壞的小鼠模型，如下檢測通過那托司亭調(diào)動到外周血的細(xì)胞是否分化為肝細(xì)胞。
首先，與實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1的第(1)項(xiàng)的方式一樣，通過將那托司亭調(diào)動的外周血從尾靜脈注入到預(yù)先用X射線照射的小鼠，制成外周血嵌合體小鼠。然后，將四氯化碳(Wako制造)通過腹腔內(nèi)注射到外周血嵌合體小鼠，劑量為2ml/kg。這里，通過用礦物油(Sigma制造)作為溶劑將四氯化碳對礦物油的體積比調(diào)整為2∶3，以制備四氯化碳。
腹腔注射2周后，將每一只小鼠以與實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1的第(2)項(xiàng)相同的方法進(jìn)行灌注和固定來切取肝臟。然后，切下固定小鼠的肝臟，浸泡到4℃的固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]中2小時，用PBS沖洗，浸泡到4℃的高糖溶液[20％蔗糖，PBS]中過夜，第二天，將其切成幾個平方毫米的小塊，用OCT化合物包埋并用經(jīng)過干冰冷卻的異戊烷進(jìn)行冷凍。
這樣經(jīng)過冷凍的組織用恒冷切片機(jī)切成厚度10μm的切片，粘附在涂有APS(Matsunami制造)的載玻片上，充分干燥后制成冰凍切片。
將如此由肝臟制成的冰凍組織切片用抗-白蛋白抗體進(jìn)行免疫染色。白蛋白是肝細(xì)胞的標(biāo)記物。
將載有用切下的肝臟制成的冰凍切片的載玻片浸入PBS 5分鐘3次。在洗滌玻片后，將其浸入室溫下的封閉液[10％豬血清(Dako制造)，PBS]1小時，在室溫下與由含有1.5％豬血清的PBS稀釋200倍的一抗[抗鼠白蛋白兔多克隆(Dako制造)]溶液反應(yīng)1小時。用PBS洗滌四次后，其在室溫下與由含有1.5％豬血清的PBS稀釋800倍的二抗[AlexaFluor 594-抗兔IgG(Molecular Probe制造)]溶液反應(yīng)1小時。用PBS洗滌四次后，將含有DAPI的Vectashield Mounting Medium(VectorLaboratories制造)滴加到切片上，用蓋玻片封片，并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。結(jié)果，觀察到形態(tài)類似于肝細(xì)胞的GFP陽性細(xì)胞和白蛋白陽性細(xì)胞。因此證實(shí)，在被四氯化碳破壞的肝臟內(nèi)，肝細(xì)胞從通過那托司亭調(diào)動到外周血的細(xì)胞中分化出來。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3具有G-CSF活性的多肽對心臟毒素給藥小鼠模型的骨骼肌的治療效果使用通過施予心臟毒素破壞其骨骼肌的小鼠模型，如下檢測通過那托司亭調(diào)動到外周血的細(xì)胞是否分化為骨骼肌纖維。
首先，與實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1的第(1)項(xiàng)中的方式一樣，通過將那托司亭調(diào)動的外周血從尾靜脈注入預(yù)先用X射線照射的小鼠，制成外周血嵌合體小鼠。將心臟毒素通過肌肉注射到外周血嵌合體小鼠的脛前肌，由此劑量為25到50μl。這里，通過溶解于PBS使得心臟毒素(Latoxan制造)濃度為1μM而使用。
接著，肌肉注射4周后，切取每一只小鼠的脛前肌，浸泡到4℃的固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]中2小時，用PBS沖洗，浸泡到4℃的高糖溶液[20％蔗糖，PBS]中過夜，第二天，將其切成幾個平方毫米的小塊，用OCT化合物包埋并用經(jīng)過干冰冷卻的異戊烷進(jìn)行冷凍。
這樣經(jīng)過冷凍的組織用恒冷切片機(jī)切成厚度10μm的切片，粘附在涂有APS(Matsunami制造)的載玻片上，充分干燥后制成冰凍切片。
將如此由脛前肌制成的冰凍組織切片用抗支架蛋白抗體進(jìn)行免疫染色。支架蛋白是骨骼肌纖維的標(biāo)記物。
將載有用切下的脛前肌制成的冰凍切片的載玻片浸入PBS 5分鐘3次。在洗滌玻片后，將其浸入用PBS稀釋到終濃度為10mg/ml的蛋白酶K(Gibco BRL制造)15分鐘。用PBS洗滌一次后，將其在室溫下與固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]反應(yīng)15分鐘。用PBS洗滌兩次后，室溫下浸入封閉液[10％豬血清(Dako制造)，PBS]1小時，在室溫下與由含有1.5％豬血清的PBS稀釋40倍的一抗[抗支架蛋白脫脂的(Delipidized)，完整抗血清D8281(Whole Antiserum D8281)(Sigma制造)]溶液反應(yīng)1小時。用PBS洗滌四次后，在室溫下與由含有1.5％豬血清的PBS稀釋800倍的二抗[Alexa Fluor 594-抗兔IgG(MolocularProbe制造)]溶液反應(yīng)1小時。用PBS洗滌四次后，將含有DAPI的Vectashield Mounting Medium(Vector Laboratories制造)滴加到切片上，用蓋玻片封片，并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。結(jié)果，觀察到GFP陽性和支架蛋白陽性的骨骼肌纖維，其在形態(tài)上被判定為骨骼肌。因此證實(shí)，在被心臟毒素破壞的骨骼肌組織內(nèi)，骨骼肌纖維從通過那托司亭調(diào)動而到外周血的細(xì)胞中分化出來。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4具有G-CSF活性的多肽對皮膚損傷小鼠模型的治療效果根據(jù)傳統(tǒng)的方法[Biological & Pharmaceutical Bulletin(Biol.Pharm.Bull.)，19，530-535(1996)]，兩只6周齡的雌性C57BL/KsJ-db/db Jcl小鼠(CLEA Japan)通過腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(Dainippon Pharmaceutical制造)進(jìn)行麻醉，在去除背側(cè)的毛后，用4mm直徑的活組織檢查環(huán)鉆(Kai Industries制造)制成皮膚全層切除傷。
從制作切除傷的那天開始(下文中記述為“0天”)，兩只小鼠中的一只在連續(xù)5天內(nèi)，每天一次皮下注射10μg/body劑量的那托司亭。另一只小鼠用PBS代替那托司亭給藥。將那托司亭(Kyowa HakkoKogyo有限公司制造)溶解于PBS，使得其濃度為100μg/ml，作為那托司亭使用。切除傷制成以后，定期測量傷口區(qū)域以計算切除傷愈合程度。傷口面積是通過用數(shù)碼相機(jī)(Nikon COOLPIX 990)對背側(cè)中心區(qū)域所制作的兩個切除傷進(jìn)行拍照，然后使用圖像分析軟件(NIHImage)測量的。除了傷口面積(mm2)，當(dāng)0天的傷口面積定為100％時的傷口面積比率，在表2中如傷口面積比率(％)所示。
表2

傷口面積(mm2)(傷口面積比率(％))如表2所示，與PBS給藥的小鼠相比，發(fā)現(xiàn)在那托司亭給藥的小鼠身上，加速了傷口面積和傷口面積比率的減少，即皮膚再生加速效果。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例5通過大鼠肺泡破壞模型進(jìn)行評估(1)將豬胰腺彈性蛋白酶(下文稱為“彈性蛋白酶”，比活度135單位/mg蛋白，Elastin Products制造)用鹽水(Otsuka Pharmaceutical制造)稀釋到70單位/ml，并將其以500μl氣管內(nèi)施于每只9周齡的雄性SD大鼠(Charles River Japan)。一個單位的彈性蛋白酶具有的活性可在pH8.8、30℃下，在20分鐘內(nèi)降解1mg彈性蛋白。兩周后，在保持每組的平均體重基本相同的情況下將其分組，每組10只小鼠。通過將GranInjection M 300(Kirin Brewery制造)溶解于鹽水使其濃度為20μg/ml而制成待用的非格司亭。在非格司亭給藥組中，施予彈性蛋白酶3周后，連續(xù)5天每天一次皮下注射劑量為100μg/kg的非格司亭。在彈性蛋白酶給藥組中，施予彈性蛋白酶后不再施予任何藥物。在鹽水給藥組中，用鹽水代替彈性蛋白酶給藥，其后不再施予任何藥物。彈性蛋白酶給藥5周后，切取肺并在25cm H2O壓力下通過呼吸道注入福爾馬林將其固定，然后通過使用切片測定肺泡破壞的程度。通過在肺切片樣本的顯微圖像上，畫5行長度和寬度各為1.325μm的方格，測量交叉于線上的肺泡壁，然后將方格線的總長除以交叉的肺泡壁的數(shù)量，計算出平均線性截取長度(Environmental Research，42，340-352(1987))。
圖1以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SE)的形式顯示平均線性截取長度。如圖1所示，通過施用彈性蛋白酶，觀察到平均線性截取長度延長，即肺泡壁的破壞。在非格司亭給藥組，16％破壞的肺泡壁得到修復(fù)。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例6通過大鼠肺泡破壞模型進(jìn)行評估(2)用實(shí)驗(yàn)實(shí)施例5同樣的方式，將那托司亭施予經(jīng)過彈性蛋白酶處理造成肺泡破壞的大鼠，并測量肺泡破壞的變化。
通過將Neu-up 250(Kyowa Hakko Kogyo有限公司制造)溶解于鹽水使其濃度為40μg/ml，從而制成待用的那托司亭。施予彈性蛋白酶3周后，連續(xù)5天每天一次皮下施用劑量為200μg/kg的那托司亭，接著的5周每周給藥3次。在彈性蛋白酶給藥組，施予彈性蛋白酶后不再施予任何藥物。在鹽水給藥組，用鹽水代替彈性蛋白酶給藥，其后不再施予任何藥物。彈性蛋白酶給藥8周后，切取肺并根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)施例5的方法分析。圖2以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SE)的形式顯示了平均線性截取長度。
如圖2所示，通過施予彈性蛋白酶，觀察到平均線性截取長度的變長，即肺泡壁的破壞。在那托司亭給藥組，35％破壞的肺泡壁得到修復(fù)。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例7通過大鼠肺泡破壞模型進(jìn)行評估(3)用實(shí)驗(yàn)實(shí)施例5同樣的方式，將全反式視黃酸(下文稱為“視黃酸”)、或那托司亭和視黃酸施予經(jīng)過彈性蛋白酶處理而造成肺泡破壞的大鼠，并測量肺泡破壞的變化。通過將視黃酸(Sigma Aldrich制造)懸浮于玉米油(Wako Pure Chemical Industries制造)使其濃度為3mg/ml，從而制成待用的視黃酸。通過將Neu-up 100(Kyowa HakkoKogyo有限公司制造)溶解于鹽水使其濃度為20μg/ml，從而制成待用的那托司亭。施予彈性蛋白酶3周后，連續(xù)5天每天一次皮下施用劑量為100μg/kg的那托司亭。施予彈性蛋白酶3周后，連續(xù)3周每天一次口服劑量為3mg/kg的視黃酸。安排一組單獨(dú)施予視黃酸(視黃酸給藥組)，而一組視黃酸和那托司亭兩者均施用(視黃酸/那托司亭給藥組)。在彈性蛋白酶給藥組，施予彈性蛋白酶后不再施予任何藥物。在鹽水給藥組，用鹽水代替彈性蛋白酶給藥，其后不再施予任何藥物。彈性蛋白酶給藥5周后，切取肺并根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)施例5的方法分析。圖3以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SE)的形式顯示了平均線性截取長度。
如圖3所示，在視黃酸給藥組，14％破壞的肺泡壁得到修復(fù)。在視黃酸/那托司亭給藥組，觀察到破壞肺泡壁的強(qiáng)烈恢復(fù)。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例8那托司亭對db/db小鼠的治療效果db/db小鼠是單隱性db基因轉(zhuǎn)基因小鼠，并且已知為II型糖尿病小鼠模型，其自發(fā)顯現(xiàn)出明顯糖尿病癥狀，例如肥胖、多食和胰島素分泌過多(Joslin’s Diabetes Mellitus，pp.317-349(1995))。由于肥胖大約發(fā)生在db/db小鼠出生后4到5周，并且血糖水平隨著體重的增加而增高，所以認(rèn)為高血糖狀態(tài)導(dǎo)致整個機(jī)體器官的組織破壞，例如炎癥。因此，經(jīng)過X射線照射的db/db小鼠，用來檢測通過那托司亭調(diào)動到外周血的細(xì)胞是否有助于組織修復(fù)。
(1)移植骨髓細(xì)胞到經(jīng)過X射線照射的db/db小鼠首先，在移植通過那托司亭調(diào)動到外周血的細(xì)胞之前，移植骨髓細(xì)胞。
6周齡的雌性C57BL/KsJ-db/db小鼠(CLEA Japan)用作db/db小鼠，并在移植前一天用X射線照射裝置(Hitachi Medico制造)以12Gy劑量的X射線進(jìn)行照射。第二天，從尾靜脈給每只小鼠移植3×106個分離自一只8周齡的、體內(nèi)所有細(xì)胞都整合了GFP基因并表達(dá)GFP蛋白的小鼠(C57BL/6×129系)的骨髓的細(xì)胞。
移植4周后，將每只小鼠解剖，并灌注和固定以切下每個器官。
具體地，小鼠通過腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(DainipponPharmaceutical制造)進(jìn)行麻醉，打開腹腔和胸腔以暴露心臟，將Terumo公司制造的帶翼的25G靜脈注射針插入左心室，切掉右心耳，20ml的PBS流入并灌注整個身體。當(dāng)所有的PBS流盡后，用20ml的固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]通過同樣的操作流入進(jìn)行固定。
然后，切下固定小鼠的所有器官，浸泡到4℃的固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]中2小時，用PBS沖洗，浸泡到4℃的高糖溶液[20％蔗糖，PBS]中過夜，第二天，將其切成幾平方毫米的小塊，用OCT化合物包埋并用經(jīng)過干冰冷卻的異戊烷進(jìn)行冷凍。
這樣經(jīng)過冷凍的組織用恒冷切片機(jī)切成厚度10μm的切片，粘附在涂有APS(Matsunami制造)的載玻片上，充分干燥后制成冰凍切片。
將這樣制成的每個器官的冰凍組織切片用不同的抗體進(jìn)行免疫染色。
結(jié)果，在肝臟切片中觀察到GFP陽性細(xì)胞和白蛋白抗體陽性細(xì)胞。同樣，在胰腺切片中觀察到GFP陽性細(xì)胞和胰島素抗體陽性細(xì)胞，在心肌切片中觀察到GFP陽性細(xì)胞和肉瘤α-肌動蛋白抗體陽性細(xì)胞。此外，在腦切片中觀察到具有神經(jīng)元樣形狀的GFP陽性細(xì)胞，和具有浦肯野氏細(xì)胞特有的樹突狀的GFP陽性細(xì)胞。
因此證實(shí)，在經(jīng)過X射線照射的db/db小鼠的移植試驗(yàn)中，肝細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元和浦肯野氏細(xì)胞從骨髓細(xì)胞中分化出來。
(2)將通過施用那托司亭調(diào)動到外周血的細(xì)胞移植到經(jīng)過X射線照射的db/db小鼠接著，將通過施用那托司亭調(diào)動到外周血的細(xì)胞，以與上述第(1)項(xiàng)同樣的方式，移植到經(jīng)過X射線照射的db/db小鼠。
首先，每只8周齡的、體內(nèi)所有細(xì)胞都整合了GFP基因并表達(dá)GFP蛋白的小鼠(C57BL/6×129系)，連續(xù)5天每天皮下注射10μg的那托司亭。至于那托司亭，是通過將Neu-up 100(Kyowa Hakko Kogyo有限公司制造)溶解于PBS(磷酸鹽緩沖液)(pH 7.4)(Life Technologies制造)中，使其濃度為100μg/ml而使用的。
最后一次施用那托司亭的后一天，每只小鼠用乙醚進(jìn)行麻醉，從眼靜脈收集外周血，收集在一個預(yù)先裝有肝素鈉(Takeda ChemicalIndustries有限公司制造)的管內(nèi)，令所收集的外周血經(jīng)過100-μm的細(xì)胞濾器(Becton Dickinson制造)。
將這樣所收集到的外周血，如下所述通過從尾靜脈注入到db/db小鼠進(jìn)行移植。
首先，將6周齡的雌性C57BL/KsJ-db/db小鼠(CLEA Japan)作為待接收移植的db/db小鼠，并在移植前一天用X射線照射裝置(Hitachi Medico制造)以9.5Gy劑量的X射線進(jìn)行照射。第二天，從尾靜脈對每只小鼠移植300μl劑量的所收集的外周血。
移植4周后，將每只小鼠解剖，并灌注和固定以及切下每個器官，并將所有器官包埋而制成冰凍切片。
將由此冰凍的每個器官的切片用不同的抗體進(jìn)行免疫染色。
結(jié)果，在肝臟切片中觀察到GFP陽性細(xì)胞和白蛋白抗體陽性細(xì)胞。同樣，在胰腺切片中觀察到GFP陽性細(xì)胞和胰島素抗體陽性細(xì)胞，在心肌切片中觀察到GFP陽性細(xì)胞和肉瘤α-肌動蛋白抗體陽性細(xì)胞，在小腸和胃切片中觀察到GFP陽性細(xì)胞和細(xì)胞角蛋白抗體陽性細(xì)胞。此外，在腦切片中觀察到NeuN抗體陽性細(xì)胞和具有神經(jīng)元樣形狀的GFP陽性細(xì)胞。而且，在肺切片中觀察到位于肺泡上皮細(xì)胞處的GFP陽性細(xì)胞。
因此證實(shí)，在經(jīng)過X射線照射的db/db小鼠的移植試驗(yàn)中，肝細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞、心肌細(xì)胞、小腸上皮細(xì)胞、胃上皮細(xì)胞、神經(jīng)元和肺泡上皮細(xì)胞，從由那托司亭調(diào)動到外周血的細(xì)胞中分化出來。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例9那托司亭對骨髓嵌合體小鼠的作用將6周齡的雌性C57BL/6小鼠(CLEA Japan)和6周齡的雌性C57BL/KsJ-db/db小鼠(CLEA Japan)用X射線照射裝置(HitachiMedical Corp.制造)以9.5Gy劑量的X射線進(jìn)行照射。第二天，從尾靜脈給每只小鼠移植3×106個分離自一只6到8周齡的、表達(dá)GFP蛋白的雄性小鼠(C57BL/6×129系)的骨髓的細(xì)胞。
將小鼠分成那托司亭給藥組和對照組，并進(jìn)行下列處理。對那托司亭給藥組，移植7天后，每只小鼠連續(xù)14天每天皮下注射10μg的那托司亭。至于那托司亭，是通過將Neu-up(Kyowa Hakko Kogyo有限公司制造)溶解于PBS使其濃度為100μg/ml而使用的。同樣，對于對照組，移植7天后，用PBS代替那托司亭連續(xù)給藥14天。
骨髓移植1個月后，將每只小鼠解剖，并灌注和固定以切下肝臟、肺和腎臟。具體地，每只外周血嵌合體小鼠通過腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(Dainippon Pharmaceutical制造)進(jìn)行麻醉，打開腹腔和胸腔以暴露心臟，將Terumo公司制造的帶翼的25G靜脈注射針插入左心室，切掉右心耳，20ml的PBS流入并灌注整個身體。其后，20ml的固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]通過同樣的操作流入進(jìn)行固定。然后，將肺連同氣管按照原狀一起切下，將裝有與Surflow留置針(20G)(Terumo公司制造)相連的導(dǎo)管、含有用PBS稀釋兩倍的OCT化合物(Miles制造)的20-ml注射器插入氣管，通過絲制縫合線(Natsume Seisakusho制造)將導(dǎo)管的頂端與氣管相連，通過氣管將10ml用PBS稀釋兩倍的OCT溶液注入肺內(nèi)。注射完畢后，將肺切成幾平方毫米的小塊，用OCT化合物包埋并用經(jīng)過干冰冷卻的異戊烷進(jìn)行冷凍。同樣也切下每只小鼠的肝臟和腎臟，浸泡到4℃的固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]中2小時，用PBS沖洗，浸泡到4℃的高糖溶液[20％蔗糖，PBS]中過夜，第二天，將其切成幾平方毫米的小塊，用OCT化合物包埋并用經(jīng)過干冰冷卻的異戊烷進(jìn)行冷凍。這樣經(jīng)過冷凍的組織用恒冷切片機(jī)切成厚度10μm的切片，粘附在涂有APS(Matsunami制造)的載玻片上，充分干燥后制成冰凍切片。
在這樣制成的冰凍組織切片中，將肝臟切片用抗-白蛋白抗體進(jìn)行免疫染色。白蛋白是肝細(xì)胞的標(biāo)記物。
將載有用切下的肝臟制成的冰凍切片的載玻片浸入PBS 5分鐘3次。在洗滌玻片后，室溫下浸入封閉液[10％豬血清(Dako制造)，PBS]1小時，室溫下與由含有1.5％豬血清的PBS稀釋200倍的一抗[抗鼠白蛋白兔多克隆(Dako制造)]溶液反應(yīng)1小時。用PBS洗滌四次后，在室溫下與由含有1.5％豬血清的PBS稀釋800倍的二抗[Alexa Fluor594-抗兔IgG(Molecular Probe制造)]溶液反應(yīng)1小時。用PBS洗滌四次后，將含有DAPI的Vectashield Mounting Medium(VectorLaboratories制造)滴加到切片上，用蓋玻片封片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。
每個小鼠制作30張冰凍切片，計量GFP陽性細(xì)胞和白蛋白陽性細(xì)胞的數(shù)目。圖4以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式顯示了單位面積的GFP陽性細(xì)胞和白蛋白陽性細(xì)胞的數(shù)目。如圖4所示，那托司亭給藥組的C57BL/6小鼠增加了大約4.5倍，那托司亭給藥組的C57BL/KsJ-db/db小鼠增加了大約4.8倍。因此，通過施用那托司亭，分化為肝細(xì)胞的骨髓源性細(xì)胞得到增加。
進(jìn)一步，計量肺和腎臟冰凍切片的GFP陽性細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過施用那托司亭，增加了GFP陽性細(xì)胞的數(shù)目。


圖1顯示了施用彈性蛋白酶后的肺泡平均線性截取長度的變化，和施用非格司亭的作用?？v座標(biāo)表示平均線性截取長度(μm)。
圖2顯示了施用彈性蛋白酶后的肺泡平均線性截取長度的變化，和施用那托司亭的作用?？v座標(biāo)表示平均線性截取長度(μm)。##代表P＜0.01(與彈性蛋白酶給藥組比較，威耳康松氏秩和檢驗(yàn))。
圖3顯示了施用彈性蛋白酶后的肺泡平均線性截取長度的變化，和施用視黃酸或視黃酸/那托司亭的作用?？v座標(biāo)表示平均線性截取長度(μm)。##代表P＜0.01(與彈性蛋白酶給藥組比較，威耳康松氏秩和檢驗(yàn))。
圖4顯示了那托司亭給藥或無那托司亭給藥后的每單位面積的GFP陽性細(xì)胞和白蛋白陽性細(xì)胞的數(shù)目。縱坐標(biāo)的單位是細(xì)胞數(shù)/cm2。#代表P＜0.05(Student’s t-test)。WT和db分別代表C57BL/6小鼠組和C57BL/KsJ-db/db小鼠組。
具體實(shí)施例方式
下面基于實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明不限于此。
實(shí)施例1注射劑(那托司亭)根據(jù)常用的方法，制備具有下列組分的注射劑。
那托司亭25μg聚山梨醇酯802.5g乳糖5mg鹽水0.5ml實(shí)施例2注射劑(那托司亭和全反式視黃酸的單一制劑)根據(jù)常用的方法，制備具有下列組分的注射劑。
那托司亭25μg全反式視黃酸1.0mg聚山梨醇酯802.5g乳糖5mg鹽水0.5ml產(chǎn)業(yè)上的適用性本發(fā)明提供用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑，其含有粒細(xì)胞集落刺激因子作為活性成分。
序列表<110>協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社<120>
<130>11570WO1<150>JP 2003-139604<151>2003-05-16<160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>174<212>PRT<213>智人<400>1Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val35 40 45Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys50 55 60Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser65 70 75 80Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser85 90 95Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp100 105 110Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro115 120 125Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe130 135 140Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe145 150 155 160Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro165 170
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑，其含有具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽作為活性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥劑，其中所述的多肽含有由SEQ IDNO1所代表的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥劑，其中所述的多肽由SEQ ID NO1所代表的氨基酸序列中至少一個氨基酸殘基被刪除、取代和/或增加的氨基酸序列組成，并且具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥劑，其中所述的多肽由與SEQ ID NO1所代表的氨基酸序列有80％或更多的同源性的氨基酸序列組成，并且具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任意一項(xiàng)所述的藥劑，其中所述的多肽是具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的化學(xué)修飾多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥劑，其中所述的多肽用聚亞烷基二醇修飾。
7.一種用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑，其含有(a)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽和(b)視黃酸或視黃酸衍生物，其中(a)和(b)可同時給藥，或間隔一段時間分別給藥，或作為含有(a)和(b)兩者的單一藥物給藥。
8.一種用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑，其含有(a)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽和(b)CXCR4抑制劑，其中(a)和(b)可同時給藥，或間隔一段時間分別給藥，或作為含有(a)和(b)兩者的單一藥物給藥。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥劑，其中所述的CXCR4抑制劑是AMD-3100或其衍生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到9中任意一項(xiàng)所述的藥劑，其中所述的伴有組織破壞的疾病選自神經(jīng)疾病、循環(huán)器官系統(tǒng)疾病、肝臟疾病、胰腺疾病、消化道系統(tǒng)疾病、腎臟疾病、皮膚疾病和肺疾病。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥劑，其中所述的神經(jīng)疾病選自腦梗塞、腦血管意外、帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈病、脊髓損傷、抑郁癥和躁狂抑郁性精神病。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥劑，其中所述的循環(huán)器官系統(tǒng)疾病選自阻塞性血管疾病、心肌梗塞、心臟衰竭和冠狀動脈疾病。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥劑，其中所述的肝臟疾病選自乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝炎、肝硬化和肝功能不全。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥劑，其中所述的胰腺疾病選自糖尿病和胰腺炎。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥劑，其中所述的消化道系統(tǒng)疾病選自克朗氏病和潰瘍性結(jié)腸炎。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥劑，其中所述的腎臟疾病選自IgA腎病、腎小球腎炎和腎功能不全。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥劑，其中所述的皮膚疾病選自褥瘡、燒傷、縫合傷、撕裂傷、切割傷、咬傷、皮炎、阿利貝爾氏瘢痕瘤、瘢痕瘤、糖尿病性潰瘍、動脈性潰瘍和靜脈性潰瘍。
18.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥劑，其中所述的肺疾病選自肺氣腫、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、囊性纖維化、突發(fā)性間質(zhì)性肺炎(肺纖維化)、彌漫性肺纖維化、結(jié)核或哮喘。
19.一種將多能干細(xì)胞從組織調(diào)動到外周血的藥物，其含有具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽作為活性成分。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的藥物，其中所述的多肽含有由SEQ IDNO1所代表的氨基酸序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的藥物，其中所述的多肽由SEQ ID NO1所代表的氨基酸序列中至少一個氨基酸殘基被刪除、取代和/或增加的氨基酸序列組成，并且具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的藥物，其中所述的多肽由與SEQ IDNO1所代表的氨基酸序列有80％或更多的同源性的氨基酸序列組成，并且具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性。
23.根據(jù)權(quán)利要求19到22中任意一項(xiàng)所述的藥物，其中所述的多肽是具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的化學(xué)修飾多肽。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的藥物，其中所述的多肽用聚亞烷基二醇修飾。
25.一種將多能干細(xì)胞從組織調(diào)動到外周血的藥物，其含有(a)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽和(b)視黃酸或視黃酸衍生物，其中(a)和(b)可同時給藥，或間隔一段時間分別給藥，或作為含有(a)和(b)兩者的單一藥物給藥。
26.一種將多能干細(xì)胞從組織調(diào)動到外周血的藥物，含有(a)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽和(b)CXCR4抑制劑，其中(a)和(b)可同時給藥，或間隔一段時間分別給藥，或作為含有(a)和(b)兩者的單一藥物給藥。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的藥物，其中所述的CXCR4抑制劑是AMD-3100或其衍生物。
28.一種用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的方法，包括施予具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽。
29.一種用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的方法，包括同時施予或間隔一段時間分別施予(a)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽和(b)視黃酸或視黃酸衍生物。
30.一種用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的方法，包括同時施予或間隔一段時間分別施予(a)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽和(b)CXCR4抑制劑。
31.一種將多能干細(xì)胞從組織調(diào)動到外周血的方法，包括施予具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽。
32.一種將多能干細(xì)胞從組織調(diào)動到外周血的方法，包括同時施予或間隔一段時間分別施予(a)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽和(b)視黃酸或視黃酸衍生物。
33.一種將多能干細(xì)胞從組織調(diào)動到外周血的方法，包括同時施予或間隔一段時間分別施予(a)具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽和(b)CXCR4抑制劑。
34.具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽在制備用于預(yù)防和/或治療伴有組織破壞的疾病的藥劑中的用途。
35.具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽在制備用于將多能干細(xì)胞從組織調(diào)動到外周血的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及伴有組織破壞的疾病的預(yù)防劑和/或治療劑，其含有具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽作為活性成分；本發(fā)明還涉及將多能干細(xì)胞從組織調(diào)動到外周血的藥物，其含有具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽作為活性成分。
文檔編號A61K31/203GK1816345SQ20048001867
公開日2006年8月9日 申請日期2004年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月16日
發(fā)明者櫻田一洋, 山田陽史, 安藤博司, 佐藤秀尚, 橫山裕美, 石原正彥, 三木一郎, 吉松亞紀(jì)子 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社