用于治療腫瘤的免疫綴合物的制作方法

專利名稱：用于治療腫瘤的免疫綴合物的制作方法
技術領域：
用于治療腫瘤的免疫綴合物。
背景技術：
某些細胞因子的抗腫瘤活性是眾所周知的，并已有描述。某些細胞因子已經(jīng)用于人體治療。例如，IL-2和IFN-γ等細胞因子已經(jīng)在患有不同類型腫瘤的患者體內顯示出有效抗腫瘤活性，所述腫瘤類型例如腎轉移癌、毛細胞白血病、卡波西肉瘤、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤(multiple mieloma)等。其它細胞因子如IFNβ、腫瘤壞死因子(TNF)α、TNFβ、IL-1、IL-4、IL-6、IL-12、IL-15和集落刺激因子(CFS)已經(jīng)顯示出對某些類型的腫瘤的確切抗腫瘤活性。
一般而言，細胞因子的全身毒性大大限制了它們的治療應用。例如，最初發(fā)現(xiàn)TNF能夠誘導某些腫瘤出血性壞死并發(fā)現(xiàn)它在體外對不同腫瘤系的細胞毒性效應，但后來證明它具有強烈的促炎活性，在過量產生的條件下，對人體有危險。
因為全身毒性是藥理學上活性數(shù)量的細胞因子在人體內應用的基本問題，新的衍生物和治療策略目前正在評價之中，目標在于降低這類生物學效應物的毒性效應，同時又保持其治療功效。
一些新方法涉及a)開發(fā)能夠將TNF傳遞給腫瘤并能增加局部濃度的融合蛋白。例如，已經(jīng)產生了由TNF和腫瘤特異性抗體組成的融合蛋白；b)開發(fā)保持其抗腫瘤活性并且具有降低全身毒性的TNF突變體。因此，已經(jīng)制備了能選擇性識別唯一受體的突變體；c)應用能降低TNF的某些毒性效應而不影響其抗腫瘤活性的抗TNF抗體。所述抗體在文獻中已有描述；
d)應用具有較長半壽期的TNF衍生物(例如與聚乙二醇綴合的TNF)。
最近，能夠選擇性靶向腫瘤部位的TNF衍生物的制備方法已有報道。例如，描述了這樣一種融合蛋白所述融合蛋白或者是通過將抗運鐵蛋白受體mAb重鏈基因與TNF基因融合而得到，或者是TNF與針對腫瘤相關TAG72抗原的單克隆抗體的“鉸鏈”區(qū)的融合蛋白，或者是Fv-TNF融合蛋白。
EP 251 494公開了用于診斷劑或治療劑的給藥系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含如下組分一種與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白綴合的抗體、一種能夠與所述綴合抗體復合的試劑和一種由綴合了生物素的診斷劑或治療劑組成的化合物；所述組分可以序貫給藥或適當延遲給藥，以便使所述治療劑或診斷劑通過生物素-鏈霉抗生物素在所述抗體識別的靶細胞表面相互作用而定位。所述治療劑或診斷劑包含金屬螯合物，尤其是放射性核素和低分子量抗腫瘤藥(例如順鉑、多柔比星等)的螯合物。
EP 496 074公開了一種方法，所述方法提供生物素化抗體、抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白和生物素化診斷劑或治療劑的序貫給藥。雖然一般性提到了細胞毒性劑(如蓖麻毒蛋白)，但主要公開了放射性標記化合物的應用。
WO 95/15979公開了用于在細胞靶上定位高毒性劑的方法，所述方法基于給予包含與配體或抗配體綴合的特異性靶分子的第一綴合物，接著給予由與抗配體或配體結合的毒性劑組成的第二綴合物。
WO 99/13329公開了用于將分子靶向腫瘤血管生成性血管的方法，所述方法基于所述分子與NGR受體的配體綴合。許多分子已經(jīng)顯示作為可能的候選分子，但是只有多柔比星有具體描述。公開了NGR受體的配體作為細胞因子的載體不能用于誘導免疫應答。
在WO 01/61017中，其發(fā)明人描述了他的令人吃驚的發(fā)現(xiàn)可以通過與氨肽酶-N受體(CD13)的配體偶聯(lián)來顯著改進某些細胞因子的治療指數(shù)并增強其免疫治療特性。CD13是150kDa跨膜糖蛋白，在不同物種中高度保守。它在正常細胞以及骨髓瘤細胞系、血管生成內皮和某些上皮細胞表面表達。CD13受體通常鑒定為“NGR”受體，因為其肽配體共享氨基酸“NGR”基序。
然而，還需要進一步改進用于治療和診斷癌癥的藥用組合物和方法。
發(fā)明概述將藥物傳遞并滲透到瘤細胞中是腫瘤化療療效的關鍵。目前，我們已發(fā)現(xiàn)靶向給予皮克劑量的細胞因子令人吃驚地增強了化療藥物的滲透。更具體地講，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將極低劑量的細胞因子給予腫瘤和腫瘤相關環(huán)境(包括腫瘤血管系統(tǒng))提供了避免負反饋機制并保留其改變藥物滲透屏障能力的新方法。因此，本發(fā)明提供了用于增加化療藥物的治療指數(shù)的令人吃驚的新策略。在一個優(yōu)選的實施方案中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用由TNF和CNGRC(一種靶向腫瘤新血管的肽)偶聯(lián)達到的血管靶向，使多柔比星的療效提高了8-10倍，而沒有毒性增加的證據(jù)。同樣，血管靶向增強了一種不同的化療藥物—美法侖的功效。用3-5ng/kg靶向TNF(腹膜內)觀察到與化學療法的協(xié)同作用，比非靶向TNF的LD50低106倍，而且比非靶向TNF所需的劑量低105倍。另外，我們也發(fā)現(xiàn)，將低劑量的TNF靶向給予腫瘤血管不能誘導可溶性TNF受體釋放到循環(huán)中。我們還發(fā)現(xiàn)RGD-TNF和IFNγ-NGR在皮克范圍內是有活性的。我們還證明NGR-TNF增強了順鉑的效果。這些結果表明，將微量細胞因子給予腫瘤血管提供了一個避免負反饋機制并且保留其改變藥物滲透屏障能力的新方法。以所述方式進行的血管靶向提供了一個用于增加化療藥物治療指數(shù)的新策略。
發(fā)明聲明按照本發(fā)明的一個方面，提供一種藥用組合物，所述藥用組合物包含細胞因子和腫瘤靶向部分(TTM)的綴合物以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，其中所述細胞因子的用量不會誘導負反饋機制。因此，所述細胞因子的用量不會誘導可溶性細胞因子受體脫落。
優(yōu)選所述綴合物的用量能提供0.5-500ng/kg的劑量范圍，更優(yōu)選1-50ng/kg的劑量范圍，最優(yōu)選5-15ng/kg的劑量范圍。
在一個實施方案中，所述細胞因子是炎性細胞因子。
在另一個實施方案中，所述細胞因子是化療細胞因子。
優(yōu)選所述細胞因子選自TNF，例如TNFα、TNFβ，IFNα、IFNβ、IFNγ，IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-15，EMAP II、血管內皮生長因子(VEGF)、PDGF、PD-ECGF或趨化因子。
在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述細胞因子是TNF-α、TNF-β或IFN-γ，最優(yōu)選TNF-α或TNF-β。
在一個實施方案中，所述TTM是結合配偶體，例如針對腫瘤細胞表面分子的配體或抗體，所述腫瘤細胞表面分子例如受體、標記或其它胞外組分。
在另一個實施方案中，所述TTM是腫瘤血管靶向部分(TVTM)，而且可以是結合配偶體，例如針對腫瘤血管細胞表面分子的配體或抗體，所述腫瘤血管細胞表面分子例如受體、標記或其它胞外組分。
在一個實施方案中，所述TTM是抗體或其片段。
在另一個實施方案中，所述TTM是配體或其片段。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述TTM是含有NGR或RGD基序的肽，或者是HIV-tat、膜聯(lián)蛋白V、骨橋蛋白、纖連蛋白、I型或IV型膠原蛋白、透明質酸或肝配蛋白(Ephrin)，或者是結合配偶體，例如抗癌胚纖連蛋白的抗體；或者是上述任何組分的片段。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述TTM包含NGR基序。在一個最優(yōu)選的實施方案中，所述TTM是CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、環(huán)狀CVLNGRMEC、線狀或環(huán)狀CNGRC。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述TTM是含有RGD基序的肽。
在一個實施方案中，所述TTM靶向VEGFR、ICAM1、ICAM2或ICAM3、PECAM-1、CD13、VCAM-1、選擇蛋白、Act RII、ActRIIB、ActRI、ActRIB、CD44、氨肽酶A、氨肽酶N(CD13)、αvβ3整聯(lián)蛋白、αvβ5整聯(lián)蛋白、FGF-1、FGF-2、FGF-3或FGF-4、IL-1R、EPHR、MMP、NG2、腱生蛋白、癌胚纖連蛋白、PD-ECGFR、TNFR、PDGFR或PSMA。
可用于本發(fā)明的優(yōu)選的靶向部分和細胞因子的組合示于下表
不用說術語“Ab”代表抗體，所述抗體和配體包括它們的片段。
在特別優(yōu)選的實施方案中，所述綴合物包含TNF-α或TNF-β和含NGR的肽，或者TNF-α或TNF-β和含RGD的肽。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述綴合物為融合蛋白形式。
在另一個實施方案中，所述綴合物為核酸形式。
在另一個實施方案中，所述組合物還包含另一種抗腫瘤藥或診斷用腫瘤造影化合物。優(yōu)選所述另一種抗腫瘤藥是多柔比星、美法侖或順鉑。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供本發(fā)明的綴合物或藥用組合物在制備用于治療或診斷癌癥的藥物中的用途。
換句話說，本發(fā)明提供一種治療或診斷癌癥的方法，所述方法包括給予有需要的患者有效量的本發(fā)明的綴合物或藥用組合物，其中所述用量不會誘導負反饋機制。
本發(fā)明的某些關鍵優(yōu)勢為了到達實體瘤內的癌細胞，化療藥物必須進入腫瘤血管，穿越血管壁，最終遷移通過間質。異質性腫瘤灌注、血管通透性和細胞密度、以及增加的間質壓力是限制藥物從腫瘤血管向瘤細胞內滲透的關鍵性屏障，因而也限制了化學療法的療效(1)。因此，目標在于改進腫瘤內藥物滲透的策略具有極大的實驗價值和臨床價值。
越來越多的證據(jù)表明，可以開發(fā)腫瘤壞死因子-α(TNF)和具有有效抗腫瘤活性的炎性細胞因子可用于該目的。例如在患有肢端軟組織肉瘤或黑素瘤的患者中，向局部孤立性肢體灌注美法侖或多柔比星時加入TNF，產生比單獨使用化療藥物高的反應率(2-6)。據(jù)信，TNF誘導內皮屏障功能的改變、腫瘤間質壓力的降低、化療藥物滲透增加和腫瘤血管損傷，都是TNF和化學療法之間協(xié)同作用的重要機制(3，4，7-10)。不幸的是，系統(tǒng)給予TNF伴隨著禁止性毒性，最大耐受劑量(8-10μg/kg)比估計有效劑量低10-50倍(11，12)。因此，已經(jīng)放棄了系統(tǒng)給予TNF，該細胞因子的臨床應用僅限于局部區(qū)域治療。然而，TNF活性的某些特征，尤其是對腫瘤相關血管的選擇性和與化療藥物的協(xié)同作用，使人們一直希望更廣泛治療應用的可能性(13)。
TNF的血管效應提供了開發(fā)目標在于增加局部功效和能夠系統(tǒng)給予治療劑量的“血管靶向”策略的原理。近來，我們已經(jīng)顯示了可通過將TNF與CNGRC肽(一種靶向腫瘤血管系統(tǒng)的氨肽酶N(CD13)配體)偶聯(lián)，將該蛋白靶向給予腫瘤血管(14)。在目前的工作中，我們已經(jīng)研究了用低劑量的這種稱為NGR-TNF的綴合物進行血管靶向是否能增強化療藥物在腫瘤中的滲透并改進其功效。我們證明了將皮克劑量的NGR-TNF(3-5ng/kg)系統(tǒng)給予小鼠(該劑量比其LD50低6個數(shù)量級)，足以增強美法侖和多柔比星的抗腫瘤活性，而沒有毒性增加的證據(jù)。另外，我們提供了用NGR-TNF進行的血管靶向能降低藥物滲透屏障并增加到達癌細胞的多柔比星量的證據(jù)。最終，我們證明將微量NGR-TNF給予腫瘤血管克服了與系統(tǒng)給予相當高劑量的TNF相關的另一個主要問題，即誘導可溶性TNF抑制劑。
發(fā)明詳述本發(fā)明各種優(yōu)選特征和實施方案將以非限制性實施例的方式進行描述。
雖然總的來講本文提到的技術都是本領域眾所周知的，但是參考文獻尤其見于Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(1989)和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版，John Wiley&Sons，Inc，以及完整版本的Current Protocols inMolecular Biology。
負反饋機制負反饋機制是本領域已知的，可包括在全身或局部水平上可溶性受體脫落和其它細胞因子、激素或生物因子的誘導，使得它們直接或間接降低本發(fā)明靶向細胞因子的活性。可溶性抑制劑或誘餌(decoy)受體的誘導是直接抑制劑的實例。IL-10、TGF-β或其它抗炎細胞因子可以間接阻止由炎性細胞因子觸發(fā)的事件級聯(lián)。
受體脫落該術語涉及細胞切割細胞因子受體的胞外結構域并將其作為可溶性產物釋放到循環(huán)中的能力。在很多情況下，這些切割產物還具有結合其配體的能力。然而，相反的是，所述膜結合受體的剩余部分不再結合配體，所述細胞因此而對特定細胞因子的作用脫敏。已經(jīng)描述了各種細胞因子的所述可溶性受體，所述細胞因子包括IL-4、IL-6、IL-6、IGF、TNF-α和IFN-γ。
綴合物本發(fā)明涉及的綴合物是分子，所述分子包含至少一種至少與通過遺傳融合或化學偶聯(lián)而形成的細胞因子連接的靶向蛋白。所述“連接”是指第一和第二序列結合，使得所述第二序列能夠通過第一序列轉運到靶細胞。因此，綴合物包括融合蛋白、直接合成的蛋白和偶聯(lián)蛋白，其中在融合蛋白中所述轉運蛋白通過編碼這些蛋白的DNA分子的遺傳表達、通過其多肽主鏈連接細胞因子；在偶聯(lián)蛋白中通過交聯(lián)劑連接預先形成的序列。在本文中該術語也用于包括細胞因子與靶蛋白的締合，例如聚集。按照一個實施方案，所述第二序列可以包含多核苷酸序列。該實施方案中可以見到蛋白/核酸復合物。
所述第二序列可以來自與所述第一序列相同的物種或不同物種，但是如果來自相同物種的話，所述第二序列在本發(fā)明綴合物中以與天然情況不同的方式存在。
本發(fā)明的綴合物能指向細胞，使得對應于與所述轉運序列偶聯(lián)的多肽序列的效應物功能能夠發(fā)生。
所述肽可以直接偶聯(lián)所述細胞因子，或通過間隔區(qū)間接偶聯(lián)所述細胞因子，所述間隔區(qū)可以是單個氨基酸、氨基酸序列或有機殘基例如6-氨基辛基-N-羥基琥珀酰亞胺。
所述肽配體最好連接到所述細胞因子N末端，因而使得對經(jīng)修飾的細胞因子與其受體結合的干擾最小化。或者，所述肽可以連接到氨基酸殘基，所述氨基酸殘基是酰胺鍵或羧基鍵接頭，所述接頭可以是所述分子上天然存在的或者是用遺傳工程技術人工插入的。所述經(jīng)修飾的細胞因子最好由使用包含編碼所述肽的5′-毗連序列的cDNA而制備。
按照一個優(yōu)選實施方案，提供TNF和CNGRC序列的綴合產物，其中TNF的氨基末端通過間隔區(qū)G(甘氨酸)連接CNGRC肽。
細胞因子藥物滲透到瘤細胞中是實體瘤化學療法療效的關鍵。為了到達實體瘤中的癌細胞，化療藥物必須進入腫瘤血管，穿越血管壁并最終遷移通過間質。異質性腫瘤灌注、血管通透性和細胞密度和增加的間質壓力是限制藥物向瘤細胞內滲透的關鍵性屏障，因而也限制了化學療法的療效。因此，具有影響這些因素的作用的細胞因子可用于本發(fā)明?？捎糜诒景l(fā)明的非限制性細胞因子列舉如下TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-15、EMAP II、血管內皮生長因子(VEGF)、PDGF、PD-ECGF或趨化因子。
TNFTNF的作用是作為炎性細胞因子，具有誘導內皮屏障功能改變、降低腫瘤間質壓力和增強化療藥物滲透及腫瘤血管損傷的作用。
當觀察到癌癥患者在受到細菌感染后偶爾顯示其腫瘤自發(fā)消退時，首次提出存在腫瘤壞死分子。此后在二十世紀六十年代的研究指出響應細菌產物而產生的宿主相關(或內源)介質可能是所觀察到作用的根源。在1975年，顯示一種由細菌誘導的循環(huán)因子對移植到小鼠皮膚的腫瘤具有強烈抗腫瘤活性。該因子稱為腫瘤壞死因子(TNF)，此后被分離、克隆，并發(fā)現(xiàn)它是參與免疫調節(jié)和炎癥的分子家族的原型。TNF受體和TNF超家族其它成員也構成相關蛋白的超家族。
TNF相關配體通常共享許多共同特征。這些特征不包括全部氨基酸序列高度同源性。除了神經(jīng)生長因子(NGF)和TNF-β以外，所有配體都合成作為含有短的胞質區(qū)段(10-80個氨基酸殘基)和相當長的胞外區(qū)(140-215個氨基酸殘基)的II型跨膜蛋白(胞外C末端)。與TNF結構無關的NGF包含在該超家族中，僅僅因為它結合TNFRSF低親和力NGF受體(LNGFR)的能力。NGF具有經(jīng)典的信號序列肽，而且是分泌型的。相反，雖然TNF-β也能完全分泌，但其一級結構與II型跨膜蛋白更相關。可以認為TNF-β是無功能、或是無效的跨膜區(qū)段的II型蛋白。一般而言，TNFSF成員形成三聚體結構，它們的單體是由其中將它們定向為兩個折疊結構的β鏈組成。這些分子的三聚體結構提示，TNSF和TNFRSF超家族的配體和受體在信號轉導中經(jīng)歷了“群集”。
TNF-α人TNF-α是233個氨基酸殘基的非糖基化多肽，或者以跨膜蛋白存在，或者以可溶性蛋白存在。當作為26kDa膜結合蛋白表達時，TNF-α由29個氨基酸殘基的胞質結構域、28個氨基酸殘基的跨膜區(qū)段和176個氨基酸殘基的胞外區(qū)組成。所述可溶性蛋白由85kDa TNF-α轉化酶(TACE)、通過蛋白水解切割事件產生，產生了17kDa的157個氨基酸殘基的分子，該分子通常在循環(huán)中作為同源三聚體。
TNF-β/LT-αTNF-β也稱為淋巴毒素-α(LT-α)，是與TNF-α同時克隆的分子。雖然TNF-β在循環(huán)中作為171個氨基酸殘基的25kDa糖基化多肽，但是已發(fā)現(xiàn)更大形式，其長度為194個氨基酸殘基。人TNF-β的cDNA編碼205個氨基酸殘基(在小鼠中是202個)的可讀框，推測某些類型的蛋白水解加工過程發(fā)生在分泌期間。和TNF-α一樣，循環(huán)TNF-β以非共價連接三聚體的方式存在，已知結合與TNF-α相同的受體。
在一個實施方案中，TNF是一種能選擇性結合一種TNF受體的TNF突變體(Loetscher H等(1993)J Biol Chem 26826350-7；VanOstade X等(1993)Nature 361266-9)。
許多其它炎性細胞因子也具有增加內皮血管通透性的特性，可以理解，本發(fā)明可以應用所述細胞因子以及增加所述細胞因子表達的藥物。炎性細胞因子也稱為促炎細胞因子，是分子量介于5kDa和70 kDa之間的多種多肽和糖蛋白。它們對炎癥反應有刺激效應。最重要的炎性細胞因子是TNF、IL-1、IL-6和IL-8。
一些分類為炎性細胞因子的細胞因子示于下表炎性細胞因子
TGF-β轉化生長因子，LIF白血病抑制因子；OSM制瘤蛋白(oncostatin)M；CNTF睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子；PF-4血小板因子4；PBP血小板堿性蛋白；NAP-2嗜中性粒細胞活化蛋白2；β-TGβ-血小板球蛋白；MIP巨噬細胞炎性蛋白；MCP單核細胞趨化蛋白。
IL-11、IFN-α、IFN-β、尤其是趨化因子超家族成員也對炎癥反應進行正調節(jié)。在某些情況下，TGF-β具有多種炎癥活性，包括對嗜中性粒細胞、T淋巴細胞和失活單核細胞的趨化效應。
IL-2
因為IL-2/IL-2R系統(tǒng)在介導免疫反應和炎癥反應中的重要作用，顯而易見，對該系統(tǒng)的監(jiān)測和操作具有重要的診斷和治療意義。IL-2因其刺激腫瘤攻擊LAK和TIL(腫瘤浸潤淋巴細胞)細胞的增殖和活性的能力，已經(jīng)顯示出作為抗癌藥物的希望。然而，IL-2毒性問題仍需要關注并值得研究。本發(fā)明解決了該問題。
IL-15白介素15(IL-15)是一種新的細胞因子，所述細胞因子與IL-2共享許多生物學特征，但是卻缺乏與IL-2氨基酸序列的同源性。在猴腎上皮細胞系(CVI/EBNA)的培養(yǎng)條件下，根據(jù)IL-15對鼠T細胞系CTLL-2的促有絲分裂活性而首次鑒定IL-15。也獨立發(fā)現(xiàn)IL-15作為由成人T細胞白血病細胞系(HuT-102)產生的細胞因子，刺激T細胞增殖，并命名為IL-T。因為IL-2作為T細胞、NK細胞、LAK細胞和TIL刺激物的活性，所以目前正在進行臨床實驗，以試驗它在治療癌癥和治療病毒感染方面的潛在用途。因為IL-15相似的生物學活性，所以IL-15將具有相似的治療潛力。
趨化因子趨化因子主要是分泌型小蛋白的超家族，在白細胞運輸、募集和再循環(huán)中起作用。它們也在許多病理生理學過程中起關鍵作用，所述病理生理學過程例如變態(tài)反應、感染性疾病和自身免疫病、血管生成、炎癥、腫瘤生長和造血細胞發(fā)育。這些蛋白中約80％的成熟形式具有66-78個氨基酸。其余蛋白較大，在所述蛋白核心上游帶有額外氨基酸或作為延伸的C末端區(qū)段部分。所有趨化因子通過七跨膜結構域G蛋白偶聯(lián)受體進行信號傳遞。至少有17個已知的趨化因子受體，這些受體中許多表現(xiàn)出混雜的結合特性，因此幾個不同的趨化因子可以通過相同的受體進行信號傳遞。
根據(jù)保守氨基酸序列基序，將趨化因子分為亞家族。大多數(shù)家族成員具有至少4個保守半胱氨酸殘基，形成兩個分子內二硫鍵。根據(jù)前兩個半胱氨酸殘基的位置定義該亞家族●α亞家族，也稱為CXC趨化因子，具有一個將所述前兩個半胱氨酸殘基隔開的氨基酸。可以根據(jù)緊接著第一個半胱氨酸殘基前是否存在glu-leu-arg(ELR)氨基酸基序，可以對該組進行進一步分類。目前有5種CXC-特異性受體，命名為CXCR1到CXCR5。ELR+趨化因子結合CXCR2，一般起嗜中性粒細胞化學引誘劑和激活劑的作用。ELR-趨化因子結合CXCR3到CXCR5，主要作用于淋巴細胞。在寫作本文時，在科學文獻中已報道了編碼CXC趨化因子的14種不同的人類基因，帶有一些由可變剪接導致的額外多樣性。
●在β亞家族(也稱為CC趨化因子)中，所述前兩個半胱氨酸彼此鄰接，沒有間插氨基酸。目前有24個不同的人β亞家族成員。該組的受體命名為CCR1到CCR11。不同CC家族成員的靶細胞包括大多數(shù)白細胞類型。
●有兩種具有趨化因子同源性的已知蛋白，不屬于α亞家族和β亞家族。淋巴細胞趨化蛋白是γ類的唯一成員(C趨化因子)，所述淋巴細胞趨化蛋白喪去所述第一個和第三個半胱氨酸。淋巴細胞趨化蛋白的受體命名為XCR1。CX3C趨化因子(fractalkine)是δ類中唯一已知成員(CX3C趨化因子)，在所述前兩個半胱氨酸殘基之間具有三個間插氨基酸。在趨化因子中該分子是獨特的，因為它是跨膜蛋白，所述跨膜蛋白的N末端趨化因子結構域與粘蛋白樣長柄融合。CX3C趨化因子受體稱為CX3CR1。
VEGF本發(fā)明也可用于血管內皮生長因子(VEGF)。血管生成是新血管從現(xiàn)有血管系統(tǒng)發(fā)育的過程。它在胚胎發(fā)育、正常的組織生長、創(chuàng)傷愈合、雌性生殖周期(即排卵、月經(jīng)和胎盤發(fā)育)中起必要作用，也在許多疾病中起主要作用。具體目標集中在癌癥上，因為如果沒有新的血液供給，腫瘤生長的大小不可能超過幾毫米。血管生成也是腫瘤細胞轉移的擴散和生長所必需的。
一個最重要的內皮生長和存活因子是VEGF。VEGF誘導血管生成和內皮細胞增殖，而且在調節(jié)血管生成中起重要作用。VEGF是以45kDa的同源二聚體分泌的一種肝素結合糖蛋白。大多數(shù)細胞類型，但通常不是內皮細胞本身，分泌VEGF。因為最初發(fā)現(xiàn)的VEGF(VEGF-A)增加血管通透性，所以稱為血管通透因子。另外，VEGF部分通過刺激內皮細胞中的一氧化氮合酶，引起血管舒張。VEGF也可刺激細胞遷移和抑制細胞凋亡。VEGF-A有幾種剪接變異體。主要的包括121個、165個、189個和206個氨基酸，每種包含添加的一個特異性外顯子。
EMAP II內皮-單核細胞活化多肽-II(EMAP-II)是一種細胞因子，是腫瘤血管發(fā)育中的抗血管生成因子，強烈抑制腫瘤生長。重組人EMAP-II是一個含有166個氨基酸殘基的18.3kDa蛋白。也發(fā)現(xiàn)EMAP II能增加內皮血管通透性。
PDGF也已經(jīng)提出血小板衍生生長因子(PDGF)拮抗劑可以在普通實體瘤中增加多種抗腫瘤藥的藥物攝入和療效。PDGF是一種30kDA的細胞因子，受傷時由血小板釋放，刺激鄰近細胞生長并修復傷口。
PD-ECGF正如其名稱所示，血小板衍生內皮細胞生長因子(PD-ECGF)首先是根據(jù)其在內皮細胞中誘導有絲分裂的能力從血小板中分離的。其相關蛋白是膠質抑制素。
靶向部分我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，細胞因子的治療指數(shù)可以通過使細胞因子靶向腫瘤血管的歸巢(homing)而增加。另外，因為已知腫瘤細胞能形成腫瘤血管內襯組成部分，本發(fā)明包括直接靶向腫瘤細胞和它的血管。對于任何常見腫瘤或腫瘤血管，尤其是內皮細胞，靶向部分可以用于本發(fā)明的綴合物。已知許多這樣的靶向部分，它們和以后會成為可利用的任何部分都包括在本發(fā)明的范圍內。在一個實施方案中，所述靶向部分是腫瘤細胞表達的受體的結合配偶體(例如配體)，或者是腫瘤細胞相關性標記或胞外基質組分的結合配偶體(例如抗體)。更具體地講，所述靶向部分是腫瘤相關血管表達的受體的結合配偶體(例如配體)，或者是血管生成血管相關性內皮標記或胞外基質組分的結合配偶體(例如抗體)。本文所用的術語結合配偶體是廣義的，包括天然結合結構域和合成結合結構域，包括配體和抗體或其結合片段。因此，所述結合配偶體可以是能夠結合所述受體、細胞胞外組分標記的抗體或其片段，例如Fab、Fv、單鏈Fv、肽或肽模擬分子(稱為肽樣分子)。
可以使所述綴合物定向的合適靶向結構域和受體/標記的非限制性實例如下CD13已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可以通過將某些細胞因子與氨肽酶-N受體(CD13)的配體偶聯(lián)，顯著改進其治療指數(shù)，增強其免疫治療特征。CD13是150kDa的跨膜糖蛋白，在不同的物種中高度保守。它在正常細胞以及骨髓腫瘤細胞系、血管生成內皮和某些上皮細胞表面表達。CD13受體通常鑒定為“NGR”受體，因為其肽配體共享氨基酸“NGR”基序。所述配體最好是包含NGR基序的直鏈或環(huán)狀肽，例如CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、環(huán)狀CVLNGRMEC或環(huán)狀CNGRC，或者更優(yōu)選CNGRC肽。更多細節(jié)可以在我們的WO01/61017中找到，所述專利文獻通過引用結合到本文中。
TNF受體和TNF超家族的成員一樣，TNF受體超家族(TNFRSF)成員也共享大量共同特征。尤其是，TNFRSF中的分子都是I型(N末端胞外)跨膜糖蛋白，在其胞外結構域中含有1-6種配體結合的、40個氨基酸殘基的富含半胱氨酸基序。另外，功能性TNFRSF成員通常是通過內部半胱氨酸二硫鍵穩(wěn)定的三聚體或多聚體復合物。與大多數(shù)TNFSF成員不同，TNFRSF成員以膜結合形式和可溶性形式存在。最終，雖然所述超家族成員的胞質結構域中氨基酸序列同源性不超過25％，但許多受體能夠在各種細胞中轉導細胞凋亡信號，這表明具有相同功能。
CD40CD40是50kDa的277個氨基酸殘基的跨膜糖蛋白，大多數(shù)通常與B細胞增殖和分化相關。人CD40的cDNA在各種細胞類型中表達，編碼20個氨基酸殘基的信號序列、173個氨基酸殘基的胞外區(qū)、22個氨基酸殘基跨膜區(qū)段和62個氨基酸殘基的胞質結構域。在其胞外區(qū)有四個富含半胱氨酸的基序，伴隨有富含絲氨酸和蘇氨酸的近膜序列。已知表達CD40的細胞包括內皮細胞。
TNFRI/p55/CD120aTNFRI是55kDa的455個氨基酸殘基的跨膜糖蛋白，顯然由所有有核哺乳動物細胞表達。所述分子具有190個氨基酸殘基的胞外區(qū)、25個氨基酸殘基的跨膜區(qū)段和220個氨基酸殘基的胞質結構域。TNF-α和TNF-β兩者結合TNFRI。在眾多細胞中，已知表達TNFRI的是內皮細胞。
TNFRII/p75/CD120b人TNFRII是75kDa的461個氨基酸殘基的跨膜糖蛋白，首先是從人肺成纖維細胞文庫中分離出來。該受體由240個氨基酸殘基的胞外區(qū)、27個氨基酸殘基的跨膜區(qū)段和173個氨基酸殘基的胞質結構域組成。已鑒定出TNFRII的可溶性形式，顯然是由稱為TRRE(TNF-受體釋放酶)的金屬蛋白酶進行蛋白水解切割而產生。脫落過程似乎獨立于可溶性TNFRI。在眾多細胞中，已知表達TNFRII的是內皮細胞。
CD134L/OX40LOX40是OX40L的受體，是有限表達的T細胞活化標記，似乎促進炎癥部位的CD4+T細胞存活(以及可能延長免疫反應)。OX40L也顯示出有限表達。目前，僅報道了活化CD4+、CD8+T細胞、B細胞和血管內皮細胞表達該因子。所述人配體是32kDa的183個氨基酸殘基的糖基化多肽，所述多肽由21個氨基酸殘基的胞質結構域、23個氨基酸殘基的跨膜區(qū)段和139個氨基酸殘基胞外區(qū)組成。
VEGF受體家族在VEGF受體家族中有三種受體。它們的共同特征是多種IgG樣胞外結構域和酪氨酸激酶活性。VEGF受體1(VEGF R1，也稱為Flt-1)、VEGF R2(也稱為KDR或Flk-1)和VEGF R3(也稱為Flt-4)的酶結構域是根據(jù)插入序列來分類。內皮細胞也表達額外的VEGF受體、神經(jīng)氈蛋白-1(Neuropilin-1)和神經(jīng)氈蛋白-2。VEGF-A結合VEGFR1和VEGF R2并結合神經(jīng)氈蛋白-1和神經(jīng)氈蛋白-2。PIGF和VEGF-B結合VEGF R1和神經(jīng)氈蛋白-1。VEGF-C和VEGF-D結合VEGF R3和VEGF R2。已發(fā)現(xiàn)HIV-tat和由它衍生的肽也靶向VEGFR。
PDGF受體PDGF受體在大多數(shù)常見實體瘤的基質區(qū)室中表達。在大鼠結腸癌模型中基質表達PDGF受體的抑制，降低腫瘤間質流體壓力并增加腫瘤跨毛細血管運輸。
PSMA前列腺特異性膜抗原(PSMA)也是良好的腫瘤內皮標記，可以產生PSMA抗體。
細胞粘著分子(CAM)細胞粘著分子(CAM)是細胞表面蛋白，所述蛋白涉及細胞(通常是白細胞)彼此結合、與內皮細胞結合或與胞外基質結合。響應傷口和感染產生的特異性信號控制某些這樣的粘著分子的表達和活化。然后通過將這些CAM與其受體/配體結合引發(fā)的相互作用和響應，在炎癥反應和免疫反應的介導中起重要作用，構成機體抵抗損傷的一道防線。迄今為止，大多數(shù)CAM的特征在于分為三大蛋白家族免疫球蛋白(Ig)超家族、整聯(lián)蛋白家族或選擇蛋白家族。
細胞表面分子的一個選擇蛋白家族成員是L-選擇蛋白，由一個NH2-末端C型凝集素結構域、一個EGF樣結構域、兩個補體控制結構域、一個15個氨基酸殘基間隔區(qū)、一個跨膜序列和一個短的胞質結構域組成。
已經(jīng)鑒別了內皮細胞表面L-選擇蛋白的三種配體，全都含有O-糖基化粘蛋白或粘蛋白樣結構域。第一種配體GlyCAM-1，幾乎是專門在外周淋巴結和腸系膜淋巴結毛細血管后微靜脈內表達。第二種L-選擇蛋白的配體起初稱為sgp90，現(xiàn)在認為是CD34。該唾液粘蛋白樣糖蛋白經(jīng)常作為用于純化多能干細胞的表面標記，所述蛋白顯示在各種不同的非淋巴組織中、以及在外周淋巴結的毛細血管內的血管表達。L-選擇蛋白的第三種配體是MadCAM 1，是在粘膜淋巴結毛細血管后微靜脈上存在的粘蛋白樣糖蛋白。
P-選擇蛋白是細胞表面分子的選擇蛋白家族成員，由一個NH2-末端C型凝集素結構域、一個EGF樣結構域、一個九個補體控制結構域、一個跨膜結構域和一個短的胞質結構域組成。
已經(jīng)鑒定出四糖唾液酸路易斯糖(sLex)是P-選擇蛋白和E-選擇蛋白的配體，但是在合適條件下，P-選擇蛋白、E-選擇蛋白和L-選擇蛋白都可結合sLex和sLea。據(jù)報道P-選擇蛋白也選擇性結合鼠骨髓細胞表面存在的160kDa糖蛋白和骨髓細胞、血嗜中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞表面的糖蛋白，所述糖蛋白稱為P-選擇蛋白糖蛋白配體-1(PSGL-1)，是一種也可結合E-選擇蛋白的配體。可以通過對PSLG-1特異性單克隆抗體完全抑制P-選擇蛋白-介導的白細胞滾動，這表明即使P-選擇蛋白在體外條件下能結合各種糖蛋白，但是生理學上重要的結合可能更受限制。大量證據(jù)表明P-選擇蛋白參與了骨髓細胞以及B細胞和T細胞亞群對活化內皮的粘著。
Ig超家族CAMIg超家族CAM是不依賴鈣的跨膜糖蛋白。Ig超家族成員包括胞間粘著分子(ICAM)、血管細胞粘著分子(VCAM-1)、血小板-內皮細胞粘著分子(PECAM-1)和神經(jīng)細胞粘著分子(NCAM)。每種Ig超家族CAM都具有胞外結構域，所述胞外結構域含有與保守半胱氨酸殘基鍵合的幾個Ig樣鏈內二硫鍵環(huán)、跨膜結構域和與細胞骨架相互作用的胞內結構域。通常，它們結合整聯(lián)蛋白或其它Ig超家族CAM。神經(jīng)元CAM參與神經(jīng)元圖式發(fā)育。內皮CAM在免疫反應和炎癥中起重要作用。
更具體地講，血管細胞粘著分子(VCAM-1、CD106或INCAM-110)、血小板內皮細胞粘著分子(PECAM-1/CD31)和胞間粘著分子1、胞間粘著分子2和胞間粘著分子3(ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3)是5種功能相關的CAM/IgSF分子，它們關鍵性地參與了白細胞-結締組織/內皮細胞的相互作用。這些分子主要在內皮細胞表面表達，通常，這些分子調節(jié)白細胞跨越血管壁的遷移并在血管生成期間為發(fā)育中內皮提供附著點，而且全都適合用于本發(fā)明的尋靶。
人CD31是130kDa的I型(胞外N末端)跨膜糖蛋白，屬于細胞粘著分子(CAM)或IgSF1的C2樣亞組。所述成熟分子長度為711個氨基酸殘基，含有574個氨基酸殘基的胞外區(qū)、19個氨基酸殘基的跨膜區(qū)段和118個氨基酸殘基的胞質尾。在所述胞外區(qū)，有9個潛在的N-聯(lián)糖基化位點，而且，因為預測分子量是80kDa，這些位點中許多似乎被占據(jù)。所述胞外區(qū)的最顯著特征是存在類似IgSF的C2結構域的6個Ig-同源單位。雖然它們在數(shù)量上不同，這些組件的存在是所有IgSF粘著分子(ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3和VCAM-1)的共同特征。
整聯(lián)蛋白整聯(lián)蛋白是由α亞基和β亞基非共價連接的異源二聚體。迄今為止，已經(jīng)鑒定出16種α亞基和8種β亞基。它們可以以不同方式組合，形成不同類型的整聯(lián)蛋白受體。幾種整聯(lián)蛋白的配體是粘著胞外基質(ECM)蛋白，例如纖連蛋白、玻連蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白。許多整聯(lián)蛋白識別氨基酸序列RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)，所述序列存在于它們所結合的纖連蛋白或其它粘著蛋白上。含有RGD序列的肽和蛋白片段可以用于調節(jié)識別RGD的整聯(lián)蛋白的活性。因此，本發(fā)明可以用作由整聯(lián)蛋白識別的靶向部分肽。這些肽通常稱為“含RGD的肽”。這些肽可包括已鑒定為與整聯(lián)蛋白結合的肽基序。這些基序包括以下氨基酸序列DGR、NGR和CRGDC。所述肽基序可以是線狀或環(huán)狀。所述基序在以下專利(其通過引用結合到本文中)中有更詳細描述，所述專利文獻中有關于RGD肽的描述美國專利5,536,814描述了環(huán)化CRGDCL、CRGDCA和GACRGDCLGA。美國專利4,578,079涉及式X-RGD-T/C-Y的合成肽，其中X和Y是氨基酸。美國專利5,547,936描述了包含序列X-RGD-XX的肽，其中X可以是氨基酸。美國專利4,988,621描述了大量含RGD的肽。美國專利4,879,237描述式RGD-Y的通用的肽(其中Y是氨基酸)和肽G-RGD-AP。美國專利5,169,930描述了結合αvβ1整聯(lián)蛋白的肽RGDSPK。美國專利5,498,694和5,700,908涉及β3整聯(lián)蛋白亞基的胞質結構域，嚴格地講，所述蛋白不是含RGD的肽；雖然它確實含有RDG序列。WO 97/08203描述了環(huán)肽，所述環(huán)肽是結構模擬物或RGD結合位點。美國專利5,612,311描述了15種含有RGD的肽，所述肽能夠通過C-C鍵或通過其它基團(例如青霉胺或巰基丙酸類似物)而環(huán)化。美國專利5,672,585描述了包括含RGD肽的通式。一組優(yōu)選的肽是其中RGD的天冬氨酸殘基衍生為O-甲氧基酪氨酸衍生物的肽。美國專利5,120,829描述了RGD細胞附著促進結合位點和疏水性附著結構域。D型描述于美國專利5,587,456。美國專利5,648,330描述了對GP Iib/IIIa具有高親和力的含RGD的環(huán)肽。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述靶向部分是αvβ3整聯(lián)蛋白或αvβ5整聯(lián)蛋白的配體。
活化素已知表達ActRII的細胞包括內皮細胞。ActRIIB的表達平行于ActRII的表達，在內皮細胞中也觀察到這種現(xiàn)象。已知表達ActRI的細胞包括血管內皮細胞。已經(jīng)在內皮細胞中鑒定出ActRIB。
血管生成素血管生成素(ANG)是14kDa的非糖基化多肽，因其誘導新血管生長的能力而得名。
膜聯(lián)蛋白V膜聯(lián)蛋白V是結合鈣和磷脂、并具有血管抗凝活性的蛋白家族成員。膜聯(lián)蛋白V的各種同義詞包括胎盤蛋白4(PP4)、胎盤抗凝蛋白I(PAP I)、鈣磷脂結合蛋白I(CPB-I)、鈣依賴性磷脂結合蛋白33(CaBP33)、血管抗凝蛋白α(VACa)、錨定蛋白CII、脂皮質蛋白-V、內聯(lián)蛋白II和織促凝血酶原激酶抑制劑。據(jù)報道，膜聯(lián)蛋白V結合位點的數(shù)量在腫瘤細胞中是6-24×106/細胞，在內皮細胞中是8.8×106/細胞。
CD44另一個顯然參與白細胞粘著事件的分子是CD44，所述分子在造血細胞和非造血細胞中廣泛表達。值得注意的是CD44產生可變剪接形式的能力，許多所述可變剪接形式的活性不同。這一顯著的靈活性使人們猜測CD44通過其變化特征，在某種方式中起作用，而腫瘤采用所述方式通過生長和轉移而成功發(fā)展。CD44是80-250kDa的I型(胞外N末端)跨膜糖蛋白。已知表達CD44H的細胞包括血管內皮細胞。
有許多CD44的配體，包括骨橋蛋白、纖連蛋白、I型膠原蛋白和IV型膠原蛋白和透明質酸。據(jù)報道，纖連蛋白的結合僅限于表達硫酸軟骨素的CD44變異體，其硫酸軟骨素附著位點位于外顯子v8-v11上。據(jù)認為透明質酸的結合實際上對于所有CD44同種型都可能。據(jù)認為一個主要的結合位點集中在外顯子2上并涉及賴氨酸和精氨酸殘基。除了已知的透明質酸結合基序的簡單表達以外，似乎還需要其它因子用于透明質酸結合。外顯子表達、特殊胞質尾、糖基化模式和所述細胞的活性狀態(tài)共同促使了透明質酸的成功結合。因此，根據(jù)其透明質酸結合功能，每種CD44表達細胞中存在大量“潛在的”靈活性。
成纖維細胞生長因子(FGF)術語“成纖維細胞生長因子”(FGF)對于該家族的細胞因子來說是局限性描述。FGF的功能不限于細胞生長。雖然某些FGF確實能誘導成纖維細胞增殖，但起初的FGF分子(FGF-2或堿性FGF)現(xiàn)在已知也誘導內皮細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞、黑素細胞及其它細胞的增殖。它也促進脂肪細胞分化、誘導巨噬細胞和成纖維細胞產生IL-6、刺激星形膠質細胞遷移以及延長神經(jīng)細胞存活。迄今為止，F(xiàn)GF超家族由23個成員組成，它們全都含有保守120個氨基酸核心區(qū)，所述區(qū)含有6個相同的散在氨基酸。
FGF-1人FGF-1(也稱為酸性FGF、FGFa、ECGF和HBGF-1)是17-18kDa的非糖基化多肽，所述多肽由來自所有三個胚層的各種細胞表達。結合分子也可以是FGF受體。已知表達FGF-1的細胞包括內皮細胞。
FGF-2人FGF-2(也稱為堿性FGF、HBGF-2和EDGF)是18kDa的非糖基化多肽，所述多肽顯示胞內和胞外活性。分泌后，F(xiàn)GF-2匯集在細胞表面HS或基質糖胺聚糖上。雖然FGF-2是以單體分泌的，但是細胞表面HS似乎以非共價的邊對邊構型將單體FGF-2二聚體化，所述構型隨后能夠將FGF受體二聚體化并激活。已知表達FGF-2的細胞包括內皮細胞。
FGF-3人FGF-3是int-2基因[即衍生自整合區(qū)-2，所述整合區(qū)在小鼠7號染色體上，含有一個在逆轉錄病毒插入后偶然被激活的基因(int-2/FGF-3)]的產物。所述分子合成時是28-32kDa的222個氨基酸糖蛋白，含有大量肽基序。據(jù)報道，表達FGF-3的細胞限于發(fā)育細胞和腫瘤。已知表達FGF-3的腫瘤包括乳腺癌細胞系和結腸癌細胞系。
FGF-4人FGF-4是22kDa的176個氨基酸糖蛋白，是發(fā)育調控基因產物。所述分子合成時是206個氨基酸前體，所述前體含有一個大的未定義的30個氨基酸信號序列以及兩個肝素結合基序(氨基酸51-55和140-143)。肝素結合位點直接涉及FGF-4活性；肝素/類肝素調節(jié)FGF-4激活FGFR1和FGFR2的能力。已知表達FGF-4的細胞包括腫瘤細胞和胚胎細胞。它在人胃癌中的鑒定中得到了另外的名稱(/hst-1/hst)，而它在卡波西肉瘤的分離中提供了另一個名稱的基礎(K-FGF)。
IL-1RIL-1通過結合特異性受體而發(fā)揮其作用。已經(jīng)鑒定出兩種不同的IL-1受體結合蛋白，以及非結合信號輔助蛋白。每種蛋白具有三個胞外免疫球蛋白樣(Ig樣)結構域，證明它們是IV型細胞因子受體家族成員。這兩個受體結合蛋白分別稱為I型IL-1受體(IL-1 RI)和II型IL-1受體(IL-1 RII)。人IL-1 RI是552個氨基酸的80kDa跨膜糖蛋白，所述蛋白已經(jīng)從內皮細胞中分離出來。
RTK已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了受體酪氨酸激酶(RTK)的新家族Eph受體和它們的配體肝配蛋白涉及血管裝配、血管生成、腫瘤生成和轉移。在腫瘤和相關血管中A類Eph受體和它們的配體也升高。
MMP已經(jīng)認為基質金屬蛋白酶(MMP)涉及腫瘤生長、血管生成、侵襲和轉移。也已認為將它們用作腫瘤標記。
NG2NG2是大的膜內在硫酸軟骨素蛋白聚糖，首先鑒定為由未成熟神經(jīng)細胞表達的細胞表面分子。以后發(fā)現(xiàn)NG2由各種未成熟細胞以及幾種類型的高度惡性腫瘤細胞表達。已認為NG2作為腫瘤血管的靶分子。具體地講，膠原蛋白酶-1(C1)是存在于新形成的微血管中主要的基質金屬蛋白酶，作為新血管形成的標記。
癌胚纖連蛋白也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在血管生成期間癌胚纖連蛋白(Fn-f)片段表達增加，表明是作為腫瘤血管生成標記。在一個實施方案中，所述TTM是癌胚纖連蛋白ED-B結構域的抗體或其片段。所述抗體及其與IL-12的綴合物的制備方法描述于Halin等(2002)Nature Biotechnology20264-269。
腱生蛋白腱生蛋白是在惡性腫瘤(包括腦瘤和乳腺癌和黑素瘤)中觀察到的基質糖蛋白。它的表達是惡性但是未完全分化的腫瘤，與腫瘤血管的結合使之成為了解惡性腫瘤和血管生成生物學的重要的靶，也是治療癌癥的靶和標記。
所述靶向部分優(yōu)選能夠結合腫瘤細胞或腫瘤血管表面分子的多肽。和以上提及一樣，其它已知的或可利用的所述表面分子也可由所述第一序列靶向。
人們將會認識到，可以采用常規(guī)蛋白結合實驗來鑒定與表面分子結合的分子。人們也將認識到，可以采用基于結構的藥物設計來開發(fā)與表面分子結合的序列。
如上所述的用于合成化合物的高通量篩選，也可用于鑒定靶向分子。
本發(fā)明也考慮采用競爭性藥物篩選實驗，其中能夠結合靶的中和抗體與試驗化合物特異性競爭與靶結合。
結合配偶體(BP)靶向部分一般表現(xiàn)為表面分子結合配偶體(BP)的形式，所述表面分子包含一個或多個結構域，或由一個或多個結構域組成。
配體本發(fā)明的靶向部分可以表現(xiàn)為配體的形式。所述配體可以是天然的或合成的。術語“配體”也指經(jīng)化學修飾的配體。BP的一個或多個結合結構域可以由例如受體的天然配體或天然配體片段組成，其中所述天然配體可以是粘著分子或生長因子受體配體(例如表皮生長因子)，所述天然配體及其片段保持了對所述受體的結合親和力。
合成配體包括設計配體。本文所用的術語“設計配體”是指根據(jù)它們的三維形狀與所述受體的三維形狀比較可能結合所述受體的試劑。
抗體一方面，結合結構域可以來自免疫球蛋白(Ig)可變區(qū)的重鏈和輕鏈序列。所述可變區(qū)可以來自天然人抗體或其它物種的抗體，例如嚙齒動物的抗體?；蛘撸隹勺儏^(qū)可以來自工程抗體(例如人源化抗體)、或來自免疫動物或未免疫動物的噬菌體展示文庫或來自經(jīng)誘變的噬菌體展示文庫。另一方面，所述可變區(qū)可以來自單鏈可變片段(scFv)。所述BP可以含有其它序列以達到多聚化或作為結合結構域之間的間隔區(qū)，或者是在編碼所述BP的基因中的限制性位點上插入產生的其它序列，所述序列包括Ig鉸鏈序列或新的間隔區(qū)和工程接頭序列。
除了一個或多個免疫球蛋白可變區(qū)外，所述BP可以包含Ig重鏈恒定區(qū)的全部或部分，這樣就可包含天然的完整Ig、工程Ig、工程Ig樣分子、單鏈Ig分子或單鏈Ig樣分子?；蛘?，或另外，所述BP可含有一個或多個來自其它蛋白的結構域，所述蛋白例如毒素。
本文所用的“抗體”是指由一個或多個多肽組成的蛋白，所述多肽基本由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼?？贵w可以完整的免疫球蛋白形式存在或以大量片段形式存在，所述片段包括通過用各種肽酶消化產生的已充分表征的片段。雖然各種抗體片段根據(jù)完整抗體消化而定義，但是技術人員會了解到抗體片段可以經(jīng)化學方法或采用重組DNA方法從頭合成。因此，本文所用的術語抗體也包括由完整抗體修飾而產生的抗體片段，或者采用重組DNA方法從頭合成而產生的抗體片段。使用術語“抗體”包含的抗體片段包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、Fv、dsFv雙功能抗體(diabody)和Fd片段。
本發(fā)明也提供針對所述表面蛋白的單克隆抗體或多克隆抗體。因此，本發(fā)明也提供用于制備針對本發(fā)明多肽的單克隆抗體或多克隆抗體的方法。
如果需要多克隆抗體，用帶有表位的免疫原性多肽免疫所選哺乳動物(例如小鼠、兔、山羊、馬等)。按照已知方法采集和加工免疫動物血清。如果含針對一種表位的多克隆抗體的血清含有針對其它抗原的抗體，則可以通過免疫親和層析純化所述多克隆抗體。生產和加工多克隆抗血清的技術是本領域已知的。為了能生產所述抗體，本發(fā)明也提供針半抗原化到另一多肽的、用作動物或人的免疫原的本發(fā)明多肽或其片段。
也可以由本領域技術人員容易地制備針對所述多肽中結合細胞表面表位的單克隆抗體。通過雜交瘤制備單克隆抗體的通用方法是眾所周知的。可以通過細胞融合和其它技術產生無限增殖抗體產生細胞系，所述技術例如用致癌DNA直接轉化B淋巴細胞，或用Epstein-Barr病毒轉染。多組針對表位生產的單克隆抗體可以根據(jù)不同特征(即同種型和表位親和力)進行篩選。
一個可選技術涉及篩選噬菌體展示文庫，其中例如噬菌體在其衣殼表面表達scFv片段以及各種互補性決定區(qū)(CDR)。該項技術是本領域眾所周知的。
為了本發(fā)明的目的，除非特別指出，術語“抗體”包括保持其結合靶抗原活性的完整抗體的片段。如上所述，所述片段包括Fv、F(ab′)和F(ab′)2片段，而術語“抗體”包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、Fv、dsFv雙功能抗體和Fd片段。
本發(fā)明也提供針對所述表面蛋白的單克隆抗體或多克隆抗體。因此，本發(fā)明還提供用于制備針對本發(fā)明多肽的單克隆抗體或多克隆抗體的方法。
如果需要多克隆抗體，用帶有表位的免疫原性多肽免疫所選哺乳動物(例如小鼠、兔、山羊、馬等)。按照已知方法，采集和加工來自免疫動物的血清。如果含針對表位的多克隆抗體的血清含有針對其它抗原的抗體，則可以通過免疫親和層析純化所述多克隆抗體。生產和加工多克隆抗血清的技術是本領域已知的。為了能生產所述抗體，本發(fā)明也提供針半抗原化到另一多肽的、用作動物或人的免疫原的本發(fā)明多肽或其片段。
也可以由本領域技術人員容易地制備針對所述多肽中結合細胞表面表位的單克隆抗體。通過雜交瘤制備單克隆抗體的通用方法是眾所周知的。可以通過細胞融合和其它技術產生無限增殖抗體產生細胞系，所述技術例如用致癌DNA直接轉化B淋巴細胞，或用Epstein-Barr病毒轉染。多組針對表位生產的單克隆抗體可以根據(jù)不同特征(即同種型和表位親和力)進行篩選。
一個可選技術涉及篩選噬菌體展示文庫，其中例如噬菌體在其衣殼表面表達scFv片段以及各種互補性決定區(qū)(CDR)。該項技術是本領域眾所周知的。
為了本發(fā)明的目的，除非特別指出，術語“抗體”包括保持其結合靶抗原活性的完整抗體的片段。如上所述，所述片段包括Fv、F(ab′)和F(ab′)2片段以及單鏈抗體(scFv)。此外，所述抗體及其片段可以是人源化抗體，例如EP-A-239400中所述。
篩選一方面，本發(fā)明涉及篩選能夠結合腫瘤或腫瘤血管細胞表面分子的試劑的方法，所述方法包括使所述細胞表面分子與試劑接觸并確定所述試劑是否結合所述細胞表面分子。
本文所用的術語“試劑”包括但不限于化合物，例如試驗化合物，所述試驗化合物可以得自或產自任何合適來源，無論是否是天然的。所述試劑可以進行設計或得自化合物文庫，所述化合物文庫可包含肽及其它化合物例如有機小分子、尤其是新型前導化合物。作為實例，所述試劑可以是天然物質、生物大分子或生物材料(例如細菌、真菌或動物(尤其是哺乳動物)細胞或組織)的提取物、有機分子或無機分子、合成試驗化合物、半合成試驗化合物、結構或功能模擬物、肽、肽模擬物、衍生化試驗化合物、由完整蛋白切割而來的肽或合成的肽(例如作為實例，可采用肽合成儀)或通過重組技術合成的肽或它們的組合、重組試驗化合物、天然或非天然試驗化合物、融合蛋白或其等同物和突變體、衍生物或它們的組合。
所述試劑可以是氨基酸序列或其化學衍生物。所述物質甚至可以是有機化合物或其它化學物。所述試劑甚至可以是核苷酸序列，所述核苷酸序列可以是有義序列或反義序列。
蛋白術語“蛋白”包括單鏈多肽分子以及多種多肽復合物，所述多肽復合物中各個組分多肽以共價或非共價方式連接。術語“多肽”包括長度為兩個或更多個氨基酸的肽，典型的多肽具有5個、10個或20個以上氨基酸。
多肽同源物人們知道，用于本發(fā)明的多肽序列不限于具體序列或其片段，也包括得自任何來源的同源序列，所述來源例如相關病毒/細菌蛋白、細胞同源物和合成肽、及其變異體或衍生物。本發(fā)明的多肽序列也包括由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽。
多肽變異體、衍生物和片段涉及本發(fā)明的氨基酸序列的術語“變異體”或“衍生物”包括對所述序列或來自該序列的一個(或多個)氨基酸的任何取代、變異、修飾、置換、缺失或添加，條件是得到的氨基酸序列最好具有靶向活性、優(yōu)選具有序列表所示多肽的至少25-50％的活性、更優(yōu)選具有至少基本相同的活性。
因此，序列可以經(jīng)修飾用于本發(fā)明。通常，只要保持所述序列的活性，就可以進行修飾。因此，在一個實施方案中，可以進行氨基酸取代，例如從1個、2個或3個到10個、20個或30個取代，條件是經(jīng)修飾序列保持至少約25-50％的活性、或基本相同的活性。然而，在一個可選實施方案中，可以有意修飾本發(fā)明多肽的氨基酸序列，以降低所述多肽的生物學活性。例如可以使用保持結合靶分子的能力但失去功能性效應物結構域的截短的多肽。
一般而言，與序列表所示的相應區(qū)比較，變異體或衍生物的氨基酸殘基的改變最好小于20％、10％或5％。
氨基酸取代可以包括使用非天然存在的類似物，例如以增加治療性給予多肽的血漿半壽期(更多細節(jié)參見以下用于治療的肽衍生物生產)。
可以例如按照下表進行保守取代。在第2列同一格的氨基酸可以相互取代，優(yōu)選在第3列的同一行氨基酸可以相互取代
本發(fā)明的多肽也包括上述多肽及其變異體的片段、包括所述序列的片段。優(yōu)選的片段包括含表位的片段。合適的片段長度至少約5個氨基酸，例如10個、12個、15個或20個氨基酸。它們的長度也可以小于200個、100個或50個氨基酸。所述蛋白和等位基因及其種屬變異體的多肽片段可以含有一個或多個(例如2個、3個、5個或10個)取代、缺失或插入，包括保守取代。當通過例如重組技術的方式，進行取代、缺失和/或插入時，優(yōu)選序列表所示氨基酸殘基的改變小于20％、10％或5％。
本發(fā)明的蛋白一般通過如下所述的重組技術進行制備。然而，也可以采用技術人員熟知方法例如固相合成，通過合成而制備它們。用于化學合成肽的各種技術有關綜述參見Borgia和Fields，2000，TibTech 18243-251并詳細描述于其中包含的參考文獻中。
治療肽本發(fā)明的肽可以治療性給予患者。最好使用不僅由天然存在的氨基酸組成的肽、而且由對所述天然存在的氨基酸進行了修飾的肽組成的肽，所述修飾例如降低免疫原性、延長在患者體內的循環(huán)半壽期、提高生物利用度和/或增強功效和/或特異性。
已經(jīng)使用了多種方法來修飾用于治療應用的肽。一種方法是將所述肽或蛋白連接在各種聚合物上，所述聚合物例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，參見例如美國專利第5,091,176號、第5,214,131號和美國專利5,264,209。
也可以用各種非編碼氨基酸或經(jīng)修飾氨基酸(例如D-氨基酸和N-甲基氨基酸)取代天然存在的氨基酸，用于修飾肽。
另一種方法是使用雙功能交聯(lián)劑，例如N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯、琥珀酰亞胺基6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺基]己酸酯和硫代琥珀酰亞胺基6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺基]己酸酯(參見美國專利5,580,853)。
最好使用本發(fā)明肽的衍生物，所述衍生物在構象上是受約束的。構象約束是指肽所呈現(xiàn)的三維形狀的穩(wěn)定性和優(yōu)選構象。構象約束包括局部約束、區(qū)域約束和總體約束，其中局部約束涉及限制肽內單個殘基的構象靈活性；區(qū)域約束涉及限制一組殘基的構象靈活性，所述殘基可形成一些二級結構單位；而總體約束涉及整個肽結構。
可以通過共價修飾(例如環(huán)化)或通過摻入γ-內酰胺或其它形式的鍵，來穩(wěn)定所述肽的活性構象。例如側鏈可以環(huán)化到主鏈上，使得在相互作用的每側上產生L-γ-內酰胺部分。一般參見Hruby等，″Applications of Synthetic Peptides，″Synthetic PeptidesA User′s Guide259-345(W.H.Freeman&Co.1992)。也可以通過例如形成半胱氨酸橋、末端氨基酸各自的氨基末端基團和羧基末端基團偶聯(lián)、或Lys殘基或相關同系物的氨基與Asp、Glu或相關同系物的羧基偶聯(lián)，達到環(huán)化。人們也可以理解，使用碘代乙酸酐將多肽α-氨基與賴氨酸殘基的ε-氨基偶聯(lián)。參見Wood和Wetzel，1992，Int′l J.Peptide Protein Res.39533-39。
描述于美國專利5,891,418的另一種方法包括所述肽結構中金屬離子配位主鏈。所述優(yōu)選的金屬-肽主鏈一般是基于一個給定的金屬配離子的配位層所需的特定配位基的必需數(shù)目。一般而言，大多數(shù)可證明是有用的金屬離子具有4-6個配位數(shù)。所述肽鏈中配位基的種類包括胺、酰胺、咪唑或胍基官能團的氮原子；硫醇或二硫化物的硫原子；以及羥基、酚基、羰基或羧基官能團的氧原子。另外，可以使所述肽鏈或單個氨基酸發(fā)生化學變化，使之包含配位基，例如肟基、肼基、硫氫基、磷酸酯基、氰基、吡啶子基、哌啶子基或嗎啉代。所述肽構建體可以是線狀或環(huán)狀，然而，通常最好是線狀構建體。線狀小肽的一個實例是Gly-Gly-Gly-Gly，在其主鏈中具有4個氮(N4配位系統(tǒng))，可以與4個配位數(shù)的金屬離子配位。
改進治療肽特征的另一個技術是使用非肽的肽模擬物。可以采用各種有用技術闡明肽的精細結構。這些技術包括氨基酸測序、x射線晶體學、質譜法、核磁共振波譜法、計算機輔助分子建模、肽作圖和它們的組合。肽的結構分析一般提供大量數(shù)據(jù)，其中包含所述肽的氨基酸序列及其原子組成的三維位置。根據(jù)這些信息，可以設計出具有治療活性所需化學官能團、但是更穩(wěn)定(例如對生物性降解敏感性降低)的非肽的肽模擬物。在美國專利5,811,512中提供了該方法的實例。
化學合成本發(fā)明治療肽的技術描述于以上參考文獻中，有關綜述參見Borgia和Fields，2000，TibTech 18243-251并詳細描述于其中包含的參考文獻中。
雙功能衍生物雙功能衍生物提供本發(fā)明的又一個實施方案，所述雙功能衍生物中用TTM修飾的細胞因子與針對腫瘤抗原或其它腫瘤血管生成標記的抗體或其片段綴合、或者與針對胞外基質組分的抗體或其片段綴合，所述腫瘤抗原或腫瘤血管生成標記例如αv整聯(lián)蛋白、金屬蛋白酶或血管生長因子；所述胞外基質組分的抗體或其片段例如抗腱生蛋白的抗體或抗纖連蛋白的EDB結構域。近來，已報道TNF與針對由胃和卵巢腺癌表達的腫瘤相關TAG72抗原的mAb的鉸鏈區(qū)兩者間融合產物的制備方法。
用生物素/抗生物素蛋白系統(tǒng)的腫瘤預先靶向提供本發(fā)明的再一個實施方案。按照該方法，在所述腫瘤抗原位點上在不同階段得到三元復合物，所述復合物是由以下組分形成1)生物素化mAb，2)抗生物素蛋白(或鏈霉抗生物素)和3)用所述TTM和生物素修飾的二價細胞因子。大量文獻證明預先靶向方法，與用免疫綴合物的常規(guī)靶向相比，實際上可以增加靶上歸巢活性分子與游離活性分子的比率，因而降低了治療毒性。該方法用生物素化TNT產生良好結果，所述生物素化TNT能在體外誘導細胞毒性，而且在其中正常TNF失活條件下降低腫瘤細胞生長。也可以通過使用雙特異性抗體、用兩步法進行預先靶向方法，所述雙特異性抗體同時結合所述腫瘤抗原和經(jīng)修飾的細胞因子。最近，已經(jīng)描述了使用針對癌胚抗原和TNF的雙特異性抗體作用TNF腫瘤預先靶向工具。
按照另一個實施方案，本發(fā)明包括同時與TTM和抗體或其片段都綴合的細胞因子(直接或間接通過生物素-抗生物素蛋白橋連)，所述綴合是在不同的TNF亞基上，其中所述抗體或其片段是針對腫瘤細胞表達的抗原或腫瘤基質的其它組分例如腱生蛋白和纖連蛋白EDB結構域。這導致了所述修飾細胞因子腫瘤歸巢特性的進一步改進，并導致了后者通過三聚體-單體-三聚體轉換在腫瘤微環(huán)境中緩慢釋放。經(jīng)修飾的例如TNG綴合物的亞基可以從靶向復合物解聚和重聚合，以便形成未修飾的三聚體TNF分子，然后在腫瘤微環(huán)境中擴散。已經(jīng)顯示了生物活性TNF的釋放在靶向后24-48小時內發(fā)生。
脂質體形式的細胞因子制劑可以改進其生物學活性。事實上，已觀察到TNF氨基的?；T導其疏水性的增加，而不損失體外生物學活性。此外，已報道結合脂質的TNF不影響體外細胞毒性、免疫調節(jié)效應并降低體內毒性。
多核苷酸用于本發(fā)明的多核苷酸包含編碼本發(fā)明多肽綴合物的核酸序列。技術人員知道，由于遺傳密碼的簡并性，許多不同的多核苷酸可以編碼相同的多肽。另外，技術人員知道，可采用常規(guī)技術進行核苷酸取代，而不影響由本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽序列，反映出在其中表達本發(fā)明多肽的任何具體宿主生物的密碼子使用。
本發(fā)明的多核苷酸可包括DNA或RNA。它們可以是單鏈或雙鏈。它們也可以是其中包含合成核苷酸或修飾核苷酸的多核苷酸。對寡核苷酸的各種不同類型的修飾是本領域已知的。這些包括主鏈的甲基磷酸化和硫代磷酸化、插入吖啶或在所述分子的3′端和/或5′端的聚賴氨酸化。為了本發(fā)明的目的，人們知道，本文描述的多核苷酸可以通過本領域任何合適的方法進行修飾?？梢赃M行所述修飾，以提高本發(fā)明多核苷酸的體內活性或壽命。
核苷酸載體可以將本發(fā)明的多核苷酸加入到重組復制型載體中。所述載體可用于在相容性宿主細胞中復制所述核酸。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供制備本發(fā)明多核苷酸的方法，即通過將本發(fā)明的多核苷酸導入復制型載體中，將所述載體導入相容性宿主細胞中并讓所述宿主細胞在使所述載體復制的條件下生長?？梢詮乃鏊拗骷毎谢厥账鲚d體。合適的宿主細胞包括細菌(例如大腸桿菌(E.coli))、酵母、哺乳動物細胞系和其它真核細胞系，例如昆蟲Sf9細胞。
在載體中的本發(fā)明多核苷酸最好有效連接控制序列，所述控制序列能通過所述宿主細胞表達所述編碼序列，也就是說，所述載體是表達載體。術語“有效連接”是指所述組分的關系容許它們按其既定方式發(fā)揮作用。調節(jié)序列“有效連接”編碼序列，是以這樣的方式連接其連接方式在與控制序列相容的條件下實現(xiàn)所述編碼序列的表達。
可以通過例如加入其它轉錄調節(jié)元件修飾控制序列，使所述控制序列指導的轉錄水平更響應轉錄調節(jié)子。
如下所述，本發(fā)明的載體可以轉化或轉染到合適的宿主細胞中，以提供本發(fā)明蛋白的表達。該過程可包括在由編碼所述蛋白的編碼序列的載體進行表達的條件下，培養(yǎng)用如上所述的表達載體轉化的宿主細胞，任選回收所述表達蛋白。
所述載體可以是例如質粒載體或病毒載體，所述載體帶有復制起點，任選帶有表達所述多核苷酸的啟動子和任選所述啟動子的調節(jié)子。所述載體可包含一個或多個選擇標記基因，例如在細菌質粒的情況下是氨芐青霉素抗性基因，或者對哺乳動物載體是新霉素抗性基因。載體可以用于例如轉染或轉化宿主細胞。
有效連接本發(fā)明蛋白編碼序列的控制序列包括啟動子/增強子和其它表達調節(jié)信號。可以選擇與所述宿主細胞相容的這些控制序列，因為所述表達載體是設計用于所述宿主細胞的。術語“啟動子”是本領域眾所周知的，包含大小和復雜性范圍從最小的啟動子到包含上游元件和增強子的啟動子的核酸區(qū)。
所述啟動子一般選自在哺乳動物中有功能的啟動子，雖然可以使用原核啟動子和在其它真核細胞中有功能的啟動子。所述啟動子一般來自病毒基因或真核基因的啟動子序列。例如可以是來自在其中發(fā)生表達的細胞的基因組。至于真核啟動子，它們可以以普遍存在的方式起作用的啟動子(例如a-肌動蛋白、b-肌動蛋白、微管蛋白的啟動子)，或者以組織特異性方式起作用的啟動子(例如丙酮酸激酶基因的啟動子)。也可使用對某些細胞有特異性的組織特異性啟動子。它們也是響應特異性刺激的啟動子，例如結合類固醇激素受體的啟動子。也可使用病毒啟動子，例如莫洛尼氏鼠白血病病毒長末端重復序列(NMLV LTR)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子或人巨細胞病毒(CMV)IE啟動子。
所述啟動子最好也是誘導型的，使得在細胞生命周期中可以調節(jié)異源基因的表達水平。用所述啟動子得到的表達水平的誘導方式是可以調節(jié)的。
另外，可以通過插入其它調節(jié)序列(例如增強子序列)來修飾任何這樣的啟動子。也可以使用包含兩個或更多個不同的上述啟動子的序列元件的嵌合啟動子。
宿主細胞為了復制所述載體/多核苷酸和/或表達由本發(fā)明多核苷酸編碼的本發(fā)明蛋白，可以將本發(fā)明的載體和多核苷酸導入宿主細胞中。雖然本發(fā)明的蛋白可以用原核細胞作為宿主細胞來生產，但是最好使用真核細胞，例如酵母、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，尤其是哺乳動物細胞。
可以采用各種本領域已知技術，將本發(fā)明的載體/多核苷酸導入合適的宿主細胞中，所述技術例如轉染、轉化和電穿孔。當本發(fā)明的載體/多核苷酸是準備給予動物時，幾種技術是本領域已知的，例如用重組病毒載體(例如逆轉錄病毒、單純皰疹病毒和腺病毒)感染、直接注射核酸和生物射彈轉化(biolistic transformation)。
蛋白表達和純化包含本發(fā)明多核苷酸的宿主細胞可用于表達本發(fā)明蛋白。宿主細胞可以在允許本發(fā)明蛋白表達的合適條件下進行培養(yǎng)。本發(fā)明蛋白的表達可以是組成型(以便能持續(xù)產生所述蛋白)，或是誘導型(需要刺激物引發(fā)表達)。在誘導型表達的情況下，當需要時，通過例如向培養(yǎng)基中加入誘導物(例如地塞米松或IPTG)時，可以引發(fā)蛋白產生。
可以通過各種本領域已知技術，從宿主細胞中提取本發(fā)明的蛋白，所述技術包括酶法裂解、化學法裂解和/或滲透壓裂解以及物理破碎。
給藥最好將本發(fā)明的蛋白與各種不同組分混合，來制備本發(fā)明的組合物。最好將所述組合物與藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合，來制備藥用組合物(所述藥用組合物可以用于人或動物)。合適的載體和稀釋劑包括等滲鹽溶液，例如磷酸緩沖鹽溶液。賦形劑的詳細資料可見于The Handbook of Pharmaceutical Excipients，第2版，Wade&Weller編著，American Pharmaceutical Association。本發(fā)明的組合物可以直接注射給藥。所述組合物可以配制成用于胃腸外、肌內、靜脈內、皮下、眼內、口服或透皮給藥。每種蛋白一般可以0.5-500ng/kg、優(yōu)選以1-50ng/kg、更優(yōu)選以5-15ng/kg劑量范圍給藥。
另一方面，本發(fā)明提供一種包含綴合物的藥用組合物，其中所述綴合物用量使得能夠給受治療者的血漿提供不大于約35,000ng/天、優(yōu)選約3,500ng/天、更優(yōu)選約1,000ng/天劑量的所述綴合物或其代謝物。
以上劑量相當于70kg受治療者的劑量。本領域技術人員能夠容易地為體重不是70kg的受治療者修改所述劑量。
用準備給予患者的劑量除以預定劑量周期的天數(shù)，來計算日劑量。預定劑量周期一般是直到下次給藥的周期，在所述周期內劑量是有效的，或者在所述周期內劑量是有效所需的。
可以配制所述組合物，使得按天、按周或按月給藥可以提供需要的日劑量。人們知道，可以將所述組合物常規(guī)配制成用于較少次數(shù)的給藥，例如每2小時、4小時、6小時、8小時、10小時或12小時一次。
編碼多肽組分的多核苷酸/載體可以作為裸核酸構建體直接給藥，最好還包含與所述宿主細胞基因組同源的側翼序列。
通過幾種已知轉染技術，可以增加哺乳動物細胞對裸核酸構建體的攝入，所述技術例如那些包括使用轉染劑的技術。所述試劑的實例包括陽離子試劑(例如磷酸鈣和DEAE-葡聚糖)和脂轉染試劑(例如lipofectamTM和transfectamTM)。通常，將核酸構建體與轉染劑混合，來制備組合物。
最好將本發(fā)明的多核苷酸或載體與藥學上可接受的載體或稀釋劑混合，來制備藥用組合物。合適的載體和稀釋劑包括等滲鹽溶液，例如磷酸緩沖鹽溶液。所述組合物可以配制成用于胃腸外、肌內、靜脈內、皮下、眼內或透皮給藥。
所述給藥途徑和給藥方案僅僅是作為指導，因為熟練醫(yī)師能夠容易地為任何具體患者和病癥確定最佳給藥途徑和給藥方案。
病毒載體在一個優(yōu)選的實施方案中，所述綴合物是用病毒載體來給藥的，更優(yōu)選用逆轉錄病毒載體。
逆轉錄病毒用于本發(fā)明的逆轉錄病毒載體可來自任何合適的逆轉錄病毒。已經(jīng)鑒定出許多不同的逆轉錄病毒。實例包括鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒、人T細胞白血病病毒(HTLV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、禽類髓細胞瘤病毒-29(MC29)和禽類成紅細胞增多癥病毒(AEV)。逆轉錄病毒的詳細列表可以見于Coffin等，1997，″retroviruses″，Cold Spring Harbour LaboratoryPressJM Coffin，SM Hughes編著，HE Varmus第758-763頁。
某些逆轉錄病毒基因組結構的詳細資料在本領域可找到。作為實例，HIV和Mo-MLV的詳細資料可以從NCBI Genbank(基因組登錄號分別是AF033819和AF033811)中找到。
逆轉錄病毒可以大致分為兩類稱為“單純型(simple)”和“復合型(complex)”。逆轉錄病毒甚至可進一步分為7組。其中5組代表具有致癌潛力的逆轉錄病毒。剩下2組是慢病毒組和泡沫病毒組。這些逆轉錄病毒的有關綜述參見Coffin等，1997(同上)。
慢病毒組可以進一步分為“靈長類”和“非靈長類(on-primate)”。靈長類慢病毒的實例包括人免疫缺陷病毒(HIV)(人自身免疫缺陷綜合征(AIDS)的病原體)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非靈長類慢病毒組包括原型“慢病毒”維斯那病毒/梅迪病毒(visna/maedi virus)(VMV)以及相關山羊關節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)和最近描述的貓免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
本發(fā)明也涉及將核苷酸序列形式的綴合物傳遞給造血干細胞(HSC)的載體的用途。
基因轉移涉及向靶細胞(例如HSC)傳遞由一個或多個核苷酸序列和控制其表達的序列組成的表達盒?？梢栽陔x體以如下方式進行基因轉移在實驗室將所述盒轉移到細胞中，然后將所述經(jīng)修飾的細胞給予受體?；蛘?，可以在體內以如下方式進行基因轉移將所述表達盒直接轉移到個體的細胞中。在這兩種策略中，通常都由載體協(xié)助基因轉移過程，所述載體有助于將所述盒傳遞到合適的胞內位點。
骨髓已成為用于轉導HSC的傳統(tǒng)來源，最近的研究表明外周血干細胞或髓血細胞可能是同樣好或更好的靶細胞(Cassel等，1993 ExpHematol 21585-591；Bregni等，1992 Blood 801418-1422；Lu等，1993 JExp Med 1782089-2096)。
其它的抗癌藥本發(fā)明的綴合物可以與一種或多種其它活性藥聯(lián)合使用，所述其它活性藥例如一種或多種細胞毒性藥。因此，在本發(fā)明的一個方面，所述方法還包括給予另一種活性藥用組分例如細胞毒性藥，或者是與所述綴合物的聯(lián)合劑型，或者是單獨劑型。所述單獨細胞毒性藥劑型可包括固體口服、口服溶液劑、糖漿劑、酏劑、注射劑、透皮劑、透粘膜劑或其它劑型。所述綴合物和其它活性藥用組分可以組合成一個劑型或提供單獨劑型，所述單獨劑型可以一起使用或序貫使用。
可用于本發(fā)明的細胞毒性藥的實例包括烷化劑，例如環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法侖、白消安、洛莫司汀、卡莫司汀、氮芥、雌莫司汀、曲奧舒凡、塞替派、二溴甘露醇；細胞毒性抗生素，例如多柔比星、表柔比星、阿柔比星、伊達比星、柔紅霉素、米托蒽醌、博來霉素、放線菌素D和絲裂霉素；抗代謝藥，例如甲氨蝶呤、卡培他濱、阿糖胞苷、氟達拉濱、克拉曲濱、吉西他濱、氟尿嘧啶、雷替曲塞、巰嘌呤、替加氟和硫鳥嘌呤；長春花屬生物堿，例如長春堿、長春新堿、長春地辛和長春瑞濱和依托泊苷；其它抗腫瘤藥物，例如安吖啶、六甲蜜胺、crisantaspase、達卡巴嗪和替莫唑胺、羥基脲、噴司他丁，鉑化合物，包括卡鉑、順鉑和奧沙利鉑、卟吩姆鈉、丙卡巴肼、雷佐生，紫杉烷類，包括多西他賽和紫杉醇，拓撲異構酶I抑制劑，包括伊立替康和托泊替康、曲妥單抗和維A酸。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述其它細胞毒性藥是多柔比星、美法侖或順鉑。
本發(fā)明的綴合物也可用于腫瘤細胞和血管對用于診斷目的的化合物的通透性。例如在腫瘤的放射免疫閃爍顯象或放射療法中，所述綴合物可以用來增加腫瘤對放射性標記抗體或激素(腫瘤造影化合物)的攝入。
附圖和實施例將通過參考以下非限制性實施例和附圖進一步描述本發(fā)明，在圖中

圖1.mTNF和NGR-mTNF對帶有RMA-T淋巴瘤的動物的腫瘤生長和體重的影響。
在兩個獨立實驗(實驗1和實驗2)中，在RMA-T腫瘤移植后第12天(A)，或第10天、第11天和第12天(B)，用NGR-mTNF或mTNF腹膜內治療帶有所述腫瘤的動物(5只小鼠/組)。顯示治療后1-4天，在實驗1(A)和實驗2(B)中腫瘤體積和實驗1(C)中動物體重。圖C中的箭頭表示治療時間。
圖2.sTNF-R2的循環(huán)水平以及它們在調節(jié)NGR-mTNF和NGR-hTNF活性中的作用。
圖A在用不同劑量的NGR-mTNF或mTNF治療后1小時，sTNF-R1和sTNF-R2在帶有B16F1腫瘤的小鼠體內的血清水平。第6天對動物(3只小鼠/組)進行治療。
圖B抗sTNF-R2的mAb 6G1對NGR-mTNF抗腫瘤活性的影響。第5天和第8天將mAb 6G1(100μg)給予帶有B16F1腫瘤的動物。1小時后用指定劑量的NGR-mTNF治療每只動物，在2小時后用美法侖(90μg，5只小鼠/組)治療每只動物。
圖CNGR-hTNF和hTNF對RMA-T腫瘤生長的影響。用不同劑量的每種細胞因子，第11天對小鼠進行治療。N.S.不顯著(t-檢驗)。
圖3.單獨使用美法侖(A)或與NGR-mTNF(C)或mTNF(D)聯(lián)合使用對帶有B16F1黑素瘤的小鼠的腫瘤生長(A-D)和體重(E-F)的影響。
在腫瘤移植后第4天、第7天和第9天(箭頭所指)，用每幅圖中(5只動物/組)所示的藥物和劑量腹膜內治療所述動物。
圖4.不同劑量的單獨多柔比星(白色條帶)或與NGR-mTNF聯(lián)合使用(黑色條帶)對帶有B16F1黑素瘤的小鼠的腫瘤生長(A、B)、體重(C、D)和存活率(E)的影響。
在腫瘤移植后第5天將所述藥物給予所述動物(5只小鼠/組，腹膜內)。
圖5.TNF受體在NGR-mTNF和美法侖協(xié)同活性上的作用。
圖A在B16F1模型中，mAb V1q(一種抗mTNF的中和抗體)對美法侖與NGR-mTNF聯(lián)合使用的抗腫瘤活性的影響。所述藥物在第5天給藥。將Mab V1q和NGR-TNF預先混合，在注射動物前溫育1小時。
圖B美法侖與指定劑量的NGR-hTNF聯(lián)用的效果。
圖6.NGR-mTNF對多柔比星在B16F1和RMA-T腫瘤內透性的影響。
圖A在體外與100μg/ml多柔比星一起溫育的B16F1細胞(30分鐘，37℃)的明視野顯微鏡圖像(上圖)和熒光顯微鏡圖像(下圖)顯微圖像。插圖明視野和熒光圖像的組合。
圖B用多柔比星在體外處理后B16F1熒光信號的穩(wěn)定性。B16F1細胞在培養(yǎng)基中與不同劑量的多柔比星一起溫育(30分鐘，37℃)，用0.9％氯化鈉洗滌，然后用4％甲醛固定。然后將所述細胞在培養(yǎng)基中在4℃溫育0小時或24小時，重新洗滌，用FACS分析。
圖C、F在體外單獨給予多柔比星(320μg)或與NGR-mTNF(0.1ng)聯(lián)合給予后2小時，用FACS分析從B16F1(C)或RMA-T(F)腫瘤中回收的細胞。虛線指示熒光間隔被認為是陽性。
圖D、G從腫瘤回收的B16F1(D)或RMA-T(G)細胞的平均值±SE熒光。
圖E、H從B16F1(E)、RMA-T(H)腫瘤回收的陽性細胞的平均值±SE。
用雙尾t-檢驗進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05(*)。
圖7.在正常血管(CD13-陰性)和腫瘤相關血管(CD13-陽性)中假設低(A)、中等(B)和高(C)劑量的NGR-TNF與可溶性受體和膜受體的相互作用的示意圖。
黑色箭頭表示TNF受體信號傳遞或胞外結構域脫落。
圖8.RGD-TNF對帶有RMA-T動物的腫瘤生長(圖8A)和體重(圖8B)的影響。
圖9.用IFNγ-NGR單獨治療(箭頭)對C57B6小鼠的RMA淋巴瘤生長(圖9A和圖9C)和動物體重(圖9B)的影響。
圖10.NGR-TNF和順鉑對C57/BL6小鼠的RMA腫瘤的影響。
實施例1-腫瘤細胞系和試劑如前所述(14，15)，對小鼠B16F1黑素瘤和RMA-T淋巴瘤細胞進行培養(yǎng)。如前所述(16，17)，產生并表征Mab 6G1(大鼠抗p75mTNF受體拮抗劑)。mAb V1q(大鼠抗mTNF)由D.Mannel博士(University ofRegensburg，Germany)友好提供。美法侖(Alkeran)得自Glaxo-Wellcome(London，Great Britain)。多柔比星(Adriblastina)購自Pharmacia-Upjohn(Milan，Italy)。
實施例2-人和鼠TNF和NGR-TNF的制備。
如(14)所述，通過重組DNA技術制備人和鼠TNF和NGR-TNF(由與CNGRCG C末端融合的TNF組成)，然后從大腸桿菌細胞提取物中純化。所有用于色譜步驟的溶液都用無菌無熱源水配制(Salf，Bergamo，Italy)。用市售蛋白定量分析試劑盒蛋白(Pierce，Rockford，IL)測定蛋白濃度。采用標準細胞溶解實驗，用L-M小鼠成纖維細胞，評價人TNF(hTNF)體外細胞溶解活性是5.4×107單位/mg，而純化NGR-hTNF的活性則是1.4×108單位/mg(18)。鼠TNF(mTNF)細胞溶解活性是7.6×107單位/mg，而NGR-mTNF的活性是9.1×107單位/mg。通過在Superdex 75 HR柱(Pharmacia，Sweden)上進行凝膠過濾色譜，NGR-mTNF、NGR-hTNF和mTNF的流體力學體積與hTNF(一種同源三聚體蛋白)相假(19)。電噴霧質譜檢測每種產物的分子量如下NGR-hTNF，17937.6±1.9Da(預期CNGRCG-hTNF1-157單體，17939.4Da)；hTNF，17349±1.3(預期hTNF1-157，17350.7)；NGR-mTNF，17841.16±2.5(預期CNGRCG-mTNF1-156，17844.2)，mTNF，17384.9±2(預期Met-mTNF1-156，17386.7)。每種產品的內毒素含量采用定量顯色鱟變形細胞溶解物(LAL)試驗(BioWhittaker)進行測定，結果是NGR-hTNF，0.079單位/μg；hTNF，0.117單位/μg；NGR-mTNF，0.082單位/μg；mTNF，1.61單位/μg。
實施例3-體內研究。
動物模型研究由San Raffaele H Scientific Institute的倫理委員會批準，并按照規(guī)定指南進行。在體重16-18g的C57BL/6小鼠(CharlesRiver Laboratories，Calco，Italy)左脅皮下注射5×104個RMA-T或B16F1活細胞；4-12天后，用TNF或NGR-TNF溶液(100μl)治療所述小鼠，2小時后給予美法侖或多柔比星溶液(100μl)。除非另有說明，所有藥物經(jīng)腹膜內(i.p.)給藥。除多柔比星外，將所有藥物用含有100μg/ml無內毒素人血清白蛋白(Farma-Biagini，Lucca，Italy)的0.9％氯化鈉稀釋，而多柔比星僅用0.9％氯化鈉稀釋。如前所述(20)通過用測徑器測量腫瘤，每天監(jiān)測腫瘤生長。在腫瘤直徑達到1.0-1.5cm之前，處死動物。腫瘤大小以平均值±SE(5只動物/組)表示。
實施例4-可溶性TNF受體分析。
用Quantikine M試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，MN 55413)測量動物血清中的可溶性p55-TNF受體(sTNF-R1)和可溶性p75-TNF受體(sTNF-R2)。
實施例5-腫瘤內多柔比星的檢測。
用或不用NGR-mTNF(0.1ng，i.p.)治療帶有B16F1或RMA-T腫瘤(直徑0.5-1cm)的C57/BL6小鼠，2小時后用多柔比星(320μg，i.p.)治療。2小時后處死動物，切取腫瘤。將每個腫瘤稱重、搗碎、重懸于冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，然后經(jīng)70μm濾器過濾。細胞用冷PBS(50ml)重新懸浮，離心(1500rpm，10分鐘，4℃)，重懸于冷PBS(2.5ml/g腫瘤組織)中，然后與新鮮制備的含有8％甲醛的PBS(2.5ml/g組織)混合。所述細胞在4℃避光保存過夜，然后用FACS分析。用從未經(jīng)治療腫瘤中回收的細胞標定FACScan(Becton-Dickinson)。用FL-3濾器和Cell Quest軟件分析每個樣品。
實施例6-鼠淋巴瘤和黑素瘤模型中NGR-mTNF和mTNF的劑量-反應曲線。
首先在沒有化療藥物的情況下，表征NGR-mTNF和mTNF的抗腫瘤活性。為了比較NGR-mTNF和mTNF的劑量-反應曲線，我們進行了幾次實驗，所述實驗是根據(jù)將不同劑量的NGR-mTNF和mTNF(從0.01ng至10000ng)單次或重復給予(i.p.)帶有RMA-T淋巴瘤或B16F1黑素瘤的小鼠。當以高劑量(10000ng)(圖1A)給藥時，鼠TNF延遲腫瘤生長；當?shù)陀?00ng劑量時，無論是單次給藥(圖1A)不是重復給藥(圖1B)，都沒有誘導作用。顯然NGR-mTNF更有效。在這種情況下，甚至在用劑量低至0.01ng時，我們都觀察到了抗腫瘤效應(圖1A，B)。然而，劑量-反應曲線更復雜。例如，10ng的效果令人吃驚地低于0.01-0.1ng和1000-10000ng的效果。在RMA-T模型以及在B16F1黑素瘤模型中進行的幾個其它實驗中，觀察到鐘形劑量-反應曲線(未顯示)。這些結果表明1)低劑量NGR-mTNF的功效顯然比mTNF的高，和2)劑量高于1-10ng的NGR-mTNF激活負反饋機制，抑制其潛在抗腫瘤活性。
實施例7-納克劑量、而不是皮克劑量的NGR-TNF誘導可溶性TNF受體脫落。
研究了造成NGR-mTNF鐘形劑量-反應曲線的保護性機制。因為外源給予TNF可以在體內誘導可溶性TNF受體(sTNF-Rs)脫落(21)，我們假設10ng NGR-TNF的較低功效與sTNF-R1和/或sTNF-R2相關，因此中和其與膜受體的相互作用。
為了檢驗該假設，我們在給予帶瘤小鼠不同劑量的mTNF和NGR-mTNF后1小時收集血清，測定了所述血清中sTNF-R1和sTNF-R2的水平。正如所預期的，在劑量大于4ng時，兩種產物都誘導sTNF-R2脫落，但不誘導sTNF-R1脫落(圖2A)。
為了評價sTNF-R2脫落是否調節(jié)NGR-mTNF的活性，我們同時給予該細胞因子和mAb 6G1(一種抗sTNF-R2抗體的拮抗劑，能阻止mTNF與可溶性和膜鼠TNF-R2結合(16))。mAb 6G1增強了10ngNGR-mTNF的抗腫瘤活性(圖2B)，符合以下假設sTNF-R2在抑制NGR-mTNF的抗腫瘤效應中起作用。
為了進一步支持該假設，利用人細胞因子不能結合鼠sTNF-R2(22)這一事實，我們比較了NGR-mTNF以及NGR-hTNF的體內劑量-反應曲線。我們發(fā)現(xiàn)NGR-hTNF的劑量-反應曲線不是鐘形的，且10ngNGR-hTNF的活性與1ng的一樣(圖2C)。也值得注意的是，1ng足以誘導最大抗腫瘤效應。這可表明可以用血中極低水平的NGR-hTNF就得到結合在血管上的受體。
綜上所述，這些實驗結果強有力地表明，NGR-mTNF和mTNF在劑量大于4ng時，誘導出數(shù)量足以抑制其抗腫瘤活性的sTNF-R2的脫落。
實施例8-皮克劑量的NGR-mTNF足以增強美法侖和多柔比星的治療效果。
我們研究了將低劑量的NGR-mTNF靶向給予腫瘤血管是否能增強化療藥物的抗腫瘤活性。這些實驗是在B16F1模型中進行，所述模型是自發(fā)性小鼠黑素瘤，其特征是缺乏免疫原性和對美法侖的低敏感性。美法侖(90μg)當單獨注射時不能影響該腫瘤生長(圖3A)。同樣，mTNF(0.1ng單用，i.p.)實際上是無活性的，而同樣劑量的NGR-mTNF中等程度地延遲腫瘤生長(圖3B，上圖)。美法侖和0.1ngNGR-mTNF聯(lián)用比起使用單一藥物，誘導更強烈的抗腫瘤效應，這表明有協(xié)同效應(圖3C)。顯然，美法侖與0.1ng NGR-mTNF聯(lián)用，比與5000ng mTNF聯(lián)用更有效(圖3C-D)。甚至當靜脈內注射NGR-mTNF(0.1ng)時，我們觀察到這樣的協(xié)同作用(未顯示)。
在B16F1模型中，用多柔比星進行了2個類似實驗。腫瘤移植后5天，用或不用NGR-mTNR治療動物，2小時后用不同劑量的多柔比星(20-320μg，i.p.)治療動物。在這兩個實驗中，多柔比星加NGR-mTNF的效果要比單用多柔比星的效果強烈(圖4A、B、E)，表明NGR-mTNF顯著改進該藥的功效。例如多柔比星(40μg)加NGR-mTNF(0.1ng)的效果要比單用320μg多柔比星的效果強(圖4B)，而多柔比星(20μg)加NGR-mTNF的效果較差(圖4A)。根據(jù)這些結果，我們估計多柔比星的活性被NGR-mTNF提高了8-10倍。
結論是，這些結果表明皮克劑量的NGR-TNF足以改進腫瘤對美法侖和多柔比星的反應。
實施例9-低劑量NGR-mTNF是無毒的，也不增加美法侖的毒性。
為了估計每種治療的功效/毒性比率，我們每天監(jiān)測動物體重和動物在治療后的存活率。當治療劑量的mTNF(10000ng)在帶有RMA-T的小鼠中誘導顯著的體重減輕(圖1C，左)時，治療劑量的NGR-mTNF(0.01-1ng)卻不引起體重減輕(圖1C，右)。此外，在帶有RNA-T腫瘤的小鼠中，無論是NGR-mTNF還是mTNF(各1ng)，都不增加200μg美法侖的致死率(表1)。
表1.在帶瘤小鼠a中，mTNF和NGR-mTNF對美法侖(高劑量)毒性的影響
a帶有11日齡腫瘤的C57BL6小鼠用1ng NGR-mTNF或mTNF進行治療(i.p.)，2小時后用200μg美法侖進行治療(i.p.)。
在B16F1模型中，治療劑量的NGR-mTNF(0.1ng)甚至當與美法侖聯(lián)用時也不引起體重減輕(圖3E)。相反，美法侖與治療劑量的mTNF(5μg)聯(lián)用引起顯著的體重減輕(圖3F)。此外，NGR-mTNF(0.1ng)不增加由高劑量的多柔比星引起的體重減輕(圖4C-D)。
這些結果表明皮克劑量的NGR-mTNF增加腫瘤對美法侖和多柔比星的反應，而沒有增加毒性的證據(jù)。
實施例10-對于NGR-TNF和化療藥物間的協(xié)同作用，TNF-R1活化是必要的和充分的。
研究了低劑量的NGR-mTNF和化療之間的協(xié)同機制。
為了評價這些機制是否依賴于TNF-Rs的活化，我們檢驗了mAbV1q(一種抗mTNF的中和抗體)對NGR-mTNF(0.1ng)與美法侖(90μg)聯(lián)用的抗腫瘤活性的效應。mAb V1q至少部分抑制這些藥物在B16F1模型中的抗腫瘤活性(圖5A)。這表明TNF部分和TNF-Rs之間的相互作用對所述綴合物的活性是關鍵性的。
因而研究了TNF-R1和TNF-R2的作用。最后，我們評價了美法侖與0.01ng或0.1ng NGR-hTNF(一種TNF-R1特異性激動劑)聯(lián)用的效果(22)。美法侖在B16F1模型中的效果被NGR-hTNF加強(圖5B)，表明TNF-R1的活化足以產生協(xié)同作用。
實施例11-NGR-TNF和化學療法之間的協(xié)同作用不依賴于腫瘤細胞的細胞毒性。
為了評價所述協(xié)同作用是否依賴于腫瘤細胞的細胞毒性，我們測定了每種化合物在培養(yǎng)的B16F1細胞中單用或聯(lián)用的效果。無論是美法侖還是NGR-mTNF，單用或聯(lián)用，都在48小時體外實驗中殺死這些細胞(未顯示)。同樣，NGR-mTNF在體外不增強多柔比星的細胞毒性(未顯示)。這些結果表明，體內協(xié)同作用不直接依賴于針對腫瘤細胞的細胞毒性作用，而是表明腫瘤基質組分(例如腫瘤血管的內皮內層的間接作用。
實施例12-NGR-TNF增加多柔比星在鼠黑素瘤和淋巴瘤中的滲透。
我們研究了NGR-mTNF是否能增加化療藥物在腫瘤中的滲透。為了該目的，我們利用多柔比星的熒光特征，測定了給藥后2小時滲透到B16F1和RMA-T腫瘤中的該藥物量(23)。初步實驗顯示，當B16F1細胞在體外暴露給多柔比星時，該細胞核變?yōu)榘l(fā)熒光(圖6A)。當該細胞用甲醛固定并保持在4℃時，用FACS進行測定，該熒光信號是劑量依賴性的，而且可以穩(wěn)定至少24小時(圖6B)。因此，得自治療后動物的腫瘤細胞的熒光強度指示滲透到腫瘤內多柔比星量。我們觀察到，在給予多柔比星之前2小時給予0.1ng NGR-mTNF，在治療2小時后，增加了得自B16F1和RMA-T腫瘤的熒光強度和陽性細胞百分率(2-5倍，圖6C-H)。這表明NGR-mTNF增加了多柔比星到達細胞的量，也增加了胞內藥物量。
實施例13-RGD-TNF對腫瘤的效果單用美法侖、或美法侖與RGD-TNF或NGR-TNF聯(lián)用，對帶有RMA-T腫瘤的C57/BL6小鼠(5只小鼠/組)進行腹膜內治療。對腫瘤體積的影響示于圖8A，而對動物體重的影響示于圖8B。這些結果證明RGD-TNF在皮克范圍內也是有活性的。
實施例14-IFNγ-NGR對腫瘤的效果帶有RMA淋巴瘤的C57/BL6小鼠用或不用IFNγ(3ng)或IFNγ-NGR(3ng)進行治療。21天后處死動物。腫瘤體積和動物體重的結果示于圖9A和9B。此外，帶有RMA淋巴瘤的C57/BL6小鼠用或不用IFNγ(3ng)、IFNγ-NGR(3ng)、IFNγ-NGR(3ng)加抗CD13 R3-63mAb(25μg)或IFNγ-NGR(3ng)加mAB 19E12(50μg)進行治療。mAb 19E12是一種無關的IgG，用來在實驗中作為陰性對照。結果證明IFNγ-NGR在皮克范圍內是有活性的。
實施例15-皮克劑量的NGR-TNF足以增強順鉑的療效我們研究了將低劑量的NGR-TNF靶向給予腫瘤血管是否能增強抗癌藥順鉑的抗腫瘤活性。在帶有8周齡RMA腫瘤的C57/BL6小鼠中進行這些實驗。第10天，所述小鼠用或不用順鉑或NGR-mTNF進行治療。結果示于圖10。該圖中，Cys＝Cisplatino Teva溶液(0.5mg/ml)；NGR＝NGR-mTNF。稀釋液是溶于0.9％NaCl的HAS(100mg/ml)。結果表明皮克劑量的NGR-TNF足以增強順鉑的療效。
優(yōu)勢概述血管通透性和間質壓力的改變、內皮細胞損傷和血纖蛋白沉積是TNF抗腫瘤活性的主要機制，無論TNF是單用還是與化療藥物聯(lián)用。當輸注到動物或患者體內后，TNF也可以誘導負反饋機制，所述機制中和大部分這些效應。例如TNF，甚至是在中等劑量時，可以誘導釋放可溶性p55和p75 TNF受體，可阻止其與膜受體的相互作用(21，24)。雖然這些可溶性抑制劑可保護機體免遭該細胞因子的有害影響，但是它們也可阻止其抗腫瘤活性，這可以部分說明有效治療需要高劑量TNF。在這項工作中，我們假設低劑量TNF向腫瘤血管歸巢代表了一種避免毒性反應和負反饋機制、同時保留其與化學療法的協(xié)同作用的新策略。為了證明該假設，我們已在兩種皮下RMA-T淋巴瘤和B16F1黑素瘤的鼠模型中，研究了高劑量和低劑量的NGR-mTNF和mTNF的抗腫瘤活性，劑量范圍從皮克到微克級。單用這些細胞因子或與美法侖或多柔比星聯(lián)用，進行該研究。我們發(fā)現(xiàn)當mTNF在低于100-1000ng時，實際上在這些模型中是無活性的；而NGR-mTNF在劑量低至0.01-0.1ng時，甚至在單用時，可以誘導抗腫瘤效應。因為在帶有RMA-T腫瘤的小鼠中，mTNF和NGR-mTNF的LD50值相似，都約為50,000ng(14)，這些結果表明，NGR-mTNF的功效/毒性比率比mTNF的大104-105倍。
將微量NGR-mTNF(0.1ng)給予帶瘤動物，增強美法侖和多柔比星的抗腫瘤活性，而沒有增加毒性的證據(jù)，所述證據(jù)用治療后腫瘤體積縮小、動物存活率和體重減輕來判斷。這表明NGR-mTNF改進了這些藥物的治療指數(shù)。值得注意的是，需要5×104倍更大劑量的mTNF，才能使美法侖的效果增強到相當水平，引起體重顯著減輕。
在B16F1模型中，美法侖和多柔比星以實際上無活性的劑量與NGR-mTNF聯(lián)用時，減少腫瘤生長，這一事實表明這些藥物協(xié)同作用。對作用機制的研究顯示，所述協(xié)同作用依賴于基質細胞(很可能是內皮細胞，可能較小是腫瘤細胞)中NGR-mTNF與TNF-R1的相互作用。另外，我們發(fā)現(xiàn)用NGR-mTNF的血管靶向改進了細胞毒性藥物在腫瘤內的透性。值得注意的是，NGR-mTNF在2小時內增加了多柔比星可以到達的癌細胞的百分數(shù)以及胞內藥物濃度，表明NGR-TNF能改變藥物滲透屏障。以前的研究顯示TNF可快速增加內皮透性(25，26)，并能降低間質流體壓力(8)，據(jù)信，間質流體壓力是藥物在腫瘤中滲透的重要屏障(1)。這些基質可能增加藥物穿越腫瘤血管壁和間質的對流運輸，最終引起腫瘤細胞對藥物攝取增加。給藥時間對這些機制來說，可能是關鍵性的，因為TNF也可以誘導血管內凝血(27)，導致血管栓塞并降低腫瘤灌注。按照這個觀點，我們觀察到在給予NGR-TNF后2小時給予美法侖，效果比在6小時后給予要高(數(shù)據(jù)未顯示)。
觀察到皮克劑量的NGR-mTNF不誘導可溶性受體脫落，而NGR-mTNF和mTNF在劑量大于4-10ng時都能快速誘導sTNF-R2釋放到循環(huán)中；這樣的觀察支持血管靶向能避免負反饋機制(通常與TNF療法有關)的假設。這樣的sTNF-R2水平抑制10ng NGR-mTNF的大部分抗腫瘤活性，可以解釋10ng的活性小于0.1ng的反常現(xiàn)象。同樣，sTNF-Rs快速結合大部分注入的分子并阻斷它們的活性。
已經(jīng)部分地闡明了低劑量的NGR-mTNF與腫瘤血管選擇性相互作用的分子機制。我們近來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，不同的CD13同種型表達于腫瘤相關血管、上皮細胞和骨髓細胞，以及NGR-TNF的NGR結構域選擇性識別與腫瘤血管相關的CD13同種型(28)。因此，我們假設血中低水平的NGR-mTNF可以快速與CD13-陽性內皮細胞相互作用，是因為CD13與TNF-Rs兩者間的高親合力多價結合；而很少或完全不結合正常血管中CD13-陰性內皮細胞，則是因為低親合力。這些概念和NGR-TNF與可溶性和膜受體的假設相互作用的示意圖示例于圖7。
我們也已發(fā)現(xiàn)RGD-TNF和IFNγ-NGR在皮克范圍內是有活性的。我們也已證明NGR-TNF增加了順鉑的效果。
結論是，我們已發(fā)現(xiàn)靶向給予腫瘤血管皮克劑量的細胞因子，在小鼠體內增強化療藥物的抗腫瘤活性，而不誘導可溶性受體脫落。假定CNGRC基序預期靶向鼠和人腫瘤相關血管(29)，我們的結果表明，低劑量的靶向細胞因子和抗癌藥物聯(lián)用能增加它們在人類患者中的治療指數(shù)。
以上說明書中提到的所有出版物都通過引用結合到本文中。不偏離本發(fā)明范圍和精神的情況下，對本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的各種修改和變動對本領域技術人員而言是顯而易見的。雖然結合具體優(yōu)選的實施方案中描述了本發(fā)明，但是可以理解，所述具體實施方案將不會過分限制要求保護的本發(fā)明。事實上，為了實施本發(fā)明對所述方式的各種修改對分子生物學或相關領域的技術人員是顯而易見的，并且在所附權利要求書的范圍內。
參考文獻1.Jain，R.K.1994.Sci Am.27158-65.
2.Lienard，D.等.1992 J.Clin.Oncol.1052-60.
3.Eggermont，A.M.等.1996.J.Clin.Oncol.142653-2665.
4.Lejeune，F(xiàn).J.1995.Eur.J Cancer.31 A1009-1016.
5.Fraker，D.L.等.1996.J Clin.Oncol.14479-489.
6.Rossi，C.R.等.1999.Cancer.861742-1749.
7.van der Veen，A.H.等.2000.Br.J.Cancer.82973-980.
8.Kristensen，C.A.等.1996.Br.J.Cancer.74533-536.
9.Suzuki，S.等.1990.Int.J.Cancer.461095-1100.
10.de Wilt，J.H.等.2000.Br.J Cancer.821000-1003.
11.Fiers，W.1995.Biologic therapy with TNFpreclinical studies.Biologic therapy of cancerprinciples and practice.V.De Vita，S.Hellman和S.Rosenberg主編.J.B.Lippincott Company，Philadelphia.295-327.
12.Fraker，D.L.，H.R.Alexander和H.I.Pass.1995.Biologic therapywith TNFsystemic administration and isolation-perfusion.Biologictherapy of cancerprinciples and practice.V.De Vita，S.Hellman和S.Rosenberg主編.J.B.Lippincott Company，Philadelphia 329-345.
13.Corti，A和F.Marcucci.1998.J.Drug Targ.5403-413.
14.Curnis，F(xiàn).A等.2000.Nat.Biotechnol.181185-1190.
15.Moro，M.等.1997.Cancer Res.571922-1928.
16.Corti，A.等.1999.Infect Immun.675762-5767.
17.Pelagi，M.等.2000.Eur.Cytokine Net.11580-588.
18.Corti，A.等.1994.J.Immunol.Meth.177191-198.
19.Smith，R.A.和C.Baglioni.1987.J.Biol.Chem.2626951-6954.
20.Gasparri，A.等.1999.Cancer Res.592917-2923.
21.Aderka，D.等.1998.J.Clin.Invest.101650-659.
22.Tartaglia，L.A.等.1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.889292-9296.
23.Luk，C.K.和I.F.Tannock.1989.J.Natl.Cancer Inst.8155-59.
24.Sella，A.等.1995.Cancer Biother.10225-235.
25.Brett，J.等.1989.J.Exp.Med.1691977-1991.
26.Goldblum，S.E.和W.L.Sun.1990.Am.J.Physiol.258L57-67.
27.Clauss，M.等.1992.Modulation of endothelial cell hemostaticproperties by TNFinsights into the role of endothelium in the hostresponse to inflammatory stimuli.In Tumour necrosis factorsthemolecules and their emerging roles in medicine.B.Beutler主編，Raven Press，New York.49-63.
28.Curnis，F(xiàn).等.2002.Cancer Res.62867-874.
29.Arap，W.等.1998.Science.279377-380.
權利要求
1.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含細胞因子和腫瘤靶向部分(TTM)的綴合物以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，其中所述細胞因子的用量不會誘導負反饋機制。
2.權利要求1的藥用組合物，其中所述細胞因子的用量不會誘導可溶性細胞因子受體脫落。
3.權利要求1或2的藥用組合物，其中所述綴合物的用量提供的劑量范圍為0.5-500ng/kg。
4.權利要求3的藥用組合物，其中所述綴合物的用量提供的劑量范圍為1-50ng/kg。
5.權利要求4的藥用組合物，其中所述綴合物的用量提供的劑量范圍為5-15ng/kg。
6.權利要求1或2的藥用組合物，其中所述綴合物的用量使得所述綴合物或其代謝物提供給待治療患者血漿的用量不大于約35,000ng/天/70kg患者。
7.前述權利要求中任一項的藥用組合物，其中所述細胞因子是炎性細胞因子。
8.前述權利要求中任一項的藥用組合物，其中所述細胞因子是化療細胞因子。
9.前述權利要求中任一項的藥用組合物，其中所述細胞因子是TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-15、EMAP II、血管內皮生長因子(VEGF)、PDGF、PD-ECGF或趨化因子。
10.權利要求9的藥用組合物，其中所述細胞因子是TNF-α、TNF-β或IFN-γ。
11.前述權利要求中任一項的藥用組合物，其中所述TTM是腫瘤血管靶向部分(TVTM)。
12.權利要求11的藥用組合物，其中所述TVTM是腫瘤血管受體、標記或其它胞外組分的結合配偶體。
13.權利要求1-10中任一項的藥用組合物，其中所述TTM是腫瘤受體、標記或其它胞外組分的結合配偶體。
14.前述權利要求中任一項的藥用組合物，其中所述TTM是抗體或配體、或它們的片段。
15.前述權利要求中任一項的藥用組合物，其中所述TTM包含NGR基序或RGD基序，或者是HIV-tat、膜聯(lián)蛋白V、骨橋蛋白、纖連蛋白、I型或IV型膠原蛋白、透明質酸、肝配蛋白，或者是癌胚纖連蛋白的結合配偶體；或者是它們的片段。
16.權利要求15的藥用組合物，其中所述TTM包含NGR基序。
17.權利要求16的藥用組合物，其中所述TTM是CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、環(huán)狀CVLNGRMEC、線狀或環(huán)狀CNGRC。
18.權利要求15的藥用組合物，其中所述TTM包含NGR基序。
19.權利要求14的藥用組合物，其中所述TTM靶向VEGFR、ICAM1、ICAM2或ICAM3、PECAM-1、CD31、CD13、VCAM-1、選擇蛋白、ActRII、ActRIIB、ActRI、ActRIB、CD44、氨肽酶A、氨肽酶N(CD13)、αvβ3整聯(lián)蛋白、αvβ5整聯(lián)蛋白、FGF-1、FGF-2、FGF-3或FGF-4、IL-1R、EPHR、MMP、NG2、腱生蛋白、癌胚纖連蛋白、PD-ECGFR、TNFR、PDGFR或PSMA。
20.前述權利要求中任一項的藥用組合物，其中所述綴合物為融合蛋白形式。
21.權利要求1-19中任一項的藥用組合物，其中所述綴合物為核酸形式。
22.前述權利要求中任一項的藥用組合物，其中所述組合物還包含另一種抗腫瘤藥或診斷用腫瘤造影化合物。
23.權利要求22的藥用組合物，其中所述另一種抗腫瘤藥是多柔比星、美法侖或順鉑。
24.前述權利要求中任一項定義的綴合物或前述權利要求中任一項的藥用組合物在制備用于治療或診斷癌癥的藥物中的用途。
25.一種治療或診斷癌癥的方法，所述方法包括給予有需要的患者有效量的權利要求1-23中任一項定義的綴合物或權利要求1-23中任一項的藥用組合物，其中所述用量不會誘導負反饋機制。
全文摘要
一種包含細胞因子和腫瘤靶向部分(TTM)的綴合物以及藥學上可接受的賦形劑的藥用組合物，其中所述細胞因子的用量不會誘導負反饋機制。
文檔編號A61K31/198GK1665933SQ03815079
公開日2005年9月7日 申請日期2003年4月30日 優(yōu)先權日2002年4月30日
發(fā)明者A·科爾蒂, F·庫爾尼斯 申請人:莫爾梅德股份有限公司