人參皂甙治療艾滋病的新用途的制作方法

專利名稱：人參皂甙治療艾滋病的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療艾滋病的藥物。具體而言，本發(fā)明涉及使用從人參中提取的物質(zhì)某類人參皂苷用于治療艾滋病的新用途。本發(fā)明還涉及含有該人參皂苷的組合物用于治療艾滋病的用途。本發(fā)明還涉及用于治療艾滋病的選自人參(panax ginseng C.A.Mey)、西洋參(Radixpanacis quinquefolii)、絞股藍(lán)(gymostemma pentaphyllum(thunb)makino)、三七(panax notoginseng(burk.)F.H.Chen.)、竹節(jié)人參(panax japonicus C.A.Meyer)和珠子參(panax japonicus var.major(burk.)Wu et Feng)的根、莖或葉的該類皂甙。
背景技術(shù)：
人參根味甘、微苦、性溫，具有調(diào)氣養(yǎng)血、安神益智、生津止咳、滋補(bǔ)強(qiáng)身之功效，被譽(yù)為“百草之王”，在中國自古就是調(diào)理身體的優(yōu)選藥物。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，人參主要有以下調(diào)理機(jī)能1.人參對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜作用，對(duì)很多興奮藥有對(duì)抗作用，并能減輕中樞抑制藥的抑制作用。人參皂甙Rb類對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜作用，而Rg類則可能有弱的興奮作用，但劑量過大則呈抑制作用。人參對(duì)中樞神經(jīng)不但能改善興奮過程，也能加強(qiáng)抑制過程，使抑制趨于集中，使分化更完全。
2.人參有抗疲勞作用。人參二醇、人參三醇和各種人參皂甙有抗疲勞作用，其中人參三醇的作用比人參二醇強(qiáng)1倍以上。有人認(rèn)為人參流浸膏能導(dǎo)致對(duì)糖元和高能磷酸化合物更經(jīng)濟(jì)的利用，增強(qiáng)乳酸、丙酮酸的代謝，通過有氧氧化，為肌肉活動(dòng)及時(shí)提供能量。
3.人參對(duì)麻醉動(dòng)物，小劑量可使血壓上升，大劑量可使血壓下降，但人參的治療劑量對(duì)患者血壓并無明顯影響；人參皂甙對(duì)麻醉動(dòng)物有輕微而短暫的降壓作用。人參水浸劑有類似強(qiáng)心甙的作用，可使收縮幅度加強(qiáng)，心率減慢。
4.人參能加強(qiáng)機(jī)體對(duì)多種有害因素的非特異性抵抗力。如對(duì)物理的(冷凍、高溫、過度運(yùn)動(dòng)、高壓或低壓)、化學(xué)的(如各種毒劑、麻醉藥物)、生物的(異種血清、微生物、移植瘤)不良影響，均能增強(qiáng)機(jī)體的抵抗。
5.人參對(duì)正常兔及用四氧嘧啶、腎上腺素引起高血糖的大鼠及狗都有降低血糖的作用，但不能代替胰島素。
6.人參提取物具有促性腺作用，人參皂甙A、C、F都具有相似強(qiáng)度的促性腺活性。
7.人參的總皂甙殆無溶血作用，而有微弱的抗皂甙或卵磷脂引起的溶血作用。近年的實(shí)驗(yàn)表明，人參總皂甙中以Rh、Rg和Rf為主的部分(即以原人參三醇為甙元的皂甙)有溶血作用，而以Rc和Rb為主的部分(即以原人參二醇為甙元的皂甙)有抗溶血作用。
8.人參提取物注射可使兔骨髓等處紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin)的含量升高。無論口服或體外直接加人參提取物，都能促進(jìn)骨髓細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的生物合成，其有效成分至少有部分是人參皂甙(特別是Rb2，Rg1等)。灌胃有抗利尿作用。
9.人參對(duì)垂體腎上腺系統(tǒng)的機(jī)能有良好的影響。表現(xiàn)為人參在使動(dòng)物對(duì)不利條件(高溫、低溫、長(zhǎng)時(shí)期游泳等)的耐受力提高的同時(shí)，也減輕應(yīng)激引起的腎上腺機(jī)能改變。
10.人參能促進(jìn)蛋白質(zhì)及核酸的合成。近年來的研究證明，人參提取物能明顯促進(jìn)大鼠肝、腎、骨髓、睪丸細(xì)胞的核酸及蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)血清蛋白質(zhì)的合成。
許多實(shí)驗(yàn)表明，人參可提高動(dòng)物與人的體力及智力活動(dòng)能力，并能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)各種有害刺激的非特異性抵抗力，在治療劑量下對(duì)正常生理功能無干擾亦無副作用，是一類有益無害的全身性強(qiáng)壯滋補(bǔ)藥。
在發(fā)現(xiàn)人參的上述藥物作用的基礎(chǔ)上，科技工作者對(duì)人參提取物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在人參中起作用的主要含30多種人參皂甙，如Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg、Rh1、Rh2、F2，和擬人參甙F1，RTs及西洋參皂甙LI等，這些人參皂苷的藥理研究主要有抗衰老作用、增強(qiáng)免疫功能的作用、降低血脂的作用，并能引起心臟及血管的一些改變。但迄今為止，尚沒有關(guān)于人參、人參提取物或任何一種人參皂苷能治療艾滋病的公開。艾滋病即“人類獲得性免疫缺損”綜合癥疾病的簡(jiǎn)稱。其病原為“艾滋病毒(HIV)”，主要侵犯人體免疫系統(tǒng)，尤其是CD4淋巴細(xì)胞，最后摧毀機(jī)體免疫功能，引發(fā)條件性感染，導(dǎo)致死亡。
抗艾滋病毒藥物的研究，第一個(gè)被報(bào)道的是蘇拉明(Suramin)，1985年發(fā)現(xiàn)AZT具有體外抗艾滋病毒的活性，1986年進(jìn)行了臨床研究，1987年AZT作為第一個(gè)被美國批準(zhǔn)用于治療艾滋病的藥，其主要問題是毒性和抗藥性，以后又有其它藥物出現(xiàn)，到目前為止被美國批準(zhǔn)的抗艾滋病毒藥有20個(gè)，按其作用機(jī)理主要屬于三類，除2002年底批準(zhǔn)的T20是作用于阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞之外，其它均是即病毒逆轉(zhuǎn)酶抑制劑，如AZT、DDC、DDI等，和病毒蛋白酶抑制劑，其中后者在美國FDA批準(zhǔn)了5種藥物，分別是沙奎那維(saquinavir)、利托那韋(ritonavir)、indinavir硫酸鹽、奈非那韋(nefinavir)等，1995年，美國科學(xué)家采用兩種逆轉(zhuǎn)酶抑制劑和一種蛋白酶抑制劑聯(lián)合用藥，即現(xiàn)在應(yīng)用的高活性抗逆轉(zhuǎn)酶療法(HAART)，組合的藥稱之為“三聯(lián)”，此療法提高了療效，進(jìn)一步延長(zhǎng)了病人壽命，至今應(yīng)用6-7年，尚有少數(shù)病人活存。
目前我國已有三種藥配制HAART療法的藥，但只有抗逆轉(zhuǎn)錄酶的藥物，缺乏抑制蛋白酶的藥物，而且毒性很大，有近20％的病人不能服用。因此在應(yīng)用中仍面臨毒性和抗藥性問題。如前所述，T20雖然可以阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞，但由于T20是一種肽類，不能口服，只能注射，且價(jià)格十分昂貴。因此迫切需要毒性小的抗艾滋病毒藥物。
祖國醫(yī)藥是一個(gè)偉大的寶庫，值得挖掘發(fā)揚(yáng)。發(fā)明人經(jīng)過十多年的研究，找到一些中藥提取物或組分或單一成分具有確切的抗艾滋病毒的活性，研究了其抗艾滋病毒作用的靶點(diǎn)，并明顯提高機(jī)體免疫功能，具有比HAART價(jià)格便宜、毒性小等的優(yōu)勢(shì)，而且由于HAART療法有抗藥性，需要不斷更新治療組合的藥物，因此，中藥治療艾滋病具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人參提取物的達(dá)瑪甾烷(dammarane)型化合物(也叫四環(huán)三萜達(dá)瑪烷型皂苷)具有明顯的治療艾滋病的作用。
因此，本發(fā)明一方面涉及具有以下通式I的化合物用于制備抗艾滋病藥物在治療艾滋病中的用途 其中，R1是-Glc2-Glc，R2選自-Glc6-Glc、-Glc6-Ara(p)、-Glc6-Xyl和-Glc6-Ara(f)；以及R3是H。優(yōu)選地，所述的R1是-Glc2-Glc，R2是-Glc6-Xyl，以及R3是H。
所述的化合物的給藥劑量是0.03～0.50mg/ml。
所述的化合物可以以口服、透皮、注射、吸入或粘膜的方式給予。
本發(fā)明的化合物可以與其它抗艾滋病毒藥物聯(lián)合應(yīng)用，并具有協(xié)同增效功能。所述的其它抗艾滋病毒藥物可以是AZT或其它已產(chǎn)生了抗性的藥物，所述的其它藥物可以是AZT、DDC、DDI、沙奎那維(saquinavir)、利托那韋(ritonavir)、indinavir硫酸鹽、奈非那韋(nefinavir)或其結(jié)合。所述的化合物可以對(duì)其它耐藥毒株亦有效。
本發(fā)明還涉及具有以下通式I的化合物作為活性成分的藥物組合物用于制備治療艾滋病的藥物中的用途 其中，R1是-Glc2-Glc，R2選自-Glc6-Glc、-Glc6-Ara(p)、-Glc6-Xyl和-Glc6-Ara(f)；以及R3是H。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有以下通式I的化合物
其中，R1是-Glc2-Glc，R2選自-Glc6-Glc、-Glc6-Ara(p)、-Glc6-Xyl和-Glc6-Ara(f)；以及R3是H。
所述的組合物可以選自人參(panax ginseng C.A.Mey)、西洋參(Radix panacis quinquefolii)、絞股藍(lán)(gymostemma pentaphyllum(thunb)makino)、三七(panax notoginseng(burk.)F.H.Chen.)、竹節(jié)人參(panax japonicus C.A.Meyer)和珠子參(panax japonicusvar.major(burk.)Wu et Feng)的根、莖或葉。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述的組合物用于制備治療艾滋病的藥物中的用途。所述的組合物亦可以對(duì)艾滋病的耐藥株有效。所述的組合物可以來自上述植物的根、莖或/和葉。另外，來自所述的植物的干粉也應(yīng)該函蓋在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明還涉及含有作為活性成份的本發(fā)明的提取物或化合物和常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。
本發(fā)明化合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。用于此目的時(shí)，如果需要，可將本發(fā)明的提取物或化合物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為藥物使用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br> 本發(fā)明提取物或化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等，優(yōu)選口服。
本發(fā)明提取物或化合物或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射和皮內(nèi)注射等。
給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其他劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等。
本發(fā)明提取物或化合物可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。其它載體如聚丙烯酸樹脂類、脂質(zhì)體，水溶性載體如PEG4000和PEG6000、PVP等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
例如為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。
例如為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分本發(fā)明提取物或化合物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。
例如，將本發(fā)明提取物或化合物制成注射用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的。
此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。
本發(fā)明提取物或化合物、藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重、性格及個(gè)體反應(yīng)，給藥途徑、給藥次數(shù)、治療目的，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來講，本發(fā)明中藥學(xué)成分的使用劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明化合物組合物中最后的制劑中所含有的實(shí)際藥物數(shù)量，加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達(dá)到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預(yù)防或治療目的。本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍本發(fā)明的提取物或化合物的用量為0.03～0.50mg/Kg體重。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥這受限于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及包括運(yùn)用其它治療手段的給藥方案。
本發(fā)明中可以對(duì)植物中含量少活性強(qiáng)的微量成分用人工仿生半合成的方法，制備該類化合物，從而獲得足量的化合物供藥用。


圖1表明Rb3體外抑制艾滋病病毒的作用靶點(diǎn)分析圖。
圖2A、B為檢測(cè)JHR、Rb3對(duì)gp41蛋白的結(jié)合圖示。
圖3為檢測(cè)Rb3對(duì)gp120蛋白的結(jié)合圖示。
圖4為檢測(cè)JHR對(duì)CD4受體的作用圖，A為對(duì)照組，B為給藥組。
圖5為JHR對(duì)CXCR4、CCR5輔助受體的作用。
圖6為JHR體外抑制艾滋病毒作用靶點(diǎn)分析圖。
具體實(shí)施例方式
發(fā)明人研究抗艾滋病毒藥物，一方面以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)為基礎(chǔ)，十分重視艾滋病治療中抗病毒的重要性，亦要考慮對(duì)免疫功能的影響，經(jīng)過體外抗病毒實(shí)驗(yàn)的篩選，選擇具有抗病毒，及可增強(qiáng)機(jī)體免疫功功能的藥物，并結(jié)合中醫(yī)辨癥，以滋陰清熱，益氣補(bǔ)血，活血消淤，滋補(bǔ)肝腎的原則，組合藥物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有以下通式I的化合物 其中，R1是-Glc2-Glc，R2選自-Glc6-Glc、-Glc6-Ara(p)、-Glc6-Xyl和-Glc6-Ara(f)；以及R3是H。優(yōu)選地，所述的R1是-Glc2-Glc，R2是-Glc6-Xyl，以及R3是H。
可以用于治療艾滋病。
上述通式I的化合物是公知化合物，可以根據(jù)本領(lǐng)域文獻(xiàn)報(bào)道的提取或合成方法合成。
具體講，本發(fā)明優(yōu)選的具體化合物包括Rb1、Rb2，Rb3，Rc，等等，其中Rb2和Rb3是本技術(shù)領(lǐng)域已知的具有相同結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體。
Rh1
Rb2 Rb3
Rc 所述的具有通式I的化合物最初是從人參中提取的，但經(jīng)過發(fā)明人的大量的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在多種植物中都含有通式I的化合物，所述的植物包括但不限于人參(panax ginseng C.A.Mey)、西洋參(Radix panacisquinquefolii)、絞股藍(lán)(gymostemma pentaphyllum(thunb)makino)、三七(panax notoginseng(burk.)F.H.Chen.)、竹節(jié)人參(panax japonicus C.A.Meyer)和珠子參(panax japonicus var.major(burk.)Wu et Feng)以及其它任何含有通式I的植物。所述的具有通式I的化合物不僅在上述植物的根中存在，在其莖與葉中都以一定的含量存在。
本發(fā)明所述的組合物可以含有一種以上的以下通式I的化合物 其中，R1是-Glc2-Glc，R2選自-Glc6-Glc、-Glc6-Ara(p)、-Glc6-Xyl和-Glc6-Ara(f)；以及R3是H。
組合物中各組分存在的比例優(yōu)選Rbl15-20wt％，Rb215-20wt％，Rb330-90wt％，Rc30-90wt％。
因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解的是，由于上述具有通式I的化合物具有治療艾滋病的作用，所以任何含有上述通式I的化合物的植物應(yīng)該具有治療艾滋病的用途，因此，含有上述通式I的化合物的植物的組合物、混合物、研磨物都函蓋在本發(fā)明保護(hù)的范圍之內(nèi)。
以下以實(shí)施例的方式闡明本發(fā)明的化合物具有抗艾滋病病毒的作用。
實(shí)施例1體外實(shí)驗(yàn)分別用HIV-1病毒感染三種細(xì)胞(MT4，Hela-CD4，PBMC)，觀察根據(jù)實(shí)施例1制備的人參組合物(JHR)對(duì)HIV-1復(fù)制的抑制作用。
1.MT4細(xì)胞病毒HIV-1，NL4方法將人參組合物配制成1mg/ml的濃度，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋成不同濃度備用。其中對(duì)所述的人參組合物進(jìn)行的分析表明，其中含有15wt％的Rbl、33wt％的Rc、17wt％的Rb2以及35wt％的Rb3。①在96孔培養(yǎng)板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，于各孔加入100μl藥液，每個(gè)濃度藥液至少設(shè)兩個(gè)孔。另取新鮮培養(yǎng)的MT4細(xì)胞，每管5×105細(xì)胞，加HIV-1病毒1×103TCID50/ML，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，兩小時(shí)后離心，棄去上清，再用RPMl1640洗一次，去除游離的病毒，加培養(yǎng)基到5×105/1ml。于96孔板每個(gè)加有藥的孔中加入100μL此感染HIV-1的細(xì)胞(5×104/100u L)二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。第三天換藥，于孔中吸出100μL上清，加入100μL與本孔相同濃度的新鮮藥液，對(duì)照組加入100μL培養(yǎng)基。第六天，各孔取上清，采用Microelisa方法及試劑，測(cè)定P24抗原量。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)病毒對(duì)照，細(xì)胞對(duì)照及AZT陽性藥對(duì)照，根據(jù)所測(cè)P24抗原量按下列公式計(jì)算抑制率 不同濃度藥液所得的不同抑制率，經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理，求得半數(shù)制率量(IC50)。
在MT4細(xì)胞株藥物JHR的半數(shù)抑制量IC50＝105.2ug/ml。
2.Hela-CD4細(xì)胞病毒HIV的單一生活周期的報(bào)告病毒(Single-life-cycle reportervirus)由帶HIV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染而得。
方法24孔板接種Hela-CD4-LTR--gal細(xì)胞0.4×105/孔，放置24小時(shí)，使之吸附，貼壁，第二天，吸去孔中上清，加100ul藥(藥對(duì)照)或藥及HIV-1(可不同濃度藥液)或培養(yǎng)基(Mock)，兩小時(shí)后各孔加入200μl相同藥液或培養(yǎng)基，CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48小時(shí)，按下列方法檢測(cè)。
固定各孔吸去上清加入固定液(1ml)再以K4[Fe(CN)6]·3H2O，K3[Fe(CN)6]及X-gel染色。
計(jì)數(shù)每孔蘭色細(xì)胞數(shù)以下列公式計(jì)算抑制率，再計(jì)算IC50。
表1體外抑制HIV-1在細(xì)胞內(nèi)(HeLa-CD4細(xì)胞)的復(fù)制(MAGI test)劑量(mg/ml)抑制率(％)1. 0.5020 1002. 0.1255 98.83. 0.0313 26.24. 0.0078 0結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hela-CD4細(xì)胞株的半數(shù)抑制量IC50＝44.3ug/ml。
3、PBMC細(xì)胞病毒NL4-3。
方法以醫(yī)院中新鮮取得的PBMC(人外周血新分離的淋巴細(xì)胞)，計(jì)數(shù)、離心1200rpm棄去上清，配成3×106細(xì)胞/ml。所用培養(yǎng)基應(yīng)加入IL2.(1000×的IL2按每ml培養(yǎng)基中加入1μl)37°C過夜。實(shí)驗(yàn)以5×106為一感染單位，JHR濃度為0.4mg/ml相同濃度設(shè)兩孔，病毒對(duì)照兩孔，細(xì)胞對(duì)照也設(shè)兩孔，24孔板每孔5×106細(xì)胞在0.5ml藥液或培養(yǎng)基中，NL4.3病毒(HIV-1)，病毒量為每孔加入4×104IU，吹打均勻，轉(zhuǎn)入12孔板，再加入相同藥液或培養(yǎng)基，1.5ml，使總量為2ml，37℃培養(yǎng)，每3-4天取上清，每孔取100μl，放-80℃保存，全部收集完測(cè)定RT，藥物組與病毒對(duì)照組比較計(jì)算抑制率。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參組合物在體外試驗(yàn)對(duì)PBMC細(xì)胞的HIV-1有明顯的抑制作用見表2。
表2

實(shí)施例2采用與實(shí)施例1相同的方法，分別在于在培養(yǎng)孔中所加入的藥物為人參皂甙單體，具體的加入濃度如下表3所示。
(一).人參皂甙單體抗HIV-1作用的分析比較-HeLa-CD4細(xì)胞株表3

由上表可以看出，在5種人參皂甙提取物中，其中所述的Rb3具有最佳的艾滋病抑制率。
(二)Rb3作用靶點(diǎn)的分析目的觀察人參組合物作用于病毒生活周期哪個(gè)或哪幾個(gè)階段，包括病毒進(jìn)入細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、轉(zhuǎn)錄、蛋白酶。應(yīng)用病毒“單一生活周期”(single life cycle)模型研究藥物作用靶點(diǎn)。
(1)MAGI法合病毒為重組病毒，以HIV的LTR，使β-半乳糖苷酶報(bào)告基因得以表達(dá)，形成病毒的一種“單一生活周期”的模型。
此模型如前述用Hela-CD4細(xì)胞以K4[Fe(CN)6]、K3[Fe(CN)6]、x-gel染色，顯微鏡下藍(lán)色細(xì)胞表示帶有病毒基因。
(2)Luciferase法采用重組、轉(zhuǎn)染的VSVG病毒，細(xì)胞系用H9細(xì)胞株，檢查方法采用發(fā)光法檢測(cè)Luciferase的活性，病毒量多則此酶活性高。
實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞感染病毒后設(shè)不同組，分別于感染后0，6，12，18，24，36小時(shí)加藥，作用至感染后48小時(shí)，分別進(jìn)行MAGI或Luciferase法檢測(cè)。
以上兩種檢測(cè)方法均為病毒“單一生活周期”模型，其最大優(yōu)點(diǎn)是感染的不同時(shí)間表示病毒繁殖的不同階段。2-6小時(shí)是病毒進(jìn)入細(xì)胞，10-14小時(shí)是逆轉(zhuǎn)錄階段，20小時(shí)以后是整合、轉(zhuǎn)錄階段。故不同時(shí)間給藥其抑制作用表示作用于何靶點(diǎn)。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)對(duì)JHR和Rb3的作用靶點(diǎn)進(jìn)行了分析。
表4.本發(fā)明藥物Rb3作用于病毒生活史靶點(diǎn)的分析

結(jié)果見圖1和圖6所示。如圖1和圖6所示，其中JHR的最佳抑制為在病毒感染后兩小時(shí)加入藥物抑制效果最佳，而此時(shí)藥物作用的靶點(diǎn)為阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞。
用嗜M細(xì)胞病毒表示對(duì)CCR5輔助受體的作用，用嗜T細(xì)胞病毒表示對(duì)CXCR4輔助受體的作用。
(三)BIACORE檢測(cè)JHR、Rb3對(duì)gp41、gp120蛋白的結(jié)合1.Rb3對(duì)gp41蛋白的結(jié)合將基因重組的gp41，gp120分別置于BIACORE檢測(cè)儀的芯片上，加入Rb3一定濃度，一定量，儀器即檢測(cè)出是否與之結(jié)合。結(jié)果如圖2。
2.Rb3對(duì)gp120蛋白的結(jié)合，結(jié)果見圖3。
從結(jié)果可以看出，JHR、Rb3可以與病毒的gp41及gp120均有結(jié)合，對(duì)gp41的結(jié)合作用更強(qiáng)。
(四)JHR對(duì)淋巴細(xì)胞CXCR4受體、巨噬細(xì)胞CCR5輔助受體的作用實(shí)驗(yàn)使用MAGItest法進(jìn)行，方法同上。(結(jié)果見圖5)，其結(jié)果說明如下表5表5輔助受體及其進(jìn)入機(jī)制的研究(MAGI Test)

(五)JHR對(duì)CD4受體的作用使用流式細(xì)胞儀的方法進(jìn)行測(cè)試。方法如下采用SupT1細(xì)胞與藥物37℃共同培育2小時(shí)，以PBS+2％FCS洗滌，于4℃冰浴條件加CD4PE放置30分鐘，洗滌，離心后加CD4單抗，冰浴中培育30分鐘，洗滌，離心，冰浴條件，懸浮于50ul的二抗Ab抗-小鼠-FITC中20分鐘，洗滌一次，懸浮于300-500ul的PBS/2％CS+PI中，F(xiàn)ACS(進(jìn)行流式儀檢測(cè))。檢測(cè)結(jié)果見圖4A、B。
結(jié)果表明JHR對(duì)CD4受體無作用。
實(shí)施例3合并用藥的研究目的觀察JHR與AZT有無協(xié)同作用方法實(shí)驗(yàn)采用MAGI+est方法(如前)①單獨(dú)用藥AZT從1uM至3.9nM，設(shè)五個(gè)劑量AZT1-5JHR從400ug/ml至1.56ug/ml，設(shè)五個(gè)劑量分別求得IC50②合并應(yīng)用以AZT與JHR各1/2量相加為一個(gè)樣品AZT1分別與JHR1-JHR5五個(gè)組合AZT2、AZT3、AZT4、AZT5亦分別與ZN1-ZN5五個(gè)組合，故為25個(gè)濃度組合，每個(gè)濃度設(shè)兩孔，另設(shè)細(xì)胞、病毒對(duì)照。
③以各藥物組合與病毒組比較，求得抑制率。以各藥物組合抑制率與單獨(dú)AZT IC50比較作用增減。
結(jié)果見表6。
表6

結(jié)果表明，單用AZT半數(shù)抑制量(IC50)為46nM/ml，與JHR(其成分同實(shí)施例1)第一個(gè)劑量相加后AZT的半數(shù)抑制量(IC50)僅為5.8nM/ml，即1/8用量可達(dá)相同效果，說明兩藥有協(xié)同作用，增效8倍。
實(shí)施例4對(duì)抗藥性病毒株的作用HIV-1對(duì)一種蛋白酶抑制劑形成的抗性株，毒力為5.7×104IU/ml，采用Hela-CD4細(xì)胞，MAGI實(shí)驗(yàn)方法觀察JHR的作用，有無交叉抗性，結(jié)果JHR劑量為0.4mg/ml，病毒5ul或8ul抑制率均達(dá)100％，表明對(duì)白酶抑制劑形成的抗性株也有作用，見表5。
表5JHR對(duì)HIV蛋白酶抑制劑抗性毒株的抑制率

注PIRV病毒是抗蛋白抑制劑的病霉。
結(jié)果表明，所述的JHR對(duì)蛋白酶抑制劑產(chǎn)生抗性的HIV-1病毒株有很好的抑制作用。
實(shí)施例5毒性實(shí)驗(yàn)一.急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果給昆明種小鼠灌胃給藥，在劑量大于20克/公斤未見任何毒性。
二.亞急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果給昆明種小鼠連續(xù)灌胃六個(gè)月，大，中，小三個(gè)劑量組動(dòng)物的體重及生長(zhǎng)情況正常ALT、BUN、RBC、WBC及白細(xì)胞分類均正常，病理切片表明心，肝，脾，肺，腎，胰，腦卵巢，睪丸等臟器未見異常。
權(quán)利要求
1.具有以下通式I的化合物用于制備治療艾滋病的藥物中的用途 其中，R1是-Glc2-Glc，R2選自-Glc6-Glc、-Glc6-Ara(p)、-Glc6-Xyl和-Glc6-Ara(f)；以及R3是H。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的R1是-Glc2-Glc，R2是-Glc6-Xyl，以及R3是H。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述的化合物的給藥劑量是0.03～0.50mg/公斤體重。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的用途，其特征在于所述的化合物可以與抗艾滋病毒藥聯(lián)合應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述的抗艾滋病毒藥可以是AZT及其它抗艾滋病毒藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述的艾滋病毒是由與其它抗艾滋病毒藥物反復(fù)作用后產(chǎn)生對(duì)該藥的抗藥性的病毒。
7.含有以下通式I的化合物作為活性成分的藥物組合物用于制備治療艾滋病藥物在治療艾滋病中的用途 其中，R1是-Glc2-Glc，R2選自-Glc6-Glc、-Glc6-Ara(p)、-Glc6-Xyl和-Glc6-Ara(f)；以及R3是H。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的組合物與抗艾滋病毒藥聯(lián)合應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的抗艾滋病毒藥可以是AZT及其它抗艾滋病毒藥物。
10.含有一種或一種以上的以下通式I的化合物的組合物用于制備治療艾滋病的藥物中的用途 其中，R1是-Glc2-Glc，R2選自-Glc6-Glc、-Glc6-Ara(p)、-Glc6-Xyl和-Glc6-Ara(f)；以及R3是H。
11.如權(quán)利要求10所述的用途，其中所述的艾滋病毒是由與其它抗艾滋病毒藥物反復(fù)作用后產(chǎn)生對(duì)該藥的抗藥性的病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有以下通式I的化合物用于制備抗艾滋病藥物在治療艾滋病中的用途，其中，R
文檔編號(hào)A61P31/00GK1745756SQ20041007430
公開日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2004年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月8日
發(fā)明者李澤琳, 曾越, 曾毅, 曾欣 申請(qǐng)人:李澤琳, 曾越, 曾毅, 曾欣