專利名稱：類胰島素生長因子制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備類胰島素生長因子的方法及其臨床應(yīng)用。更具體地說涉及一種從牛初乳中制備類胰島素生長因子的方法以及該制劑單獨(dú)應(yīng)用或與其他營養(yǎng)成份聯(lián)合應(yīng)用的方法。
發(fā)明技術(shù)背景類胰島素生長因子(IGF)由兩種低分子多肽，類胰島素生長因子I(IGF-I)和類胰島素生長因子II(IGF-II)組成。1978年被分離純化，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)與胰島素原相似，命名為類胰島素生長因子，以強(qiáng)調(diào)它們與胰島素結(jié)構(gòu)的同源性。
胰島素生長因子I是由70個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，分子量為7649D，耐熱，主要在肝臟合成，在細(xì)胞的生長、分化和代謝調(diào)節(jié)中有著重要作用，并參與神經(jīng)再生，骨的生長、修復(fù)和改建，骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展，燒傷組織的修復(fù)，免疫系統(tǒng)的功能，糖尿病、腎病、心臟病及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。
綜合目前研究成果，類胰島素生長因子-I(IGF-I)具備下列明確的生理功能介導(dǎo)生長激素的促生長作用；通過增加脂肪、旦白質(zhì)、糖元的合成，減少其分解；通過增加葡萄糖的攝取和利用等途徑降低血糖，促進(jìn)細(xì)胞增殖和促進(jìn)紅細(xì)胞生成。
現(xiàn)有研究表明，應(yīng)用類胰島素生長因子-I可以增加胰島素敏感性，減少胰島素抵抗，從而糾正胰島素抵抗患者的高血糖狀態(tài)。
臨床醫(yī)學(xué)研究顯示，肝硬化患者血清或血循環(huán)中IGF-I較正常明顯減少，隨著肝硬化的逐步加深，IGF-I也持續(xù)下降，其下降程度與肝功能損害程度(Ghild-Pugh評分)明顯相關(guān)。肝硬化患者常合併營養(yǎng)不良，而IGF-I有促生長作用，多數(shù)研究者認(rèn)為IGF-I對肝硬化患者有營養(yǎng)作用。肝硬化患者應(yīng)用基因重組IGF-I治療后，血液中IGF-I水平明顯提高，淋巴細(xì)胞計數(shù)、體重指數(shù)、前臂肌周長等營養(yǎng)狀態(tài)相應(yīng)改善。IGF-I改善肝硬化患者的營養(yǎng)狀態(tài)可能通過改善機(jī)體糖代謝和影響小腸的結(jié)構(gòu)和功能來實現(xiàn)。
有研究者觀察了由于熱量及旦白質(zhì)攝入不足所致的小兒營養(yǎng)不良，并應(yīng)用動物實驗進(jìn)行了分子生物學(xué)研究，結(jié)果表明，營養(yǎng)不良引起小兒生長停滯、身材矮小的關(guān)鍵是IGF-I在基因轉(zhuǎn)錄水平降低，肝細(xì)胞IGF-I mRNA水平下降，血漿IGF-I含量減少，清除速度過快，因此，IGF-I與小兒生長發(fā)育關(guān)系十分密切。
某些臨床試驗表明，應(yīng)用IGF-I治療生長發(fā)育不良的兒童效果顯著，在兩年內(nèi)身高增高10cm。
目前國外已經(jīng)能夠采用基因重組方式制備類胰島素生長因子，并應(yīng)用于治療糖尿病、侏儒癥、神經(jīng)系統(tǒng)損傷等疾病，然而基因重組的類胰島素生長因子-I價格十分昂貴。市場急需價格便宜、效果顯著的IGF-I制劑。
近來研究表明，牛初乳中含有十分豐富的IGF-I，其中部分是短鏈類胰島素生長因子，部份IGF-I處于與類胰島素生長因子旦白結(jié)合方式。
澳大利亞科學(xué)家Francis在生物化學(xué)雜志(The BioChemical Joural)公開了從牛初乳中提取短鏈類胰島素生長因子的實驗方法，該方法屬于實驗室性質(zhì)，費(fèi)用高、產(chǎn)量低，難以形成規(guī)模生產(chǎn)。中國發(fā)明專利(96116428)公布的技術(shù)，直接從牛初乳中提取與類胰島素生長因子結(jié)合旦白結(jié)合的IGF-I，這種方法制備的制劑純度不能達(dá)到臨床使用要求，使用劑量難以計算。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提出一種有效、廉價、適合大規(guī)模生產(chǎn)的制備方法，從牛初乳中制備類胰島素生長因子，并提出其單獨(dú)應(yīng)用或與其他制劑聯(lián)合臨床應(yīng)用的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案，其特征是，采用離心方式去除脂肪，用酸制劑調(diào)整牛初乳中PH值至強(qiáng)酸性。拆散部份短鏈類胰島素生長因子與類胰島素生長因子結(jié)合旦白之間的結(jié)合，直接用低分子量超濾膜分離過濾類胰島素生長因子-I，分離液調(diào)整PH值至弱酸性或中性，用超濾膜濃縮后冷凍干燥制粉，獲得IGF-I純制劑。超濾分離的濃縮物中仍然含有部份與結(jié)合旦白結(jié)合形式的短鏈類胰島素，用堿液調(diào)整PH值至弱酸性同時加熱，促使酪旦白析出及凝固，用尼龍濾布過濾除去酪旦白，所得上清液用分子量50,000～70,000的超濾膜過濾分離。分離液用超濾膜濃縮后冷凍干燥成粉。獲得與類胰島素生長因子結(jié)合旦白結(jié)合形式的類胰島素生長因子制劑，在制備注射制劑時可采用純類胰島素生長因子-I制劑，在制備口服制劑時可以采用上述兩種不同制劑的混合形式，以降低成本。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案也可以采用另外一種方法和程序，其特征是，直接用低分子量超微濾膜分離過濾脫脂牛初乳，提取游離狀態(tài)的類胰島素生長因子，分離液濃縮后冷凍干燥成粉，分離過濾的殘留物調(diào)PH同時加熱以析出和沉淀酪旦白，用離心或濾布過濾方式除去酪旦白，用分子量50,000～70,000的超微濾膜分離類胰島素生長因子結(jié)合旦白及其與其結(jié)合的類胰島素生長因子，分離物濃縮后干燥成粉。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，收集的牛初乳是母牛分娩三日內(nèi)(72小時)的牛初乳，收集的牛初乳是新鮮或冷凍狀態(tài)(4℃)，對收集的牛初乳進(jìn)行脫脂程序，可以采用冷凍離心的方法，離心速度2000～4000轉(zhuǎn)/分，優(yōu)選3000轉(zhuǎn)/分，離心時溫度不高于10℃～28℃，離心后去除離心液表面的脂肪。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，采用酸制劑調(diào)整脫脂初乳的PH值至強(qiáng)酸性，采用的酸制劑可以是HCL或其他酸制劑，調(diào)整PH值至2.2～3.5，優(yōu)選2.8～2.9，調(diào)整PH值至規(guī)定的區(qū)間后，采用分子量為8,000～20,000的超濾膜，采用常規(guī)超濾設(shè)備，最理想的是采用切面交錯流體超濾設(shè)備進(jìn)行分離，收集過濾液，用堿性制劑調(diào)整過濾液的PH值至5.5～7.5，優(yōu)選5.8～6.2，調(diào)整PH值后的過濾液采用分子量為3,000～6,000的超濾膜，優(yōu)選為分子量4,000～5,000超濾膜，采用常規(guī)超濾設(shè)備濃縮至起始容量10％～60％，優(yōu)選20％～30％后，送至冷凍干燥設(shè)備，制備冷凍干燥粉，在調(diào)整PH值后，也可以在過濾液中加入相當(dāng)于過濾液1倍～5倍，優(yōu)選2倍～3倍的無菌蒸鎦水稀釋過濾液后進(jìn)行濃縮，尤其采用切面交錯流體超濾裝置時更應(yīng)采用后一步驟。與此同時，收集第一次超濾分離的濃縮物，加堿性制劑，可以是NaOH也可以是其他堿性制劑，調(diào)整濃縮物PH至弱酸性或中性，PH值3.8～5.2，優(yōu)選4.5～4.8，調(diào)整濃縮物PH值后，加熱析出酪旦白，加熱溫度40℃～55℃，最好45℃～50℃，加熱時間15分鐘～90分鐘，最好30分鐘～45分鐘，最好是加熱至看到乳水明顯分離，然后用離心機(jī)離心沉淀析出的酪旦白，離心速度3000～6000轉(zhuǎn)/分，優(yōu)選5000轉(zhuǎn)/分，收集離心上清液。除去酪旦白的另一種方式可以是在超濾分離的殘留物內(nèi)滴入堿性制劑調(diào)整PH值到4.7～4.8同時加熱至30℃～50℃范圍，在酪旦白凝固后直接用尼布濾布或其他濾布過濾除去酪旦白，收集上清液，將上清液放入超濾裝置內(nèi)，用分子量50,000～70,000的超濾膜，優(yōu)選分子量為60,000的超微濾膜，分離過濾，收集上清液，用分子量4,000～6,000的超微濾膜進(jìn)行濃縮，濃縮物冷凍干燥成粉。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，直接用脫脂牛初乳，以分子量為8,000～12,000的超微濾膜分離過濾游離的IGF-I，分離過濾的上清液用4,000～6,000分子量超微濾膜濃縮至原體積20％～30％后冷凍干燥成粉，調(diào)節(jié)殘余濃縮物PH值至4.6～4.8同時加熱至30℃～40℃，加熱時間20～60分鐘，酪旦白凝固后用濾布，最好用尼龍濾布去除酪旦白，上清液用分子量50,000～70,000的超濾膜分離后濃縮，冷凍干燥成粉。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，制備類胰島素生長因子，還可以采用下列方法，脫脂牛初乳用1倍～5倍，優(yōu)選2倍～3倍的蒸鎦水稀釋，調(diào)節(jié)PH值至4.6～4.9，優(yōu)選4.7～4.8，與此同時加熱30℃～50℃，時間15～45分鐘，然后于4℃貯存過液，用尼布濾布或其他濾布或用離心方式去除沉淀的酪旦白，上清液用分子量為50,000～70,000的超微濾膜分離過濾后，用分子量為4,000～6,000的超濾膜濃縮，并冷凍干燥制粉，直接制備含有類胰島素生長因子及其類胰島素生長因子結(jié)合旦白的混合制劑，用于口服形式給藥。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，采用上述方法制備的類胰島素生長因子制劑可以單獨(dú)應(yīng)用治療糖尿病，可以采用胃腸道給藥形式，也可以給予胃腸道外給藥的方式，可以單獨(dú)施用于有胰島素抵抗的II型糖尿病患者，也可以與其他營養(yǎng)成份或其他藥物成分聯(lián)合應(yīng)用于有胰島素抵抗的II型糖尿病患者，這些營養(yǎng)或藥物成份包括但不限于三價鉻、生物素、鋅、鎂、硒、釩、各類維生素例如維生素C和維生素E等、各類口服降糖藥物及胰島素制劑、各種有降低血糖功效的植物或動物成份例如苦瓜、南瓜、西洋參等。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，采用上述方法制備的類胰島素生長因子制劑，可以單獨(dú)應(yīng)用治療肝硬化，可以采用胃腸道給藥形式，也可以采用胃腸道外給藥的方式，還可以與其他改善營養(yǎng)代謝或改善肝功能的營養(yǎng)成份或藥物成份聯(lián)合應(yīng)用，這些成份包括但不限于谷氨酰胺、左旋谷氨酰胺、利肝靈等。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，采用上述方法制備的類胰島素生長因子制劑可以用來治療侏儒癥或營養(yǎng)不良，發(fā)育延緩的兒童，可以采用單獨(dú)施用的方式，也可以采用聯(lián)合用藥的形式，這些協(xié)作的制劑包括但不限于生長激素類制劑、能刺激人體生長激素釋放的制劑如精氨酸、賴氨酸等。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，采用上述方法制備的類胰島素生長因子制劑，還可以應(yīng)用于創(chuàng)傷、潰瘍、糖尿病患者傷口不能愈合等外用途徑，可以單獨(dú)應(yīng)用，也可以與其他制劑聯(lián)合應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是，能夠有效地從牛初乳中制備類胰島素生長因子，方法簡單、效率高、便于大規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)，可單獨(dú)應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用，可以有效治療多種疾病，與現(xiàn)有技術(shù)相比，制備成本降低，產(chǎn)品純度提高。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明實施例1收集牛初乳，以3000轉(zhuǎn)/分速度離心脫脂，用2N HCL滴入調(diào)節(jié)脫脂初乳至PH2.9，采用12000分子量超微濾膜用板框式超濾器過濾分離，過濾液用2N NaOH調(diào)整PH至6.2，換用分子量為4000的超濾膜在板框式超濾器濃縮，濃縮的冷凍干燥成粉。經(jīng)類胰島素生長因子放射免疫藥盒測試每克干粉含0.5微克類胰島素生長因子。
實施例2收集母牛分娩后3日內(nèi)分泌的牛初乳，冷凍離心脫脂，速度為3000轉(zhuǎn)/分，離心時間為30分鐘，去除離心液上層脂肪，在脂脫初乳內(nèi)滴入2N HCL調(diào)整PH值至2.8，采用裝有分子量為10000超微濾膜的美國Pall公司生產(chǎn)的切面交錯流體過濾設(shè)備(TFF)進(jìn)口壓為3500千克/厘米2，出口壓0.4千克/厘米2，料液溫度＜35℃，收集過濾液，用2N NaOH調(diào)PH至6.5，過濾液繼續(xù)用同樣設(shè)備和參數(shù)，但改用分子量為5000的超微濾膜進(jìn)行濃縮，棄去過濾液，收集濃縮液，送入冷凍干燥裝置冷凍干燥成粉。制劑內(nèi)含有純IGF-I。同步收集第一次過濾分離的濃縮液，用2N NaOH調(diào)節(jié)PH值至4.7，加熱至50℃，加熱30分鐘，使酪旦白凝固，用5000轉(zhuǎn)/分速度離心15分鐘，收集離心上清液，用分子量100000的超濾膜及上述超濾裝置濃縮，濃縮物直接噴霧干燥成粉。制劑內(nèi)含有與類胰島素結(jié)合旦白結(jié)合形式的IGF-I。
實施例3選用脫脂牛初乳，用2倍量蒸鎦水稀釋，用1N HCL調(diào)PH至4.8，加熱至40℃維持半小時，4℃靜置過液，讓酪旦白沉淀，用尼龍濾布去除沉淀的酪旦白，上清液用分子量6萬的超微濾膜分離過濾，收集上清液，用分子量4000的超微濾膜濃縮至原體積20％，濃縮液送至冷凍干燥機(jī)干燥成粉末。
實施例4取實施例1制備的粉末2毫克，三吡啶甲酸鉻500微克，灌裝膠囊，為有胰島素抵抗的患者每天服用劑量。
實施例5取實施例3制備的粉末，喂養(yǎng)糖尿病大鼠一周，血糖濃度從原來375±150mg/100ml下降至218±126mg/100ml。
實施例6取實施例1制備的制劑1.5mg，左旋谷氨酰胺300mg，灌裝膠囊，為肝硬化患者每天服用劑量。
實施例7取實施例1制備的制劑3mg，精氨酸1500mg，灌裝膠囊，為身材矮小營養(yǎng)不良患者每天服用劑量。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一種從牛初乳中制備類胰島素生長因子的方法及其臨床應(yīng)用，其特征是在牛初乳脫脂后酸化，使類胰島素生長因子與結(jié)合旦白分離，采用超微濾膜的方式分離，濃縮后制備干粉制劑，或者直接用蒸鎦水稀釋脫脂牛初乳后，通過調(diào)PH值和加熱方法使酪旦白凝固，用離心或濾布過濾方法去除酪旦白，然后直接用超微濾膜分離類胰島素結(jié)合旦白及其相連接的類胰島素生長因子，收集上清液，濃縮后冷凍干燥制粉，上述方法制備的制劑可以單獨(dú)應(yīng)用或與其他營養(yǎng)成分和藥物成分聯(lián)合應(yīng)用于糖尿病、肝硬化、侏儒癥、外傷等疾病的治療。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，采用酸制劑調(diào)整脫脂初乳的PH值至強(qiáng)酸性，采用的酸制劑可以是HCL或其他酸制劑，調(diào)整PH值至2.2～3.5，優(yōu)選2.8～2.9，調(diào)整PH值至規(guī)定的區(qū)間后，采用分子量為8,000～20,000的超濾膜，采用常規(guī)超濾設(shè)備，最理想的是采用切面交錯流體超濾設(shè)備進(jìn)行分離，收集過濾液，用堿性制劑調(diào)整過濾液的PH值至5.5～7.5，優(yōu)選5.8～6.2，調(diào)整PH值后的過濾液采用分子量為3,000～6,000的超濾膜，優(yōu)選為分子量4,000～5,000超濾膜，采用常規(guī)超濾設(shè)備濃縮至起始容量10％～60％，優(yōu)選20％～30％后，送至冷凍干燥設(shè)備，制備冷凍干燥粉，在調(diào)整PH值后，也可以在過濾液中加入相當(dāng)于過濾液1倍～5倍，優(yōu)選2倍～3倍的無菌蒸鎦水稀釋過濾液后進(jìn)行濃縮，尤其采用切面交錯流體超濾裝置時更應(yīng)采用后一步驟。與此同時，收集第一次超濾分離的濃縮物，加堿性制劑，可以是NaOH也可以是其他堿性制劑，調(diào)整濃縮物PH至弱酸性或中性，PH值3.8～5.2，優(yōu)選4.5～4.8，調(diào)整濃縮物PH值后，加熱析出酪旦白，加熱溫度40℃～55℃，最好45℃～50℃，加熱時間15分鐘～90分鐘，最好30分鐘～45分鐘，最好是加熱至看到乳水明顯分離，然后用離心機(jī)離心沉淀析出的酪旦白，離心速度3000～6000轉(zhuǎn)/分，優(yōu)選5000轉(zhuǎn)/分，收集離心上清液。除去酪旦白的另一種方式可以是在超濾分離的殘留物內(nèi)滴入堿性制劑調(diào)整PH值到4.7～4.8同時加熱至30℃～50℃范圍，在酪旦白凝固后直接用尼布濾布或其他濾布過濾除去酪旦白，收集上清液，將上清液放入超濾裝置內(nèi)，用分子量50,000～70,000的超濾膜，優(yōu)選分子量為60,000的超微濾膜，分離過濾，收集上清液，用分子量4,000～6,000的超微濾膜進(jìn)行濃縮，濃縮物冷凍干燥成粉。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，直接用脫脂牛初乳，以分子量為8,000～12,000的超微濾膜分離過濾游離的IGF-I，分離過濾的上清液用4,000～6,000分子量超微濾膜濃縮至原體積20％～30％后冷凍干燥成粉，調(diào)節(jié)殘余濃縮物PH值至4.6～4.8同時加熱至30℃～40℃，加熱時間20～60分鐘，酪旦白凝固后用濾布，最好用尼龍濾布去除酪旦白，上清液用分子量50,000～70,000的超濾膜分離后濃縮，冷凍干燥成粉。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，制備類胰島素生長因子，還可以采用下列方法，脫脂牛初乳用1倍～5倍，優(yōu)選2倍～3倍的蒸鎦水稀釋，調(diào)節(jié)PH值至4.6～4.9，優(yōu)選4.7～4.8，與此同時加熱30℃～50℃，時間15～45分鐘，然后于4℃貯存過液，用尼布濾布或其他濾布或用離心方式去除沉淀的酪旦白，上清液用分子量為50,000～70,000的超微濾膜分離過濾后，用分子量為4,000～6,000的超濾膜濃縮，并冷凍干燥制粉，直接制備含有類胰島素生長因子及其類胰島素生長因子結(jié)合旦白的混合制劑，用于口服形式給藥。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，采用上述方法制備的類胰島素生長因子制劑可以單獨(dú)應(yīng)用治療糖尿病，可以采用胃腸道給藥形式，也可以給予胃腸道外給藥的方式，可以單獨(dú)施用于有胰島素抵抗的II型糖尿病患者，也可以與其他營養(yǎng)成份或其他藥物成分聯(lián)合應(yīng)用于有胰島素抵抗的II型糖尿病患者，這些營養(yǎng)或藥物成份包括但不限于三價鉻、生物素、鋅、鎂、硒、釩、各類維生素例如維生素C和維生素E等、各類口服降糖藥物及胰島素制劑、各種有降低血糖功效的植物或動物成份例如苦瓜、南瓜、西洋參等。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，采用上述方法制備的類胰島素生長因子制劑，可以單獨(dú)應(yīng)用治療肝硬化，可以采用胃腸道給藥形式，也可以采用胃腸道外給藥的方式，還可以與其他改善營養(yǎng)代謝或改善肝功能的營養(yǎng)成份或藥物成份聯(lián)合應(yīng)用，這些成份包括但不限于谷氨酰胺、左旋谷氨酰胺、利肝靈等。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，采用上述方法制備的類胰島素生長因子制劑可以用來治療侏儒癥或營養(yǎng)不良，發(fā)育延緩的兒童，可以采用單獨(dú)施用的方式，也可以采用聯(lián)合用藥的形式，這些協(xié)作的制劑包括但不限于生長激素類制劑、能刺激人體生長激素釋放的制劑如精氨酸、賴氨酸等。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，采用上述方法制備的類胰島素生長因子制劑，還可以應(yīng)用于創(chuàng)傷、潰瘍、糖尿病患者傷口不能愈合等外用途徑，可以單獨(dú)應(yīng)用，也可以與其他制劑聯(lián)合應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從牛初乳中制備類胰島素生長因子的方法及其臨床應(yīng)用，其特征是在牛初乳脫脂后酸化，使類胰島素生長因子與結(jié)合蛋白分離，采用超微濾膜的方式分離，濃縮后制備干粉制劑，或者直接用蒸餾水稀釋脫脂牛初乳后，通過調(diào)pH值和加熱方法使酪蛋白凝固，用離心或濾布過濾方法去除酪蛋白，然后直接用超微濾膜分離類胰島素結(jié)合蛋白及其相連接的類胰島素生長因子，收集上清液，濃縮后冷凍干燥制粉，上述方法制備的制劑可以單獨(dú)應(yīng)用或與其他營養(yǎng)成分和藥物成分聯(lián)合應(yīng)用于糖尿病、肝硬化、侏儒癥、外傷等疾病的治療。
文檔編號A61K35/20GK1557480SQ20041001586
公開日2004年12月29日 申請日期2004年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月15日
發(fā)明者高春平 申請人:高春平