利用肝細胞生長因子培養(yǎng)神經干細胞的方法

專利名稱：利用肝細胞生長因子培養(yǎng)神經干細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用肝細胞生長因子(HGF)來培養(yǎng)神經干細胞(NSCs)。具體地，本發(fā)明涉及包括HGF的生長培養(yǎng)基。本發(fā)明進一步涉及利用培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞的方法和利用通過這種方法培養(yǎng)的細胞來治療神經疾病(neuro-logical discorders)。
背景技術：
迄今為止，中樞神經系統(tǒng)(CNS)的疾病主要是通過施用藥物化合物來治療的。令人遺憾的是，這種治療有問題，例如轉運藥物化合物穿越血腦屏障的能力是有限的，以及由于化合物的長期給藥帶來了抗藥性。
因此，神經病學上的組織移植是用于治療CNS紊亂的有前途的技術。神經移植避免了對恒定的藥物給藥以及復雜的藥物遞送系統(tǒng)的需要。然而，缺點是神經移植需要利用在宿主中不產生免疫反應而且能夠與周圍的細胞形成正常的神經元聯(lián)系的細胞。迄今為止，在最初的研究中這種細胞只限于胎兒細胞(例如，Perlow等人，Science 204643647(1979)；Freed等人，N.Engl.J.Med.3271549-1555(1992)；Spencer等人，N.Engl.J.Med.3271541-1548(1992)；Widner等人，N.Engl.J.Med.3271556-1563(1992))。對胎兒組織的利用涉及倫理和政治的問題。此外，超過一種的細胞類型組成了胎兒的CNS組織，并且該組織可能已經感染了細菌或病毒。因此，移植這種組織可能涉及一些風險。此外，需要來自6至8個胎兒的組織來治療一個患有N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(NPTP)-誘導的帕金森癥的患者(Widner等人，N.Engl.J.Med.3271556-1563(1992)。因此，很難提供移植所需要的長期供應的胎兒組織。
為了克服這些缺點，研究人員建議可誘導增殖多潛能的神經干細胞(NSCs)，而提供用于神經移植的無限數(shù)目神經細胞的可靠來源，其通過使用包括補充有表皮生長因子(EGF)或轉化生長因子α(TGFα)的培養(yǎng)基的組合物而能夠分化成為神經元、星形細胞和少突膠質細胞(美國專利號5,851,832)。
神經干細胞(NSCs)具有自我更新和體外產生各種類型神經元、星形細胞和少突膠質細胞的能力，因此可在整個成年期的哺乳動物中樞神經系統(tǒng)(CNS)的發(fā)育和作用中扮演重要的角色(Reynolds和Weiss，Science 2551707-1710(1992)；Temple和Devis，Development 120999-1008(1994)；Reynolds和Weiss，Dev.Biol.1751-13(1996)；Palmer等人，Mol.Cell.Neurosci.8389-404(1997))。NSCs增殖和分化的調控是發(fā)展用于治療神經元損傷和神經變性疾病的移植策略及其它治療方法中的重要障礙(Svendsen等人，Prog.Brain Res.12813-24(1997)；Armstrong等人，Cell Transplant 955-64(2000))。
當在補充有神經生長因子、缺乏血清的培養(yǎng)基中以懸浮培養(yǎng)NSCs時，已知細胞形成稱為神經球(neurosphere)的球形細胞簇。形成神經球的細胞是未分化的，并且一個神經球是一個NSC的后代。在包含一種或多種神經生長因子(例如，EGF、bFGF或其組合)的培養(yǎng)基中神經球的細胞持續(xù)增殖。在分化條件下，細胞具有分化成為神經細胞，例如神經元和膠質細胞(星形細胞和少突膠質細胞)的能力。
基于NSC神經形成和膠質形成的體外研究表明這些過程是有限制的逐步發(fā)生的，并且取決于環(huán)境的信號(Ahmed等人，J.Neurosci.155765-5778(1995)；Tropepe等人，J.Neurosci.177850-7859(1997)；Arsenijevic和Weiss，J.Neurosci.182118-2128(1998)；Qian等人，Neuron 2869-80(2000))。許多生長因子支持NSCs的增殖和來自其祖代的分化。例如，已知表皮生長因子(EGF)和成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)在NSCs的增殖和維持中發(fā)揮重要作用。
最近，已經報道其它的因子，例如睫狀向神經營養(yǎng)因子(ciliary neurotro-phic factor)(CNTF)和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)在NSC增殖和維持的調控中起關鍵作用(Arsenijevic等人，J.Neurosci.217194-7202(2001)；Shimazaki等人，J.Neurosci.217642-7653(2001))。也已知FGF-2和血小板衍生的生長因子(PDGF)增強神經元的分化(Johe等人，Genes Dev.103129-3140(1996)；Erlandsson等人，J.Neurosci.213483-3491(2001)；Yoshimura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 985874-5876(2001))。另一方面，已經顯示CNTF和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)在培養(yǎng)物中增強星形細胞分化(Johe等人，GenesDev.103129-3140(1996)；Bonni等人，Science 278477-483(1997)；Shimazaki等人，J.Neurosci.217642-7653(2001))，同時已經顯示三碘甲腺原氨酸(T3)促進少突膠質細胞分化(Johe等人，Genes Dev.103129-3140(1996))。
已經將FGF-2、CNTF、白血病抑制因子(LIF)、腦來源的神經營養(yǎng)性因子(BDNF)和PDGF分類為在神經系統(tǒng)的發(fā)育、維持、活性依賴性調節(jié)和調控中發(fā)揮重要作用的神經營養(yǎng)性因子。
最初鑒定肝細胞生長因子(HGF)是肝細胞的有效促細胞分裂原，并且后來在1989被純化和分子克隆出來(Nakamura等人，Nature 342440-443(1989))。HGF不但對肝細胞而且對各種類型的細胞具有多種效應。
近來HGF的廣泛分析已經顯示HGF是在正常發(fā)育和病理狀況中誘導多種應答的多效因子。(Matsumoto和Nakamura，Biochem.Biophys.Res.Commun.239639-644(1997))。也表明HGF在神經元誘導的早期階段發(fā)揮作用。HGF是通過結合c-Met酪氨酸激酶受體而起作用的多肽生長因子。已經發(fā)現(xiàn)HGF和c-Met存在于發(fā)育和成熟的CNS中(Jung等人，J.Cell.Biol.126485-494(1994)；Honda等人，Mol.Brain Res.32197-210(1995)；Hamanoue等人，J.Neurosci.Res.43554-564(1996)；Achim等人Dev.BrainRes.102299-303(1997))。HGF和c-Met在成體中持續(xù)表達(Jung等人，J.Cell.Biol.126485-494(1994)；Achim等人，Dev.Brain Res.102299-303(1997)；Streit等人，Development 1241191-1202(1997)Maina和Klein，Nat.Neurosci.2213-217(1999))。因此，HGF是誘導神經細胞的有絲分裂發(fā)生、遷移性、形態(tài)發(fā)生和抗凋亡活性的多效細胞因子(Honda等人，Mol.Brain Res.32197-210(1995)；Hamanoue等人，J.Neurosci.43554-564(1996)；Ebens等人，Neuron 171157-1172(1996)；Novak等人，J.Neurosci.20326-337(2000))。此外，最近已經顯示HGF在神經系統(tǒng)的不同部分中表達并且具有神經營養(yǎng)的能力。然而，HGF對NSCs的增殖或分化的效應是未知的。
發(fā)明公開本發(fā)明人研究了HGF對分離自E14小鼠紋狀體(striatal)細胞的NSCs增殖和分化的體外效應。單獨包含HGF的培養(yǎng)基能夠誘導從紋狀體細胞形成神經球。向含有FGF-2、EGF、或兩者皆有的培養(yǎng)基加入HGF顯示增加新形成的神經球的大小和數(shù)目?？赏ㄟ^將HGF加入含1％胎牛血清的分化培養(yǎng)基獲得更多的神經元。相比之下，機械分離NSCs的重復傳代培養(yǎng)后顯示神經球的數(shù)目減少。這表明HGF形成的神經球主要是由定型至神經元或神經膠質系的祖細胞組成的。這些結果依次表明HGF促進來源于小鼠胚胎的NSCs的增殖和神經元分化。
因此本發(fā)明提供如下(1)一種用于培養(yǎng)神經干細胞(NSCs)的生長培養(yǎng)基(medium)，其包括肝細胞生長因子(HGF)；(2)(1)的生長培養(yǎng)基，其進一步包括除HGF之外的另一種生長因子；(3)(2)的生長培養(yǎng)基，其中該生長因子選自成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)和/或表皮生長因子(EGF)；(4)(1)或(2)的生長培養(yǎng)基，其中該培養(yǎng)基用于體外增殖哺乳動物的NSCs；(5)(1)或(2)的生長培養(yǎng)基，其中該培養(yǎng)基用于體外分化哺乳動物的NSC；(6)一種用于培養(yǎng)NSCs的方法，其中NSC或包括至少一種NSC的細胞群是在(1)至(5)中任何一項的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)的；(7)一種用于增殖NSCs的方法，其中NSC或包括至少一種NSC的細胞群是在容許NSC增殖的條件下，在(1)至(5)中任何一項的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)的；(8)一種用于分化NSCs的方法，其中NSC或包括至少一種NSC的細胞群是在容許NSC分化成為包含神經元和膠質細胞的細胞群的條件下，在(1)至(5)中任何一項的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)的；(9)(6)至(8)中任何一項的方法，其中NSC來源于選自腦干、小腦、大腦皮層(cerebral cortex)、中腦、脊髓或室性的(ventricular)哺乳動物神經組織；(10)(6)至(9)中任何一項的方法，其中NSC是遺傳改變的；(11)通過在(1)至(6)中任何一項的培養(yǎng)基中培養(yǎng)NSC或包括至少一種NSC的細胞群所獲得的細胞群用于治療神經紊亂的用途；(12)(11)的用途，其中該細胞群是在NSCs中富集的；(13)(11)的用途，其中該細胞群是在神經元中富集的；以及
(14)(11)至(13)中任何一項的用途，其中神經紊亂選自癲癇癥、頭部損傷、中風、肌萎縮性側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)、帕金森氏癥(Parkinson’s disease)、阿爾茨海默氏癥(Alzheimer’s disease)、和Huntington′s癥。
(15)(11)至(14)中任何一項的用途，其中通過移植細胞群的至少一種細胞來治療該神經紊亂。
附圖簡述

圖1a-1b顯示HGF對形成分離自小鼠E14紋狀體細胞的神經球的影響。圖1a描繪了在存在多種生長因子時，初級球體生長7天的照片。比例尺度50μM。圖1b描繪了顯示E14紋狀體細胞中神經球數(shù)目的圖表。在存在FGF-2(■)、EGF(▲)、FGF-2加EGF(x)或什么都沒有(◆)，以及各種濃度的HGF的情況下，在24-孔平板中以每孔75,000個細胞培養(yǎng)7天。顯示了5個不同實驗的平均值。
圖2a-2c描繪了顯示免疫染色c-Met受體(a，b)和nestin c的結果的照片。圖2a顯示在存在FGF-2和EGF時培養(yǎng)的神經球中細胞上c-Met受體的表達(綠色)。細胞核用Hoechst對比染色(藍色)。比例尺度20μM。圖2b顯示單個分離的細胞中c-Met受體的免疫染色。比例尺度10μM。圖2c顯示在存在HGF下神經球的細胞中nestin(紅色)的表達。比例尺度50μM。
圖3a顯示在存在各種生長因子時所培養(yǎng)的神經球中BrdU陽性細胞的百分比。將BrdU(10μM)加入次級神經球，并培養(yǎng)神經球12hr。然后機械分離該神經球，接種在24孔平板上并且固定12hr以上。顯示了5個不同實驗的平均值。*p＜0.05對FGF，**p＜0.01FGF+EGF。圖3b顯示有或沒有HGF的神經球中TUNEL陽性細胞的數(shù)目。機械分離次級神經球，在1％多聚甲醛中固定并用TUNEL試劑盒染色。顯示了5個不同實驗的平均值。*p＜0.05對FGF，**p＜0.05FGF+EGF。
圖4描繪了顯示HGF對表型百分比的影響的照片。顯示了來自在存在HGF、FGF-2加EGF，和FGF-2加EGF加HGF時，所培養(yǎng)的神經球中細胞的雙標記免疫細胞化學。將細胞接種在1％FBS或1％FBS加HGF中。顯示了MAP-2陽性神經元(紅色)、GFAP陽性星形細胞(綠色)和Hoechst標記的核(藍色)。比例尺度50μM。
圖5描繪了顯示當存在HGF(a)、FGF-2和EGF(b)、FGF-2、EGF和HGF(c)時，培養(yǎng)的神經球中免疫陽性細胞百分比的圖表。該神經球在1％PBS或1％PBS加HGF(20ng/ml)中分化7天。顯示了5個不同實驗的平均值。*p＜0.01對1％FBS神經元，**p＜0.01對(b)。
實現(xiàn)本發(fā)明的最佳方式除非另外具體地標明，如在此所使用的單詞″一個″(a or an)、″一種″(a oran)和″這個″(the)是指″至少一個″。
利用FGF-2和/或EGF作為促細胞分裂原建立的用于神經干細胞(NSCs)表達的體外培養(yǎng)系統(tǒng)提供了用于研究NSC發(fā)育中細胞機理的有用模型(Reynolds和Weiss，Science 2551707-1710(1992)；Temple和Davis，Development 120999-1008(1994)；Reynolds和Weiss，Dev.Biol.1751-13(1996)；Weiss等人，J.Neurosci.167599-7609(1996)；McKay，Science 27666-71(1997)；Palmer等人，Mol.Cell.Neurosci.8389-404(1997))。闡明NSC增殖和分化的機制對于針對神經元損傷和神經變性疾病的治療方法的新前途是很重要的。近來研究已經顯示環(huán)境信號，例如細胞因子和生長因子影響NSCs的增殖或分化(Ahmed等人，J.Neurosci.155765-5778(1995)；Tropepe等人，J.Neurosci.177850-7859(1997)；Tropepe等人，Dev.Biol.208166-188(1999)；Arsenijevic和Weiss，J.Neurosci.182118-2128(1998)；Qian等人，Neuron 2869-80(2000)。本研究旨在確定肝細胞生長因子(HGF)對NSCs的體外影響。
在目前的研究中，在分離自E14小鼠胚胎的神經球中觀察到細胞上的c-Met受體的免疫反應性。這表明HGF的受體存在于神經球中的細胞上。沒有FGF-2或EGF時，在僅僅包含HGF的培養(yǎng)基中觀察到神經球的形成，盡管在培養(yǎng)基中包含F(xiàn)GF-2、EGF、或兩者皆有時，產生尺寸更大并且其中具有更多數(shù)目細胞的神經球。隨HGF形成的神經球包含對nestin免疫陽性，并且是多潛能的的細胞(即，能夠分化成為神經元、星形細胞和少突膠質細胞)。然而，機械分離該神經球的重復傳代培養(yǎng)后降低了形成神經球的能力?？赏ㄟ^假定HGF不僅促進干細胞分裂而且促進最終分化成為各種程度的神經元和神經膠質的祖細胞的生產來解釋該現(xiàn)象。實際上，已經報道說神經球包含干細胞以及已經定型為神經元和神經膠質的神經元和神經膠質祖細胞(Reynolds和Weiss，Dev.Biol.1751-13(1996)；Svendsen和Caldwell，Prog.Brain Res.12713-24(2000))。
NSC的增殖性分裂被劃分為產生NSCs的對稱分裂和產生祖細胞的不對稱分裂。也已知神經元祖細胞主要是在初期產生的(神經原發(fā)生階段(neurogenic phase))而神經膠質祖細胞是在后期階段產生的(神經膠質發(fā)生階段)(gliogenic phase)(Morrison等人，Cell 88287-298(1997)；Qian等人，Neuron 2869-80(2000))。在存在HGF時，形成的神經球很可能主要包含定型為神經元或神經膠質的祖細胞。這些祖細胞不能和NSCs加以區(qū)分因為它們對nestin也是免疫陽性的。換句話說，HGF促進不對稱分裂而非對稱分裂。這個假設解釋了包含HGF的培養(yǎng)基中分離的細胞自我更新能力的降低。
根據(jù)本研究，向含有FGF-2、EGF、或其組合的培養(yǎng)基加入HGF增加神經球的數(shù)目和大小。雖然不希望受到理論的束縛，可通過假設(1)HGF促進NSCs的增殖；(2)HGF抑制NSCs的凋亡或壞死；和/或(3)HGF使NSCs保持未分化狀態(tài)來解釋這個現(xiàn)象。
支持假設(1)的是，向包含F(xiàn)GF-2、EGF、或兩者皆有的培養(yǎng)基加入HGF顯示BrdU陽性細胞數(shù)目的增加。此外，在包含HGF的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)后獲得更多的神經元。這些結果表明HGF可能促進產生神經元祖細胞的不對稱分裂。關于假設(2)，已經報道說在CNS發(fā)育期間發(fā)生顯著數(shù)量的細胞死亡(Oppenheim，Annu.Rev.Neurosci.14453-501(1991))。有趣地是，大多數(shù)TUNEL陽性細胞位于存在NSCs的腦的室周區(qū)帶(PVZ)(Thomaidou等人，J.Neurosci.171075-1085(1997)；Blaschke等人，Development 1221165-1174(1996))。也已知在生長和分化狀態(tài)期間神經球的中心發(fā)生細胞死亡?？磥淼蛲鏊坪跖c該細胞死亡緊密相關。根據(jù)本研究，表明在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)的神經球中存在許多TUNEL陽性細胞。除上述NSCs的增殖影響之外，HGF的抗凋亡效應可能導致神經球數(shù)目和大小的增加。關于假設(3)，已經報道說通過由CNTF活化的gb130(Shimazaki等人，(2001)或由Notch信號表達Hes1或Hes5而發(fā)生信號轉導(Artavanis-Tsakonas等人，Science 284770-776(1999)；Nakamura等人，J.Neurosci.20283-293(2000)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.27630467-30474(2001))。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)HGF促進NSCs的增殖和神經元分化。因此，本發(fā)明提供用于培養(yǎng)NSCs的補充有HGF的生長培養(yǎng)基。該生長培養(yǎng)基可用于體外增殖或分化哺乳動物NSCs。
HGF是分子量為82,000至85,000，由α和β鏈組成的雜二聚體。人HGF的核苷酸序列和氨基酸序列是本領域已知的(Nakamura等人，Nature342440-443(1989))。任何HGF，包括類似物、同系物和突變體，可用于本發(fā)明的生長培養(yǎng)基，只要其保持誘導NSCs增殖和/或分化的能力。因此，除上述人HGF外，來源于除了人以外的哺乳動物的HGF同系物可用于本發(fā)明。此外，因為已知由相似序列的基因編碼的蛋白質具有相似的活性，由在嚴謹條件下與人HGF基因雜交的基因或多核苷酸編碼的蛋白質也可用于本發(fā)明，只要這種蛋白質能夠誘導NSCs的增殖和/或分化。此外，用于本發(fā)明的HGF可以是天然存在的HGF突變體或從修飾，例如通過缺失、取代、添加和/或插入一個或多個氨基酸殘基而產生的HGF突變體。HGF的片段也可用于本發(fā)明，只要它們誘導NSCs的增殖和/或分化。
可根據(jù)常規(guī)方法例如，利用抗HGF抗體或根據(jù)其活性從天然源分離HGF及其類似物、同系物和突變體。備選地，可表達為重組蛋白質，然后根據(jù)需要進行純化。對于重組表達，可根據(jù)已知的技術，例如定點誘變、聚合酶鏈式反應(PCR)(參見，例如，edit.Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology，publish.John Wiley&Sons，第6.1-6.4節(jié)(1987))和雜交(參見例如，edit.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，publish.John Wiley&Sons，第6.3-6.4節(jié)(1987))來獲得編碼HGF的基因。
向本發(fā)明的培養(yǎng)基加入HGF，終濃度為大約1ng/ml至大約1mg/ml，優(yōu)選大約1ng/ml至大約100ng/ml，更優(yōu)選大約1ng/ml至大約20ng/ml。然而，HGF的最佳濃度根據(jù)加入的其它生長因子而不同。一般地，優(yōu)選加入的生長因子總濃度為大約1ng/ml至大約1mg/ml，以及通常濃度為大約1ng/ml至大約100ng/ml是足夠的。為了確定HGF和其它特定生長因子的最佳濃度，本領域的技術人員可容易地進行簡單的滴定實驗。這是常規(guī)實驗。
根據(jù)本發(fā)明的生長培養(yǎng)基可包括培養(yǎng)NSCs所需要的其它因子。即，任何已知的培養(yǎng)基可用于本發(fā)明，只要它支持NSCs的生長。合適的培養(yǎng)基實例包括但不限于，DMEM、F-12、HEM，RPIM等。兩種或多種的這些培養(yǎng)基可組合用于如下所述的實施例infra.。用于實施例的包括HGF的DMEM和F-12組合是本發(fā)明特別優(yōu)選的培養(yǎng)基實例。
如果需要，可向培養(yǎng)基添加補充例如氨基酸(例如，谷氨酰胺等)、維生素、礦物、蛋白質(例如轉運蛋白(transferring)等)和抗生素(例如青霉素、鏈霉素、慶大霉素等)。用于增殖NSC的生長培養(yǎng)基優(yōu)選是無血清培養(yǎng)基，因為血清趨向于誘導NSCs分化。備選地，用于分化NSC的培養(yǎng)基可任選地包含血清。示范性的血清包括來源于牛、雞、馬等的血清。加入血清的濃度范圍是大約0.01至大約10％，優(yōu)選大約0.1至大約5％，更優(yōu)選大約0.5至大約3％，以及最優(yōu)選大約1.0至大約1.5％。
此外，本發(fā)明的生長培養(yǎng)基可包括除HGF外的其它生長因子?？膳cHGF組合使用的生長因子包括容許NSCs增殖的生長因子。實例包括但不限于成纖維細胞生長因子-2(FGF-2；也稱為堿性的成纖維細胞生長因子(bFGF))、表皮生長因子EGF)、雙調蛋白、酸性的成纖維細胞生長因子(aFGF或FGF-1)、轉化生長因子α(TGFα)等。除上述誘導NSCs增殖的生長因子外，影響NSC增殖和分化的其它生長因子也可加入本發(fā)明的培養(yǎng)基。例如，已知胰島素-樣生長因子(IGF-1)，壞死生長因子(NGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、促甲狀腺素釋放激素(TRH)、轉化生長因子β(TGFβ)等影響細胞的增殖和分化，如果需要可以進行添加。此外，也已知FGF-1、FGF-2、睫狀向神經營養(yǎng)性因子(CNTF)、NGF、腦衍生的神經營養(yǎng)性因子(BDNF)、向神經素2、向神經素4、白細胞間介素、白血病抑制因子(LIF)、環(huán)腺苷單磷酸、福斯高林、破傷風毒素、高水平的鉀、雙調蛋白、TGF-α、IGF-1、地塞米松，異丁基3-甲基黃嘌呤、生長激素抑制因子、生長激素、視黃酸和PDGF影響NSCs的分化，并且因此可加入培養(yǎng)基而用于分化。
這些生長因子可單獨或與其它生長因子組合加入本發(fā)明的培養(yǎng)基。如本實施例中所證明的，優(yōu)選的生長因子包括FGF-2和/或EGF。類似于HGF，這些附加的生長因子可包括其類似物、同系物、突變體和片段，只要其具有增強通過加入HGF誘導NSC增殖和/或分化的能力。
本發(fā)明進一步提供用于培養(yǎng)NSCs的方法。發(fā)現(xiàn)向生長培養(yǎng)基加入HGF誘導NSC的增殖。因此，本發(fā)明進一步提供用于增殖NSCs的方法。根據(jù)該方法，在本發(fā)明包括HGF的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)NSC或包括至少一種NSC的細胞群。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當在神經球分化期間向培養(yǎng)基加入HGF時，獲得多于星形細胞的神經元。因此，本發(fā)明提供用于分化NSCs的方法。根據(jù)該方法，在本發(fā)明包括HGF的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)NSC或包括至少一種NSC的細胞群。
神經干細胞(NSC)是能夠自我維持的未分化神經細胞?？梢詮呐咛サ?、分娩后的、幼年和成年的神經元組織獲得NSCs?？蓮木哂猩窠浽M織的任何動物獲得神經元組織。優(yōu)選從哺乳動物，更優(yōu)選嚙齒動物和靈長類，以及甚至更優(yōu)選小鼠、大鼠和人獲得神經元組織。用于獲得神經元組織的合適區(qū)域包括腦干、小腦、大腦皮層、中腦、脊髓和室性組織，以及周圍神經系統(tǒng)的區(qū)域，例如頸動脈體和腎上腺髓質。優(yōu)選的區(qū)域包括但不限于，基底神經節(jié)，例如由尾狀物和殼核組成的紋狀體中的區(qū)域，以及蒼白球、核上顎基片、黑質密部(substantia nigra pars compacta)以及底丘腦核(subthalamic nucleus)的細胞。特別優(yōu)選的神經組織是從神經室性組織，包括室管膜下層獲得的。人NSCs可來源于隨意性流產或分娩后的胎兒組織、幼體或成體的器官供體?？赏ㄟ^活組織檢查獲得，或獲得自經受神經外科手術，例如癲癇癥外科手術、暫時性葉切除術和海馬結構切除術(hippocampalectomies)的患者。
可用于本發(fā)明方法的細胞或細胞群可利用任何本領域已知的方法從上述的組織分離獲得。從相關的細胞外基質分離細胞的方法包括酶處理，例如用胰蛋白酶或膠原酶處理，以及物理方法，例如利用鈍器的方法。
如果需要，可遺傳改變神經干細胞。短語″遺傳改變″是指通過導入至少一種外源核酸構建體穩(wěn)定或瞬時改變細胞的基因型。優(yōu)選的核酸構建體包括包含編碼表達調控序列下游的目標蛋白質的DNA的載體。這種載體包括病毒載體、質粒等。來源于轉基因動物的NSCs也包括在本發(fā)明遺傳改變的NSCs內。
NSC基因型的改變能夠有效檢測細胞。例如，當將連接在調控序列下游的可檢測的報告基因(例如，β-半乳糖苷酶基因、綠色熒光蛋白基因等)導入NSCs實現(xiàn)在神經元、星形細胞或少突膠質細胞中的特異表達時，可以根據(jù)報告基因檢測NSCs的分化。
備選地，可使用編碼生物活性物質的基因進行轉染以提供對治療CNS紊亂有用的細胞。生物活性物質的實例包括但不限于，BDNF、CNTF、EGF、FGF-1、FGF-2、IGFs、白細胞間介素、神經營養(yǎng)因子、例如NT-3、NT-4/NT-5等，NGF、PDGF、TGF-α、TGF-βs、其受體、神經遞質受體，例如乙酰膽堿(ACh)、多巴胺、內啡肽、腦啡肽、腎上腺素、γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸、甘氨酸、組胺、L-3，4-二羥苯丙氨酸(L-DOPA)、N-甲基D-天冬氨酸、去甲腎上腺素、5-羥色胺、P物質和速激肽；神經遞質合成基因，例如膽堿O-乙?；D移酶(ChAT)、多巴脫羧酶(DDC)、多巴胺-β-羥化酶(DBH)、谷氨酸脫羧酶(GAD)、組氨酸脫羧酶、苯乙醇胺N-甲基轉移酶(PNMT)、酪氨酸羥化酶(TH)和色氨酸羥化酶；和編碼神經肽的基因，例如鈴蟾素、降鈣素基因相關的肽、縮膽囊肽(CCK)、腦啡肽、胰高血糖素、神經肽-Y、抑生長素、P-物質、加壓素和血管活性腸肽(VIP)。
可在懸浮液中或在固定的基底上培養(yǎng)神經細胞。對于NSCs的增殖，由于基底趨向誘導NSCs分化，因此懸浮培養(yǎng)是優(yōu)選的。
根據(jù)本方法，細胞或細胞懸液可接種在任何能支持細胞的容器中。這種容器包括培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)平板、滾瓶等。容器包括本發(fā)明的包含HGF的生長培養(yǎng)基?？蓡为毣蛞圆煌M合，一起或按時間順序加入影響增殖和/或分化的其它生長因子和分子。
應使用接近于生理條件的條件來用于本發(fā)明的培養(yǎng)。因此，最佳的培養(yǎng)溫度范圍是大約30℃至大約40℃，更優(yōu)選大約32℃至大約38℃，以及更優(yōu)選大約35℃至大約37℃，同樣地，培養(yǎng)基的pH優(yōu)選是大約pH6至大約8之間，以及更優(yōu)選大約pH7.0至大約7.8。然而，本發(fā)明的培養(yǎng)條件不局限于這些實例，本領域的技術人員可考慮到各種參數(shù)，例如所使用的培養(yǎng)基的種類、細胞起源等而成功地確定適當?shù)臈l件。
可根據(jù)需要持續(xù)培養(yǎng)足夠的時間。
根據(jù)美國專利5,851,832，大約4至5天后，增殖的神經球高出離開培養(yǎng)皿底面，并且趨向于形成游離浮動簇特性的神經球。因此，對于NSCs的增殖，優(yōu)選持續(xù)培養(yǎng)長于4天的時間。應每2至7天，優(yōu)選2至4天更換培養(yǎng)基。具體地，大約3至10天后(更特別地大約6至7天后)體外溫和地離心培養(yǎng)物，然后再懸浮在適當?shù)耐耆囵B(yǎng)基中。
也可通過本領域已知的任何方法進行NSCs的分化。例如，美國專利5,851,832教導，釋放環(huán)己六醇三磷酸鹽和胞內的Ca2+；釋放二?；视筒⑶一罨鞍准っ讣捌渌毎っ?；用佛波酯、誘導分化的生長因子、膠原、纖維結合素、層粘連蛋白、MATRIGELTM(Collaborative Research)等進行治療；并且將細胞接種到涂有離子電荷的表面，例如聚-L-賴氨酸、聚-L-omithine等的固定基底上。
在分化條件下培養(yǎng)2至3天后，NSCs趨向于分化?？筛鶕?jù)常規(guī)方法分析NSCs的分化。例如，已經表征nestin作為在許多類型未分化的CNS細胞中發(fā)現(xiàn)的中間纖維蛋白質(Lehndahl等人，Cell 60585-595(1990))。因此，優(yōu)選地可利用抗nestin的抗體免疫細胞化學地檢測NSCs。備選地，用于神經元或膠質細胞的標記物也是本領域已知的。用于神經元的標記物包括微管締合的蛋白質2(MAP-2)、神經元特異的烯醇酶(NSE)、神經絲(NF)等。用于膠質細胞的標記物包括神經膠質纖絲酸性蛋白(GFAP)(星形細胞的鑒定物)、(GalC)(少突膠質細胞的髓磷脂糖脂鑒定物)、髓磷脂堿性蛋白(MBP)(少突膠質細胞的鑒定物)、O4(少突膠質細胞的鑒定物)等。用于神經元和膠質細胞的各種其它標記物是本領域已知的，并且其中的任何標記物都可成功地用于確定本發(fā)明中NSCs的分化。分別用于檢測NSCs、神經元和膠質細胞的許多抗體是可商業(yè)購買的，并且可使用其中的任何抗體。除免疫細胞化學外，也可利用特異于各個細胞標記物的cDNA和RNA探針檢測標記物。
如果需要，通過本發(fā)明的培養(yǎng)或增殖方法獲得的NSCs可通過本領域已知的任何方法冷凍保藏。
公認將組織移植到CNS中是對于由于損傷造成的神經變性紊亂和CNS損傷的潛在治療(Lindvall，TINS 14(8)376-383(1991))。認為將新細胞移植到神經系統(tǒng)的損傷區(qū)域有修復損傷的腦回路并提供神經遞質的潛能，由此可恢復神經學功能。因此，通過本發(fā)明的培養(yǎng)方法獲得的細胞群可用于治療神經系統(tǒng)紊亂。本發(fā)明提供通過在包括HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)NSC或包括至少一種NSC的細胞群而獲得的細胞群體用于治療神經系統(tǒng)紊亂的用途。根據(jù)本方法獲得的細胞是特別優(yōu)選的，因為它們不是永生的并且不是致瘤的起點。此外，如果自體組織不具有缺陷，可從供體組織獲得根據(jù)本方法培養(yǎng)的細胞以避免免疫反應的發(fā)生。
可通過本發(fā)明的細胞或細胞群治療的神經系統(tǒng)紊亂包括神經變性疾病，急性的腦損傷和CNS機能障礙。在一些疾病中觀察到CNS特定位點中神經細胞的退化，包括阿爾茨海默氏癥、肌萎縮性側索硬化、Huntington′s疾病、多發(fā)性硬化和帕金森氏癥。在阿爾茨海默氏癥中觀察到前腦和大腦皮層的細胞變性，以及基底神經節(jié)，特別是Meynert的核上顎基片中的定位退化。已知Huntington′s遺傳性舞蹈病與紋狀體中神經元的退化相關；帕金森氏癥與基底脊層區(qū)域中多巴胺神經元的退化相關。作為神經退化，例如肌萎縮性側索硬化和大腦性麻痹(cerebral palsy)的結果或作為CNS tauma，例如中風和癲癇癥的結果，可能發(fā)生其它形式的神經學損傷。
實際上，已經建議將神經元的移植用于Huntigton′s疾病患者(Science2875457(2000))；同樣，有報道說產生多巴胺的神經元對于帕金森氏癥是有效的(Nature 41850-56(2002))。此外，膠質細胞的移植導致脊髓修復(Honmou等人，J.Neurosci.16(10)3199-3208(1996)；Nishio等人，Physiological Sci.(2001))。
與移植成熟的神經元或膠質細胞相反，移植未分化的NSCs導致體內分化，預期其提供CNS回路中的神經元功能或不成熟的星形細胞。已知與成熟星形細胞相比，不成熟的星形細胞具有更大的遷移能力(Lindsay等人，Neurosci.12513-530(1984)；Duffy等人，Exp.Cell.Res.139145-157(1982)；WO91/06631)，因此使少突膠質細胞生長和遠離移植位點處分裂的時機最佳化。
提供下列實施例說明本發(fā)明，并且?guī)椭胀夹g人員實現(xiàn)和利用本發(fā)明。無論如何該實施例不是旨在另外限制本發(fā)明的范圍的。
除非另外限定，在此所使用的所有技術和科學術語具有本發(fā)明所屬領域的普通技術人員所理解的通常含義。盡管與在此所描述的實施例相似或等效的方法和材料可被用于實現(xiàn)或測試本發(fā)明，如下描述合適的方法和材料。將在此引用的任何專利、專利申請和出版物引入作為參考。
材料和方法(1)原代培養(yǎng)和神經球傳代在包含青霉素(50U/ml)和鏈霉素(50U/ml)(兩者都來自ICNPharmaceuticals)的PBS緩沖液中，從14日齡的小鼠胚胎(C57BL/6，插入天數(shù)＝1.0)移出紋狀體細胞。用火磨光(fire-polished)的吸液管在由DMEM和F-12養(yǎng)分(1∶1；Invitrogen)組成的無血清培養(yǎng)基中機械分離組織。使細胞在Falcon培養(yǎng)瓶(Falcon)，六孔碟(Falcon)或24孔碟(Falcon)中以150,000個細胞/ml的濃度生長在生長培養(yǎng)基中。生長培養(yǎng)基包含DMEM和F-12養(yǎng)分(1∶1；Invitrogen)、葡萄糖(0.6％)、谷氨酰胺(2mM)、B27添加物(2％；Invitrogen)和EGF，以及濃度分別為20ng/ml的FGF-2和/或HGF(R&D Systems)。每4天用包含相同濃度生長因子的新鮮培養(yǎng)基替換一半的培養(yǎng)基。7天后，通過離心(2,300×g)收集初級神經球，重懸浮在新鮮的培養(yǎng)基中，以及如上所述用火磨光的吸液管分離。
為了評估HGF對原代培養(yǎng)物中神經球大小和數(shù)目的影響，在包含F(xiàn)GF-2(20ng/ml)和/或EGF(20ng/ml)、補充有各種濃度HGF的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)E14紋狀體細胞7天。計算初級神經球的數(shù)目，在相差顯微鏡(IMT-2，Olympus，日本)下測量初級神經球的大小。
(2)神經球的分化在缺乏生長因子的生長培養(yǎng)基中漂洗在單獨存在HGF、FGF-2+EGF或FGF-2+EGF+HGF時培養(yǎng)的次級神經球，并且用火磨光的吸液管分離。將分離細胞(1×105個細胞)接種到在24孔平板(Falcon)中涂有聚-D-賴氨酸的蓋玻片上。為了確定HGF對NSCs分化的影響，每個孔包含1％胎牛血清(FBS)和20ng/ml HGF或只有1％FBS。7天后用含有4％多聚甲醛的含4％蔗糖的PBS固定細胞。
(3)抗體初級抗體(最后稀釋；來源)針對nestin的小鼠單克隆抗體(1∶500；Chemicon)、針對微管締合蛋白質2(MAP-2)的小鼠單克隆抗體(1∶500；Sigma-Aldrich)、針對神經膠質纖絲酸性蛋白(GFAP)的兔多克隆抗體(1∶500；DAKO)、針對O4的小鼠IgM單克隆抗體(1∶20；Chemicon)、針對c-Met的兔多克隆抗體(1∶100；Santa Cruz)和針對5-溴脫氧尿核苷的小鼠單克隆抗體(BrdU)(1∶2；Becton Dickinson Immunocytometry Systems)。
次級抗體結合熒光素(FITC)的山羊抗小鼠IgG(1∶200；BiosourceInternational)、結合若丹明(TRITC)的山羊抗小鼠IgG(1∶200；Molecular Probes)和針對小鼠IgM的結合熒光素的親合純化山羊抗體(1∶200；ICNPharmaceuticals)、結合FITC的山羊抗兔IgG(1∶200；MBL，日本)和結合AMCA的山羊抗兔IgG(1∶200；Chemicon)。
(4)免疫細胞化學將細胞在含4％多聚甲醛的含4％蔗糖的PBS中固定30分鐘。對于c-Met免疫熒光染色，將細胞在75％冷的甲醇中固定，在PBS中洗滌，在封閉溶液中孵育(含2％脫脂乳、1％常規(guī)山羊血清、0.2％BSA和0.2％Triton X-100的PBS)2小時。對于三重標記免疫染色，在含2％脫脂乳和0.2％Triton X-100的PBS中稀釋初級抗體(抗MAP-2和抗GFAP)。使蓋玻片上的細胞在37℃孵育2hr，加入次級抗體并在37℃再孵肓2hr。隨后使細胞與針對O4的小鼠IgM單克隆抗體在37℃孵育1hr，然后與小鼠IgM的結合熒光素的親合純化山羊抗體在37℃孵育1hr。最后，用PBS洗滌蓋玻片兩次，然后加入Hoechst(10mM)并在室溫下孵育5分鐘，在PBS中洗滌兩次。在用Vectoshield(Vector Laboratories)固定到載玻片上之前用急流水洗滌。
(5)BrdU標記和檢測通過向在存在不同生長因子時生長5天的次級神經球培養(yǎng)物加入10μM BrdU(Sigma-Aldrich)來確定BrdU的結合。加入BrdU 12小時后，收集細胞，用培養(yǎng)基洗滌，機械分離，重懸浮在分化培養(yǎng)基中(生長培養(yǎng)基加1％FBS)，并接種到在24孔平板(Falcon)中的涂有聚-D-賴氨酸的蓋玻片上。12hr后使細胞在冷的75％甲醇中固定20分鐘，在2M HCl中變性30分鐘，然后用PBS洗滌兩次。然后，用抗BrdU在37℃孵育細胞30分鐘，再用PBS洗滌兩次。使細胞與結合FITC的山羊抗小鼠IgG在37℃孵育30分鐘。最后，用PBS洗滌細胞兩次，并加入0.04mg/ml碘化丙啶(propidium iodide)(MolecularProbes)。然后在室溫下孵育細胞5分鐘，再用PBS洗滌兩次。
(6)TUNEL分析為了評估生長條件下凋亡細胞的數(shù)目，將次級神經球固定在1％多聚甲醛中。另一方面，為了評估分化條件中凋亡細胞的數(shù)目，將細胞接種到含有分化培養(yǎng)基的24孔平板(Falcon)中涂有聚-D-賴氨酸的蓋玻片上6天，然后在1％多聚甲醛中固定。利用TUNEL試劑盒(ApopTag Fluorescein試劑盒，INTERGEN)染色細胞。
(7)細胞計數(shù)和統(tǒng)計分析在熒光顯微鏡下用高分辨率的數(shù)碼相機(DMRA，Q-Fish系統(tǒng)，Leica，德國)檢測熒光并攝影。以隨機模式計數(shù)每蓋玻片10個視野(每視野50-100個細胞)中細胞的免疫反應性和數(shù)目。使用不成對t檢驗評估實驗之間的差異。所有的結果表示為平均值±SEM。
結果(1)HGF濃度對來源于小鼠胚胎腦的NSCs的神經球形成和增殖的影響缺乏生長因子時，原代E14紋狀體細胞低密度培養(yǎng)7天后沒有觀察到神經球(圖1a和1b)。低到5ng/ml的HGF中，觀察到顯著數(shù)目的神經球(63.8±44.8個細胞/孔)。神經球的數(shù)目以劑量依賴性的方式增加直到20ng/ml HGF，在50ng/ml達到平臺期(圖1a和1b)。由HGF形成的神經球的數(shù)目小于通過加入任何濃度的FGF-2、EGF、或其組合所獲得的神經球數(shù)目(圖1b)。向FGF-2、EGF或其組合加入20ng/ml HGF，顯著增加了神經球的數(shù)目(沒有HGFFGF-2(341.3±89.6個細胞/孔)、EGF(146.3±28.7個細胞/孔)、FGF-2+EGF(507±95.7個細胞/孔)；有HGFFGF-2(745.9±115.1個細胞/孔)、EGF(511.9±43.5)、FGF-2+EGF(1218.8±143.6個細胞/孔))(圖1a和1b)。
為了確定HGF對NSCs增殖的影響，利用相差顯微鏡術測量神經球的大小。缺乏HGF時，沒有觀察到神經球。存在20ng/ml HGF時，觀察到神經球，但其尺寸小于加入通過其它生長因子而產生的尺寸。當向包含F(xiàn)GF-2、EGF或其組合的培養(yǎng)基加入HGF時，神經球的大小顯著增加(表1)。這些結果表明HGF對NSCs的增殖影響與存在其它生長因子可能是協(xié)同的。
表1.
HGF對初級神經球的大小和數(shù)目的影響

在存在明確的生長因子時，將E14紋狀體細胞以每孔3×105個細胞接種在6孔板中。7天后從5個不同的實驗中所獲得的計數(shù)確定初級神經球的大小和數(shù)目。*p＜0.05對HGF(-)。
(2)通過用HGF培養(yǎng)所獲得的神經球中細胞的特性為了確定高血糖受體，c-Met的表達，對神經球中的細胞和從具有HGF的分離物中分離的細胞進行免疫染色。證實神經球中的細胞和從神經球分離的細胞中的大多數(shù)表達c-Met(圖2a和2b)。也可通過Western印跡分析確證使用HGF或FGF-2和EGF而分離的神經球上c-Met蛋白質的表達(數(shù)據(jù)未顯示)。在使用另外的生長因子而分離的細胞中c-Met也是免疫陽性的(數(shù)據(jù)未顯示)。來自使用20ng/ml HGF而分離的神經球的細胞對干細胞標記物nestin也是免疫陽性的(圖2c)。
(3)HGF對BrdU摻入神經祖代的影響為了確定HGF對NSCs增殖影響的機制，將神經球與10μM的BrdU共孵育12hr并固定。BrdU是摻入分裂細胞DNA的胸腺嘧啶脫氧核苷類似物。向包含F(xiàn)GF-2、EGF或其組合的培養(yǎng)基加入HGF，顯著增加了BrdU陽性細胞的百分比(圖3a)。很可能HGF通過在NSCs培養(yǎng)期間抑制細胞死亡而促進NSCs的存活。為了檢測HGF對NSCs存活的影響，對在有和沒有HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的神經球進行TUNEL染色。HGF的加入降低了神經球中TUNEL陽性細胞的數(shù)目(圖3b)。
(4)HGF對神經祖代分化的影響為了闡明HGF對NSCs分化的影響，也為了檢驗使用HGF而形成的神經球是真正的NSCs，研究NSCs分化成為神經元、星形細胞、少突膠質細胞及其它細胞類型的能力。首先，分離在包含20ng/ml HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天的次級神經球，接種到具有1％FBS、有和沒有20ng/ml HGF的蓋玻片上，然后培養(yǎng)7天。用神經元標記物MAP2(紅色)、神經膠質標記物GFAP(綠色)和核標記物Hoechst(藍色)免疫染色細胞(圖4)。對于各種標記物計數(shù)免疫陽性細胞的數(shù)目并計算完整細胞中其百分比。令人感興趣的是，當在分化期間向培養(yǎng)基加入HGF，獲得的神經元多于星形細胞(沒有HGF神經元(35.8±11.7％)、星形細胞(43.1±16.0％)；具有HGF神經元(52.5±7.9％)、星形細胞(35.2±8.9％))(圖5a)。當使用FGF-2和EGF而分離細胞時，獲得相似的百分比(沒有HGF神經元(28.5±12.7％)、星形細胞(50.8±11.9％)；具有HGF神經元(53.5±8.9％)、星形細胞(32.6±7.9％))(圖5b)。當向來自腦的細胞的原代培養(yǎng)培養(yǎng)基加入20ng/ml HGF，在包含1％FBS、沒有HGF的培養(yǎng)基中分化后趨向于存在更多的神經元(圖5c)。然而，當向包含1％FBS的用于分化的培養(yǎng)基加入HGF時，獲得相似的神經元百分比(圖5c右側條形)。這些結果表明當HGF加入分化的培養(yǎng)基時，其促進分化成為神經元。
工業(yè)實用性顯示一種包含肝細胞生長因子(HGF)的培養(yǎng)基能夠誘導神經球形成。此外，向含有FGF-2、EGF、或兩者皆有的培養(yǎng)基加入HGF顯示增加新形成的神經球的大小和數(shù)目。因此，本發(fā)明提供用于培養(yǎng)神經干細胞(NSCs)的包括HGF的生長培養(yǎng)基和利用該培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞的方法。在包括HGF的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)NSC或包含NSC的細胞群提供了在NSCs中富集的細胞群或分化NSCs的細胞群。這種細胞群可用于治療神經系統(tǒng)紊亂，例如癲癇癥、頭部損傷、中風、肌萎縮性側索硬化、帕金森氏癥、阿爾茨海默氏病和Huntington′s癥。
發(fā)現(xiàn)HGF促進分離自E14小鼠胚胎的NSCs的增殖和神經元分化。對于HGF對NSCs影響機制的進一步理解可能導致開發(fā)新的生物技術或體內治療以控制和調節(jié)中樞神經系統(tǒng)(CNS)的發(fā)生和/或修復，其依次可用作針對損傷和紊亂的新的治療方法。
雖然已經詳細地參考其具體的實施方案描述了本發(fā)明，但是對于本領域的技術人員來說產生各種變化和改進而不背離本發(fā)明的精神和范圍是顯而易見的。
權利要求
1.一種包括肝細胞生長因子(HGF)的用于培養(yǎng)神經干細胞的培養(yǎng)基。
2.權利要求1的培養(yǎng)基，進一步包括除HGF之外的另一種生長因子。
3.權利要求2的培養(yǎng)基，其中該生長因子選自成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)或表皮生長因子(EGF)。
4.一種用于培養(yǎng)神經干細胞的方法，其包括在權利要求1至3中任何一項的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)神經干細胞或包括至少一種神經干細胞的細胞群的步驟。
5.一種用于使神經干細胞增殖的方法，其包括在容許神經干細胞增殖的條件下，在權利要求1至3中任何一項的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)神經干細胞或包括至少一種神經干細胞的細胞群的步驟。
6.一種用于使神經干細胞分化的方法，其包括在容許神經干細胞分化成為包含神經元和膠質細胞的細胞群的條件下，在權利要求1至3中任何一項的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)神經干細胞或包括至少一種神經干細胞的細胞群的步驟。
7.權利要求4至6中任何一項的方法，其中該神經干細胞來源于選自腦干、小腦、大腦皮層、中腦、脊髓或室的哺乳動物神經組織。
8.權利要求4至7中任何一項的方法，其中該神經干細胞是經遺傳改變的。
9.一種利用在權利要求1至3中任何一項的培養(yǎng)基中所培養(yǎng)的神經干細胞或包括至少一種神經干細胞的細胞群治療神經疾病的方法。
10.權利要求9的方法，其中該細胞群是在神經干細胞中富集的。
11.權利要求9的方法，其中該細胞群是在神經元中富集的。
12.權利要求9至11中任何一項的方法，其中待治療的神經疾病選自癲癇癥、頭部損傷、中風、肌萎縮性側索硬化、帕金森氏癥、阿爾茨海默氏癥、或Huntington′s癥。
13.權利要求9至12中任何一項的方法，其中通過移植至少一種細胞群來治療神經疾病。
全文摘要
一種包含肝細胞生長因子(HGF)的培養(yǎng)基顯示誘導神經球形成。此外，向含有FGF－2、EGF、或兩者皆有的培養(yǎng)基加入HGF增加新形成的神經球的大小和數(shù)目。因此，本發(fā)明涉及包括用于培養(yǎng)神經干細胞的HGF的生長培養(yǎng)基和利用該培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞的方法。
文檔編號A61P25/00GK1745168SQ20038010945
公開日2006年3月8日 申請日期2003年12月2日 優(yōu)先權日2002年12月2日
發(fā)明者石澤錠二, 吉村紳一, 北島英臣, 篠田淳, 郭泰彥, 巖間亨, 森下竜一, 國貞隆弘, 坂井升 申請人:安增子摩祺株式會社