人溶菌酶在制備治療皮膚病的藥物中的新用途的制作方法

專利名稱：人溶菌酶在制備治療皮膚病的藥物中的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人溶菌酶的用途，特別是人溶菌酶在制藥領(lǐng)域中的新用途。
背景技術(shù)：
皮膚病是由多種因素引起的，這些病的發(fā)生和發(fā)展與機體的內(nèi)外因素、宿主的反應(yīng)狀況、遺傳和個人素質(zhì)等因素有關(guān)。皮膚病有時輕微極易被忽視，有時可累及內(nèi)臟，如不早期診斷和早期治療可導致嚴重后果。很多皮膚病是細菌引起的，抗生素有很好的療效?？股貏?chuàng)造了許多醫(yī)學奇跡，使許多疾病消失無蹤，如肺炎、腦膜炎、產(chǎn)褥熱、敗血癥、結(jié)核等。但是21世紀的今天，抗生素的外用導致大量耐藥菌產(chǎn)生，耐藥菌的發(fā)展令人觸目驚心。如耐青霉素的肺炎鏈球菌，過去對青霉素、紅霉素、磺胺等藥品都很敏感，現(xiàn)在幾乎“刀槍不入”。肺炎克雷伯氏菌對西力欣、復達欣等16種高檔抗生素的耐藥性高達51.85％-100％。金黃色葡萄球菌(MRSA)除萬古霉素外已經(jīng)無藥可治，而銅綠假單孢菌在臨床上也基本無藥可治。目前急需開發(fā)一種針對不同耐藥菌株均有效的不產(chǎn)生耐藥性的新型“超級抗生素”用于臨床治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人溶菌酶在制備治療皮膚病的藥物中的新用途，有效針對由細菌、真菌、病毒、變態(tài)反應(yīng)、職業(yè)性、化學性、物理性、神經(jīng)功能障礙性、免疫性引起的皮膚病變、感染、潰爛疾病。
實際上，本發(fā)明涉及人溶菌酶在制備治療皮膚病的藥物中的應(yīng)用。
涉及人溶菌酶在制備治療由單純皰疹病毒和帶狀皰疹病毒引起的皮膚疾病的藥物中的應(yīng)用。
涉及人溶菌酶在制備治療由細菌引起的皮膚膿皰病和新生兒皮膚膿皰病的藥物中的應(yīng)用。
涉及人溶菌酶在制備治療由細菌引起的深膿皰病的藥物中的應(yīng)用。
涉及人溶菌酶在制備治療由細菌引起的膿皮病的藥物中的應(yīng)用。
涉及人溶菌酶在制備治療由變態(tài)反應(yīng)引起接觸性皮炎和蕁麻疹的藥物中的應(yīng)用。
涉及人溶菌酶在制備治療由神經(jīng)功能障礙性引起的瘙癢癥和結(jié)節(jié)性癢疹疾病的藥物中的應(yīng)用。
涉及人溶菌酶在制備治療由機體免疫疾病引起的銀屑、掌跎膿皰病和天皰瘡的藥物中的應(yīng)用。
所述人溶菌酶包括基因工程表達的重組人溶菌酶、基因工程表達人溶菌酶的氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶、基因工程表達或化學合成突變體重組人溶菌酶。
重組人溶菌酶基因來源人的外周血。再通過DNA重組技術(shù)，將基因克隆于pUC19質(zhì)粒載體中，克隆株通過核苷酸DNA序列分析，證實為重組人溶菌酶基因。它是一種有效的抗菌劑，全稱為1，4-β-N-溶菌酶，或者稱粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它能切斷細菌細胞壁的肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵的聯(lián)結(jié)，破壞肽聚糖支架，細菌在內(nèi)部滲透壓的作用下細胞脹裂開，引起細菌裂解。人和動物細胞無細胞壁結(jié)構(gòu)亦無肽聚糖，故溶菌酶對人體細胞無毒性作用。溶菌酶除可以直接裂解細菌，還可以作為免疫調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)中性粒細胞的作用，保護炎癥部位正常組織，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中起負反饋作用(Leo IG，et al.J.Clin.Invist.1979；64222)。它可能通過與多形核粒細胞膜表面的多糖部分結(jié)合，抑制多形核粒細胞向炎癥部位移動，并可衰減炎癥部位由多形核粒細胞所產(chǎn)生的超氧化物的作用，保護機體在炎癥反應(yīng)時由于免疫應(yīng)答過度而發(fā)生的組織損傷。
所述藥物中含有活性300U～300萬U/ml人溶菌酶。可以根據(jù)通用制劑方法制成噴霧劑、滴劑、奶液、乳劑、膏、霜劑等。
本發(fā)明對基因重組人溶菌酶發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。療效顯著且安全無毒副作用，有很好的藥用前景。并且基因重組人溶菌酶來源豐富，制備工藝簡單，使用方便。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將用基因重組人溶菌酶的藥理試驗及結(jié)果來說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。
以配制200毫升培養(yǎng)基為基準，用H3PO4(磷酸)4-8毫升、MgSO4(硫酸鎂)1-5克，K2SO4(硫酸鉀)2-6克，KOH(氫氧化鉀)1-3克，CaSO42H2O(硫酸鈣)1-3.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20-35℃，在恒溫床上培養(yǎng)36-48小時。再進行種子罐培養(yǎng)，然后進行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。將含有基因工程表達的人溶菌酶的畢赤酵母菌培養(yǎng)液過濾濃縮，冰凍干燥，測定蛋白量、純度和溶菌酶活性(純度99.8％活性8萬單位/ml)保存。將合格的基因重組人溶菌酶凍干粉溶于水中制得噴霧劑、滴劑30000U/ml備用；制得膏(霜)劑30000U/g備用。
一、動物模型試驗A、人溶菌酶對大鼠的鎮(zhèn)痛作用(大鼠甩尾法)選用120-150克SD健康大鼠50只，雌雄各半，動物自由飲水。試驗室溫度控制在22-28℃左右，動物喂飼大鼠標準飼料。在TF-光熱測痛儀(光源為12V，50W)熱照射下10秒鐘內(nèi)反應(yīng)的大鼠，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半。設(shè)空白對照組、人溶菌酶三個劑量組(120、60、30IU/只)、雞溶菌酶(陽性對照)30IU/，均尾部涂藥。涂藥前和涂藥后0.5-4小時測每只大鼠的疼痛反應(yīng)(甩尾)時間，若痛閾升高到照射30秒鐘不甩尾時即中斷照射，以免損傷皮膚與起泡，并以30秒計算。試驗重復一次。
試驗結(jié)果見表17-21，結(jié)果表明，涂抹人溶菌酶30、60、120IU/只三小時內(nèi)，其痛閾明顯升高，具有鎮(zhèn)痛作用。
表17-21(A)人溶菌酶外涂對大鼠的鎮(zhèn)痛作用(甩尾法)(第一次試驗結(jié)果)
疼痛反應(yīng)時間(秒，X±SD)組別劑量 動物數(shù)(IU/只) (只) 00.5 1 2 34(h)空白- 10 5.2 5.7 6.4 6.4 6.8 10.3對照 ±1.69 ±2.16±2.46±3.34±3.91 ±5.33雞溶3010 5.5 11.4**14.0**14.7**15.2**12.7**菌酶 ±1.72 ±4.5 ±6.93±7.67±7.45 ±6.99人溶120 10 5.3 13.6**15.2**13.4**15.4**14.9菌酶 ±1.77 ±6.98±7.42±6.38±6.62 ±6.54人溶6010 5.3 9.8*12.9**12.7*13.5*12.4菌酶 ±1.89 ±4.05±6.69±6.9 ±6.72 ±6.65人溶3010 5.2 8.6*12.4*10.9 11.7 10.1菌酶 ±1.93 ±2.67±7.49±7.09±6.89 ±7.5注經(jīng)統(tǒng)計學處理，與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表17-21(B)人溶菌酶外涂對大鼠的鎮(zhèn)痛作用(甩尾法)(第二次試驗結(jié)果)疼痛反應(yīng)時間(秒，X±SD)組別劑量 動物數(shù)(IU/只)(只)0 0.5 1 23 4(h)空白- 10 5.5 5.9 6.5 6.6 6.9 9.8對照 ±1.58 ±1.66±1.78 ±4.95 ±6.35±6.73雞溶30 10 5.7 12.3**15.0** 13.8*13.6* 11.7菌酶 ±1.64 ±4.6 ±7.99 ±7.99 ±7.6 ±6.9人溶12010 5.8 14.2**15.7** 14.5** 14.3* 13.5菌酶 ±1.23 ±6.54±6.78 ±7.11 ±7.44±7.69人溶60 10 5.6 12.6**14.3** 14.0*13.8* 12.5菌酶 ±1.89 ±4.05±6.69 ±6.9±6.72±6.65人溶30 10 5.7 10.0* 12.0* 10.7 10.1 11.2菌酶 ±1.34 ±4.47±7.85 ±4.27 ±3.84±4.5注經(jīng)統(tǒng)計學處理，與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
B、人溶菌酶對巴豆油誘發(fā)小鼠耳廓腫脹的影響選用體重27-30克的健康雄性昆明小鼠50只，隨機分成5組，每組10只。動物自由飲水。試驗室溫度控制在22-28℃左右。動物喂飼大鼠標準飼料。第一組為空白對照組；第二、三、四組為人溶菌酶，劑量分別為120、60、30IU/只；第五組為雞溶菌酶(陽性對照)，30IU/只。首先，各組小鼠全部右耳內(nèi)側(cè)涂1％巴豆油30μL致炎，(巴豆油，淺棕色油狀液體，藥用級，批號000309，由江西吉水縣華寶天然藥用廠生產(chǎn)。臨用前用乙醇∶水∶乙醚25∶5∶70混合溶媒配制成1％濃度備用。)半小時后分別用雙蒸水20μl、人溶菌酶(6000IU/ML)20μl、人溶菌酶(3000IU/ML)20μl、人溶菌酶(1500IU/ML)20μl、雞溶菌酶(1500IU/ML)20μl涂抹各組小鼠右耳內(nèi)側(cè)。致炎后4小時將小鼠脫頸椎致死，沿耳廓基線剪下左右兩耳片，用8mm打孔器沖下兩耳片，精確稱重，左右耳片重量之差為腫脹度。經(jīng)T檢驗，比較藥物組與空白對照組的差異，并求出抑制率。試驗重復一次。
試驗結(jié)果見表17-22。小鼠經(jīng)外涂人溶菌酶120、60、30IU/只，使小鼠由巴豆油誘發(fā)耳廓腫脹度明顯減輕，經(jīng)T檢驗，藥物組與空白對照組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果表明人溶菌酶具有抗炎作用。
表17-22 人溶菌酶對巴豆油誘發(fā)小鼠耳廓腫脹的影響第1次試驗 第2次試驗組別劑量(IU/只) 腫脹度 抑制率 腫脹度 抑制率(mg，X±SD)(％)(mg，X±SD) (％)空白對照- 20.3±3.40 20.1±4.01人溶菌酶120 12.5±5.56** 38.42 13.6±3.78** 32.34
人溶菌酶60 13.5±4.67** 33.5015.1±2.42** 24.88人溶菌酶30 14.2±3.77** 30.0515.4±4.22*23.38雞溶菌酶30 14.6±2.12** 28.0815.1±2.51** 24.88注與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
C、基因重組人溶菌酶(HLZ)體內(nèi)外抗菌作用評價1體外抗菌作用藥品及試劑1、人溶菌酶(Human Lysozyme HLZ)活性單位30000單位/mL，由大連奇龍生物技術(shù)研究所提供。
2、對照溶菌酶(contral Lysozyme，CLZ)白色粉未，活性單位50000單位/mg，美國SIGMA公司產(chǎn)品，批號L6876。
3、克拉霉素效價948μ/mg，中國藥品生物制品檢定所標準品，批號4、羅紅霉素效價878μ/mg，中國藥品生物制品檢定所標準品，批號5、注射用阿莫西林哈爾濱制藥廠產(chǎn)品，批號010504。
6、瓊脂糖(B10WEST AGAROSE)7、三羥甲基氨基甲烷(Tris)成都化學試驗廠，批號010211試驗菌株所用菌株均為2001.4-2002.4月于四川、北京地區(qū)收集的臨床分離致病菌。經(jīng)本室用API方法重新鑒定后用于試驗。
質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923大腸埃希菌ATCC25922
銅綠假單孢菌ATCC27853培養(yǎng)基1、Tris-HCl緩沖液0.1M Tris 100ml，0.1M HCl 70ml，HighWater 800ml，測PH值，用HCl溶液調(diào)至PH7.2，加High Water至1000ml。
2、Tris-HCl瓊脂培養(yǎng)基在Tris-Cl緩沖液中加入瓊脂糖116℃！滅菌后使用。
3、M-H培養(yǎng)基中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品，M-H肉湯培養(yǎng)基稱取25g加1000ml蒸餾水，加熱溶解，分裝，高壓滅菌，116℃20分鐘。M-H固體培養(yǎng)基稱取36g，加1000ml蒸餾水，高壓滅菌，116℃20分鐘，用于革蘭陽性、陰性需氧菌的藥敏試驗。
4、血培養(yǎng)基，即在M-H培養(yǎng)基中加5-10％脫纖維兔血配制而成，用于腸球菌、鏈球菌的藥敏試驗。
試驗方法體外抗菌活性(MIC)測定采用瓊脂二倍稀釋法測定受試藥物對試驗菌株的最低抑菌濃度(MIC)。將受試藥物用滅菌蒸餾水溶解，適當稀釋。分別取1ml藥液加9ml融化的Tris-HCl瓊脂糖固體培養(yǎng)基混勻，以二倍稀釋，制備系列含藥平皿。每皿所含藥物終濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03……0.001mg/ml；用多點接種儀(Denley A400，England)將稀釋至105CFU/ml的試驗菌液接種于各含藥平皿表面，置于37℃培養(yǎng)8-10小時，取出分別吸取6ml融化的M-H培養(yǎng)基(50℃)覆蓋上述系列平皿表面，再置于37℃培養(yǎng)10小時取出，觀察結(jié)果，以無細菌生長平皿內(nèi)所含最低藥物濃度為該菌的最低抑菌濃度(MIC)。
2、體內(nèi)抗菌作用評價藥品人溶菌酶來源同前。
克拉霉素來源同前。
羅紅霉素來源同前。
阿莫西林來源同前。
細菌金黃色葡球菌01193，金黃色葡球菌MRSA021923均為臨床分離致病菌。
動物昆明種小鼠，體重18-22克，由本所動物室提供。
試驗方法(1)體內(nèi)保護試驗挑取一定量的菌苔接種于2ml M-H液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6小時后，取出用滅菌干酵母液進行適當稀釋(10-1，10-2，10-3，10-4)，再取昆明種小鼠，隨機分組，每組5只鼠，分別腹腔感染不同菌量的受試菌液，測定引起小鼠100％死亡的最小致死菌量(MLD)。再按1∶0.5劑間距設(shè)置5個劑量組，每組10只鼠，每只小鼠腹腔感染1MLD菌量的菌液0.5ml，感染后即刻靜脈注射受試藥0.5ml，設(shè)感染對照組(不給藥)，觀察1周，記錄小鼠死亡數(shù)。按Bliss法計算半數(shù)有效劑量ED50及95％可信限。
(2)小鼠皮膚燒傷感染模型的療效評價昆明種小鼠26-30g，隨機分組，每組5只鼠，分別皮膚燒傷感染模型噴涂金黃色葡萄球菌菌液100ml，菌量為108CFU/ml，連續(xù)噴5次(間隔10分鐘噴一次)，末次噴菌后6小時，分別用無菌棉簽挑取皮膚燒傷感染模型涂于無藥瓊脂平板表面，37℃培養(yǎng)18小時，皮膚燒傷感染模型感染細菌數(shù)在＞103CFU/ml，且經(jīng)革蘭氏染色、光鏡檢測為金黃色葡萄球菌的小鼠為感染模型成功。
選取皮膚燒傷感染模型感染成功小鼠隨機分組，每組10只鼠，分別用噴霧器噴涂受試藥物100μl/次，4次/日，連續(xù)5日，每日采用咽試子涂片法，于瓊脂平板表面進行活菌計數(shù)，作統(tǒng)計學處理，與感染對照組和克拉霉素組、羅紅霉素給藥組作比較。
試驗結(jié)果(1)人溶菌酶對臨床分離菌株的體外抗菌活性見表1。(2)克拉霉素、羅紅霉素、阿莫西林與人溶菌酶以1∶1聯(lián)合用藥的體外抗菌作用結(jié)果見表2。(3)人溶菌酶對379株臨床分離致病菌的MIC50、MIC90見表3。
根據(jù)以上試驗結(jié)果表明人溶菌酶體外具有一定抗菌作用，體內(nèi)對傷口感染潰爛的療效較確切。對多數(shù)菌株的抗菌活性比不上克拉霉素、羅紅霉素和阿莫西林。人溶菌酶與克拉霉素、羅紅霉素聯(lián)用(1∶1)，可使克拉霉素、羅紅霉素對其耐藥菌株的抗菌活性增效2-16倍以上，個別菌株增效倍數(shù)在1000倍。溶菌酶是一種小分子蛋白質(zhì)，存在于機體的淚液、唾液、白細胞和血清中，對多種革蘭氏陽性菌和少數(shù)革蘭氏陰性菌有殺菌作用，由大連奇龍生物技術(shù)研究所研制的基因重組人溶菌酶(Human Lysozyme)也具有溶菌酶相同作用機制，主要切斷肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1、4糖苷鍵之間的聯(lián)結(jié)，破壞肽聚糖支架，引起細菌裂解。
表1 人溶菌酶、雞溶菌酶、克拉霉素和羅紅霉素體內(nèi)外抗菌活性MIC細菌 HLZ CLZ CLAROXmg/ml(萬μ/ml)mg/ml(萬μ/ml)mg/ml mg/ml金葡MRSA02-22 0.25(0.8) 0.008(0.04) ＞1＞1金葡MRSA02-23 0.25(0.8) 0.008(0.04) ＞1＞1金葡MRSA02-26 0.25(0.8) 0.004(0.02) ＞1＞1金葡MRSA02-28 0.5(1.5) 0.016(0.08) ＞1＞1金葡02-19-5 0.03(0.1) ＜0.002(0.001)＞1＞1表葡MssE250.016(0.05) 0.004(0.02) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-290.063(0.2)0.5(2.5) 0.03 0.5表葡MRSE 02-5 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.003)＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-6 ＜0.001(0.005)＜0.001(0.005)＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-20-2 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005)＞11表葡MRSE 02-20-3 ＜0.001(0.003)0.004(0.02) ＞11表葡MRSE 02-20-4 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005)＞1＞1表葡MRSE 02-20-5 0.004(0.012) ＜0.001(0.005)＞1＞1表葡MRSE 02-20-6 0.004(0.012) ＜0.001(0.005)＞1＞1表葡MRSE 02-20-7 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005)1 1表葡MRSE 02-20-8 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005)＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-20-9 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005)＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-20-1 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005)＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-3 1(3) 0.015(0.08) ＞1＞1表葡MRSE 02-4 0.004(0.012) 0.008(0.04) 0.5＞1
續(xù)表2MIC細菌 HLZCLZ CLAROXmg/ml(萬μ/ml) mg/ml(萬μ/ml) mg/ml mg/ml表葡MRSE 02-10 0.004(0.012) 0.25(1.25) 1 1表葡MRSE 02-12 ＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005) 0.008 0.125表葡MRSE 02-11 ＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-15 0.008(0.024) 0.002(0.01) 1 ＞1表葡MRSE 02-17 0.004(0.012) ＜0.001(0.005) 0.25 ＞1表葡MRSE 02-18 ＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-20 0.008(0.024) ＜0.001(0.005) ＞1＞1表葡MRSE 02-21 0.016(0.05)0.25(1.25) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-22 0.004(0.012) ＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡菌02-7-4 0.008(0.02)4(20) 0.002 0.002表葡菌02-7-5 0.008(0.02)0.25(0.63) ＜0.001＜0.001金葡菌02-7-6 0.008(0.02)0.063(0.31) 0.008 0.25金葡菌02-7-9 0.063(0.2) 0.125(0.63) 0.008 0.016金葡菌02-7-7 0.125(0.4) 0.016(0.08) 0.032 0.25金葡菌01-2-22 0.032(0.1) 0.5(2.5)1 1金葡菌01-2-30 0.063(0.2) 4(10) ＞1＞1金葡菌01-2-32 0.016(0.05)0.25(1.25) 0.008 0.5金葡菌01-2-33 0.032(0.1) 2(10) ＞1＞1金葡菌01-2-36 0.063(0.2) 4(20) 0.25 0.5金葡菌01-2-37 0.032(0.1) ＞4(20) ＞11金葡菌01-2-39 0.032(0.1) 0.5(2.5)0.51
續(xù)表3MIC細菌 HLZ CLZ CLA ROXmg/ml(萬μ/ml) mg/ml(萬μ/ml) mg/mlmg/ml銅綠假單孢菌01-2-41 0.032(0.1) 0.5(2.5)＞1 ＞1銅綠假單孢菌01-2-42 0.016(0.05) 0.5(2.5)0.063＞1銅綠假單孢菌01-2-43 ＜0.001(0.003) ＞4(20) 0.0160.25銅綠假單孢菌01-2-45 0.032(0.1) 2(10) 0.25 0.5銅綠假單孢菌01-2-51 0.032(0.1) ＞4(20) ＞1 ＞1銅綠假單孢菌01-2-52 0.032(0.1) ＞4(20) ＞1 0.25銅綠假單孢菌01-2-53 0.008(0.024)4(20) 0.03 0.25銅綠假單孢菌01-2-54 0.032(0.1) 1(5)＞1 1金葡菌01-2-56 0.032(0.1) ＞4(20) 0.0160.25金葡菌01-2-57 ＜0.001(0.003) 2(10) 0.0320.25大腸埃希菌01-2-58 ＜0.001(0.003) 4(20) ＞1 0.5大腸埃希菌01-2-59 0.032(0.1) 4(20) 0.1250.25沙雷氏菌2-31-80.008(0.02) 0.5(0.25) 0.0080.016沙雷氏菌2-31-80.008(0.02) 1(5)0.0080.016金葡菌2-31-8 0.008(0.02) 0.125(0.63) 0.0160.016金葡菌02-6-14 0.25(0.8) 1(5)0.063 ＞1金葡菌02-6-18 0.5(1.5)＞4(20) 0.5 1注HLZ指人溶菌酶，CLZ指對照溶菌酶(雞溶菌酶)，CLA指克拉霉素，ROX指羅紅素D、重組人溶菌酶抑制豚鼠牛血清白蛋白過敏反應(yīng)試驗?zāi)Ｐ瓦x用體重250克左右的健康豚鼠20只，雄性，隨機均分四組，每組5只，進行靜脈注射牛血清白蛋白造模。將造模后的20只小鼠重新合并后再隨機分成四組，分別設(shè)立三個給藥組和一模型組。重組人溶菌酶臨床氣霧劑治療時藥液的濃度為15000u/ml，初步擬定劑量為15000u/次，每日3～5次，即0.5mg/次/日。(按體表面積推算至豚鼠劑量為1.3×10-3mg/只(250g體重計)，由于人通氣量9000ml/分相當于豚鼠通氣量31ml/分的290倍，人用單次劑量0.5mg/70kg相當于小鼠劑量1.3×10-3mg/250g的280倍，以上二者較為接近)。所以設(shè)定用臨床人用濃度0.5mg/ml對小鼠進行霧化治療，另考慮到臨床人用氣霧吸入重組人溶菌酶氣體利用率較高，而小鼠在霧化缸內(nèi)只能靠自身呼吸吸入含藥氣體，故只有延長吸入時間才能確保吸入藥量，設(shè)定為一小時。在15000u/ml為低劑量濃度基礎(chǔ)上再配制30000u/ml、60000u/ml二濃度作為中、高劑量組治療時的藥液濃度。在第二十一天給每只豚鼠靜脈注射牛血清白蛋白前一個小時，將豚鼠置于玻璃干燥器后，用PAR1.BOY壓縮噴霧器霧化不同濃度的重組人溶菌酶液對豚鼠進行霧化預防。然后給每只豚鼠靜脈注射牛血清白蛋白1mg，肉眼觀察豚鼠形態(tài)變化情況和死亡數(shù)量及時間。
實驗結(jié)果豚鼠靜脈注射牛血清白蛋白后10秒鐘模型組出現(xiàn)咳嗽、氣促和撓唇現(xiàn)象。30秒鐘后模型組豚鼠全部死亡。給藥重組人溶菌酶組30小時豚鼠仍然全部存活。給藥重組人溶菌酶組和一模型組有明顯區(qū)別。見表4、見表5。
表4 氣霧治療第1天動物數(shù)組別 用藥后10秒 用藥后30秒 用藥后60秒(只)模型對照組 5只4只0只0只模型高劑量組5只5只5只5只模型中劑量組5只5只5只5只模型低劑量組5只5只5只5只表5 氣霧治療第二天動物數(shù)組別 用藥后10小時 用藥后20小時用藥后30小時(只)模型對照組 0只0只0只 0只模型高劑量組5只5只5只 5只模型中劑量組5只5只5只 5只模型低劑量組5只5只5只 5只綜合以上實驗結(jié)果表明，對豚鼠靜脈注射牛血清白蛋白進行過敏反應(yīng)試驗重組人溶菌酶霧化保護，有很好的保護預防效果。其保護預防效果與使用劑量無明顯量效關(guān)系。
E、重組人溶菌酶抗皰疹病毒抑制豚鼠角膜炎試驗?zāi)Ｐ瓦x用體重250克左右健康豚鼠20只，雄性，將20只豚鼠隨機均分四組，每組5只，進行滴眼液造模。首先用細針在豚鼠的眼角膜上輕微劃出三道痕跡，然后用四川抗菌素工業(yè)研究所實驗動物中心提供I型皰疹病毒100～1000TCID50感染豚鼠的眼角膜，每天三次。第三天豚鼠眼角膜出現(xiàn)輕微角膜炎，第四天豚鼠眼角膜出現(xiàn)紅腫，角膜炎加重。將造模后的20只豚鼠重新合并后再隨機分成四組，分別設(shè)立三個給藥組和一模型組。
重組人溶菌酶滴眼液以15000u/ml(每滴1500U)為低劑量濃度基礎(chǔ)上再配制30000u/ml(每滴3000U)、60000u/ml(每滴6000U)二濃度作為中、高劑量組治療時的藥液濃度。在第五天開始給豚鼠眼角膜用重組人溶菌酶滴眼液，每天三次，每次每只眼一滴，肉眼觀察豚鼠形態(tài)變化情況及時間。
實驗結(jié)果給藥重組人溶菌酶滴眼液第二天，給藥重組人溶菌酶滴眼液中、高劑量組治療效果凸現(xiàn)，豚鼠角膜紅腫減輕。給藥重組人溶菌酶滴眼液第三天，給藥重組人溶菌酶滴眼液低劑量組也出現(xiàn)好轉(zhuǎn)治療效果。給藥重組人溶菌酶滴眼液第六天，給藥模型低、中、高組豚鼠角膜炎和紅腫全部消退好轉(zhuǎn)。模型對照組豚鼠角膜紅腫，角膜炎癥加重并出現(xiàn)潰瘍。給藥重組人溶菌酶組和一模型組有明顯區(qū)別。見表6、見表7。
表6動物數(shù)組別 用藥第一天用藥第二天用藥第三天(只)角膜紅腫角膜模型組對照5只角膜紅腫角膜炎角膜紅腫角膜炎炎角膜紅腫角膜模型高劑量組 5只紅腫減輕 紅腫減輕炎角膜紅腫角膜模型中劑量組 5只紅腫減輕 紅腫減輕炎角膜紅腫角膜模型低劑量組 5只角膜紅腫角膜炎紅腫減輕炎表7動物數(shù)組別 用藥第四天 用藥第五天用藥第六天(只)角膜紅腫、角膜炎 角膜紅腫、角膜炎模型組對照 5只 角膜紅腫角膜炎角膜潰瘍 角膜潰瘍角膜紅腫角膜炎模型高劑量組5只 角膜炎癥減輕 恢復正常消退角膜紅腫角膜炎模型中劑量組5只 角膜炎癥減輕 恢復正常消退角膜紅腫角膜炎模型低劑量組5只 角膜炎癥減輕 恢復正常消退綜合以上實驗結(jié)果表明，試驗重組人溶菌酶滴眼液對抗I型皰疹病毒100～1000TCID50感染豚鼠的眼角膜炎，有很好的治療效果。其治療效果與使用劑量有明顯量效關(guān)系。
六、用法與用量1、噴霧劑直接噴霧作用于病灶局部給藥，每日1～6次，每次1500u～30000u成人與小兒相同。
2、奶液、乳劑、滴劑直接作用于病灶局部給藥每日1～6次，每次1500u～30000u。
3、霜劑直接作用于病灶局部給藥1500u～30000u/g外用，每日2～3次，每次按病灶部位大小給藥。
具體實施例方式實施例1將純度85％-99％的基因重組人溶菌酶制得300U～300萬U/mL，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、萬分之五吐溫80，在常溫下混合均質(zhì)，(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)制成噴霧劑。
實施例2將純度85％-99％的基因重組人溶菌酶制得、300U～300U萬/ml、磷酸鹽緩沖液10(pH6.0)80％、5～20％丙二醇、6％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、0.9％水溶性氮酮、萬分之三吐溫80的(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)滴劑、奶液、乳劑。
實施例3將85％-99％的基因重組人溶菌酶制得、300U～300U萬/ml/g、磷酸鹽緩沖液20mM(pH7.0)85％、5～20％丙二醇、萬分之三吐溫80、卡波樹脂1％、香精0.3％(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)霜劑。
權(quán)利要求
1.人溶菌酶在制備治療皮膚病的藥物中的應(yīng)用。
2.人溶菌酶在制備治療由單純皰疹病毒和帶狀皰疹病毒引起的皮膚疾病的藥物中的應(yīng)用。
3.人溶菌酶在制備治療由細菌引起的皮膚膿皰病和新生兒皮膚膿皰病的藥物中的應(yīng)用。
4.人溶菌酶在制備治療由細菌引起的深膿皰病的藥物中的應(yīng)用。
5.人溶菌酶在制備治療由細菌引起的膿皮病的藥物中的應(yīng)用。
6.人溶菌酶在制備治療由變態(tài)反應(yīng)引起接觸性皮炎和蕁麻疹的藥物中的應(yīng)用。
7.人溶菌酶在制備治療由神經(jīng)功能障礙性引起的瘙癢癥和結(jié)節(jié)性癢疹疾病的藥物中的應(yīng)用。
8.人溶菌酶在制備治療由機體免疫疾病引起的銀屑、掌跎膿皰病和天皰瘡的藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一所述的人溶菌酶在制備治療皮膚病的藥物中的新用途，其特征是藥物為噴霧劑、滴劑、奶液、乳劑或膏、霜劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一所述的人溶菌酶在制備治療皮膚病的藥物中的新用途，其特征是人溶菌酶為基因工程表達的重組人溶菌酶、基因工程表達人溶菌酶的氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶、基因工程表達或化學合成突變體重組人溶菌酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及人溶菌酶在制藥領(lǐng)域的新用途，涉及在制備治療由細菌、真菌、病毒、變態(tài)反應(yīng)、職業(yè)性、物理性、神經(jīng)功能障礙性、免疫性引起的皮膚病變、感染、潰爛疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明對基因重組人溶菌酶發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。安全無毒副作用，有很好的藥用前景。并且基因重組人溶菌酶來源豐富，制備工藝簡單，使用方便。
文檔編號A61P17/04GK1593652SQ20041002081
公開日2005年3月16日 申請日期2004年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月21日
發(fā)明者張華 申請人:張華