專利名稱：人溶菌酶栓劑、制法及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物制藥，特別是涉及針對抗耐藥菌、病毒的人溶菌酶藥物及其制法、應用。
背景技術(shù)：
21世紀的今天，耐藥菌的發(fā)展令人觸目驚心。所謂耐藥菌就是細菌對藥物產(chǎn)生抗性，是細菌多次與藥物接觸后，對藥物的敏感性減小甚至消失，致使藥物對細菌的敏感性降低甚至無效。其中耐藥菌包括金黃色葡萄球菌MRSA、表皮葡萄球菌MRSE、肺炎鏈球菌、溶血性鏈球菌、腸球菌屬、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、丙酸桿菌、淋病雙球菌、枸櫞酸桿菌、沙雷氏菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單孢菌、白色念珠菌等。主要是對下列藥品產(chǎn)生耐藥性克拉霉素、羅紅霉素、阿莫西林、萬古霉素、德可霉素、廣譜青霉素、甲氧西啉類、頭孢類、青霉素鈉、青霉素鉀、磺胺類。
具體的耐藥標準是(抑菌圈直徑mm)
從細菌的耐藥發(fā)展史可以看出，在某種新的抗生素出現(xiàn)以后，就有一批耐藥菌株出現(xiàn)。開發(fā)一種新的抗生素一般需要10年左右的時間，而一代耐藥菌的產(chǎn)生只要2年的時間，抗生素的研制速度遠遠趕不上耐藥菌的發(fā)展速度。目前急需開發(fā)一種針對不同耐藥菌株均有效的“超級抗生素”用于臨床治療。如中國專利03110824.5所公開了人溶菌酶針對抗耐藥菌的用途，但是針對某些疾病是否有更合理有效的劑型，以及在制備治療更多種疾病的開發(fā)上仍有很大空白。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種人溶菌酶栓劑，針對抗耐藥菌包括對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌引起的抗耐藥性，胃腸免受刺激，直接作用于患處，使用方便，效果好。
本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是人溶菌酶栓劑，含有活性300U～300萬U/mL人溶菌酶。
所述人溶菌酶包括基因工程表達的重組人溶菌酶、基因工程表達人溶菌酶的氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶、基因工程表達或化學合成突變體重組人溶菌酶。
本發(fā)明栓劑制備工藝流程為配方原料藥物準備→配方藥物分別制備→配方藥物混合制備→倒入栓劑模具→冷卻固化成型→含量及其它質(zhì)量測定→成品包裝。(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)。
具體的制法如下第一步、基因重組人溶菌酶的制備基因重組人溶菌酶以配制200毫升培養(yǎng)基為準，用磷酸6毫升、硫酸鎂3克，硫酸鉀4克，氫氧化鉀1克，硫酸鈣1.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20-35℃，在恒溫床上培養(yǎng)36-48小時。進行種子罐培養(yǎng)，最后進行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。將發(fā)酵表達完成的培養(yǎng)液進行提取純化，對提取純化的蛋白濃縮液進行凍干，測蛋白測活性保存。
第二步、栓劑制備將純度95％的基因重組人溶菌酶制得300U～300萬U/mL，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)，75～85％丙二醇、萬分之五吐溫80，明膠15％，稱取明膠，加磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)適量，浸泡20分鐘，使其變軟，將多余的液體倒出，稱取丙二醇加入，置水浴上加熱溶化蒸發(fā)，無液體后取下，冷卻50℃以下，加入重組人溶菌酶和萬分之五吐溫80，攪拌均勻，接近凝固時，倒入栓劑模具中，冷卻、固化、成型，產(chǎn)品活性含量及其它質(zhì)量測定，成品包裝。
本發(fā)明栓劑在制備針對抗耐藥菌包括對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌引起的抗耐藥性的藥物中的應用。
涉及人溶菌酶栓劑在制備預防或治療由耐藥白色念珠菌引起的陰道炎的藥物中的應用。
涉及人溶菌酶栓劑在制備預防或治療由II型皰疹病毒引起的子宮頸炎的藥物中的應用。
涉及人溶菌酶栓劑在制備預防或治療由耐藥淋病雙球菌引起的尿道炎的藥中的應用。
涉及人溶菌酶栓劑在制備治療由細菌、病毒、和自身免疫異常引起的潰瘍性結(jié)腸炎的藥中的應用。
本發(fā)明基因重組人溶菌酶安全無毒副作用，來源豐富，有很好的藥用前景，制備工藝簡單，做成栓劑給藥有如下特點①藥物不受胃腸pH或酶的破壞而失去活性；②對胃粘膜有刺激性的藥物可用直腸給藥，可免受刺激；③藥物直腸吸收，不象口服藥物受肝臟首過作用破壞；④直腸吸收比口服干擾因素少；⑤對不能或者不愿吞服片、丸及膠囊的病人，尤其是嬰兒和兒童可用此法給藥；⑥對伴有嘔吐的患者的治療為一有效途徑；⑦制備方法成熟，簡單。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將用基因重組人溶菌酶的藥理試驗及結(jié)果來說明其在制藥領域中的新用途。
基因重組人溶菌酶以配制200毫升培養(yǎng)基為準，用磷酸6毫升、硫酸鎂3克，硫酸鉀4克，氫氧化鉀1克，硫酸鈣1.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20-35℃，在恒溫床上培養(yǎng)36-48小時。進行種子罐培養(yǎng)，最后進行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。將發(fā)酵表達完成的培養(yǎng)液進行提取純化，對提取純化的蛋白濃縮液進行凍干，測蛋白測活性保存。將合格的基因重組人溶菌酶制得30000U/ml備用；將純度95％的基因重組人溶菌酶制得300U～300萬U/mL，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)，75～85％丙二醇、 萬分之五吐溫80，明膠15％，制成栓劑(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)。
一、對動物的模型試驗A、基因重組人溶菌酶(HLZ)體內(nèi)外抗菌作用評價(1)體外抗菌作用受試藥品及試劑1、人溶菌酶(Human Lysozyme HLZ)活性單位30000單位/mL，由大連奇龍生物技術(shù)研究所提供。
2、對照溶菌酶(contral Lysozyme，CLZ)白色粉未，活性單位50000單位/mg，美國SIGMA公司產(chǎn)品，批號L6876。
3、克拉霉素效價948μ/mg，中國藥品生物制品檢定所標準品，批號4、羅紅霉素效價878μ/mg，中國藥品生物制品檢定所標準品，批號5、注射用阿莫西林哈爾濱制藥廠產(chǎn)品，批號010504。
6、瓊脂糖(B10WEST AGAROSE)
7、三羥甲基氨基甲烷(Tris)成都化學試驗廠，批號010211試驗菌株所用菌株均為2001.4~2002.4月于四川、北京地區(qū)收集的臨床分離致病菌。經(jīng)本室用API方法重新鑒定后用于試驗。
質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923大腸埃希菌ATCC25922銅綠假單孢菌ATCC27853培養(yǎng)基4、Tris-HCl緩沖液0.1M Tris 100ml，0.1M HCl 70ml，High Water 800ml，測PH值，用HCl溶液調(diào)至PH7.2，加High Water至1000ml。
2、Tris-HCl瓊脂培養(yǎng)基在Tris-Cl緩沖液中加入瓊脂糖116℃無菌后使用。
3、M-H培養(yǎng)基中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品，M-H肉湯培養(yǎng)基稱取25g加1000ml蒸餾水，加熱溶解，分裝，高壓滅菌，116℃20分鐘。M-H固體培養(yǎng)基稱取36g，加1000ml蒸餾水，高壓滅菌，116℃20分鐘，用于革蘭陽性、陰性需氧菌的藥敏試驗。
4、血培養(yǎng)基，即在M-H培養(yǎng)基中加5-10％脫纖維兔血配制而成，用于腸球菌、鏈球菌的藥敏試驗。
試驗方法體外抗菌活性(MIC)測定采用瓊脂二倍稀釋法測定受試藥物對試驗菌株的最低抑菌濃度(MIC)。將受試藥物用滅菌蒸餾水溶解，適當稀釋。分別取1ml藥液加9ml融化的Tris-HCl瓊脂糖固體培養(yǎng)基混勻，以二倍稀釋，制備系列含藥平皿。每皿所含藥物終濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03……0.001mg/ml；用多點接種儀(Denley A400，England)將稀釋至105CFU/ml的試驗菌液接種于各含藥平皿表面，置于37℃培養(yǎng)8-10小時，取出分別吸取6ml融化的M-H培養(yǎng)基(50℃)覆蓋上述系列平皿表面，再置于37℃培養(yǎng)10小時取出，觀察結(jié)果，以無細菌生長平皿內(nèi)所含最低藥物濃度為該菌的最低抑菌濃度(MIC)。
(2)體內(nèi)抗菌作用評價藥品人溶菌酶來源同前。
克拉霉素來源同前。
羅紅霉素來源同前。
阿莫西林來源同前。
細菌金黃色葡球菌01193，金黃色葡球菌MRSA021923均為臨床分離致病菌。
動物昆明種小鼠，體重18-22克，由本所動物室提供。
試驗方法體內(nèi)保護試驗挑取一定量的菌苔接種于2ml M-H液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6小時后，取出用滅菌干酵母液進行適當稀釋(10-1，10-2，10-3，10-4)，再取昆明種小鼠，隨機分組，每組5只鼠，分別腹腔感染不同菌量的受試菌液，測定引起小鼠100％死亡的最小致死菌量(MLD)。再按1∶0.5劑間距設置5個劑量組，每組10只鼠，每只小鼠腹腔感染1MLD菌量的菌液0.5ml，感染后即刻靜脈注射受試藥0.5ml，設感染對照組(不給藥)，觀察1周，記錄小鼠死亡數(shù)。按Bliss法計算半數(shù)有效劑量ED50及95％可信限。
小鼠皮膚燒傷感染模型的療效評價昆明種小鼠26-30g，隨機分組，每組5只鼠，分別皮膚燒傷感染模型噴涂金黃色葡萄球菌菌液100ml，菌量為108CFU/ml，連續(xù)噴5次(間隔10分鐘噴一次)，末次噴菌后6小時，分別用無菌棉簽挑取皮膚燒傷感染模型涂于無藥瓊脂平板表面，37℃培養(yǎng)18小時，皮膚燒傷感染模型感染細菌數(shù)在＞103CFU/ml，且經(jīng)革蘭氏染色、光鏡檢測為金黃色葡萄球菌的小鼠為感染模型成功。
選取皮膚燒傷感染模型感染成功小鼠隨機分組，每組10只鼠，分別用噴霧器噴涂受試藥物100μl/次，4次/日，連續(xù)5日，每日采用咽試子涂片法，于瓊脂平板表面進行活菌計數(shù)，作統(tǒng)計學處理，與感染對照組和克拉霉素組、羅紅霉素給藥組作比較。
試驗結(jié)果(1)人溶菌酶對臨床分離菌株的體外抗菌活性見表1。
(2)克拉霉素、羅紅霉素、阿莫西林與人溶菌酶以1∶1聯(lián)合用藥的體外抗菌作用結(jié)果見表2。
(3)人溶菌酶對379株臨床分離致病菌的MIC50、MIC90見表3。
根據(jù)以上試驗結(jié)果表明人溶菌酶體外具有一定抗菌作用，體內(nèi)對傷口感染潰爛的療效較確切。對多數(shù)菌株的抗菌活性比不上克拉霉素、羅紅霉素和阿莫西林。人溶菌酶與克拉霉素、羅紅霉素聯(lián)用(1∶1)，可使克拉霉素、羅紅霉素對其耐藥菌株的抗菌活性增效2-16倍以上，個別菌株增效倍數(shù)在1000倍。溶菌酶是一種小分子蛋白質(zhì)，存在于機體的淚液、唾液、白細胞和血清中，對多種革蘭氏陽性菌和少數(shù)革蘭氏陰性菌有殺菌作用，由大連奇龍生物技術(shù)研究所研制的基因重組人溶菌酶(Human Lysozyme)也具有溶菌酶相同作用機制，主要切斷肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1、4糖苷鍵之間的聯(lián)結(jié)，破壞肽聚糖支架，引起細菌裂解。
表1 人溶菌酶、雞溶菌酶、克拉霉素和羅紅霉素體內(nèi)外抗菌活性MIC細菌HLZ CLZ CLA ROXmg/ml(萬μ/ml) mg/ml(萬μ/ml)mg/mlmg/ml金葡MRSA02-22 0.25(0.8)0.008(0.04) ＞1 ＞1金葡MRSA02-23 0.25(0.8)0.008(0.04) ＞1 ＞1金葡MRSA02-26 0.25(0.8)0.004(0.02) ＞1 ＞1金葡MRSA02-28 0.5(15) 0.016(0.08) ＞1 ＞1金葡02-19-5 0.03(0.1)＜0.002(0.001)＞1 ＞1表葡MssE25 0.016(0.05) 0.004(0.02) ＜0.001 ＜0.001表葡MRSE 02-29 0.063(0.2) 0.5(2.5) 0.03 0.5表葡MRSE 02-5 ＜0.001(0.003) ＜0.001(0.003)＜0.001 ＜0.001表葡MRSE 02-6 ＜0.001(0.005) ＜0.001(0.005)＜0.001 ＜0.001表葡MRSE 02-20-2＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005)＞1 1表葡MRSE 02-20-3＜0.001(0.003) 0.004(0.02) ＞1 1表葡MRSE 02-20-4＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005)＞1 ＞1表葡MRSE 02-20-50.004(0.012) ＜0.001(0.005)＞1 ＞1表葡MRSE 02-20-60.004(0.012) ＜0.001(0.005)＞1 ＞1表葡MRSE 02-20-7＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005)11表葡MRSE 02-20-8＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005)＜0.001 ＜0.001表葡MRSE 02-20-9＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005)＜0.001 ＜0.001表葡MRSE 02-20-1＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005)＜0.001 ＜0.001表葡MRSE 02-3 1(3) 0.015(0.08) ＞1 ＞1表葡MRSE 02-4 0.004(0.012) 0.008(0.04) 0.5 ＞1
續(xù)表2MIC細菌 HLZ CLZCLA ROXmg/ml(萬μ/ml)mg/ml(萬μ/ml) mg/ml mg/ml表葡MRSE 02-100.004(0.012) 0.25(1.25) 1 1表葡MRSE 02-12＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) 0.008 0.125表葡MRSE 02-11＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＜0.001 ＜0.001表葡MRSE 02-150.008(0.024) 0.002(0.01)1 ＞1表葡MRSE 02-170.004(0.012) ＜0.001(0.005) 0.25 ＞1表葡MRSE 02-18＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＜0.001 ＜0.001表葡MRSE 02-200.008(0.024) ＜0.001(0.005) ＞1 ＞1表葡MRSE 02-210.016(0.05) 0.25(1.25) ＜0.001 ＜0.001表葡MRSE 02-220.004(0.012) ＜0.001(0.005) ＜0.001 ＜0.001表葡菌02-7-4 0.008(0.02) 4(20) 0.002 0.002表葡菌02-7-5 0.008(0.02) 0.25(0.63) ＜0.001 ＜0.001金葡菌02-7-6 0.008(0.02) 0.063(0.31)0.008 0.25金葡菌02-7-9 0.063(0.2)0.125(0.63)0.008 0.016金葡菌02-7-7 0.125(0.4)0.016(0.08)0.032 0.25金葡菌01-2-22 0.032(0.1)0.5(2.5) 1 1金葡菌01-2-30 0.063(0.2)4(10) ＞1 ＞1金葡菌01-2-32 0.016(0.05) 0.25(1.25) 0.008 0.5金葡菌01-2-33 0.032(0.1)2(10) ＞1 ＞1金葡菌01-2-36 0.063(0.2)4(20) 0.25 0.5金葡菌01-2-37 0.032(0 1)＞4(20)＞1 1金葡菌01-2-39 0.032(0.1)0.5(2.5) 0.5 1
續(xù)表3MIC細菌HLZCLZ CLAROXmg/ml(萬μ/ml) mg/ml(萬μ/ml) mg/ml mg/ml銅綠假單孢菌01-2-410.032(0.1) 0.5(2.5) ＞1＞1銅綠假單孢菌01-2-420.016(0.05)0.5(2.5) 0.063 ＞1銅綠假單孢菌01-2-43＜0.001(0.003) ＞4(20) 0.016 0.25銅綠假單孢菌01-2-450.032(0.1) 2(10)0.25 0.5銅綠假單孢菌01-2-510.032(0.1) ＞4(20) ＞1＞1銅綠假單孢菌01-2-520.032(0.1) ＞4(20) ＞10.25銅綠假單孢菌01-2-530.008(0.024) 4(20)0.03 0.25銅綠假單孢菌01-2-540.032(0.1) 1(5) ＞11金葡菌01-2-56 0.032(0.1) ＞4(20) 0.016 0.25金葡菌01-2-57 ＜0.001(0.003) 2(10)0.032 0.25大腸埃希菌01-2-58 ＜0.001(0.003) 4(20)＞10.5大腸埃希菌01-2-59 0.032(0.1) 4(20)0.125 0.25沙雷氏菌2-31-8 0.008(0.02)0.5(0.25)0.008 0.016沙雷氏菌2-31-8 0.008(0.02)1(5) 0.008 0.016金葡菌2-31-8 0.008(0.02)0.125(0.63) 0.016 0.016金葡菌02-6-14 0.25(0.8) 1(5) 0.063 ＞1金葡菌02-6-18 0.5(1.5) ＞4(20) 0.51注HLZ指人溶菌酶，CLZ指對照溶菌酶(雞溶菌酶)，CLA指克拉霉素，ROX指羅紅素B、重組人溶菌酶抗病毒試驗模型實驗材料1、動物健康家兔20只，雌性，體重2000克左右，由四川抗菌素工業(yè)研究所實驗動物中心提供，質(zhì)量符合壹級標準。
2、試藥重組人溶菌酶效價30000u/mL，由大連奇龍生物技術(shù)研究所提供，臨用前用磷酸鹽緩沖液PH6.5～7.5配成所需濃度備用。
3、試劑AR級鹽酸，市售。用蒸餾水配制成1N濃度備用。
4、BL 3100型，BS 200S-WE1型電子天平，北京賽多利斯天平公司生產(chǎn)。玻璃干燥器大小φ23×12.5cm。
5、醫(yī)用無菌棉簽。
6、II型皰疹病毒100～1000TCID50(由四川抗菌素工業(yè)研究所實驗動物中心提供)7、用德國菲弗公司100ul噴霧泵向陰道內(nèi)噴霧重組人溶菌酶。
實驗方法及劑量設計將20只家兔隨機均分四組，每組5只，進行陰道宮頸造模。用醫(yī)用無菌棉簽粘取II型皰疹病毒100～1000TCID50擦家兔陰道宮頸感染家兔子宮頸炎膜型。每天一次，連續(xù)三天。第三天家兔陰道出現(xiàn)分泌物，第四天家兔陰道出現(xiàn)分泌物增多，模型成立。將造模后的20只家兔重新合并后再隨機分成四組，分別設立三個給藥組和一模型組。
重組人溶菌酶溶液以15000u/ml(每噴1500U)為低劑量濃度基礎上再配制30000u/ml(每噴3000U)、60000u/ml(每噴6000U)二濃度作為中、高劑量組治療時的藥液濃度。在造模型第四天開始給家兔陰道內(nèi)宮頸噴霧重組人溶菌酶藥液，每天三次，每次100ul，肉眼觀察家兔形態(tài)變化情況及時間。
實驗結(jié)果
給藥重組人溶菌酶藥液第二天，給藥重組人溶菌酶藥液中、高劑量組治療效果凸現(xiàn)，家兔陰道分泌物減少。給藥重組人溶菌酶藥液第三天，給藥重組人溶菌酶藥液低劑量組也出現(xiàn)好轉(zhuǎn)治療效果。給藥重組人溶菌酶藥液第六天，給藥模型低、中、高組家兔陰道無分泌。模型對照組家兔陰道分泌增多，并伴有血絲。給藥重組人溶菌酶模型組和一模型對照組有明顯區(qū)別。見表4、見表5表4動物數(shù)組別用藥前一天 用藥第一天用藥第二天(只)模型組對照 5只 陰道出現(xiàn)分泌物 分泌物增多分泌物增多模型高劑量組5只 陰道出現(xiàn)分泌物 分泌物增多分泌物減少模型中劑量組5只 陰道出現(xiàn)分泌物 分泌物增多分泌物減少模型低劑量組5只 陰道出現(xiàn)分泌物 分泌物增多分泌物增多表5動物數(shù)組別用藥第三天 用藥第四天 用藥第五天(只)模型組對照 5只 分泌物增多 分泌物增多、有血絲 分泌物增多、有血絲模型高劑量組5只 分泌物減少 陰道無分泌 恢復正常模型中劑量組5只 分泌物減少 陰道無分泌 恢復正常模型低劑量組5只 分泌物減少 分泌物減少 陰道無分泌綜合以上實驗結(jié)果分析，試驗重組人溶菌酶藥液對抗II型皰疹病毒100～1000TCID50感染家兔子宮頸炎膜型，有很好的治療效果。其治療效果與使用劑量有明顯量效關系。
C、重組人溶菌酶抗耐藥淋病雙球菌試驗
耐藥淋病雙球菌青霉素鈉抑菌圈≤2.7，耐藥菌淋病雙球菌尿道感染所致小鼠尿道炎模型的制備選用健康昆明種小鼠10只，雌雄各半，體重為18-22克，挑取一定量的耐藥淋病雙球菌用注射方式感染小鼠尿道致小鼠尿道炎10只，感染后即刻靜脈注射受試藥30000U/ml/20g鼠重，觀察一周，每日一次給藥，記錄小鼠有效率。實驗結(jié)果表明基因重組人溶菌酶對耐藥淋病雙球菌尿道感染所致小鼠尿道炎有明顯療效。結(jié)果如下表
D、重組人溶菌酶抗耐藥白色念珠菌試驗耐藥白色念珠菌廣譜青霉素抑菌圈≤2.7，耐藥大腸埃希菌染所致小鼠陰道炎模型的制備選用健康昆明種小鼠10只，雌雄各半，體重為18-22克，挑取一定量的耐藥白色念珠菌用涂抹方式感染小鼠陰道致小鼠陰道炎10只，感染后即噴霧給藥重組人溶菌酶30000U/ml/20g鼠重，每次100ul，3000U，觀察一周，每日三次給藥，記錄小鼠有效率。實驗結(jié)果表明基因重組人溶菌酶對耐藥白色念珠菌感染所致小鼠陰道炎有明顯療效。結(jié)果如下表
二、用法與用量用手推入陰道內(nèi)部或直腸深部，直接作用于病灶，局部給藥，每日1～2次，每次一枚。
具體實施例方式實施例1第一步、基因重組人溶菌酶的制備基因重組人溶菌酶以配制200毫升培養(yǎng)基為準，用磷酸6毫升、硫酸鎂3克，硫酸鉀4克，氫氧化鉀1克，硫酸鈣1.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20-35℃，在恒溫床上培養(yǎng)36-48小時。進行種子罐培養(yǎng)，最后進行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。將發(fā)酵表達完成的培養(yǎng)液進行提取純化，對提取純化的蛋白濃縮液進行凍干，測蛋白測活性保存。
第二步、栓劑制備將純度95％的基因重組人溶菌酶制得3000U/mL，磷酸鹽緩沖液12mM(pH6.5～7.5)，75％丙二醇、萬分之五吐溫80，明膠15％，稱取明膠，加磷酸鹽緩沖液12mM(pH6.5～7.5)適量，浸泡20分鐘，使其變軟，將多余的液體倒出，稱取丙二醇加入，置水浴上加熱溶化蒸發(fā)，無液體后取下，冷卻50℃以下，加入重組入溶菌酶和萬分之五吐溫80，攪拌均勻，接近凝固時，倒入栓劑模具中，冷卻、固化、成型，產(chǎn)品活性含量及其它質(zhì)量測定，成品包裝。
實施例2按實施例1所述方法，在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程將純度95％的基因重組人溶菌酶制得100萬U/mL，磷酸鹽緩沖液15mM(pH6.5～7.5)，80％丙二醇、萬分之五吐溫80，明膠15％，制成栓劑。
實施例3按實施例1所述方法，在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程將純度95％的基因重組人溶菌酶制得200萬U/mL，磷酸鹽緩沖液20mM(pH6.5～7.5)，85％丙二醇、萬分之五吐溫80，明膠15％，制成栓劑。
權(quán)利要求
1.人溶菌酶栓劑，含有活性300U～300萬U/ml人溶菌酶。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的人溶菌酶栓劑，其特征是由純度95％的基因重組人溶菌酶制得300U～300萬U/mL，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)，75～85％丙二醇、萬分之五吐溫80，明膠15％，制成栓劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人溶菌酶，其特征是人溶菌酶包括基因工程表達的重組人溶菌酶、基因工程表達人溶菌酶的氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶、基因工程表達或化學合成突變體重組人溶菌酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的人溶菌酶栓劑的制法，其特征是將純度95％的基因重組人溶菌酶制得300U～300萬U/mL，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)，75～85％丙二醇、萬分之五吐溫80，明膠15％，稱取明膠，加磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)適量，浸泡20分鐘，使其變軟，將多余的液體倒出，稱取丙二醇加入，置水浴上加熱溶化蒸發(fā)，無液體后取下，冷卻50℃以下，加入重組人溶菌酶和萬分之五吐溫80，攪拌均勻，接近凝固時，倒入栓劑模具中，冷卻、固化、成型，產(chǎn)品活性含量及其它質(zhì)量測定，成品包裝。
5.權(quán)利要求1、2或3所述的人溶菌酶栓劑在制備針對抗耐藥菌包括對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌引起的抗耐藥性的藥物中的應用。
6.權(quán)利要求1、2或3所述的人溶菌酶人溶菌酶栓劑在制備預防或治療由耐藥白色念珠菌引起的陰道炎的藥物中的應用。
7.權(quán)利要求1、2或3所述的人溶菌酶人溶菌酶栓劑在制備預防或治療由II型皰疹病毒引起的子宮頸炎的藥物中的應用。
8.權(quán)利要求1、2或3所述的人溶菌酶人溶菌酶栓劑在制備預防或治療由耐藥淋病雙球菌引起的尿道炎的藥中的應用。
9.權(quán)利要求1、2或3所述的人溶菌酶人溶菌酶栓劑在制備治療由細菌、病毒、和自身免疫異常引起的潰瘍性結(jié)腸炎的藥中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物制藥，特別是涉及針對抗耐藥菌、病毒的人溶菌酶藥物及其制法、應用。人溶菌酶栓劑，含有活性300U～300萬U/ml人溶菌酶。本發(fā)明基因重組人溶菌酶安全無毒副作用，來源豐富，有很好的藥用前景，制備工藝簡單，做成栓劑給藥藥物不受胃腸pH或酶的破壞而失去活性；對胃粘膜有刺激性的藥物可用直腸給藥，可免受刺激；藥物直腸吸收，不像口服藥物受肝臟首過作用破壞；直腸吸收比口服干擾因素少；對不能或者不愿吞服片、丸及膠囊的病人，尤其是嬰兒和兒童可用此法給藥；對伴有嘔吐的患者的治療為一有效途徑；制備方法成熟，簡單。
文檔編號A61P31/04GK1593654SQ200410020818
公開日2005年3月16日 申請日期2004年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月21日
發(fā)明者安米 申請人:安米