芐達(dá)賴氨酸在制備預(yù)防和治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用的制作方法

專利名稱：芐達(dá)賴氨酸在制備預(yù)防和治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及芐達(dá)賴氨酸的新用途，尤其是涉及芐達(dá)賴氨酸在制備防治糖尿病腎病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是指糖尿病特發(fā)性全身微血管病變的腎臟表現(xiàn)，是糖尿病最常見的并發(fā)癥，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國糖尿病的標(biāo)化患病率為3.2％，也就是說目前我國有5000萬人以上正面臨著糖尿病的威肋，在我國93％的糖尿病患者是2型糖尿病，其中40％將發(fā)展為DN。可以預(yù)見，隨著我國人民生活水平的迅速提高和人均壽命的延長，21世紀(jì)我國糖尿病的患病率將不斷上升，由DN發(fā)展而來的終末期腎功能衰竭的發(fā)生比例也將顯著提高。因此，DN正在成為本世紀(jì)全世界醫(yī)藥界的重要研究課題之一。
芐達(dá)賴氨酸(bendazac lysine，BDL)首先由Anglini制藥集團(tuán)開發(fā)，作為治療白內(nèi)障藥物于1983年在意大利上市，有0.5g的片劑和0.5％的滴眼液兩種。該藥已在意大利、阿根廷、西班牙、葡萄牙、菲律賓取得生產(chǎn)許可證，在希臘、巴西和韓國登記注冊(cè)，在加拿大、瑞士、美國、德國已進(jìn)行第三期臨床研究，日本正在進(jìn)行第二期臨床研究。奧地利、比利時(shí)、哥倫比亞、墨西哥、秘魯、土耳其、英國、委內(nèi)瑞拉己在進(jìn)行臨床前研究。1989年，國內(nèi)原南京藥物研究所在江蘇省科委立題進(jìn)行應(yīng)用基礎(chǔ)研究，打通了合成路線，得到了純品，進(jìn)行了初步的藥效學(xué)研究，1990年開始與浙江平湖制藥廠合作，按二類新藥要求，進(jìn)行開發(fā)性研究，改進(jìn)了合成工藝，提高了得率。
BDL對(duì)多種類型的早期老年性白內(nèi)障，糖性白內(nèi)障有預(yù)防和延緩白內(nèi)障的進(jìn)展的作用.口服BDL 500mg每日三次治療12至24個(gè)月，顯示口服BDL有很好的耐受性，經(jīng)常報(bào)道的不良反應(yīng)是關(guān)于胃腸道的。局部使用BDL已在幾個(gè)發(fā)炎的動(dòng)物模型中顯示了抗炎作用，BDL可有效的用于臨床治療各種皮癥，包括嬰兒的臀部紅斑，濕疹等；此外并有降血脂作用(Drug.1990，39(4)576-96)。至今未見到芐達(dá)賴氨酸能治療糖尿病腎病的有關(guān)報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
1.發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供芐達(dá)賴氨酸的新用途，即在制藥中的新應(yīng)用。
實(shí)際上，本發(fā)明涉及芐達(dá)賴氨酸作為制備預(yù)防和治療糖尿病腎病的藥物中的應(yīng)用。
2.技術(shù)方案近年來發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制與多元醇通路的異常有關(guān)。多元醇通路由醛糖還原酶(aldose reductase，AR)和山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase，SDH)共同構(gòu)成，與DN的病理進(jìn)程有著極其密切的關(guān)系。正常生理?xiàng)l件下，多元醇通路的代謝極低，糖尿病時(shí)非胰島素依賴性組織(如晶體、神經(jīng)、腎臟、視網(wǎng)膜等)的葡萄糖攝取大大增加糖尿病狀態(tài)下繼發(fā)性的細(xì)胞內(nèi)高糖激活A(yù)R，葡萄糖通過多元醇代謝通路大量轉(zhuǎn)化為極性很強(qiáng)的山梨醇，在細(xì)胞內(nèi)大量蓄積，造成高滲狀態(tài)，破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)。因此，作為AR抑制劑的BDL可能對(duì)DN具有一定的預(yù)防或治療作用。我們研究發(fā)現(xiàn)BDL能顯著降低早期DN大鼠的血糖和尿白蛋白，提示BDL可能具有防治糖尿病腎病的作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證AR抑制劑BDL對(duì)DN的療效，并探索其防治早期DN的機(jī)制，我們?cè)阪滊寰卣T導(dǎo)的早期糖尿病腎病大鼠上觀察了BDL對(duì)血糖和腎臟功能、抗氧化作用、細(xì)胞外基質(zhì)、TGF-β1以及腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響。通過上述芐達(dá)賴氨酸(BDL)的各種藥理試驗(yàn)及其結(jié)果，來說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途，從而進(jìn)一步理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)。
BDL對(duì)DN大鼠血糖和糖化血紅蛋白的影響的研究。實(shí)驗(yàn)證明BDL在高劑量(400mg/kg)下對(duì)DN大鼠具有非常顯著的降低血糖和糖化血紅蛋白的作用，低中高劑量(分別為100、200、400mg/kg)的BDL可以非常顯著地降低尿蛋白，而且這種降低尿蛋白的作用呈明顯的劑量相關(guān)性。
BDL對(duì)DN大鼠的抗氧化作用的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低中高劑量組的BDL均可顯著降低腎皮質(zhì)非酶糖化蛋白(AGEs)和血清中AGEs的含量，而且這種降低作用呈劑量依賴性關(guān)系，BDL可顯著升高血清中總抗氧化能力(T-AOC)和谷胱苷肽(GSH)的含量，由此可見，BDL不僅具有短期的抗氧化作用，而且具有顯著的長期抗氧化作用。
BDL對(duì)DN大鼠的細(xì)胞外基質(zhì)的作用研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果高劑量的BDL對(duì)層粘蛋白(LN)具有一定的降低作用，而層粘蛋白屬于結(jié)構(gòu)性蛋白，存在與基底膜的透明層中，與糖尿病腎纖維化有密切關(guān)系。
BDL對(duì)DN大鼠腎皮質(zhì)中轉(zhuǎn)移生長因子TGF-β1含量的影響。實(shí)驗(yàn)證明BDL在低劑量即可非常顯著地降低TGF-β1的相對(duì)含量，而且隨著其劑量的加大，BDL降低TGF-β1的作用也越來越強(qiáng)，說明BDL對(duì)TGF-β1的這種抑制作用對(duì)DN頗具重要意義。
BDL對(duì)DN大鼠的腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低中高BDL劑量組對(duì)基底膜厚度有一定幅度的降低，而隨著劑量的加大降幅也越大。
BDL對(duì)DN大鼠醛糖還原酶的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低中高劑量的BDL均具非常顯著性的降低醛糖還原酶(AR)的活性，而DN的發(fā)病機(jī)制與多元醇通路的異常有關(guān)，而多元醇通路由醛糖還原酶和山梨醇脫氫酶共同構(gòu)成，BDL作為AR的抑制劑對(duì)DN有較好的治療效果。
在芐達(dá)賴氨酸中加入適當(dāng)?shù)妮o料，用常規(guī)的制備方法，可制成片劑、顆粒劑，膠囊劑、口服液等口服制劑。所述的輔料是常用的助劑，如淀粉、明膠、阿拉伯膠、聚乙二醇等。
3.有益效果以上藥理試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明對(duì)已知芐達(dá)賴氨酸發(fā)現(xiàn)了新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域，(2)本發(fā)明的芐達(dá)賴氨酸的藥理效果好，作用強(qiáng)，預(yù)示著有良好的藥用前景，(3)本發(fā)明的芐達(dá)賴氨酸具有非常顯著的降低血糖和糖化血紅蛋白以及尿蛋白的作用，且成明顯的劑量相關(guān)性。
(4)芐達(dá)賴氨酸具有顯著降低腎皮質(zhì)AGEs和血清中AGEs的含量，顯著升高血清中總抗氧化能力和谷胱苷肽的含量，由此可見它具有顯著的抗氧化作用。
(5)芐達(dá)賴氨酸具有一定的降低層粘蛋白的作用，對(duì)腎皮質(zhì)中TGF-β1有非常顯著的抑制作用，而且隨著BDL劑量的加大，其抑制作用越強(qiáng)，這對(duì)DN頗具重要意義。
(6)芐達(dá)賴氨酸具有非常顯著的降低AR的活性，而DN的發(fā)病機(jī)制與AR有關(guān)、因此BDL作為AR的抑制劑對(duì)DN有很好的治療效果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1BDL對(duì)糖尿病腎病大鼠血糖和腎臟功能的影響1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD品系大鼠8周齡，雄性，體重160～180g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.2藥品與試劑 芐達(dá)賴氨酸由浙江平湖莎普愛思制藥有限公司提供，鏈脲霉素(STZ)購自Calbiochem公司，血糖檢測(cè)藥盒購自浙江東甌生物工程有限公司，尿白蛋白放免檢測(cè)藥盒購自北京中國原子能科學(xué)研究院，1.3方法1.3.1造模與實(shí)驗(yàn)治療85只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、DN模型組、BDL高劑量治療組、BDL中劑量治療組、BDL低劑量治療組、epalrestat(EPS)陽性藥治療組，共6組，除正常對(duì)照組10只以外，其余各組15只。各組禁食12h后，腹腔一次性注射STZ 60mg·kg-1(臨用前溶于0.1mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液，pH4.4)，正常對(duì)照組僅給等量的該緩沖液。72h后尾靜脈取血，測(cè)定血糖≥13.88mmol·L-1者為造模成功。DN成模當(dāng)日作為實(shí)驗(yàn)第1天，低中高BDL治療組的劑量分別為100mg·kg-1、200mg·kg-1、400mg·kg-1，均配成混懸液，灌胃給藥。實(shí)驗(yàn)中觀察各組大鼠的體重、進(jìn)食水量、尿量、毛發(fā)等，每周測(cè)體重1次。于第8周末處死大鼠，收集尿液，腹主動(dòng)脈收集血液標(biāo)本測(cè)定除血糖外各項(xiàng)血指標(biāo)，取出腎臟稱重，切片。
1.3.2指標(biāo)測(cè)定空腹血糖測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法；尿白蛋白采用放免法測(cè)定由南京醫(yī)科大學(xué)同位素室測(cè)定；HbAlC由南京建成生物工程研究所用親和層析法測(cè)定；BUN和肌酐由南京建成生物工程研究所分別用化學(xué)比色法測(cè)定；腎臟濕重用電子天平稱量。
1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有測(cè)定結(jié)果用x±s表示，采用組間t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
2結(jié)果2.1 BDL對(duì)DN大鼠生化指標(biāo)的改善作用DN模型組大鼠的血糖、HbAlC、尿白蛋白、腎重/體重與正常對(duì)照組相比明顯升高，且皆有非常顯著性差異(P＜0.01)，表明造模成功。BDL低劑量治療組的以上指標(biāo)與DN模型組相比基本相近；而中高劑量治療組的血糖和尿白蛋白、高劑量治療組的HbAlC較DN模型組有較大幅度的降低，在兩組之間有非常顯著性差異(P＜0.01)。EPS組的HbAlC和尿白蛋白較DN模型組有明顯的降低，兩組之間有非常顯著性差異(P＜0.01)(見表1)。
表1 BDL對(duì)大鼠糖尿病腎病的改善作用(x±s)組別 n 血糖 HbAlC 尿白蛋白 腎重/體重BUN(mmol·L-1) (％) (μg·mol-1·Cr-1) (×1000) (mmol·L-1)NS 10 5.35±1.20 12.31±1.83 3.39±1.93 6.61±0.52 7.73±0.96DN 10 18.26±6.98##21.20±3.41##29.07±9.98##11.54±3.85##11.16±0.56##BDLL10 16.26±5.50 19.90±4.09 9.22±3.30**9.12±1.44 11.28±1.40BDLM11 13.77±3.23**17.26±6.13 6.56±2.95**10.46±2.8210.29±1.48BDLH10 10.28±3.82**13.74±4.84**4.22±2.34**10.68±1.9410.07±1.64EPS 10 17.10±5.62 13.14±3.08**6.19±2.40**9.72±4.37 10.78±1.81與正常對(duì)照組相比，##P＜0.01；與DN模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01實(shí)施例2 BDL對(duì)糖尿病腎病大鼠的抗氧化作用1材料和方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品與試劑同實(shí)施例1，將采集的皮質(zhì)樣本和血清樣本分別測(cè)定皮質(zhì)AGEs和血清AGEs，以及血清中T-AOC、CAT活力、GSH含量。
1.2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(同實(shí)施例1)2結(jié)果2.1 BDL對(duì)DN大鼠皮質(zhì)AGEs和血清AGEs的影響DN模型組大鼠的腎皮質(zhì)中的AGEs相對(duì)含量(AUF/mg皮質(zhì))和血清中的AGEs相對(duì)含量(AUF/mg蛋白)與正常對(duì)照組相比明顯升高，在兩組之間皆有非常顯著性差異(P＜0.01)；BDL低劑量治療組的腎皮質(zhì)AGEs和血清AGEs即有明顯下降，分別有顯著性和非常顯著性差異，中劑量和高劑量組的腎皮質(zhì)AGEs和血清AGEs進(jìn)一步下降，與DN模型組相比皆有非常顯著性差異(P＜0.01)。而且BDL對(duì)腎皮質(zhì)和血清中AGEs的降低作用皆呈劑量依賴性關(guān)系；EPS治療組大鼠的皮質(zhì)AGEs和血清AGEs也都有顯著性或非常顯著性降低(見表2)。
表2 BDL對(duì)DN大鼠皮質(zhì)AGEs和血清AGEs的影響組別 樣本數(shù)皮質(zhì)AGEs(AUF/mg皮質(zhì))血清AGEs(AUF/mg蛋白)NS 10 0.54±0.184.70±0.94DN 10 2.30±0.71##17.25±2.50##BDLL10 1.74±0.31*11.05±0.98**BDLM10 1.45±0.44**7.85±2.65**BDLH10 0.95±0.23**5.03±1.35**EPS 10 1.60±0.36*8.46±2.07**與正常對(duì)照組相比，##P＜0.01；與DN模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.012.2 BDL對(duì)DN大鼠血清中T-AOC、CAT活力、GSH含量的影響DN模型組大鼠的血清中總抗氧化能力T-AOC(U/ml)、過氧化物酶CAT活力(U/ml)和谷胱苷肽含量GSH(mg/L)與正常對(duì)照組相比明顯降低，在兩組之間皆有非常顯著性差異(P＜0.01)。BDL低中高劑量治療組的T-AOC與DN模型組相比有非常顯著性升高(P＜0.01)，且此升高作用有劑量依賴性，EPS治療組對(duì)T-AOC也有升高作用，與DN模型組相比有非常顯著性差異(P＜0.01)。BDL低中高劑量治療組及EPS治療組的CAT活力與DN模型組相比略有升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。BDL低中高劑量組的GSH含量與DN模型組相比皆有較大幅度的升高，具有非常顯著性差異(P＜0.01)，但該升高作用的劑量依賴性卻不明顯，EPS治療組的GSH含量與DN模型組基本相同(見表3)。
表3 BDL對(duì)DN大鼠血清中T-AOC、CAT活力、GSH含量的影響組別 樣本數(shù)T-AOC(U/ml) CAT活力(U/ml) GSH(mg/L)NS 10 15.70±1.04 5.37±1.13 258.3±17.6DN 10 6.94±1.81##3.74±0.91##165.4±7.9##BDLL10 10.36±0.93**4.39±0.79 195.7±10.1**BDLM10 11.21±1.27**4.39±0.85 202.7±8.9**BDLH10 12.46±1.23**4.00±0.53 190.5±6.6**EPS 10 9.00±0.70**4.33±0.40 165.2±9.0與正常對(duì)照組相比，##P＜0.01；與DN模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01實(shí)施例3 BDL對(duì)糖尿病腎病大鼠的細(xì)胞外基質(zhì)的作用1材料和方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品與試劑同實(shí)施例1，將采集的皮質(zhì)樣本和血清樣本分別測(cè)定層粘蛋白。
1.1層粘蛋白的提取與測(cè)定將低溫保存的腎皮質(zhì)標(biāo)本吸干水分后制備均漿(勻漿液為0.15mol/L NaCl，0.05mol/L Tris-HCl，pH7.4)，加提取液1mL(提取液為HAc 0.5mol/L，胃蛋白酶1g/L)，4℃抽提18h，取上清液測(cè)定層粘蛋白含量。
1.2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(同實(shí)施例1)2結(jié)果DN模型組大鼠腎組織中層粘蛋白(μg/g)含量與正常對(duì)照組相比明顯升高，在兩組之間皆有非常顯著性差異(P＜0.01)。BDL低中劑量治療組的層粘蛋白含量與DN模型組相比僅有微弱降低，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；高劑量治療組及EPS治療組的層粘蛋白含量與DN模型組相比有明顯下降，分別有非常顯著性和顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05)(見表4)。
表4 BDL對(duì)DN大鼠層粘蛋白的影響組別 n層粘蛋白(μg/g)NS 101.00±0.69DN 102.87±1.83##BDLL102.20±1.44BDLM102.04±1.20BDLH100.93±0.45**EPS 101.28±0.97*與正常對(duì)照組相比，##P＜0.01；與DN模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01
實(shí)施例4 BDL對(duì)糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)中TGF-β1含量的影響1材料和方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品與試劑同實(shí)施例1，將采集的皮質(zhì)樣本測(cè)定腎皮質(zhì)中TGF-β1的相對(duì)含量。
1.1腎皮質(zhì)TGFβ1的PCR測(cè)定以酸性異硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法用Trizol試劑提取大鼠腎組織總RNA。以O(shè)ligo(dT)15為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV)催化下合成第一鏈cDNA。具體反應(yīng)體系為總RNAlμg與Oligo(dT)150.5μL，65℃10min，然后加入MgCl2(25mmol/L)4μL，10×RTBuffer 2μL，MMLV 0.8μL，DEPC處理水4.7μL，42℃水浴1h，沸水浴5min，-20℃保存。以適量cDNA為模板在TaqDNA聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用引物均由GENETOOL軟件設(shè)計(jì)，上海生工生物公司合成。TGFβ1上游引物為5’-CCCGCATCCCAGGACCTCTCT-3’，下游引物為5’-CGGGGGACTGGCGAGCCTTAG-3’，擴(kuò)增長度519bp。β-actin上游引物為5’-GCTGCGTGTGG CCCCTGAG-3’，下游引物為5’-ACGCAGGATGGCATGAGGGA-3’，擴(kuò)增長度252bp。取2μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，在25μL體系中先將模板于94℃預(yù)變性5min，進(jìn)入循環(huán)，94℃1min，54℃5min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)后72℃7min。將TGFβ1的PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳(80V，60min)分離，EB染色后置于凝膠圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描，以管家基因β-actin作為內(nèi)參照校正，用TGFβ1的吸光度與β-actin吸光度的比值表示目的基因TGFβ1的相對(duì)表達(dá)含量。
1.2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(同實(shí)施例1)2結(jié)果DN模型組大鼠腎皮質(zhì)中TGFβ1的相對(duì)含量與正常對(duì)照組相比明顯升高，在兩組之間皆有非常顯著性差異(P＜0.01)。BDL低劑量治療組的TGFβ1含量與DN模型組相比有顯著性降低(P＜0.05)，中劑量和高劑量治療組與DN模型組相比有非常顯著性降低(P＜0.01)，而且此降低作用隨著劑量的增大而依次增大，有劑量依賴性傾向，EPS治療組的TGFβ1含量也有非常顯著性降低(P＜0.01)(見表5)。
表5 BDL對(duì)DN大鼠腎皮質(zhì)中TGF-β1相對(duì)含量的影響組別nTGF-β1含量(TGFβ1/β-actin)NS 100.55±0.09DN 101.21±0.25##BDLL100.90±0.07*BDLM100.80±0.18**BDLH100.68±0.10**EPS 100.82±0.19**與正常對(duì)照組相比，##P＜0.01；與DN模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01
實(shí)施例5 BDL對(duì)糖尿病腎病大鼠的腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響1材料和方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品與試劑同實(shí)施例1。
1.1形態(tài)學(xué)光鏡觀察將腎組織塊脫水、石蠟包埋、切片(3μm)，蘇木精-伊紅(HE)和PAS雙重染色，觀察光鏡下腎臟形態(tài)學(xué)改變。將腎小球系膜增生分成0～I(xiàn)II級(jí)，分別記為0、2、4、6分。0級(jí)正常腎小球；I級(jí)系膜增生寬度小于毛細(xì)血管直徑，呈節(jié)段性分布；II級(jí)系膜增生寬度大于毛細(xì)血管直徑，呈彌漫性分布；III級(jí)系膜增生寬度呈團(tuán)塊狀聚集，彌漫指狀分布，擠壓血管腔。每例隨機(jī)取1個(gè)腎小球按上述標(biāo)準(zhǔn)記分取均數(shù)。
1.2形態(tài)學(xué)電鏡觀察從每組大鼠中隨機(jī)抽取3例標(biāo)本進(jìn)行電鏡觀察。取腎皮質(zhì)常規(guī)固定、脫水、包埋(Epon 812)，RKB-V型切片機(jī)切片，HE染色，光鏡腎小球定位后超薄切片，醋酸鈾染色30min，枸櫞酸鉛染色5min，JEM-1200EX ELECTRON MICROSCOPE透射電鏡(日本電子，JEOL)觀察腎小球系膜區(qū)基質(zhì)和基底膜，并照相，每例標(biāo)本5張照片。將照片掃描轉(zhuǎn)換為JPG文件，然后以LEICA QWIN STANDARD V2.6(Leica MicrosystemsLtd)圖象分析系統(tǒng)測(cè)量計(jì)算基底膜厚度。每張照片上隨機(jī)測(cè)量7處基底膜的厚度，并計(jì)算其平均值。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(同實(shí)施例1)2結(jié)果2.1 BDL對(duì)DN大鼠腎組織光鏡形態(tài)的影響光鏡顯示，與正常大鼠相比，DN模型組大鼠腎組織形態(tài)表現(xiàn)出一定程度的異常，如腎小球肥大、系膜細(xì)胞增生等。與DN模型大鼠相比，BDL高劑量組的系膜細(xì)胞增生減輕，并有顯著性差異(P＜0.05)，其他方面的組織形態(tài)學(xué)也有一定的改善；而低劑量組則基本上沒有變化。
在光鏡下觀察DN模型組大鼠的腎小球系膜增生和中性白細(xì)胞兩個(gè)指標(biāo)與正常對(duì)照組相比明顯增大，有非常顯著性差異(P＜0.01)。BDL低劑量治療組的腎小球系膜增生和中性白細(xì)胞與DN模型組大鼠相比無顯著性差異(P＞0.05)；而中高劑量治療組則較DN模型組則有顯著性差異降低(P＜0.05)(見表6)。3個(gè)劑量組的腎小球系膜增生和中性白細(xì)胞下降幅度與其給藥劑量呈一定的劑量依賴性。
表6 BDL對(duì)DN大鼠腎組織光鏡下腎小球系膜增生和中性白細(xì)胞的影響組別n腎小球系膜增生 中性白細(xì)胞NS 100.6±1.00.3±0.7DN 104.4±1.8##3.4±1.3##BDLL103.2±1.03.4±0.8BDLM102.8±1.3*2.3±1.1BDLH101.4±1.0**1.6±1.3EPS 103.6±0.82.4±0.8與正常對(duì)照組相比，##P＜0.01；與DN模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.012.2 BDL對(duì)DN大鼠腎組織電鏡形態(tài)的影響DN模型組大鼠的基底膜厚度與正常對(duì)照組相比明顯增大，有非常顯著性差異(P＜0.01)。BDL低劑量治療組的基底膜厚度即有一定幅度的降低，且有顯著性差異(P＜0.05)；而中高劑量治療組則較DN模型組有進(jìn)一步的降低皆有非常顯著性差異(P＜0.01)(見表7)。3個(gè)劑量組基底膜厚度的下降幅度與其給藥劑量呈劑量依賴性。
表7 BDL對(duì)DN大鼠腎組織電鏡基底膜厚度的影響組別n基底膜厚度(nm)NS 10141.6±9.7DN 10219.4±8.5##BDLL 10191.6±2.4BDLM 10160.5±10.2BDLH 10145.7±10.0*EPS10160.2±15.9與正常對(duì)照組相比，##P＜0.01；與DN模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01實(shí)施例6 BDL在DN大鼠上對(duì)醛糖還原酶的抑制作用1材料和方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品與試劑、造模與實(shí)驗(yàn)治療皆同實(shí)施例1。
1.1 BDL在糖尿病腎病整體大鼠上對(duì)醛糖還原酶的抑制作用造模與實(shí)驗(yàn)治療與實(shí)施例1相同外，于第8周末處死大鼠，腹主動(dòng)脈收集全血標(biāo)本1.0mL于冰水浴中預(yù)冷的肝素抗凝管，3000rpm離心10min，分離紅細(xì)胞層，以5mL冷等滲生理鹽水分別沖洗3次后，加入1.5倍體積的水制成溶血液，4℃10000rpm離心30min，取上清液測(cè)定紅細(xì)胞醛糖還原酶活性。
反應(yīng)溫度為25℃，酶促反應(yīng)體系體積為1.0ml，其組成為67mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.47)、400mmol/L硫酸鋰、0.10mmol/L NADPH、大鼠血清、10mmol/L DL-甘油醛，以磷酸鹽緩沖液補(bǔ)足體積。其中DL-甘油醛最后加入并開始記時(shí)，反應(yīng)30min后加入11.8mol/L NaOH終止反應(yīng)，在島津RF-5000型熒光分光光度計(jì)(SHIMADZUspectrofluorophoto meter RF-5000)上記錄其熒光強(qiáng)度的變化，激發(fā)波長為360nm，檢測(cè)波長為450nm。規(guī)定37℃下反應(yīng)體系吸光度每分鐘下降0.001為一個(gè)酶活力單位U。以不含底物的樣品為空白對(duì)照，扣除空白對(duì)照體系中NADPH自然氧化所造成的吸光度變化。例如比色杯中每分鐘吸光度下降0.050，即具有50個(gè)酶活力單位U。
2結(jié)果2.1 BDL在DN整體大鼠上對(duì)醛糖還原酶的抑制作用DN模型組大鼠血清中醛糖還原酶的活性是正常對(duì)照組的3倍，在兩組之間皆有非常顯著性差異(P＜0.01)。BDL低中高劑量治療組的醛糖還原酶活性與DN模型組相比皆有非常顯著性降低(P＜0.01)，且此降低作用有劑量依賴性，EPS治療組對(duì)醛糖還原酶的降低作用較強(qiáng)，與DN模型組相比有非常顯著性差異(P＜0.01)(見表8)。
表8 BDL在DN整體大鼠上對(duì)醛糖還原酶的抑制作用組別樣本數(shù)AR活性(U)NS 108.91±7.02DN 1027.29±13.35##BDLL1018.38±7.89**BDLM1016.92±8.07**BDLH109.29±6.70**EPS 1011.07±4.91**與正常對(duì)照組相比，##P＜0.01；與DN模型組相比**P＜0.01實(shí)施例7 芐達(dá)賴氨酸制劑的實(shí)施例1.芐達(dá)賴氨酸口服膠囊1.1口服膠囊的原料配比芐達(dá)賴氨酸 200g淀粉32g硬脂酸鎂3.5g50％乙醇適量制成1000粒
1.2制粒灌裝取200g通過80目篩的芐達(dá)賴氨酸(BDL)粉與32g淀粉混勻，加入適量的50％乙醇作濕潤劑，攪拌成適度之軟材，過18目篩，制成松緊適度的顆粒，60～70℃干燥，干粒經(jīng)16目篩整，加入3.5g硬脂酸鎂混勻后，制成1000粒，測(cè)定含量，按顆粒含量計(jì)算灌裝。
2.芐達(dá)賴氨酸片劑2.1片劑的原料配比芐達(dá)賴氨酸200g淀粉 32g硬脂酸鎂 3.5g95％乙醇 適量制成 1000片2.2制粒壓片取200g通過80目篩的芐達(dá)賴氨酸(BDL)粉與32g淀粉混勻，加入適量的95％的乙醇作濕潤劑，攪拌成適度之軟材，過18目篩，制成松緊適度的顆粒，50～60℃干燥，干粒稱重后加入3-5g硬脂酸鎂，經(jīng)18目篩整?；靹蚝?，測(cè)定含量與水分，供壓片用。壓片按顆粒含量計(jì)算片重，用Φ10mm淺凹沖壓片，檢查合格后分裝。
權(quán)利要求
1.芐達(dá)賴氨酸在制備預(yù)防和治療糖尿病腎病的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芐達(dá)賴氨酸，其特征是在芐達(dá)賴氨酸中加入適當(dāng)?shù)妮o料，用常規(guī)的制備方法，可以制成片劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液等口服制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及芐達(dá)賴氨酸在制藥領(lǐng)域中的新用途。芐達(dá)賴氨酸具有顯著降低血糖和糖化血紅蛋白以及尿蛋白的作用，能降低腎皮質(zhì)中轉(zhuǎn)移生長因子TGF－β1的含量，能降低腎皮質(zhì)非酶糖化蛋白(AGE
文檔編號(hào)A61K9/00GK1568976SQ20041001475
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2004年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月27日
發(fā)明者任寶華, 印曉星, 張銀娣, 沈建平, 吳建偉 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué), 浙江平湖莎普愛思制藥有限公司