Hiv－1治療性重組雞痘病毒疫苗的制作方法

專利名稱：Hiv－1治療性重組雞痘病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一株重組雞痘病毒疫苗。
背景技術(shù)：
艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)在全球的迅速蔓延，已成為威脅人類最嚴(yán)重的病毒病之一。據(jù)聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署和WHO估計，AIDS從80年代初流行至2000年6月為止，全球累計5300多萬人感染HIV或身患AIDS，其中約1880萬人已經(jīng)死亡。目前我國的HIV-1感染人數(shù)正呈加速上升趨勢，在我國大陸的HIV感染人數(shù)已超過100萬，到2010年可達1000萬以上。目前HIV感染者的藥物治療費用每人每年需要1.2-5.0萬美元，這樣大的費用即使在發(fā)達國家亦難以承受，何況迄今為止尚未見有真正有效的治療藥物。因此，世界各國又一次將目標(biāo)轉(zhuǎn)向?qū)嵱没疉IDS疫苗的開發(fā)。
HIV全病毒滅活后制備的滅活疫苗，由于殘留的HIV核酸可能具有感染性，作為免疫原接種予人，危險性很大。而在過去開發(fā)的HIV基因工程疫苗大多為亞單位疫苗(gp160、gp120、p24、p55)和多肽疫苗(V3、C4-V3)，但造價高，抗感染免疫效果不佳。在大腸桿菌、沙門氏菌(表達env)、結(jié)核桿菌(表達V3)、酵母等系統(tǒng)表達的蛋白不能被忠實地加工，常用于制作診斷制劑而不適于用作疫苗研究。因此人們普遍寄希望于基因工程活載體疫苗和巨分子亞單位疫苗，以期誘導(dǎo)機體產(chǎn)生堅強的細(xì)胞免疫和體液免疫，可寄希望于新型HIV治療性疫苗。
到目前為止，人們已利用多種病毒系統(tǒng)，例如，昆蟲的桿狀病毒(gp160、gp120、p24、p55、gag-V3)、腺病毒、痘苗病毒、金絲雀痘病毒等表達了HIV的結(jié)構(gòu)基因，以期制備第三代基因工程重組疫苗，其中包括治療和預(yù)防用疫苗。已進入I、II、III期臨床試驗、且有望成為疫苗的有HIV重組雞痘病毒(表達env)進入I期臨床試驗，HIV重組痘苗病毒(表達env、env-pol、gag-pol-env)將進入II期臨床試驗，HIV重組金絲雀痘病毒(表達gag-pol-env)將進入III期臨床試驗，DNA疫苗(表達env-rev、gag-pol、gag-pol-rev)將進入II、III期臨床試驗。
近年來的研究表明，利用痘苗病毒表達的Env進行基礎(chǔ)免疫接種后，再用桿狀病毒表達的Env蛋白進行追加免疫，可誘發(fā)人體較高的中和抗體。Gag蛋白是HIV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一。由于Gag蛋白氨基酸序列相對保守，抗原變異較少，使用Gag蛋白作為AIDS疫苗，有可能克服Env蛋白不能有效抵抗異源變異病毒株攻擊的缺陷。此外，Gag蛋白還有一個重要特點即自我裝配功能，它能在病毒的其他成分缺失，甚至在自身序列不完整時，自我裝配成病毒樣粒子，在細(xì)胞膜表面出芽成熟。這對于構(gòu)建巨分子顆?；乖直匾蚨鳪ag蛋白成為疫苗研究的新熱點。目前正在通過對核心蛋白(Gag)、Gag-Pol(聚合酶)、Gag-Env和Gag-Pol-Env的表達研究，以求制備HIV巨分子顆?；呙绾虷IV巨分子重組活載體疫苗。
在真核載體系統(tǒng)中，雞痘病毒是目前安全性好、具有良好應(yīng)用前景的哺乳動物病毒載體，其基因組結(jié)構(gòu)更為龐大，能容納較大的外源基因而不喪失其感染性；被表達的外源蛋白，在哺乳動物細(xì)胞中的流產(chǎn)性早期復(fù)制過程中，仍能忠實地進行修飾，如糖基化、羧基化等；外源基因的表達產(chǎn)物具有良好的免疫原性，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生持續(xù)時間較長的細(xì)胞免疫和體液免疫；嚴(yán)格的胞漿內(nèi)復(fù)制，避免了病毒基因重組入宿主細(xì)胞染色體的可能性，消除了重組病毒應(yīng)用對人畜的潛在威脅。同時，既可提取目的蛋白作為亞單位疫苗，又可直接用重組病毒本身作為重組活載體疫苗。
近幾年來，發(fā)現(xiàn)AIDS、結(jié)核及乙型肝炎等一些慢性疾病的持續(xù)性感染中，應(yīng)用其治療性疫苗后，可有效調(diào)動機體的免疫應(yīng)答，增強天然免疫力，在控制感染方面發(fā)揮重要作用，從而使得疫苗在治療方面的作用受到人們的廣泛關(guān)注，成為當(dāng)前病毒研究的熱點。雖然治療性疫苗在應(yīng)用上有其局限性，但對某些慢性感染、持續(xù)性感染、周期性復(fù)發(fā)性疾病、腫瘤等的治療，以及作為某些傳染病的輔助治療，控制微生物感染和提高機體免疫應(yīng)答能力上，還是有著廣闊的發(fā)展前景。治療性疫苗與預(yù)防性疫苗相比，不但在免疫機理上不同，且各有其特點，前者的接種對象大多是持續(xù)性慢性感染者，或無癥狀的帶毒者，且機體的免疫應(yīng)答能力低下；后者的接種對象則是廣大的易感的健康群體，免疫應(yīng)答能力正常。另外，二者在組成成分上有所不同，治療性疫苗不像預(yù)防性疫苗那樣僅為保護性抗原成分，而是根據(jù)需要，對治療性疫苗的成分作各種最佳組合，且十分強調(diào)佐劑的作用。治療性疫苗是用高度純化的微生物抗原及能提高機體免疫力的其它成分組合而成，所以其免疫原性強，對免疫系統(tǒng)有較強的刺激作用，且可通過不同途徑把微生物抗原提呈給免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)機體免疫力的產(chǎn)生，并可打破免疫耐受，提高機體自身對病原微生物的特異性免疫應(yīng)答等。另外，導(dǎo)致這些慢性疾病的病原微生物又多為胞內(nèi)寄生性，免疫物質(zhì)難以發(fā)揮作用，患者的細(xì)胞介導(dǎo)免疫(CMI)又多發(fā)生缺陷，注射疫苗后，則可通過改善機體的免疫狀態(tài)，刺激恢復(fù)特異性CMI應(yīng)答，達到根除病原，防止疾病復(fù)發(fā)的目的。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供根據(jù)HIV-1抗原表位的構(gòu)象特點，設(shè)計、構(gòu)建最佳的疫苗抗原構(gòu)象，開發(fā)以HIV-1抗原表位為基礎(chǔ)、以HIV-1結(jié)構(gòu)蛋白P24為載體分子，對抗原進行人工分子設(shè)計并輔以計算機模擬的新型基因工程治療性重組雞痘病毒疫苗。
本發(fā)明以HIV-1CNB gag基因為模板，利用PCR方法，獲得HIV衣殼蛋白基因p24，將p24基因插入MEG基因的QYIANSKFIGITEL與AMQMLKETI兩個表位之間，獲得了以P24核心蛋白為載體分子的全新HIV復(fù)合多表位基因MEGp24。
再將MEGp24嵌合基因插入至雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUTA2復(fù)合啟動子ATI-P7.5×20下游，構(gòu)建出重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUTA2-MEGp24。
再將重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUTA2-MEGp24與雞痘病毒FPV共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞CEF，進行同源重組，通過BUdR加壓篩選，獲得重組病毒rFPV-MEGp24。
本發(fā)明的優(yōu)點是1、本發(fā)明獲得的HIV治療性重組雞痘病毒疫苗基因為人工設(shè)計，在HIV表達產(chǎn)物中優(yōu)選高度保守的免疫優(yōu)勢T/B細(xì)胞表位基因，刪除產(chǎn)生免疫抑制及免疫病理的基因序列。
2、本發(fā)明獲得的HIV治療性重組雞痘病毒疫苗可誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生針對所選表位及衣殼蛋白P24的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
3、本發(fā)明獲得的HIV治療性重組雞痘病毒疫苗對實驗動物是安全的，無任何病理現(xiàn)象出現(xiàn)。
4、本發(fā)明獲得的HIV治療性重組雞痘病毒疫苗的基因序列來自HIV-1B亞型中國流行株，該疫苗可作為我國治療兼預(yù)防AIDS的活載體疫苗。
5、本發(fā)明獲得的全新HIV復(fù)合多表位基因MEGp24覆蓋了中國流行株HIV-1env、gag、Nef、pol等主要結(jié)構(gòu)蛋白基因，可用于不同流行株HIV-1的預(yù)防和治療。
6、本發(fā)明重組病毒可表達中國流行株HIV-1 Env、Gag、Nef、Pol等主要結(jié)構(gòu)蛋白的優(yōu)勢表位肽及P24蛋白，從而誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生針對所選表位及衣殼蛋白P24的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
具體實施例方式1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法)
以無菌接種環(huán)刮取凍存于-70℃冰箱的大腸桿菌菌種，劃線接種于不含氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16h左右。挑取單一菌落，接種到100ml LB培養(yǎng)基中，37℃、250r/min振搖培養(yǎng)到OD600＝0.4~0.6，在無菌條件下將細(xì)菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到兩個無菌并以冰預(yù)冷的聚丙烯離心管中(以下操作均需無菌)，冰浴10min，使培養(yǎng)物冷卻到0℃；4℃2000r/min離心10min，棄上清，以10ml冰預(yù)冷的75mmol/L CaCl2、10mmol/L(pH6.5)溶液重懸沉淀，冰浴10min，4℃2000r/min離心10min，棄上清，以2ml冰預(yù)冷的、含15％(v/v)甘油的75mmol/L CaCl2、10mmol/L Tris·Cl(pH6.5)溶液重懸每管沉淀，用無菌吸頭將感受態(tài)細(xì)胞分裝于無菌微量離心管中，每管200μl；標(biāo)明菌株、體積和日期，置-70℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?br> 2轉(zhuǎn)化將適量質(zhì)粒DNA(質(zhì)粒體積＜1μl，連接產(chǎn)物＜10μl，DNA＜50ng)加入200μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃水浴熱沖擊90s，冰浴冷卻2min；加入200μl 37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，37℃150r/min振搖培養(yǎng)50min；取培養(yǎng)液涂布于含Amp(50μg/ml)的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)14~16h后，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌落。
3質(zhì)粒的提取3.1質(zhì)粒的小量制備(堿裂解法)挑取單個轉(zhuǎn)化菌落，接種到2ml含50μg/ml Amp的LB培養(yǎng)液(下同)中，37℃250r/min振搖培養(yǎng)12~16h；將1.5ml轉(zhuǎn)入微量離心管中，12000r/min離心30s，棄上清。以200μl冰預(yù)冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris·Cl，pH8.0；10mmol/L EDTA，pH8.0)重懸沉淀，加入200μl新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，顛倒數(shù)次混勻，加入200μl用冰預(yù)冷的溶液III(3mol KAc，5mol/L冰乙酸)，顛倒混勻，4℃12000r/min離心10min，取上清，分別用等量飽和酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，氯仿/異戊醇(24∶1)各抽提一次；加2倍體積冷無水乙醇，混合均勻，置-20℃30min，4℃12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用70％冷乙醇洗滌抽干。以20μl含終濃度20μg/ml RNA酶(無DNA酶)的TE(10mmol/L Tris·HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA，pH8.0，下同)溶解沉淀，并于37℃水浴中作用30min，瓊脂糖凝膠電泳檢查或-20℃保存。
3.2質(zhì)粒的大量制備與純化將含有目的質(zhì)粒的細(xì)菌接種于100ml LB培養(yǎng)液中，37℃250r/min振搖培養(yǎng)16~18h；冰浴10min，4℃4000r/min離心10min，棄上清，沉淀用20ml預(yù)冷的STE(10mmol/L Tris·Cl，pH8.0；50mmol/LEDTA，pH8.0)洗滌一次，4000r/min離心10min，棄上清；用4ml預(yù)冷的溶液I重懸沉淀，加8ml新配的溶液II充分混勻，冰浴10min后，加6ml預(yù)冷的溶液III中止反應(yīng)，冰浴10min，4℃7000r/min離心15min，取上清加0.6~0.7倍體積的異丙醇，37℃作用30min；4℃，7000r/min離心15min，棄上清，以適量TE(pH8.0)溶解沉淀后，加等體積的氯化鋰(5mol/L)充分混勻，8000r/min離心10min；取上清，加2倍體積100％冷乙醇，-20℃30min，4℃12000r/min離心10min；棄上清，沉淀用70％冷乙醇洗滌并抽干。以適量TE(pH8.0)溶解沉淀，加無DNA酶的RNA酶(10mg/ml)至終濃度20μg/ml，37℃水浴30min；加等體積13％聚乙二醇溶液(PEG8000，2.5mol/L NaCl)，4℃靜置過夜；4℃12000r/min離心l0min，棄上清；加400μl TE(pH8.0)溶解沉淀，用等體積酚、酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)、氯仿/異戊醇(24∶1)各抽提一次，加0.1倍體積3MNaAC(pH5.2)，2倍體積100％冷乙醇，混勻后-20℃30min以上，4℃12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用70％冷乙醇洗滌并抽干，溶于適量TE(pH8.0)中，-20℃保存。
3.3質(zhì)粒DNA的定量以TE(pH8.0)為空白對照，用TZK-800Z型紫外可見分光光度計測定波長260nm和280nm下的核酸溶液光密度(OD)值。OD260＝1相當(dāng)于含質(zhì)粒大約50μg/ml，雙鏈DNA純品的OD260/OD280值為1.8，如樣品OD260/OD280值明顯低于1.8，則可能有蛋白質(zhì)或酚污染，需進一步純化。
4瓊脂糖凝膠電泳用0.5×TBE電泳緩沖液(0.045mol/L Tris-硼酸，0.001mol/LEDTA)配0.8-1.2％(w/v)瓊脂糖凝膠溶液，加熱至瓊脂糖完全溶解后，加EB(10mg/ml)至終濃度0.5μg/ml；混勻倒入封固好的膠模中，插入相應(yīng)的梳子，梳子距底板1.0mm左右，待凝膠完全凝固，小心移去梳子，將凝膠放入裝有0.5×TBE電泳緩沖液的電泳槽中，取適量DNA樣品在封口膜上與適量體積加樣緩沖液(0.25％溴酚藍(lán)、0.25％二甲苯青FF、40％蔗糖)混勻，用微量加樣器將樣品加到梳孔中，以5v/cm的電壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)電泳至適當(dāng)位置，在長波紫外燈下觀察結(jié)果和拍照。
5 DNA操作5.1限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)單酶切反應(yīng)將1.0μg質(zhì)粒DNA與適量水混勻，使其總體積為18μl，加入2-3單位限制性內(nèi)切酶及1μl相應(yīng)的10×限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，輕彈管壁混勻并離心，置最適反應(yīng)溫度水浴2~3h，瓊脂糖凝膠電泳檢查。對大量質(zhì)粒DNA的酶切反應(yīng)，相應(yīng)擴大限制性內(nèi)切酶用量和反應(yīng)體積，取少量反應(yīng)液電泳檢查，完全酶切后，-20℃保存，以備進一步鑒定或回收片段之用。
雙酶切反應(yīng)選擇反應(yīng)活性等于或接近100％的同一緩沖系統(tǒng)進行雙酶切反應(yīng)，若溫度或緩沖系統(tǒng)不同，則按先低溫后高溫，先低鹽后高鹽的順序進行；或第一酶切完成后，酚/仿抽提，乙醇沉淀后，再進行第二酶切反應(yīng)。
5.2 DNA片段的回收將酶切完全的、含目的DNA片段的溶液與上樣緩沖液混合，加入適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠板中電泳至目的DNA片段完全分離。電泳結(jié)束后用潔凈的刀片在長波紫外燈下切下含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠，放入一1.5ml的微量離心管中。選用北京鼎國生物公司生產(chǎn)的從凝膠中回收DNA試劑盒回收DNA片段。
將切取的含DNA片段的凝膠(100-300mg)搗碎，按重量比1∶3(DNA片段∶溶液B)加入溶液B；50℃水浴10min，直至膠完全溶化，其間漩渦振蕩三次，瓊脂糖必須完全溶化。如果體積大于500μl，可適當(dāng)增加溶膠時間，若此時溶液變紅，可加15μl NaAc；將溶液置于離心柱中，靜止1-2min，大于8,000rpm，離心30～60s。若一次加不完，可分兩次離心；倒掉液體，加入500μl溶液C(用時乙醇1∶1稀釋)于離心柱中，大于8,000rpm，離心30～60s，倒掉液體；用溶液C(用時乙醇1∶1稀釋)500μl再洗一遍，大于8,000rpm離心30～60s；15,000rpm再次離心30～60s，摔干剩余液體；將離心柱置于新的離心管中，加入50℃預(yù)熱的溶液D 30~50μl，混勻，靜止2min，15,000rpm離心60s。管底即DNA；將DNA貯存于-20℃。
5.3外源DNA片段與質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)粘端連接取0.5μg回收的載體DNA，加3~5倍摩爾量的外源DNA片段，2μl 5×連接緩沖液加水定容至10μl，最后加入1Weiss單位T4DNA連接酶，混勻并離心，16℃連接1~4h，取7μl連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞。
平端連接取0.1μg平末端去磷后的載體DNA，加5~8倍量的平端目的DNA片段，3μl 5×連接緩沖液，加水定容至15μl混勻后，加入1Weiss單位T4 DNA連接酶，混勻離心，15℃連接4~18h。取5μl連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞。
5.4重組子的酶切篩選和鑒定將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，37℃培養(yǎng)過夜。取單菌落接種于2ml AmpLB培養(yǎng)液中，小量制備質(zhì)粒DNA。選擇1~2種合適的限制性內(nèi)切酶單獨或組合消化，瓊脂糖凝膠電泳分析。挑選酶切結(jié)果與預(yù)計相同者進一步用2種以上的內(nèi)切酶消化，所有酶切結(jié)果均與預(yù)計完全相同者，即為目的重組質(zhì)粒。
6雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建6.1PCR擴增HIV-1 p24基因利用DNAStar軟件設(shè)計出上游引物F5’CGG GAT CCA TGT ACC CTA TAG TGC AAA ACC TCCAG 3’下游引物R5’GCT CTA GAT TCA GCC AAA ATT CTT GCT TTA TG3’分別引入BamH I、Xba I兩個酶切位點，以pKS-gag(HIV-1)為模板進行PCR擴增。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為pKS-Gag，1l；引物F(20pmol/l)，0.5l；引物R(20pmol/l)，0.5l；premix EXtaq，25l；H2O，23l。PCR反應(yīng)條件為94℃ 60秒、55℃ 30秒、72℃ 45秒，共30個循環(huán)，72℃延伸10min。
將PCR反應(yīng)產(chǎn)物克隆至pGEM-T載體中，篩選陽性重組子(pGEM-T-p24)，提取質(zhì)粒，使用T7做為測序引物對陽性重組質(zhì)粒進行序列測定。
6.2嵌合基因(MEGp24)的構(gòu)建將序列測定正確的pGEM-T-p24陽性重組質(zhì)粒用BamHI/XbaI雙酶切下，與用相同雙酶切的pKS-MEG(BamHI/XbaI)連接，利用6.1中的F/R引物對，進行陽性重組子的篩選和鑒定，并進一步用Xba I及Xho I雙酶切鑒定。將陽性重組子命名為pKS-MEGp24。
6.3雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUTA2-MEGp24的構(gòu)建將嵌合基因MEGp24用EcoRI和NotI從中間載體pKS-MEGp24上切下，以Klenow大片段補平；用Sma I酶切雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUTA2，并去磷酸化；將已補平的MEGp24基因與已去磷酸化的pUTA2載體進行連接，轉(zhuǎn)化，酶切鑒定正反向。挑選正向連接的陽性克隆作為雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體，并命名為pUTA2-MEGp24。
7同源重組及重組病毒的加壓篩選7.1 FPV毒價測定用于同源重組的FPV經(jīng)細(xì)胞傳代復(fù)壯，計算蝕斑形成單位(PFU)，并用HE染色，鑒定病毒。將FPV按102~106稀釋倍數(shù)接種于傳代生長的6×30mm培養(yǎng)板CEF單層，補加含1％甲基纖維素和1％小牛血清(FCS)的MEM作為維持液，37℃，5％CO2培養(yǎng)120h后，棄培養(yǎng)液，PBS(pH7.2)洗2次，室溫下1％甲醛固定15min，自來水洗滌，0.1％結(jié)晶紫染色5min，自來水洗滌，統(tǒng)計病毒蝕斑數(shù)，并計算出每毫升病毒液中所含的蝕斑形成單位(Plaque forming units，PFU)。
PFU＝(病毒蝕斑數(shù)×稀釋倍數(shù))/染毒體積(ml)7.2體內(nèi)同源重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞采用脂質(zhì)體法于6×30mm培養(yǎng)板中接種傳代的CEF 1×105~3×105個/ml，當(dāng)細(xì)胞長至80％融合時，感染0.1MOI(Multiplicity of infection)的FPV，37℃ 5％CO2吸附2h后，與在室溫下作用15~30min的轉(zhuǎn)染試劑DOTAP和重組質(zhì)粒的混合物共轉(zhuǎn)染。即在500μl MEM中，加入15μl DOTAP Liposomal，輕輕混勻，另取500μl MEM加入重組質(zhì)粒DNA 10μg混勻。然后將后者滴加于前一液體中輕輕混勻，溫室下作用15~30min。轉(zhuǎn)染后12~18h，更換新鮮配制的含2％FCS的MEM，繼續(xù)培養(yǎng)48~72h，收獲病毒。
7.3重組病毒的BUdR加壓篩選在6×30mm培養(yǎng)板上制備CEF單層。接毒前24小時用含40μg/mlBUdR(5-溴脫氧核糖尿苷)的MEM營養(yǎng)液培養(yǎng)，然后按10MOI接種重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后收獲的病毒，5％CO2吸附2h后，再用含40μg/ml BUdR的MEM營養(yǎng)液培養(yǎng)120h，收獲細(xì)胞。重復(fù)上述實驗，然后將收獲細(xì)胞反復(fù)凍融三次，在無BUdR的營養(yǎng)液中培養(yǎng)，待細(xì)胞出現(xiàn)病變后，分別挑出單個病毒蝕斑，純化3次后，分別進行擴毒。用無BudR的MEM營養(yǎng)液培養(yǎng)，待出現(xiàn)細(xì)胞病變后挑出單個病毒蝕斑，并分別進行擴毒，按下述四種方法鑒定重組病毒。
8重組病毒的基因組PCR與RT-PCR鑒定8.1基因組PCR鑒定取20μl細(xì)胞培養(yǎng)物(凍融3次)加入到25μl蛋白酶K溶液(0.25％SDS，5mM EDTA，10mM Tris-HCl pH8.0)中，56℃反應(yīng)2h，置95℃作用10min滅活蛋白酶K。加入1×PCR緩沖液使總體積為450μl，PCR時取5～25μl即可。
上游引物FP5’GAG CCT GTT TCT GTT GTT GC 3’下游引物RP5’AGC TGC GGA TCT GTC TCT G 3’PCR反應(yīng)條件94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。瓊脂糖電泳觀察目的條帶擴增情況。基因組中擴增出1174bp片段的候選毒株為重組病毒，野毒FPV的基因組中不能擴增出該條帶。
8.2 RT-PCR鑒定將加壓篩選后的單個蝕斑在CEF上2次擴增，至細(xì)胞出現(xiàn)病變達80-90％時，收獲細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA后，進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)Oligo dT，1μl；總RNA，8μl；H2O，補至15μl。將上述反應(yīng)體系置于70℃，持續(xù)5min后，迅速放入冰浴中，加入M-MLV，1μl；酶抑制劑，1μl；5×buffer，6μl；dNTP，1.5μl；H2O，補至30μl。將該體系置于42℃反應(yīng)1h，然后置于95℃，作用5min；迅速冰浴后利用特異性引物對FP/RP對cDNA進行PCR反應(yīng)，體系及條件同上?？俁NA中擴增出1174bp片段的候選毒株為重組病毒，野毒FPV的總RNA中不能擴增出該條帶。
9重組病毒表達產(chǎn)物的檢測9.1間接免疫熒光法(IFA)鑒定重組病毒取適量初步篩選并純化的重組病毒，接種于飛片上CEF單層細(xì)胞，同時設(shè)FPV和細(xì)胞對照。37℃5％CO2感作2h，加入含1％FCS及0.5g甲基纖維素的MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)到細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后，取出飛片，PBS(pH7.2)洗一次，100％丙酮固定10~15min，PBS沖洗。在用3％牛血清白蛋白緩沖液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20)溶液封閉2h后，與中國人HIV-1陽性血清(1∶300)或鼠抗人P24單抗(1∶50)反應(yīng)2h，PBS洗滌3次，然后與異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗人IgG或羊抗鼠IgG反應(yīng)2h，PBS洗滌3~5次，載玻片上加一滴甘油緩沖液(50％甘油PBS)，將載有細(xì)胞的飛片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察和拍照。
IFA檢測顯示，感染重組病毒的CEF細(xì)胞在核周圍及細(xì)胞漿中出現(xiàn)與特異性熒光抗體發(fā)生反應(yīng)的黃綠色熒光，而對照組FPV感染細(xì)胞則看不到黃綠色熒光，為伊維斯藍(lán)染成紅色熒光。結(jié)果說明，重組病毒表達了MEGP24蛋白。
9.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將擴增后的純化重組病毒，以10MOI分別接種于10ml培養(yǎng)瓶1×106個/ml CEF細(xì)胞中，同時設(shè)FPV對照和細(xì)胞對照，至細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時，棄培養(yǎng)液，用1ml 37℃預(yù)熱的TEN(40mmol/L Tris·ClpH7.5，1mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl)洗脫細(xì)胞，收集于Eppendorf管中，3000r/min離心5min，棄上清，細(xì)胞沉淀用PBS洗一次，加60μl裂解緩沖液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.4，1mmol/L MgCl2，0.5％NP40，20μg/ml DNaseI)裂解，冰浴30min，煮沸3min，5000r/min離心5min，-20℃凍存。
取30μl細(xì)胞裂解液與等量2×樣品緩沖液(100mmol/L Tris·Cl，pH6.8，4％SDS，0.2％溴酚藍(lán)，20％甘油，使用前加入2.5％β-巰基乙醇)混勻，于10％凝膠進行SDS-PAGE電泳。
9.3免疫印跡(Western blot)經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白后，將其電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5％脫脂乳或3％牛血清白蛋白緩沖液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.5，150mmol/LNaCl，0.05％Tween20)37℃封閉2h，洗滌緩沖液(10mmol/L Tris·ClpH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20)洗滌3次，每次5~10min，將中國人HIV-1陽性血清或鼠抗人P24單抗用封閉緩沖液稀釋后覆蓋膜上，室溫感作2h，洗滌3~5次，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG(1∶1000)室溫感作2h，洗滌3~5次后，每次5~10min，用10ml堿性磷酸酶緩沖液(100mmol/L NaCl，5mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris·Cl pH9.5)加入66μl NBT(0.5g NBT，70％二甲基甲酰胺)，混勻后再加33μlBCIP(0.5g BCIP，100％二甲基甲酰胺)，顯色10~20min，用蒸餾水中止反應(yīng)。
結(jié)果證實，表達產(chǎn)物可以與中國人HIV-1陽性血清及鼠抗P24單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，證明重組雞痘病毒成功表達了MEGp24蛋白。
將以上4種方法檢測均為陽性的重組病毒候選株命名為rFPV-MEGp24，即HIV-1治療性重組雞痘病毒疫苗。
10重組病毒表達外源蛋白的穩(wěn)定性將獲得的重組病毒rFPV-MEGp24在CEF細(xì)胞連續(xù)傳10代，分別用第4、6、8和10代重組病毒以10MOI的量接種同等量的CEF細(xì)胞，對收獲的細(xì)胞總蛋白作SDS-PAGE和Western blot分析，檢測目的蛋白的相對表達量。
11 HIV-1治療性重組雞痘病毒疫苗的實驗免疫研究11.1重組雞痘病毒疫苗免疫小鼠BALB/c雌性小鼠16只，體重18~20g，6～8周齡，SPF(III)級動物。隨機分2組，分別于雙側(cè)脛前肌注射野毒FPV和重組毒rFPV-MEGp24，毒量為107PFU/只，容量為100μl。共免疫3次，第1次與第2次的時間間隔為14天，第2次與第3次的時間間隔為28天。最后一次免疫后第7天摘眼球取血，頸椎脫臼處死，凝血分離血清供ELISA檢測抗HIV抗原的IgG抗體。無菌取其脾臟分別檢測細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性，并用流式細(xì)胞儀分析T淋巴細(xì)胞亞類的數(shù)量。
11.2脾臟免疫學(xué)指標(biāo)的檢測11.2.1脾臟單淋巴細(xì)胞懸液制備斷頭處死小鼠，無菌條件下取出脾臟，置于盛有RPMI 1640培養(yǎng)基的平皿中，用玻片研磨，300目尼龍網(wǎng)過濾制成單細(xì)胞懸液，1500r/min，離心5min，棄上清。用Hanks液離心洗細(xì)胞兩次，重懸于含10％NBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，計數(shù)，調(diào)至2×107個/ml備用。
11.2.2脾T淋巴細(xì)胞亞類數(shù)量的檢測取脾細(xì)胞懸液0.1ml，加5ml PBS，1500r/min，離心10min，洗細(xì)胞兩次，在0.5ml PBS細(xì)胞懸浮液中分別加熒光標(biāo)記大鼠抗小鼠CD3+、CD4+和CD8+單克隆抗體(此抗體用PBS按1∶10稀釋)室溫避光放置30min，再加5ml PBS洗一次，1500r/min離心10min，將管底細(xì)胞用200μl PBS懸浮，待上流式細(xì)胞儀檢測。FACS檢測10000個細(xì)胞，所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。
結(jié)果表明，重組毒免疫組小鼠CD3+/CD4+與CD3+/CD8+的比值顯著高于FPV對照組，提示重組病毒免疫小鼠后，均表達了外源蛋白，并誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生良好的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
11.2.3脾細(xì)胞特異性CTL細(xì)胞毒活性檢測靶細(xì)胞的制備將H-2d限制性HIV識別表位多肽RGPGRAFVTI、AMQMLKETI、DRVIEVVQGAYRAIR及不相關(guān)對照肽AGCKNFFWKTFTSC與P815細(xì)胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱共孵育2h，制備成相應(yīng)肽標(biāo)記的靶細(xì)胞。
特異性CTL細(xì)胞毒活性檢測將RGPGRAFVTI、AMQMLKETI、DRVIEVVQGAYRAIR及不相關(guān)對照肽AGCKNFFWKTFTSC作為體外刺激原，與小鼠的脾細(xì)胞于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱共孵育2h，加入絲裂霉素C至終濃度為40mg/L，培養(yǎng)2h后用PBS洗滌細(xì)胞4次，以除掉絲裂霉素，即為相應(yīng)肽標(biāo)記的刺激細(xì)胞。將免疫小鼠的脾細(xì)胞懸液調(diào)整至5×107個/ml。靶細(xì)胞和刺激細(xì)胞各1ml加入60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，補加2mlRPMI1640，培養(yǎng)24h后加入IL2至終濃度50U/ml，繼續(xù)培養(yǎng)5天。2000r/min離心5min。沉淀以RPMI 1640懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度至107個/ml，即作為效應(yīng)細(xì)胞。以乳酸脫氫酶釋放法檢測CTL反應(yīng)。96微孔板上劃分好樣品、自然釋放及最大釋放孔，效靶細(xì)胞比例(E/T)為12.5∶1、25∶1、50∶1，每孔補加RPMI 1640至200l，每組設(shè)3個復(fù)孔，效靶細(xì)胞于37℃5％CO2共同孵育4h，取上清501，加入LDH作用底物50l，室溫、閉光反應(yīng)30min后加50l終止液終止反應(yīng)，490nm下測吸光度，計算公式如下 結(jié)果表明，重組病毒rFPV-MEGp24免疫組產(chǎn)生了針對所選表位RGPGRAFVTI、AMQMLKETI和DRVIEVVQGAYRAIR的強CTL反應(yīng)，與FPV對照組及不相關(guān)對照肽AGCKNFFWKTFTSC組相比，差異顯著(P＜0.01)，提示重組病毒能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生HIV特異性細(xì)胞殺傷反應(yīng)。
11.3ELISA試劑盒測定免疫小鼠血清中抗HIV抗體ELISA試劑盒中的包被抗原為基因工程表達的HIV外膜及核心抗原，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體。在酶聯(lián)免疫儀450nm測量各孔OD值，將酶標(biāo)儀測得的OD450值進行統(tǒng)計學(xué)分析。
結(jié)果表明，重組病毒rFPV-MEGp24免疫組HIV特異性抗體的水平明顯高于FPV對照組(P＜0.01)，表明重組病毒誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生HIV特異性體液免疫應(yīng)答。
權(quán)利要求
1.一種HIV-1治療性重組雞痘病毒疫苗，其特征在于以HIV-1CNB gag基因為模板，利用PCR方法，獲得HIV衣殼蛋白基因p24，將p24基因插入MEG基因的QYIANSKFIGITEL與AMQMLKETI兩個表位之間，獲得了以P24核心蛋白為載體分子的全新HIV復(fù)合多表位基因MEGp24。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HIV-1治療性重組雞痘病毒疫苗，其特征在于將MEGp24嵌合基因插入至雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUTA2復(fù)合啟動子ATI-P7.5×20下游，構(gòu)建出重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUTA2-MEGp24。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的HIV-1治療性重組雞痘病毒疫苗，其特征在于將重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUTA2-MEGp24與雞痘病毒FPV共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞CEF，進行同源重組，通過BUdR加壓篩選，獲得重組病毒rFPV-MEGp24。
全文摘要
一種HIV－1治療性重組雞痘病毒疫苗，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的目的在于，提供根據(jù)HIV－1抗原表位的構(gòu)象特點，設(shè)計、構(gòu)建最佳的疫苗抗原構(gòu)象，開發(fā)以HIV－1抗原表位為基礎(chǔ)、以HIV－1結(jié)構(gòu)蛋白P24為載體分子，對抗原進行人工分子設(shè)計并輔以計算機模擬的新型基因工程治療性重組雞痘病毒疫苗。本發(fā)明重組病毒可表達中國流行株HIV－1Env、Gag、Nef、Pol等主要結(jié)構(gòu)蛋白的優(yōu)勢表位肽及P24蛋白，從而誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生針對所選表位及衣殼蛋白P24的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。對實驗動物是安全的，無任何病理現(xiàn)象出現(xiàn)。
文檔編號A61P31/22GK1672733SQ20041001075
公開日2005年9月28日 申請日期2004年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月26日
發(fā)明者金寧一, 張立樹, 李子健, 江文正, 宋英今, 王宏, 金洪濤, 馬鶴雯 申請人:中國人民解放軍軍需大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所