專利名稱：重組人溶菌酶在制備治療支氣管哮喘的藥物中的新用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種重組人溶菌酶的新用途，特別是涉及制藥領域中重組人溶菌酶在制備治療支氣管哮喘的新用途。
背景技術：
哮喘為變態(tài)反應性疾病，氣道炎癥為哮喘發(fā)病的重要基礎。變應原首次接觸有過敏體質(zhì)的人，經(jīng)呈遞細胞(包括樹突狀細胞)處理，激活輔助性T淋巴細胞(Th)，其中Th2細胞增殖并釋放IL-4、IL-5、IL-13、干細胞因子(SCF)等細胞因子，使B細胞轉(zhuǎn)化為漿細胞，分泌特異性IgE(sIgE)，后者附著于呼吸道黏膜下肥大細胞、嗜堿性哩細胞和巨噬細胞等效應細胞表面而致敏。傳統(tǒng)觀點認為吸入變應原通過IgE依賴機制作用于肥大細胞表面，當再次吸入同類抗原后，該抗原與已致敏肥大細胞表面的IgE抗體以橋聯(lián)形式相結(jié)合，激活效應細胞，引起脫顆粒和介質(zhì)釋放如組氨和白三烯類，組氨作用于支氣管平滑肌受體，引起平滑肌痙攣，患者往往在吸入抗原后數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)癥狀，于15～30mim時達高峰，持續(xù)約1.5～3.0h，嚴重者很快窒息。
肺胞巨噬細胞通過多種途徑被激活后釋放脂類介質(zhì)如血栓素A2(TXA2)、前列腺素E2(PGE2)、白三烯B4(LTB4)、血小板激活因子(PAF)氧基團和一氧化炭(NO)等及細胞因子如IL-1、IL8、IL-10、TNF-α巨粒細胞集落刺激因子(GM-CSF)血小板衍化生長因子(PDGF)和MIP-1α等，具有重要的炎癥調(diào)控作用。過敏體質(zhì)人的免疫調(diào)控和炎癥調(diào)控作用是引起支氣管哮喘的主要原因。
各種特異性或非特異性變應原可通過吸入、攝入或接觸，使有過敏體質(zhì)和家族過敏史者發(fā)生哮喘，但以吸入為主要誘因。特異性變應原包括花粉、塵螨、蟑螂、動物皮屑和分泌物、呼吸道病毒感染、霉菌、化妝品、魚及蝦等。尤其隨著美化環(huán)境大量種植花草，花粉過敏導致支氣管哮喘患者大量增加。非特異性包括寒冷空氣、大氣污染、職業(yè)性粉塵、煙霧及精神因素等，導致支氣管哮喘發(fā)病。
目前用于治療支氣管哮喘的藥物多為中、西藥，在治療病癥的同時，或多或少都存在著副作用，而且長期服用會產(chǎn)生耐藥性。
重組人溶菌酶是一種有效的抗菌劑，全稱為1，4-β-N-溶菌酶或者稱粘肽N-乙?；邗Ｋ饷?。它能切斷細菌細胞壁的肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵的聯(lián)結(jié)，破壞肽聚糖支架，細菌在內(nèi)部滲透壓的作用下細胞脹裂開，引起細菌裂解。人和動物細胞無細胞壁結(jié)構亦無肽聚糖，故溶菌酶對人體細胞無毒性作用。重組人溶菌酶除可以直接裂解細菌外，還有抗病毒、抗腫瘤、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對各種特異性和非特異性變應原引起的支氣管哮喘疾病，提供一種重組人溶菌酶在制備治療支氣管哮喘的藥物中的新用途，另一目的是提供該藥物的合理劑型。
實際上，本發(fā)明涉及重組人溶菌酶在制備治療由特異性變應原花粉導致支氣管哮喘疾病的藥物中的應用。
涉及重組人溶菌酶在制備治療由特異性變應原塵螨、蟑螂、動物皮屑和分泌物導致支氣管哮喘疾病的藥物中的應用。
涉及重組人溶菌酶在制備治療由特異性變應原呼吸道病毒感染、霉菌、化妝品、魚及蝦等導致支氣管哮喘疾病的藥物中的應用。
涉及重組人溶菌酶作為制備治療由非特異性變應原包括寒冷空氣、大氣污染、職業(yè)性粉塵、煙霧及精神因素等導致支氣管哮喘疾病的藥物中的應用。
所述的重組人溶菌酶為基因工程表達的重組人溶菌酶或基因工程表達人溶菌酶的氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶或基因工程表達或化學合成突變體重組人溶菌酶。
所述藥物劑型為氣霧吸入劑，藥物含有活性15000u～300萬U/ml人溶菌酶。如采用德國菲弗公司出品的每次100ul的氣霧泵。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將用基因重組人溶菌酶的藥理、藥效試驗及結(jié)果來說明其在制藥領域中的新用途。
基因重組人溶菌酶以配制200毫升培養(yǎng)基為基準，用H3PO44-8毫升、MgSO41-5克，K2SO42-6克，KOH1-3克，CaSO42H2O1-3.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20-35℃，在恒溫床上培養(yǎng)36-48小時。進行種子罐培養(yǎng)后進行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。將發(fā)酵表達完成的培養(yǎng)液進行提取純化，對提取純化的蛋白濃縮液冰凍干燥，測定蛋白量、純度和溶菌酶活性保存。將合格的基因重組人溶菌酶凍干粉溶于水中制得氣霧劑。
氣霧劑的制備工藝氣霧劑應在避菌環(huán)境下配置，各種用具、容器等須用適應的方法清潔、滅菌，在整個操作過程中應注意防止微生物的污染。(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)制備工藝流程如下容器與閥門系統(tǒng)的處理和裝配→藥物的配制和分裝→填充拋射劑→質(zhì)量檢查→成品(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)。
一、容器的處理在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成洗凈、滅菌、烘干氣霧劑罐備用。采用德國菲弗公司生產(chǎn)的氣霧劑泵，用三氯甲烷熏蒸滅菌備用。
二、藥物的配制和分裝取重組人溶菌酶純度95％以上、活性15000u～300萬U/ml重組人溶菌酶溶液，司盤85 0.28g，油酸乙酸0.28g，134A 10g，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、在常溫下混合均質(zhì)，(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)配制成15000u～300萬U/ml重組人溶菌酶氣霧吸入劑成品。按分散體系配置后，分別經(jīng)過質(zhì)量檢查，定量分裝在已準備好的容器內(nèi)，安裝閥門，扎緊封帽。
三、拋射劑的填充拋射劑的充填方法分為壓罐法，將已分裝藥物的容器裝上閥門，扎緊封帽，先抽去容器內(nèi)的空氣，以免影響容器內(nèi)的壓力，然后通過壓力灌裝機將定量的拋射劑壓灌入內(nèi)。進入成品檢定。
一、重組人溶菌酶對小鼠吸入鹽酸性肺損傷炎癥模型的作用將50只小鼠隨機均分五組，每組10只，任意挑選其中四組進行吸入霧化鹽酸造模。將造模后的40只小鼠重新合并后再隨機分成四組，分別設立三給藥組和一模型組。重組人溶菌酶臨床霧化治療時藥液的濃度為15000u/ml，初步擬定劑量為15000u/次，每日一次，即0.5mg/次/日。按體表面積推算至小鼠劑量為1.3×10-3mg/只(20g體重計)，由于人通氣量9000ml/分相當于小鼠通氣量24ml/分的375倍，人用單次劑量0.5mg/70kg相當于小鼠劑量1.3×10-3mg/20g的384倍，以上二者較為接近。所以設定用臨床人用濃度0.5mg/ml對小鼠進行霧化治療，另考慮到臨床人用吸入霧化溶菌酶氣體利用率較高，而小鼠在霧化缸內(nèi)只能靠自身呼吸吸入含藥氣體，故只有延長吸入時間才能確保吸入藥量，設定為一小時。在0.5mg/ml為低劑量濃度基礎上再配制1.0mg/ml、2.0mg/ml二濃度作為中、高劑量組治療時的藥液濃度。
小鼠置于玻璃干燥器后，用PAR1.BOY壓縮噴霧器霧化不同濃度的人溶菌酶液對小鼠進行霧化治療，每日一次，連續(xù)5-10天。
霧化治療第5天和10天時，每組處理一半動物(5只)，解剖取肺組織稱重，并根據(jù)體重計算肺臟器系數(shù)，肉眼觀察肺外觀病變情況，取肺組織進行病理切片觀察。
實驗結(jié)果(1)霧化治療5天后，解剖發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肺呈暗紅色，有個別肺葉顏色更深暗，比正常對照組的肺色澤相比存在明顯反差，正常對照組肺呈鮮明淡粉紅色。各用藥組肺外觀色澤有較明顯的改觀。各組肺臟器系數(shù)見表1。
表1霧化治療5天后各組小鼠肺臟器系數(shù)動物數(shù) 肺臟器系數(shù)組別 體重(g) P值(只) (g/g)×10-3正常對照組 5 30.2±1.6 6.4±0.69模型組5 24.5±2.7 10.5±1.60 ＜0.01(與正常對照組比)高劑量組 5 29.4±3.3 9.1±1.00 ＞0.05(與模型組比)中劑量組 5 29.2±2.4 7.8±0.65 ＜0.01(與模型組比)低劑量組 5 29.6±1.6 7.30±0.43 ＜0.01(與模型組比)由表1可見，霧化治療5天后，模型組體重仍明顯低于正常對照組，用藥組使體重恢復。模型組肺臟器系數(shù)明顯增大，用藥組除高劑量組外，中、低二劑量組與模型組比較顯著性下降。
病理切片結(jié)果顯示，模型組肺組織大片彌散分布性肺泡壁明顯增厚，致肺泡壓閉，其間多量單核細胞及部分中性白細胞浸潤。4/5只產(chǎn)生病變；高劑量組有2/5只呈現(xiàn)病變，為細支氣管周單核細胞為主浸潤，另一只為多處小灶分布肺泡壁增厚伴單核細胞浸潤，其余3/5只正常；中劑量組5/5只基本正常；低劑量組4/5只基本正常，有一只為肺泡壁型及細支氣管周少許單核細胞浸潤。
(2)霧化治療10天后，解剖發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肺似呈暗紅色，與正常對照組相比較明顯存在色澤反差，并且該組動物于第9天有死亡(一只)，解剖肺臟見有重試病變，系暗黑色。各用藥組小鼠肺外觀有較大程度改觀，各組肺臟器系數(shù)見表2。
表2 霧化治療10天后各組小鼠肺臟器系數(shù)動物數(shù) 肺臟器系數(shù)組別 體重(g)值(只) (g/g)×10-3正常對照組5 31.6±2.46.38±0.68模型組4 28.0±1.99.90±0.66 ＜0.01(與正常對照組比)高劑量組 5 31.2±2.08.32±1.84＞0.05(與模型組比)中劑量組 5 30.6±2.28.30±1.40＞0.05(與模型組比)低劑量組 5 30.7±3.07.10±0.61＜0.01(與模型組比)由表2可見，霧化治療10天，模型組體重的顯著性(P＜0.05)低于正常對照組，各用藥組體重與正常對照組接近，模型組肺臟器系數(shù)顯著性(P＜0.01)高于正常對照組，用藥組有下降趨勢，但只有低劑量組表現(xiàn)顯著。
綜合以上實驗結(jié)果分析，重組人溶菌酶治療小鼠吸入鹽酸性肺損傷模型有效，以臨床人用濃度進行霧化治療療效最佳，其治療效果與使用劑量無明顯量效關系。
二、重組人溶菌酶抑制豚鼠牛血清白蛋白過敏反應試驗模型將20只健康豚鼠隨機均分四組，每組5只，進行靜脈注射牛血清白蛋白造模。將造模后的20只小鼠重新合并后再隨機分成四組，分別設立三個給藥組和一模型組。重組人溶菌酶臨床氣霧劑治療時藥液的濃度為15000u/ml，初步擬定劑量為15000u/次，每日3～5次，即0.5mg/次/日。(按體表面積推算至豚鼠劑量為1.3×10-3mg/只(250g體重計)，由于人通氣量9000ml/分相當于豚鼠通氣量31ml/分的290倍，人用單次劑量0.5mg/70kg相當于小鼠劑量1.3×10-3mg/250g的280倍，以上二者較為接近)。所以設定用臨床人用濃度0.5mg/ml對小鼠進行霧化治療，另考慮到臨床人用氣霧吸入重組人溶菌酶氣體利用率較高，而小鼠在霧化缸內(nèi)只能靠自身呼吸吸入含藥氣體，故只有延長吸入時間才能確保吸入藥量，設定為一小時。在15000u/ml為低劑量濃度基礎上再配制30000u/ml、60000u/ml二濃度作為中、高劑量組治療時的藥液濃度。在第二十一天給每只豚鼠靜脈注射牛血清白蛋白前一個小時，將豚鼠置于玻璃干燥器后，用PAR1.BOY壓縮噴霧器霧化不同濃度的重組人溶菌酶液對豚鼠進行霧化預防。然后給每只豚鼠靜脈注射牛血清白蛋白1mg，肉眼觀察豚鼠形態(tài)變化情況和死亡數(shù)量及時間。
實驗結(jié)果豚鼠靜脈注射牛血清白蛋白后10秒鐘模型組出現(xiàn)咳嗽、氣促和撓唇現(xiàn)象。30秒鐘后模型組豚鼠全部死亡。給藥重組人溶菌酶組30小時豚鼠仍然全部存活。給藥重組人溶菌酶組和一模型組有明顯區(qū)別。見表3、見表4表3氣霧治療第1天動物數(shù)組別 用藥后10秒 用藥后30秒用藥后60秒(只)模型對照組5只4只0只 0只模型高劑量組 5只5只5只 5只模型中劑量組 5只5只5只 5只模型低劑量組 5只5只5只 5只表4 氣霧治療第二天動物數(shù)組別 用藥后10小時用藥后20小時用藥后30小時(只)模型對照組0只 0只0只 0只模型高劑量組 5只 5只5只 5只模型中劑量組 5只 5只5只 5只模型低劑量組 5只 5只5只 5只綜合以上實驗結(jié)果分析，對豚鼠靜脈注射牛血清白蛋白進行過敏反應試驗重組人溶菌酶霧化保護，有很好的保護預防效果。其保護預防效果與使用劑量無明顯量效關系。
具體實施例方式
實施例1基因重組人溶菌酶以配制200毫升培養(yǎng)基為基準，用H3PO44-8毫升、MgS041-5克，K2SO42-6克，KOH1-3克，CaSO42H2O1-3.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20-35℃，在恒溫床上培養(yǎng)36-48小時。進行種子罐培養(yǎng)后進行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。將發(fā)酵表達完成的培養(yǎng)液進行提取純化，對提取純化的蛋白濃縮液冰凍干燥，測定蛋白量、純度和溶菌酶活性保存。將純度95％的基因重組人溶菌酶制得300U～300萬U/mL，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、 萬分之五吐溫80，司盤85 0.28g，油酸乙酸0.28g，134A 10g，在常溫下混合均質(zhì)，(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)制成氣霧吸入劑。
實施例2
取重組人溶菌酶純度95％以上、活性15000u～300萬U/ml重組人溶菌酶溶液，司盤85 0.28g，油酸乙酸0.28g，134A 10g，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、在常溫下混合均質(zhì)，(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)配制成15000u～300萬U/ml重組人溶菌酶氣霧吸入劑成品。按分散體系配置后，分別經(jīng)過質(zhì)量檢查，定量分裝在已準備好的容器內(nèi)，安裝閥門，扎緊封帽。進入成品檢定。
權利要求
1.人溶菌酶在制備治療由特異性變應原花粉導致支氣管哮喘疾病的藥物中的應用。
2.人溶菌酶在制備治療由特異性變應原塵螨、蟑螂、動物皮屑和分泌物導致支氣管哮喘疾病的藥物中的應用。
3.人溶菌酶在制備治療由特異性變應原呼吸道病毒感染、霉菌、化妝品、魚及蝦等導致支氣管哮喘疾病的藥物中的應用。
4.人溶菌酶在制備治療由非特異性變應原包括寒冷空氣、大氣污染、職業(yè)性粉塵、煙霧及精神因素等導致支氣管哮喘疾病的藥物中的應用。
5.根據(jù)權利要求1、2、3、4所述的人溶菌酶的應用，其特征是人溶菌酶為基因工程表達的重組人溶菌酶、基因工程表達人溶菌酶的氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶或基因工程表達或化學合成突變體重組人溶菌酶。
6.根據(jù)權利要求1、2、3或4所述的人溶菌酶的應用，其特征是藥物劑型為氣霧吸入劑。
7.根據(jù)權利要求6所述的人溶菌酶的應用，其特征是藥物含有活性15000u～300萬U/ml人溶菌酶。
8.根據(jù)權利要求6所述的人溶菌酶的應用，其特征是氣霧吸入劑采用德國菲弗公司出品的每次100ul的氣霧泵。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人溶菌酶的新用途，特別是涉及制藥領域中人溶菌酶的新用途。本發(fā)明提供一種人溶菌酶在制備治療由各種特異性和非特異性變應原引起的支氣管哮喘疾病的藥物中的應用。藥物劑型為氣霧吸入劑，使用安全方便，釋藥速度快，作用迅速，能夠達到理想的臨床治療效果。
文檔編號A61K38/48GK1583167SQ20041002073
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月10日 優(yōu)先權日2004年6月10日
發(fā)明者張華 申請人:張華