可控降解的聚合生物分子或藥物載體及其合成方法

專利名稱：可控降解的聚合生物分子或藥物載體及其合成方法
專利說(shuō)明可控降解的聚合生物分子或藥物載體及其合成方法 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種合成可控降解的聚合載體分子的新方法，該載體用于生物醫(yī)學(xué)方面，例如生物分子的傳遞、診斷造影組分的傳遞、敏化劑組分的傳遞和組織工程。特別地，本發(fā)明涉及一種可控降解的聚合物的主鏈及用于生物分子傳遞(如將核酸、蛋白質(zhì)、縮氨酸和藥物傳遞到細(xì)胞、組織或者需要治療的個(gè)體處)的聚合物的合成方法。

背景技術(shù)：
基因治療中首要關(guān)注的是基因的傳遞?；騻鬟f系統(tǒng)被設(shè)計(jì)成通過(guò)影響基因表達(dá)系統(tǒng)的傳遞和進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞，和/或細(xì)胞表面受體的識(shí)別，及其后的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸及細(xì)胞核易位，來(lái)保護(hù)和控制基因在體內(nèi)的位置(Friedmann，T.The Development of Human Gene Therapy.Cold SpringHarbor Laboratory Press.San Diego.1999)。
由于病毒載體和陽(yáng)離子脂基基因載體系統(tǒng)的局限性，人們對(duì)聚合基因載體的興趣不斷增長(zhǎng)。聚合物是高分子物質(zhì)，其為設(shè)計(jì)新的傳遞系統(tǒng)，包括小分子藥物、蛋白質(zhì)、縮氨酸、低聚核苷酸和基因，提供了很多令人興奮的機(jī)會(huì)。在此類系統(tǒng)中，簡(jiǎn)單地通過(guò)改變混合物的組成、聚陽(yáng)離子的分子質(zhì)量、聚陽(yáng)離子的結(jié)構(gòu)(線性、無(wú)規(guī)則支鏈、樹(shù)枝狀聚合物、嵌段和接枝共聚物)以及通過(guò)引入支鏈或其它功能分子(如糖、縮氨酸和抗體)來(lái)對(duì)聚陽(yáng)離子主鏈進(jìn)行修飾，就可以實(shí)現(xiàn)其更大的設(shè)計(jì)靈活性(Pouton CW，Seymour LW.Key issues in non-viral gene delivery.Adv.Drug Deliv.Rev.2001 Mar 1；46(1-3)187-203)。低致免疫性或無(wú)致免疫性是聚合物優(yōu)于脂基基因載體的另一方面，這一優(yōu)點(diǎn)使聚合物可以作為生物相容性材料應(yīng)用于患者。
通常用作基因載體主鏈的陽(yáng)離子聚合物是聚(L-賴氨酸)(PLL)、聚乙烯亞胺(PEI)、殼聚糖、PAMAM樹(shù)枝狀聚合物和聚(2-二甲氨基)乙基異丁烯酸酯(pDMAEMA)。
聚(L-賴氨酸)基聚合物(首次于1987年)被用于基因的傳遞，是通過(guò)使用靶向配體(如脫唾液酸血清類粘蛋白和葉酸鹽)來(lái)促進(jìn)以受體為媒介的攝取作用。(Wu，GY.，and Wu，CH.Receptor-mediated in vitro genetransformation by a soluble DNA carrier system.J Biol Chem.1987 Apr5；262(10)4429-32；Wu，GY.，and Wu，CH.Receptor-mediated gene deliveryand expression in vivo.J Biol Chem.1988 Oct 15；263(29)14621-4；MislickKA，Baldeschwieler JD，Kayyem JF，Meade TJ.Transfection offolate-polylysine DNA complexesevidence for lysosomal delivery.BioconjugChem.1995 Sep-Oct；6(5)512-5)。已經(jīng)證明，位于PLL/DNA配合物表面的配體與受體相互作用的結(jié)果使該配合物得以內(nèi)在化進(jìn)入細(xì)胞中。(Wagner E，Zenke M，Cotten M，Beug H，Birnstiel ML.Transferrin-polycationconjugates as carriers for DNA uptake into cells.Proc Natl Acad Sci USA.1990 May；87(9)3410-4)。也可以通過(guò)使用親溶酶體(lysosomatotropic)劑(如氯化奎寧)或失活的腺病毒，或自流感嗜血桿菌包膜蛋白中提取的縮氨酸，來(lái)促進(jìn)PLL/DNA配體從內(nèi)層中釋放出來(lái)，從而提高以PLL為媒介的基因傳遞的效率。(Wagner E，Plank C，Zatloukal K，Cotton M，BirnstielML.Influenza virus hemagglutinin HA-2 N-terminal fusogenic peptidesaugment gene transfer by transferring-polylysine-DNA complexestoward asynthetic virus-like gene-transfer vehicle.Proc Natl Acad Sci USA.1992Sep 1；89(17)7934-8；Curiel DT，Wagner E，Cotten M，Birnstiel ML，AgarwalS，Li CM，Loechel S，Hu PC.High-efficiency gene transfer mediated byadenovirus coupled to DNA-polylysine complexes.Hum Gene Ther.1992Apr；3(2)147-54)。很明顯，因?yàn)镻LL只是由伯胺構(gòu)成的，所以當(dāng)不使用靶向配體及內(nèi)層溶解劑而單獨(dú)使用PLL聚合復(fù)合物時(shí)，基因傳遞的效果不好。另一方面，高分子量的PLL對(duì)細(xì)胞有很大的毒性。
與PLL不同，高分子量支化的和線性的聚乙烯亞胺(PEI)不需要內(nèi)層溶解劑和靶向試劑的輔助就顯示出高效的基因傳遞效率。(Boussif O，Lezoualc’h F，Zanta MA，Mergny MD，Scherman D，Demeneix B，Behr JP.Aversatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in cultureand in vivopolyethylenimine.Proc Natl Acad Sci USA.1995 Aug1；92(16)7297-301)。帶正電的PEI聚合復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞，且由于其高度密集的仲胺和叔胺基團(tuán)，PEI也被認(rèn)為可促進(jìn)內(nèi)體的逸出。令人遺憾的是，也有報(bào)道稱高分子量的PEI對(duì)細(xì)胞有毒性，因而極大地限制了PEI作為基因傳遞工具應(yīng)用在人類患者身上的可能性。
曾經(jīng)將一系列的聚酰胺胺樹(shù)枝狀聚合物作為基因傳遞系統(tǒng)被研究。(Eichman JD，Bielinska AU，Kukowska-Latallo JF，Baker JR Jr.The use ofPAMAM dendrimers in the efficient transfer of genetic material into cells.Pharm.Sci.Technol.Today.2000 Jul；3(7)232-245)。末端氨基通過(guò)靜電作用與DNA結(jié)合，形成帶正電的配合物，該配合物通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用被吸收。此類聚合物的星型外形的優(yōu)點(diǎn)是，因?yàn)镈NA僅與表面的伯胺相互作用，所以內(nèi)部的叔胺基團(tuán)得以保留并協(xié)助內(nèi)體從樹(shù)枝狀聚合物-基因配合物中逸出。令人遺憾的是，也有報(bào)道稱樹(shù)枝狀聚合物對(duì)細(xì)胞有毒性，這成為該聚合物應(yīng)用在人類患者身上的主要限制。此外，只有高度衍生的聚酰胺胺樹(shù)枝狀聚合物才顯示出可應(yīng)用的基因轉(zhuǎn)染效率，但制備此類聚合物的成本非常高。
將基因載體應(yīng)用在醫(yī)學(xué)的基因治療中，首要的考慮是安全性和對(duì)細(xì)胞可能造成的傷害，然后是轉(zhuǎn)染效率。上述的有效基因傳遞所需的大分子量陽(yáng)離子聚合物通常都有固有的缺陷，即對(duì)細(xì)胞有毒性。另一方面，盡管低分子量的陽(yáng)離子聚合物或低聚物通常顯示出較小的細(xì)胞毒性或者沒(méi)有細(xì)胞毒性，但它們也不具有明顯的基因轉(zhuǎn)染效率。解決這一矛盾的方法之一是合成一種生物可降解的陽(yáng)離子聚合物，該聚合物在基因傳遞至所需細(xì)胞的核內(nèi)之后會(huì)降解為小分子。
目前，有報(bào)道稱使用由可降解陽(yáng)離子聚合物制成的基因載體，可成功地將基因傳遞至哺乳動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)部且細(xì)胞毒性大幅下降。(Lim YB，Kim SM，Lee Y，Lee WK，Yang TG，Lee MJ，Suh H，Park JS，J.，CationicHyperbranched Poly(amino ester)A Novel Class of DNA CondensingMolecule with Cationic Surface，Biodegradable Three-Dimensional Structure，and Tertiary Amine Groups in the Interior，J.Am.Chem.Soc.，123(10)，2460-2461，2001)。然而，與不可降解聚合物主鏈相比，這些聚合物的基因傳遞效率較低，原因可能是這些聚合物在水溶液中快速地降解導(dǎo)致在基因傳遞試劑的制備過(guò)程中或者在基因傳遞至細(xì)胞內(nèi)部之前其基因傳遞效力迅速地喪失。在控制降解速率及合成生物可降解的陽(yáng)離子聚合物方面的困難限制了這些聚合基因載體在體內(nèi)基因傳遞和臨床患者中的應(yīng)用。
為了提高低分子量PEI的轉(zhuǎn)染效率，Gosselin等人(Gosselin，MichealA.，Guo，Menjin，and Lee，Robert J.Efficient Gene Transfer Using ReversiblyCross-Linked Low Molecular Weight Polyethylenimine.Bioconjugate Chem.2001.12232-245)報(bào)道稱通過(guò)使用含二硫化物的鏈接劑，二硫代雙(丁二酰亞胺基丙酸酯)(DSP)和二甲基-3，3’-二硫代雙丙酰亞胺酯-2HCl(DTBP)可以獲得高分子量的PEI，且該聚合物顯示出有相當(dāng)?shù)幕騻鬟f效率和更低的細(xì)胞毒性。因?yàn)榧?xì)胞質(zhì)內(nèi)是明顯的還原性環(huán)境，因此可以合理地預(yù)期通過(guò)交聯(lián)試劑引入的二硫鍵會(huì)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被還原，使得在基因傳遞到進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞核內(nèi)部之前，PEI結(jié)合物就已經(jīng)被破壞了。然而，Gosselin等人使用的含二硫化物的鏈接劑價(jià)格昂貴，使得大規(guī)模制備此類系統(tǒng)很困難且沒(méi)有必要。此類包含有含二硫化物的鏈接劑的聚合物只能在還原條件下降解，因此限制了該聚合物在其它條件下的應(yīng)用。并且，Gosselin等人僅公開(kāi)了支化PEI-800 Da的應(yīng)用，且在大量應(yīng)用于人體時(shí)該化合物仍表現(xiàn)出有細(xì)胞毒性。此外，如果原料是低分子量的陽(yáng)離子化合物(如五亞乙基六胺、N-(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺)，按照Gosselin的方法很難得到有很高基因傳遞效率的聚合物。
Lynn等人(Lynn，David A.；Anderson，Daniel G.；Putnam，David；andLanger，Robert.Accelerated Discovery of Synthetic Transfection VectorsParallel Synthesis and Screening of a Degradable Polymer Library.J.Am.Chem.Soc.2001，123，8155-8156.)描述了一種用二丙烯酸酯作為陽(yáng)離子化合物之間的鏈接劑分子來(lái)合成生物可降解陽(yáng)離子聚合物的方法。然而，生成的聚合物是線性的且陽(yáng)離子密度較低，因而不足以凝縮DNA。合成這些聚合物需要很長(zhǎng)時(shí)間，并且可用于基因傳遞的有效產(chǎn)物的量較低。按照Lynn等人的方法生產(chǎn)了一百多種陽(yáng)離子聚合物，但其中只有兩種顯示出有效的基因轉(zhuǎn)染效率。這些因素使得按照這種方法難以實(shí)現(xiàn)制備高分子量的聚合物。
發(fā)明概述 當(dāng)前需要一種聚合轉(zhuǎn)染載體，該載體是能有效傳遞基因材料的高分子量的陽(yáng)離子聚合物，但是為了使其細(xì)胞毒性和對(duì)細(xì)胞的損傷最小化，該載體必須是可控降解的。雖然本說(shuō)明書(shū)主要描述了可降解聚合物，但這并不排除使用基本上不可降解的聚合物。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一種合成可控降解的陽(yáng)離子聚合物及各種生物可降解聚合物的方法?？梢詫⑸锓肿?如核酸和縮氨酸)及合成藥物和其它分子與此類聚合物共軛或配合，從而為這些分子提供了一種傳遞機(jī)理。此類聚合物的可控制時(shí)間和空間的降解作用，在使細(xì)胞損傷最小化的同時(shí)，為真核生物細(xì)胞(尤其是高級(jí)真核生物細(xì)胞)的高效轉(zhuǎn)染提供了興趣分子。
進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了一種將低分子量的陽(yáng)離子化合物或低聚物轉(zhuǎn)化為低細(xì)胞毒性的高效轉(zhuǎn)染材料的簡(jiǎn)單方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在溫和條件下和很短時(shí)間內(nèi)，使用了一個(gè)合成步驟完成了整個(gè)合成過(guò)程。因?yàn)檫@種合成方法的大部分原料都是商業(yè)銷售的，因此該方法可以很容易地以很低的成本放大到生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。
此外，上述聚合物的合成方法效率很高。所觀察到的按照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的聚合物的轉(zhuǎn)染效率比以其它商業(yè)銷售的聚合基因載體為媒介的轉(zhuǎn)染效率更高。
此處所述的聚合物合成方法根據(jù)可用來(lái)制造高分子量聚合物的分子種類而靈活變化。通過(guò)加入鏈接劑分子，可以將任何含至少三個(gè)氨基的陽(yáng)離子低聚物或化合物用作制造有用的聚合基因載體試劑的原料。本發(fā)明中的鏈接劑分子包含有可水解的鍵。它們也可以包含其它物理學(xué)上、生物學(xué)上或化學(xué)上可控?cái)嗔训逆I(如可還原鍵、含有酶特異剪切位點(diǎn)的縮氨酸)，或者物理上或化學(xué)上敏感的鍵(如光敏、pH值敏感或聲音敏感的分子)。本發(fā)明所指的聚合物的降解可以通過(guò)但不局限于以下方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括水解、酶消化、聲波降解法和物理降解法(如光分解)。
此處描述的聚合物合成方法提供了一種有用的方法，該方法可以很容易地生成一個(gè)用于優(yōu)化某些特殊應(yīng)用的反應(yīng)條件的聚合物庫(kù)。這些方法也可以用來(lái)合成多組聚合物庫(kù)，該庫(kù)用于設(shè)計(jì)和篩選具備研究人員所需特性(如某一特定的降解速率)的聚合物。
所述聚合物合成方法還提供了一種有用的方法，該方法通過(guò)簡(jiǎn)單地將陽(yáng)離子化合物與一個(gè)或多個(gè)含有興趣官能團(tuán)的鏈接劑交聯(lián)起來(lái)，從而很容易地將縮氨酸、糖或者蛋白質(zhì)與合成的聚合物相結(jié)合。也可以通過(guò)常用的方法(如通過(guò)含二硫鍵的基團(tuán))將所述配體引入該合成的聚合物中。也可以通過(guò)任何本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的方法將核酸、縮氨酸、藥物和其它官能團(tuán)等共軛/結(jié)合到所述聚合物上。
進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案包括具有可控降解速率的生物可降解陽(yáng)離子聚合物，與商業(yè)銷售的轉(zhuǎn)染試劑(如脂轉(zhuǎn)染胺試劑(Invitrogen)和SuperFect(Qiagen))相比較該聚合物表現(xiàn)出高基因轉(zhuǎn)染效率和低細(xì)胞毒性。通過(guò)簡(jiǎn)單地調(diào)整聚合物組成中各分子的比例或者改變各種鏈接劑分子，可以很容易地控制按此處描述的方法合成的聚合物的降解過(guò)程。
依照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了一種可降解的陽(yáng)離子聚合物，該聚合物包含多個(gè)陽(yáng)離子分子和至少一個(gè)通過(guò)支鏈方式與所述陽(yáng)離子分子連接的鏈接劑分子。所述的陽(yáng)離子分子選自 (i)式1的陽(yáng)離子化合物
式1 其中 R1是氫原子，含2-10個(gè)碳原子的烷基或雜烷基，含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基，或者另一個(gè)式1的化合物； R2是氫原子，含2-10個(gè)碳原子的烷基或雜烷基，或者含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基； R3是氫原子，含2-10個(gè)碳原子的烷基或雜烷基，或者含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基； R4是氫原子，含2-10個(gè)碳原子的烷基或雜烷基，含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基，或者另一個(gè)式1的化合物； R5是氫原子，含2-10個(gè)碳原子的烷基或雜烷基，含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基，或者另一個(gè)式1的化合物； (ii)陽(yáng)離子聚氨酸；和 (iii)陽(yáng)離子聚合碳水化合物； 可降解的鏈接劑分子由下式表示 CLn 其中C是間隔部分，其可以是含2-10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基或雜烷基，或者含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基，且可以包含帶有或不帶有雜原子的醚、酯、酰胺、亞酰胺、羰基；L是丙烯酸酯或異丁烯酸酯部分，且n是大于或等于二的整數(shù)；并且其中的C和L以共價(jià)鍵結(jié)合。
依照另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生物材料傳遞系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含至少一種生物分子，上述對(duì)生物分子有親合力的可降解陽(yáng)離子聚合物，和至少一種傳遞增強(qiáng)劑，該增強(qiáng)劑可以內(nèi)在化進(jìn)入真核生物細(xì)胞內(nèi)，并且促進(jìn)所述真核生物細(xì)胞內(nèi)的受體識(shí)別、內(nèi)在化、生物分子從核內(nèi)體中逸出、細(xì)胞核定位、生物分子釋放、或系統(tǒng)穩(wěn)定。
依照另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種醫(yī)療診斷系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含造影對(duì)比試劑，上述對(duì)生物分子有親合力的可降解陽(yáng)離子聚合物，和可識(shí)別真核生物細(xì)胞、組織或器官的特異受體的配體、抗體或試劑，其中所述的配體、抗體或試劑偶合在所述的可降解陽(yáng)離子聚合物上。
依照另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種藥物組合物，其中包含可被光或其它物理刺激功能上觸發(fā)的敏化劑，和上述可降解陽(yáng)離子聚合物，其中所述的聚合物對(duì)生物分子有親合力。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明 在以下附圖中所使用的本發(fā)明的不同陽(yáng)離子聚合物用CmLn來(lái)代表，其中Cm代表表1中所示的陽(yáng)離子化合物，而Ln代表表2中所示的鏈接劑分子。例如，C1L4代表一種包含表1中的陽(yáng)離子化合物C1和表2中的鏈接劑分子L4的陽(yáng)離子聚合物。


圖1是對(duì)所述的可降解陽(yáng)離子聚合物的合成和降解過(guò)程的說(shuō)明?！癈”代表陽(yáng)離子化合物或陽(yáng)離子低聚物，而“L”代表鏈接劑分子。
圖2說(shuō)明了低聚物C3、聚合物C3L1和C4L1對(duì)DNA的結(jié)合親合力。聚合物/DNA的重量比顯示為16、8、4、2、1和0.5，而自由DNA(不受聚合物控制)顯示為聚合物/DNA重量比0。M指示了1kb的DNA分子的標(biāo)記子。
圖3顯示了某些陽(yáng)離子低聚物和聚合物的電泳圖案。泳道1-3分別是分子量為25KD，10KD和1.8KD的支化PEI。C3是支化PEI600D，PLL是分子量為30KD的聚-L-賴氨酸，而C3L1是由C3和L1衍生出來(lái)的聚合物。
圖4說(shuō)明了轉(zhuǎn)染后第24小時(shí)不同聚合物對(duì)綠色熒光蛋白(GFP)基因的轉(zhuǎn)染效率，其中Y軸指示了轉(zhuǎn)染中使用的聚合物/DNA重量比。
圖5說(shuō)明了使用所述可降解陽(yáng)離子聚合物和商業(yè)銷售的轉(zhuǎn)染試劑對(duì)293細(xì)胞進(jìn)行GFP基因轉(zhuǎn)染之后觀察到的GFP信號(hào)。
圖6說(shuō)明了使用各種聚合物對(duì)293細(xì)胞進(jìn)行pCMV-Luc基因轉(zhuǎn)染后第24小時(shí)熒光素酶的活性。
圖7說(shuō)明了使用不同聚合物-DNA配合物處理后的細(xì)胞的存活情況。
圖8A應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳法說(shuō)明在37℃下經(jīng)過(guò)0h(A)、6h(B)、12h(C)、1d(D)、2d(E)、3d(F)、4d(G)和6d(H)培養(yǎng)的C3L1的分子量的變化。泳道1含有支化PEI10K，而泳道2含有支化PEI25K。泳道3和泳道4分別含有C4和C3。
圖8B說(shuō)明了將C3L1在37℃下培養(yǎng)0h、6h、12h、1d、2d、3d、4d和6d之后，使用該C3L1進(jìn)行GFP基因轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率。
圖9A應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳法說(shuō)明了在37℃下經(jīng)過(guò)0(A)、6h(B)、12h(C)、1d(D)、2d(E)、3d(F)、4d(G)和6d(H)培養(yǎng)的C3L2的分子量的變化。泳道1含有BPEI10K而泳道2含有C3。
圖9B說(shuō)明了將C3L2和C3L1在37℃下培養(yǎng)0h、6h、12h、1d、2d、3d、4d和6d之后，使用他們進(jìn)行GFP基因轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率。
圖10說(shuō)明了使用不同聚合物傳遞ODN之后的FITC信號(hào)，還說(shuō)明了使用不同聚合物時(shí)的ODN轉(zhuǎn)染效率。
圖11提供了一些按照下面優(yōu)選的實(shí)施方案所述，可以使用的陽(yáng)離子分子的例子。然而，可以使用的陽(yáng)離子分子并不局限于這些例子。
圖12提供了一些按照下面優(yōu)選的實(shí)施方案所述，可以使用的鏈接劑分子的例子。然而，可以使用的鏈接劑分子并不局限于這些例子。
圖13提供了一些按照本文描述的優(yōu)選實(shí)施方案所述，可以使用的除異丁烯酸酯基之外的其它具有氨基反應(yīng)活性的殘基的例子。然而，可以使用的有反應(yīng)活性的殘基并不局限于這些例子。
圖14是被轉(zhuǎn)染細(xì)胞所占百分比的示意圖，使用不同聚合物(CmLn)將GFP基因轉(zhuǎn)染入這些細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行了蛋白質(zhì)表達(dá)。應(yīng)用陽(yáng)離子化合物和鏈接劑的不同組合來(lái)制備陽(yáng)離子聚合物載體。然而，可以應(yīng)用的陽(yáng)離子聚合物載體并不局限于這些例子。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明 在此描述了一種可降解的陽(yáng)離子聚合物，該聚合物用于傳遞生物分子(核酸、縮氨酸等)、藥物、醫(yī)學(xué)造影應(yīng)用中使用的分子、癌癥治療中使用的敏化劑，和組織工程中使用的分子。此外還提供了一種合成這些聚合物的方法。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，可以使用陽(yáng)離子分子或任何包含有三個(gè)以上反應(yīng)位點(diǎn)的氨基基團(tuán)的分子。當(dāng)用作使基因或核酸轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞的載體時(shí)，這些低分子量的陽(yáng)離子化合物或低聚物通常表現(xiàn)出沒(méi)有或者很低的轉(zhuǎn)染效率。然而，它們與具有高轉(zhuǎn)染效率的更高分子量的載體相比，確實(shí)具有很低的細(xì)胞毒性或沒(méi)有細(xì)胞毒性。因?yàn)榻到庋杆?，生物可降解的?yáng)離子聚合物通常在表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性的同時(shí)也表現(xiàn)出低的轉(zhuǎn)染效率，因此與用于基因轉(zhuǎn)移和其它應(yīng)用的其它載體相比，它們的競(jìng)爭(zhēng)力較低。可以通過(guò)可降解的鏈接劑將低分子量的陽(yáng)離子化合物或低聚物連接起來(lái)，從而提高這些可降解陽(yáng)離子聚合物的轉(zhuǎn)染效率。這些鏈接劑含有生物學(xué)上、物理學(xué)上、或化學(xué)上可斷裂的鍵，如可水解鍵、可還原鍵、含有酶特異剪切位點(diǎn)的縮氨酸序列、pH敏感的或聲波敏感的鍵。這些聚合物的降解過(guò)程可以通過(guò)但不局限于以下的方法進(jìn)行，包括水解、酶消化和物理降解方法如光裂解(光分解)。
此外，可以通過(guò)將可降解聚合物與病毒性或非病毒性蛋白共軛或結(jié)合，從而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)染效率。例如，可以將囊狀口腔炎病毒G蛋白(VSVG)和其它本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的縮氨酸或蛋白質(zhì)加到所述聚合物上，以提高其轉(zhuǎn)染效率。
此處所述聚合物的最吸引人的特性之一在于，根據(jù)鏈接劑的類型和結(jié)構(gòu)不同，該聚合物的降解過(guò)程在聚合物降解的速率和位置上是可以控制的。
可以用陽(yáng)離子低聚物(如低分子量的聚乙烯亞胺(PEI)、低分子量的聚(L-賴氨酸)(PLL)、低分子量的殼聚糖和低分子量的PAMAM聚合復(fù)合物)來(lái)生產(chǎn)此處所述的聚合物。此外，可以使用任何包含有三個(gè)以上反應(yīng)位點(diǎn)的氨基的分子。陽(yáng)離子化合物可以選自但并不局限于下列物質(zhì) (i)式1的陽(yáng)離子化合物
式1 其中 R1是氫原子，含2-10個(gè)碳原子的烷基或雜烷基，含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基，或者另一個(gè)式1的化合物； R2是氫原子，含2-10個(gè)碳原子的烷基或雜烷基，或者含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基； R3是氫原子，含2-10個(gè)碳原子的烷基或雜烷基，或者含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基； R4是氫原子，含2-10個(gè)碳原子的烷基或雜烷基，含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基，或者另一個(gè)式1的化合物； R5是氫原子，含2-10個(gè)碳原子的烷基或雜烷基，含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基，或者另一個(gè)式1的化合物； (ii)陽(yáng)離子聚氨酸；和 (iii)陽(yáng)離子聚合碳水化合物； 這些陽(yáng)離子分子的例子包括但不局限于圖11和表1中所示的陽(yáng)離子分子。
表1依照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的陽(yáng)離子化合物和低聚物的結(jié)構(gòu)

此處使用的陽(yáng)離子聚合物可以包含伯胺基或仲胺基，該基團(tuán)可以與活性配體如糖、縮氨酸、蛋白質(zhì)和其它分子共軛結(jié)合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將乳糖酸共軛結(jié)合到所述陽(yáng)離子聚合物上。因?yàn)楦渭?xì)胞表面存在半乳糖受體，所以該半乳糖基單元提供了有用的指向肝細(xì)胞的靶向分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將乳糖共軛結(jié)合到可降解陽(yáng)離子聚合物上，從而在該聚合物上引入半乳糖基單元。
可降解的鏈接分子包括但不局限于含有至少一個(gè)生物可降解間隔部位的二-丙烯酸酯和多-丙烯酸酯、二-異丁烯酸酯和多-異丁烯酸酯、二-丙烯酰胺和多-丙烯酰胺、二-異硫氰酸酯和多-異硫氰酸酯、二-異氰酸酯和多-異氰酸酯、二-環(huán)氧化物和多-環(huán)氧化物、二-醛和多-醛、二-酰氯和多-酰氯、二-磺酰氯和多-磺酰氯、二-鹵化物和多-鹵化物、二-酸酐和多-酸酐、二-馬來(lái)酰亞胺和多-馬來(lái)酰亞胺、二-羧酸和多-羧酸、二-á-乙酰鹵基和多-á-乙酰鹵基，和二-N-羥基丁二酰亞胺酯和多-N-羥基丁二酰亞胺酯。下式表示可以依照優(yōu)選實(shí)施方案使用的鏈接劑 CLn 其中C是間隔部位，其可以是含2-10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基或雜烷基，或者含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基，且可以包括有或沒(méi)有雜原子的醚、酯、酰胺、亞酰胺、羰基；L是丙烯酸酯或異丁烯酸酯部分，且n是大于等于二的整數(shù)；并且其中C和L以共價(jià)鍵結(jié)合。圖12中提供了幾個(gè)鏈接劑分子的例子，然而此處也預(yù)想和描述了這些分子的其它實(shí)施方案。
圖13說(shuō)明了所述鏈接劑分子反應(yīng)殘基的幾個(gè)實(shí)施方案，然而這些例子并不用于限制本發(fā)明的范圍。該反應(yīng)殘基可以選自但并不局限于丙烯酰基、馬來(lái)酰亞胺、鹵化物、羧基酰鹵、異氰酸酯、異硫氰酸酯、環(huán)氧化物、醛、磺酰氯、和N-羥基丁二酰亞胺酯及其組合物。此處也公開(kāi)了所述鏈接劑和陽(yáng)離子分子的其它實(shí)施方案。表2列出本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中使用的鏈接劑。
表2本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中應(yīng)用的生物可降解的鏈接劑分子的結(jié)構(gòu)

可以通過(guò)改變所述聚合物的組成、進(jìn)料比例和該聚合物的分子量，來(lái)控制該聚合物的降解速率。例如，當(dāng)使用含較大烷基的鏈接劑時(shí)，所述聚合物降解較慢。此外，在某些情況下增加分子量也會(huì)導(dǎo)致降解速率的下降?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)整陽(yáng)離子聚合物和鏈接劑的比例或者通過(guò)改變各種可降解的鏈接劑分子，來(lái)控制所述聚合物的降解速率。
在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以產(chǎn)生不可降解的陽(yáng)離子聚合物。在這些聚合物中，陽(yáng)離子化合物之間的一種或多種鏈接劑分子用此處描述的方法是不可降解的。
因?yàn)楹蚧锏逆溄觿┑暮铣筛鼮槔щy，所以丙烯酸酯鏈接劑比含二硫化物的鏈接劑廉價(jià)得多。丙烯酰酯鏈接劑在任何水溶液中都是可降解的，所以，只要其中含有水，含有丙烯酰酯鏈接劑的聚合物可以在各種環(huán)境中降解。因此，含丙烯酸酯鏈接劑的聚合物與含二硫化物鏈接劑的聚合物相比，具有廣泛的應(yīng)用。此外，含二硫化物鏈接劑的聚合物的降解速率通常是一樣的，但是用丙烯酸酯鏈接劑合成的聚合物的降解速率根據(jù)所使用的丙烯酸酯鏈接劑的不同而變化。
此處所述的制備陽(yáng)離子聚合物的合成方法簡(jiǎn)單且成本相對(duì)較低。通過(guò)使用不同的陽(yáng)離子化合物或低聚物與鏈接劑分子的組合，或者通過(guò)改變陽(yáng)離子化合物與鏈接劑的比例，可以得到一個(gè)生物可降解的陽(yáng)離子聚合物庫(kù)?？梢酝ㄟ^(guò)使用不同的陽(yáng)離子化合物與鏈接劑的組合，或者通過(guò)改變陽(yáng)離子化合物與鏈接劑的比例來(lái)調(diào)整庫(kù)中聚合物的物理和化學(xué)性質(zhì)。庫(kù)中的聚合物可以作為可降解的基因載體，將興趣質(zhì)粒DNA和反義寡-DNA引入細(xì)胞內(nèi)。圖14所示的GFP轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，這些聚合物中50％以上可以有效地將GFP基因傳遞到細(xì)胞內(nèi)并產(chǎn)生蛋白質(zhì)表達(dá)。
實(shí)施例1 合成概述 圖1說(shuō)明了支鏈型的或輕微交聯(lián)的生物可降解陽(yáng)離子聚合物的合成過(guò)程?？梢杂眠@種合成方法來(lái)生成支鏈型的或輕微交聯(lián)的生物可降解陽(yáng)離子聚合物的大型庫(kù)。圖中也對(duì)本發(fā)明的陽(yáng)離子聚合物的降解過(guò)程進(jìn)行了說(shuō)明。
在圖1中，C代表有至少三個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)(用于邁克爾加成)的含氨基的陽(yáng)離子化合物或低聚物，且L代表含至少兩個(gè)丙烯酸酯基的化合物。C和L之間的反應(yīng)在有機(jī)溶劑中，在很溫和的條件下進(jìn)行。反應(yīng)后，可以通過(guò)兩種不同的方法回收所述聚合物。在第一種方法中，通過(guò)在減壓條件下直接除去溶劑來(lái)回收該聚合物。在第二種方法中，該聚合物通過(guò)加酸(如鹽酸)中和，且中和后的聚合物通過(guò)過(guò)濾或離心分離回收?？梢酝ㄟ^(guò)控制C和L的比例、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、溶劑和溶質(zhì)濃度來(lái)得到支鏈型的或輕微交聯(lián)的水溶性的高分子量聚合物。
實(shí)施例2 通過(guò)使用二丙烯酸酯鏈接劑交聯(lián)陽(yáng)離子低聚物制備，并通過(guò)直接除去溶劑將其回收的聚合物 可以通過(guò)多種本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的方法來(lái)進(jìn)行按照本發(fā)明所述的高分子量的陽(yáng)離子聚合物的合成。下面提供了衍生自分子量為600的聚乙烯亞胺低聚物(PEI-600)及二丙烯酸-1，3-丁二酯(1，3-BDODA)的聚合物的合成過(guò)程，作為通用的方法，該方法可以作為使用類似化合物的其它合成方法的模板，這些類似化合物可以用來(lái)合成一系列可降解的陽(yáng)離子聚合物。稱取0.44g PEI-600(Aldrich)裝入一個(gè)小瓶中，并加入6ml二氯甲烷。當(dāng)PEI-600完全溶解后，在攪拌的同時(shí)緩慢加入含有0.1g1，3-BDODA的2ml二氯甲烷溶液。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌10小時(shí)。減壓下除去有機(jī)溶劑之后，得到0.55g透明的粘稠的液體。1H-核磁共振譜圖顯示丙烯酸的碳-碳雙鍵徹底地消失了。使用瓊脂糖凝膠電泳估算所得聚合物的分子量。通過(guò)類似方法，可制備與此處所使用的鏈接劑有類似結(jié)構(gòu)的其它陽(yáng)離子低聚物和其它鏈接劑衍生出來(lái)的其它支鏈型的或輕微交聯(lián)的可降解陽(yáng)離子聚合物。
實(shí)施例3 通過(guò)使用二丙烯酸酯鏈接劑交聯(lián)陽(yáng)離子低聚物制備，并在用酸中和后將其回收的聚合物 下面提供的衍生自PEI-600及二丙烯酸1，6-己二酯(1，6-HDODA)的聚合物的合成過(guò)程，可作為通用的方法，該方法可以作為使用類似化合物的其它合成方法的模板，這些類似化合物可以用來(lái)合成一系列可降解的陽(yáng)離子聚合物。使用移液管或注射器將含有0.43g PEI-600的2ml二氯甲烷溶液加入20ml的小瓶中。攪拌下將0.23g(1.0mmol)的1，6-HDODA快速加入上述PEI-600溶液中。通過(guò)加入更多二氯甲烷將反應(yīng)溶液中的PEI-600濃度調(diào)節(jié)至0.1g/ml。室溫下(25℃)將反應(yīng)混合物攪拌5小時(shí)。然后，加入2.5ml 4M的HCl中和反應(yīng)混合物。將生成的白色沉淀過(guò)濾，用二氯甲烷洗滌并在室溫下減壓干燥。所得的聚合物用NMR譜圖和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行表征。通過(guò)類似的方法，也可以用與此處所使用的有類似結(jié)構(gòu)的其它陽(yáng)離子低聚物(如聚丙烯亞胺)和其它聚烯亞胺來(lái)制備其它不同的可降解陽(yáng)離子聚合物。
實(shí)施例4 通過(guò)使用多-丙烯酸酯鏈接劑交聯(lián)陽(yáng)離子低聚物制備的聚合物 可以用含三個(gè)或三個(gè)以上丙烯酸酯基的丙烯酸酯型鏈接劑來(lái)交聯(lián)如實(shí)施例2和3中所述的陽(yáng)離子低聚物。但是，與二丙烯酸酯鏈接劑相比，當(dāng)使用含三個(gè)或多于三個(gè)丙烯酸酯基的鏈接劑與陽(yáng)離子聚合物交聯(lián)時(shí)，所需的鏈接劑的摩爾比更低。下面提供了使用三丙烯酸三羥甲基丙烷酯(TMOPTA)交聯(lián)PEI-600的反應(yīng)過(guò)程，作為通用的方法，該方法可以作為其它使用類似化合物的合成方法的模板。攪拌下，將含有0.13g(0.44mmol)TMOPTA的2ml二氯甲烷溶液快速加入含有0.43g PEI-600的2ml二氯甲烷溶液中。通過(guò)加入更多二氯甲烷將反應(yīng)溶液中的PEI-600濃度調(diào)節(jié)至0.1g/ml。室溫下(25℃)將反應(yīng)混合物攪拌5小時(shí)，并用和實(shí)施例3中相同的方法回收生成的聚合物?？梢杂妙愃品椒?，通過(guò)使用與此處所使用的有類似結(jié)構(gòu)的其它多-丙烯酸酯鏈接劑交聯(lián)其它聚烯亞胺來(lái)制備聚合物。
實(shí)施例5 通過(guò)使用丙烯酸酯鏈接劑交聯(lián)PAMAM低聚物制備的聚合物 按照本發(fā)明中的方法，可以將末端帶伯胺基或仲胺基的聚(酰胺胺)樹(shù)枝狀聚合物(PAMAM)作為陽(yáng)離子低聚物制備可降解陽(yáng)離子聚合物。為了得到均質(zhì)的溶液，此處使用甲醇和二氯甲烷的混合溶劑作為溶劑。將0.1g PAMAM(第二代，含0.39mmol伯胺基)溶解在由0.5ml甲醇和1.0ml二氯甲烷構(gòu)成的混合溶劑中。攪拌下，向溶液中加入含有40mg1，3-BDODA的1ml二氯甲烷溶液。在5℃攪拌10h后，將0.25ml 2M HCl加入反應(yīng)混合物中。通過(guò)離心分離回收生成的聚合物，并在常溫下減壓干燥?？梢酝ㄟ^(guò)類似的方法，制備衍生自與此處所用的有類似結(jié)構(gòu)的PAMAM低聚物和其它丙烯酸酯鏈接劑的聚合物。
實(shí)施例6 通過(guò)使用丙烯酸酯鏈接劑交聯(lián)聚(氨基酸)低聚物制備的聚合物 將0.11g氫溴化聚(L-賴氨酸)低聚物(Mw1000-3000)和50mg三乙胺溶解在1.0ml干燥的DMSO中。向上述溶液中快速加入含42mg二丙烯酸-2，4-戊二酯(2，4-PDODA)的1.0ml干燥DMSO溶液。室溫下攪拌6小時(shí)后，通過(guò)加入0.5M HCl水溶液將反應(yīng)混合物的pH值調(diào)節(jié)至4.5。在HCl水溶液中(pH4.0，4℃)使用MWCO為3000的透析管進(jìn)行透析來(lái)純化所生成的聚合物，并使用凍-干法回收?？梢酝ㄟ^(guò)類似的方法，制備衍生自與此處所使用的有類似結(jié)構(gòu)的其它含三個(gè)以上伯胺基或仲胺基的聚(氨基酸)低聚物和其它丙烯酸酯鏈接劑的聚合物。
實(shí)施例7 通過(guò)使用丙烯酸酯鏈接劑交聯(lián)多-胺制備的聚合物 除實(shí)施例2-6中使用的陽(yáng)離子低聚物外，按照本發(fā)明中的交聯(lián)方法，也可以用低分子量的多-胺來(lái)制備所述的可降解陽(yáng)離子聚合物。下面提供了使用二(三羥甲基丙烷)四丙烯酸酯(DTMOPTA)交聯(lián)五亞乙基六胺(PEHA)的反應(yīng)過(guò)程作為通用的方法，該方法可以作為其它使用類似化合物的合成方法的模板。稱取0.23g PEHA加入盛有2ml二氯甲烷的小瓶中。當(dāng)PEHA完全溶解后，攪拌下將含有0.28g DTMOPTA的1ml二氯甲烷溶液緩慢加入上述溶液中。另外再加入2ml二氯甲烷。室溫下攪拌8小時(shí)后，加入2ml 4M HCl中和該反應(yīng)混合物。生成的聚合物通過(guò)直接去除有機(jī)溶劑來(lái)回收，然后在室溫下減壓干燥。可以通過(guò)類似的方法，制備衍生自其它與此處所使用的多-胺和丙烯酸酯鏈接劑有類似結(jié)構(gòu)的多-胺和丙烯酸酯鏈接劑的聚合物。
實(shí)施例8 一個(gè)由通過(guò)使用丙烯酸酯鏈接劑交聯(lián)陽(yáng)離子低聚物或化合物制備的可降解陽(yáng)離子聚合物庫(kù) 以實(shí)施例2-6所述的方法為基礎(chǔ)，可以由不同的陽(yáng)離子低聚物或化合物與不同的鏈接劑制備一個(gè)由支鏈型的或輕微交聯(lián)的、水溶性的、可降解陽(yáng)離子聚合物庫(kù)。本發(fā)明中使用的陽(yáng)離子低聚物或化合物和鏈接劑分別顯示但并不局限于表1和表2中，本發(fā)明中制備的聚合物顯示但并不局限于表3中?？梢酝ㄟ^(guò)控制陽(yáng)離子化合物與鏈接劑的比例、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、溶劑和溶質(zhì)的濃度來(lái)調(diào)整所述聚合物的性質(zhì)。其中某些聚合物用其對(duì)GFP報(bào)道基因的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了評(píng)估(圖11)。表3使用不同陽(yáng)離子化合物和鏈接劑制備的聚合物 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L9 L10 L11 L12 L13 C1 C1L1 C1L3 C1L4 C1L5 C1L6 C1L7 C1L8 C2 C2L1 C2L3 C2L5 C2L6 C2L7 C2L8 C3 C3L1 C3L2 C3L6 C3L7 C3L8 C3L9 C3L10 C3L11 C3L12 C3L13 C4 C4L1 C4L2 C4L9 C4L11 C5 C5L1 C5L3 C5L5 C5L6 C5L7 C5L8 C6 C6L3 C6L6 C6L7 C6L8 C7 C7L3 C7L5 C7L6 C7L7 C7L8 C8 C8L1 C8L3 C8L5 C8L6 C8L7 C8L8 C9 C9L1 C9L3 C9L5 C9L6 C9L7 C9L8 C10 C10L1 C10L2 C11 C11L1 C11L3 C12 C12L3 C12L6 C12L7 C12L8 C13 C13L3 C13L6 C13L7 C13L8 C14 C14L1 C14L3 C14L5 C14L6 C14L7 C14L8 C15 C15L1 C15L3 C13L4 C16 C16L5 C16L8 實(shí)施例9 通過(guò)使用雙環(huán)氧化合物鏈接劑交聯(lián)陽(yáng)離子低聚物制備的基本上不可降解的陽(yáng)離子聚合物 下面提供了使用甘油醇二縮水甘油醚交聯(lián)PEI-600制備聚合物的合成過(guò)程，作為通用的方法，該方法可以作為其它用來(lái)合成一系列不可降解陽(yáng)離子聚合物的合成方法的模板。將0.43g PEI-600和0.37g甘油醇二縮水甘油醚溶解在7.0ml甲醇中。將反應(yīng)溶液在40℃攪拌48h。冷卻至室溫后，向反應(yīng)溶液中加入2.5ml 4M HCl(在二噁烷中)，產(chǎn)生白色沉淀。生成的聚合物用離心分離法回收并在室溫下減壓干燥。所得聚合物用NMR譜圖和瓊脂糖凝膠電泳表征?？梢酝ㄟ^(guò)類似的方法制備使用其它雙環(huán)氧化合物鏈接劑交聯(lián)其它陽(yáng)離子低聚物制備的聚合物。
實(shí)施例10 通過(guò)使用多-環(huán)氧化合物鏈接劑交聯(lián)多-胺制備的基本上不可降解的陽(yáng)離子聚合物 下面提供了使用三羥甲基丙烷三縮水甘油醚(TMOPTE)交聯(lián)N，N’-雙(2-氨基丙基)-乙二胺(BAPEDA)制備聚合物的合成過(guò)程，作為通用的方法，該方法可以作為其它使用類似化合物的合成方法的模板。將0.18gBAPEDA和0.24g TMOPTE溶解在3.0ml甲醇中。反應(yīng)溶液在35℃下攪拌74小時(shí)。冷卻至室溫后，向反應(yīng)溶液中加入1.0ml 4M HCl(在二噁烷中)，生成的沉淀聚合物通過(guò)減壓除去溶劑進(jìn)行回收。所得聚合物用NMR譜圖和瓊脂糖凝膠電泳表征。可以通過(guò)類似的方法制備使用其它多-環(huán)氧化合物鏈接劑交聯(lián)其它多-胺制備的聚合物。
實(shí)施例11 半乳糖基單元連接到所述陽(yáng)離子聚合物上的過(guò)程 在本合成方法的一個(gè)實(shí)施方案中，將102mg聚合物C3L5和50ml乳糖酸加入10ml水中，并用Na2CO3水溶液調(diào)節(jié)至pH5.5。劇烈攪拌下加入25mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺。室溫下攪拌5小時(shí)后，反應(yīng)溶液在水(pH＝3.5)中透析24小時(shí)。生成的連有半乳糖基的聚合物用凍-干法回收，并用NMR譜圖表征。
實(shí)施例12 DNA阻滯實(shí)驗(yàn) 結(jié)合和凝縮DNA是以陽(yáng)離子聚合物為媒介的基因轉(zhuǎn)染過(guò)程的第一步。DNA阻滯實(shí)驗(yàn)通常用于判斷DNA聚合物的結(jié)合親合力。低DNA結(jié)合能力的聚合物通常表現(xiàn)出低的或者沒(méi)有轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)方案如下所述。簡(jiǎn)而言之，在渦流條件下將溶在10μl DMEM(不含血清和抗體)中的不同比例的聚合物滴加入溶有0.2μg綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒的10μlDMEM(不含血清和抗體)中。在進(jìn)行電泳前，將生成的配合物在室溫下靜置15分鐘。分別在各配合物中加入5μl示蹤染料，并將每種混合物各取15μl裝入各孔中。使用電泳法分析DNA配合物，介質(zhì)使用含0.04M三價(jià)醋酸鹽緩沖劑、pH值為7.4、并含1mM EDTA的濃度為0.3％瓊脂糖凝膠，在電壓為100V條件下進(jìn)行30分鐘。DNA在UV照射下顯影。在電場(chǎng)中，自由DNA完全從孔中逸出，而在凝膠中可以看到質(zhì)粒條帶(每個(gè)樣品中的0線，圖2)。如果質(zhì)粒完全被聚合物包裹，那么它的遷移就被完全阻止了，因而在凝膠中就看不到條帶。然而如果質(zhì)粒沒(méi)有被聚合物結(jié)合，那么該質(zhì)粒就會(huì)從孔中遷移出來(lái)，因此在凝膠中只能觀察到被結(jié)合了的質(zhì)?；蛘呶埸c(diǎn)。在這個(gè)試驗(yàn)中，即使當(dāng)聚合物/DNA比例為16∶1時(shí)，下列物質(zhì)的DNA結(jié)合親合力也很弱，其包括原料陽(yáng)離子化合物或低聚物、五亞乙基六胺(C1)、線性PEI423Da(C2)、支化PEI 600Da(C3)和支化PEI 1200Da(C4)。質(zhì)粒仍然流失了(圖2，C3)。交聯(lián)之后，所有本發(fā)明的衍生自原料低聚物或陽(yáng)離子化合物的聚合物都表現(xiàn)出了高結(jié)合親合力。例如，當(dāng)聚合物/DNA比例為2∶1時(shí)，DNA遷移完全被C3L1阻止；而當(dāng)聚合物/DNA比例為4∶1時(shí)，DNA遷移完全被C4L1阻止(圖2，C4L1)。圖2的結(jié)果顯示，用本發(fā)明制造的聚合物的DNA結(jié)合親合力提高了。
實(shí)施例13 用瓊脂糖凝膠電泳法估算聚合物的分子量 分子量是決定DNA結(jié)合親合力和轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵問(wèn)題。高DNA結(jié)合親合力和轉(zhuǎn)染效率需要較高的分子量。本發(fā)明的重要優(yōu)點(diǎn)之一是可以將低分子量的陽(yáng)離子低聚物或陽(yáng)離子化合物轉(zhuǎn)變成較大分子量的聚合物。為了評(píng)估本發(fā)明合成的聚合物的分子范圍，進(jìn)行了一個(gè)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將聚合物溶解在150mM的NaCl溶液中達(dá)到最終濃度為5mg/ml。在每個(gè)孔中，各取20μl樣品與2μl 50％的甘油和1μlOregon紅色熒光染料混合，并裝載于含0.6％的瓊脂糖凝膠的TAE緩沖液中。電泳在100伏特下進(jìn)行30分鐘，聚合物的分子量可以通過(guò)在UV光下對(duì)熒光染料進(jìn)行顯影或者在用commassie藍(lán)染色之后進(jìn)行顯影來(lái)分析。聚合物的遷移速率取決于聚合物的大小。通常，在瓊脂糖凝膠中低分子量的聚合物比高分子量的聚合物遷移得更快。在這些實(shí)驗(yàn)中，在泳道1-3中，分別用支化的PEI25K、PEI10K、PEI1.8K作為聚合物分子量的標(biāo)準(zhǔn)。泳道C3是一種陽(yáng)離子低聚物(PEI0.6K)，它是合成聚合物C3L1的原料。對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)分子量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示聚合物C3L1的分子量遠(yuǎn)高于其原料(C3)的分子量(圖3)。
實(shí)施例14 體外轉(zhuǎn)染 在研究過(guò)程中，始終在不斷調(diào)整為個(gè)體實(shí)驗(yàn)制定的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)方案。將永久性細(xì)胞(293細(xì)胞和HT1080細(xì)胞，ATCC)鋪板在24孔的組織培養(yǎng)板中(293細(xì)胞，2×105個(gè)細(xì)胞/孔；HT1080細(xì)胞，8×104個(gè)細(xì)胞/孔)，并在含有10％FBS(Gibco)的DMEM(Gibco)中培養(yǎng)過(guò)夜。精確的質(zhì)粒/聚合物配合物的混和順序是決定轉(zhuǎn)染結(jié)果的重要參數(shù)。渦流條件下，在每一個(gè)孔中，將等份的含不同量的所述聚合物的30ìl DMEM滴加到含0.6ìg質(zhì)粒DNA(如pCMV-GFP質(zhì)粒DNA或pCMV-luc)的30ìl DMEM溶液中。室溫下，將聚合物-DNA溶液培養(yǎng)15分鐘以形成DNA-聚合物配合物。在上述DNA-聚合物配合物中加入含10％的FBS和抗體的150ìl(150微升)DMEM培養(yǎng)基，在用PBS清洗細(xì)胞之后，將混合物分別加入每一孔內(nèi)的細(xì)胞中。將細(xì)胞培養(yǎng)3小時(shí)(37℃，7.5％ CO2)，然后將培養(yǎng)基替換為含10％FBS和100U/ml盤(pán)尼西林及100ìg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，使用下述方法檢測(cè)GFP信號(hào)和螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性。根據(jù)生產(chǎn)商提供的方案，將Lipofectamine和Superfect用作正控制。
以新的合成聚合物為媒介的GFP報(bào)道基因轉(zhuǎn)染 在第一輪篩選中使用了綠色熒光蛋白(GFP)基因。轉(zhuǎn)染后，在熒光顯微鏡(Olympus，515-550nm濾光片)下觀察細(xì)胞內(nèi)的GFP信號(hào)。使用10X的物鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照。通過(guò)對(duì)三塊區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，可以確定轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中具備GFP信號(hào)的細(xì)胞比例，從而確定最佳的陽(yáng)離子聚合物用量。結(jié)果顯示原料聚合物C1、C2、C3和C4基本上沒(méi)有轉(zhuǎn)染效率。交聯(lián)之后，由上述原料衍生出來(lái)的聚合物則顯示出高的轉(zhuǎn)染效率。例如，C4L1、C3L1、C3L2、C2L3、C1L3、C1L4的轉(zhuǎn)染效率約為45％到55％，優(yōu)于LPEI25KDa(約45％)。
圖5顯示了使用C3、C4和C3L1、C4L1的通常結(jié)果。轉(zhuǎn)染24h后，在測(cè)試細(xì)胞內(nèi)，C3和C4基本上沒(méi)有顯示出GFP信號(hào)。C4L1和C3L1則顯示出非常明亮的GFP信號(hào)，該結(jié)果與商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine(Gibco)相當(dāng)，且優(yōu)于另一種商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Superfect(Qiagen)。
以新的合成聚合物為媒介的熒光素酶報(bào)道基因轉(zhuǎn)染 按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)(熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)；Promega，Madison，WI，USA)使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行測(cè)量。簡(jiǎn)而言之，基因轉(zhuǎn)染三十小時(shí)后，測(cè)試細(xì)胞用PBS清洗兩次，然后在室溫下，用細(xì)胞溶解緩沖液(1％ Triton X-100、100mM K3PO4、2mM二硫蘇糖醇、10％甘油醇、和2mM EDTA pH7.8)溶解細(xì)胞15分鐘。然后室溫下，在光度計(jì)中將一份10ìl的細(xì)胞溶解產(chǎn)物與50ìl熒光素酶檢測(cè)劑用注射器混和。對(duì)光發(fā)射量測(cè)量三次，每次10秒，用RLUs(相對(duì)光單位)表示。用Coommassie蛋白質(zhì)檢測(cè)法(Pierce，Rockford，Illinois)將代表每一樣品中蛋白質(zhì)含量的相對(duì)光單位(RLU)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。圖6中顯示了使用各種轉(zhuǎn)染試劑對(duì)293和HT1080進(jìn)行pCMV-luc轉(zhuǎn)染的結(jié)果。結(jié)果顯示C4、C3和C2沒(méi)有轉(zhuǎn)染效率；其熒光素酶活性與背景相當(dāng)。交聯(lián)后，由這些低分子量陽(yáng)離子化合物衍生出來(lái)的C3L1、C4L1和C2L3則顯示出高轉(zhuǎn)染效率。C4L1的熒光素酶活性是1.88×106，高于支化PEI 25K和lipofectamin(熒光素酶活性分別為1.58和1.28×106)，并且與線性PEI 25K相比，其熒光素酶活性高7.9倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用本發(fā)明的方法可以顯著提高轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)而找到制造新轉(zhuǎn)染試劑的優(yōu)良方法。
實(shí)施例15 新合成聚合物對(duì)細(xì)胞的毒性 陽(yáng)離子基因載體對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞毒性可以用3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑葎溴化物(MTT)法評(píng)估。簡(jiǎn)而言之，將HT1080細(xì)胞(2×104細(xì)胞/孔)或293細(xì)胞(4×104個(gè)細(xì)胞/孔)接種在96孔培養(yǎng)板中，并培養(yǎng)16-24小時(shí)。將一份15μl含聚合物的DMEM滴加在15μl含0.3μg質(zhì)粒的DMEM中，并在室溫下培養(yǎng)15分鐘以形成聚合物-DNA配合物。在聚合物-DNA配合物中加入75μl DMEM，取50μl該混合物加入細(xì)胞中，再培養(yǎng)3h(37℃，7.5％ CO2)。然后除去培養(yǎng)基，并加入含10％ FBS和100U/ml盤(pán)尼西林及100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，除去培養(yǎng)基并在每個(gè)孔中加入10ìl MTT溶液(5.0mg/ml，Sigma)，再培養(yǎng)3小時(shí)。然后除去培養(yǎng)基并加入200ìl DMSO以溶解生成的甲撍(formazan)晶體。在570nm處測(cè)量溶液的吸光度。細(xì)胞的成活力用下式進(jìn)行計(jì)算成活力(％)＝{Abs570(樣品)/Abs570(對(duì)照組)×100。所有的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三遍。結(jié)果顯示C4L1、C3L1、C2L3、C1L3的細(xì)胞毒性比支化PEI25K要低，即轉(zhuǎn)染后存活的細(xì)胞要多得多；這些聚合物的細(xì)胞毒性與LPEI 25K的類似或者更低(圖7)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用本發(fā)明的方法可以很容易地得到高基因轉(zhuǎn)染效率及較低細(xì)胞毒性的合成陽(yáng)離子聚合物。
實(shí)施例16 合成聚合物的可控降解 為了評(píng)估新的合成陽(yáng)離子聚合物的降解過(guò)程，將由PEI 600D衍生出來(lái)的C1L3在37℃用PBS分別培養(yǎng)6小時(shí)(h)、12h、1天(d)、2d、3d、4d和6d。在培養(yǎng)前后，采用分子量分析的凝膠譜圖(圖8A)和轉(zhuǎn)染效率(圖8B)對(duì)聚合物的降解過(guò)程進(jìn)行評(píng)估。分子量檢測(cè)的數(shù)據(jù)顯示培養(yǎng)前C1L3的分子量高于標(biāo)準(zhǔn)聚合物(PEI25K)。在37℃培養(yǎng)6小時(shí)后，凝膠上面部份的聚合物帶逐漸消失而凝膠底部的色帶逐漸累積，這一證據(jù)表明聚合物已降解為低分子量的低聚物。培養(yǎng)三天后，大多數(shù)的聚合物出現(xiàn)在低分子量區(qū)域中，表明聚合物基本上已完全降解了(圖8A)。這一結(jié)果與轉(zhuǎn)染效率變化的結(jié)果相一致，轉(zhuǎn)染效率變化的結(jié)果顯示，在37℃培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)染效率從30％降到0(圖8B)。
通過(guò)簡(jiǎn)單地改變不同類型的鏈接劑，可以很容易地得到具有不同降解速率的聚合物。例如，聚合物C3L1和C3L2是使用相同的陽(yáng)離子化合物C3(支化PEI 600D)合成的，但使用了不同的可水解的鏈接劑。C3L1是使用二丙烯酸-1，3-丁二酯(L1)合成的，而C3L2是使用二丙烯酸-2-甲基-2，4-異戊二酯(L2)合成的。這兩種生成的聚合物在凝膠電泳檢測(cè)法和在轉(zhuǎn)染檢測(cè)法中均顯示出不同的降解速率。轉(zhuǎn)染檢測(cè)法顯示，C3L2聚合物在37℃下用PBS培養(yǎng)24小時(shí)后，其轉(zhuǎn)染效率基本上沒(méi)有變化，在37℃下用PBS培養(yǎng)3天后僅下降了10％；然而在相同條件下培養(yǎng)24小時(shí)后，聚合物C3L1的轉(zhuǎn)染效率明顯地從40％降到了25％，培養(yǎng)3天后其轉(zhuǎn)染效率基本降到0％(圖9A)。瓊脂糖凝膠電泳的數(shù)據(jù)也與轉(zhuǎn)染檢測(cè)法中相一致，該數(shù)據(jù)顯示C3L2的分子量基本上沒(méi)有明顯的變化(圖9B，底部)，而C3L1的分子量在第6小時(shí)開(kāi)始變化，降解4天后則基本上和C3相同了(圖9B，頂部)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明聚合物的降解速率是可以控制的，并且可以通過(guò)使用不同的鏈接劑來(lái)實(shí)現(xiàn)所需的降解速率。
實(shí)施例17 以新的合成聚合物為媒介的反義寡脫氧核苷酸的傳遞 在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)C4、C3、C2、C3L1、C2L3、C1L3、BPEI25K和Lipofectamine的反義ODN傳遞效率進(jìn)行了測(cè)試。
在渦流攪拌的同時(shí)，將溶解在25μl DMEM(不含血清和抗體)中的不同比例的樣品滴加在含有FITC標(biāo)記的0.3μg ODN的10μl DMEM(不含血清和抗體)溶液中。15分鐘后，將150μl DMEM(不含血清和抗體)加入聚合物-ODN配合物中并混和。ODN的最終濃度是250nM。用PBS清洗置于24孔的培養(yǎng)板中的HeLa 705細(xì)胞，然后將聚合物-ODN配合物加入細(xì)胞中。在顯微鏡下觀察FITC信號(hào)。結(jié)果顯示C4、C3、C2沒(méi)有傳遞FITC標(biāo)記的ODN的效率。BPEI25K和Lipofectamine在傳遞ODN中有很高的效率。BPEI具有比Lipofectamine更高的傳遞效率，且當(dāng)PEI/ODN比例為0.25μg/0.3μg時(shí)，用ODN處理2小時(shí)后，約60-70％的細(xì)胞顯示出FITC信號(hào)。此時(shí)，在Lipofectamine組中只有5-10％的細(xì)胞是正信號(hào)。在ODN傳遞24小時(shí)后，在BPEI 25K組中有超過(guò)85％的細(xì)胞顯示出FITC信號(hào)，而在Lipofectamine組中有65％的細(xì)胞顯示出了FITC信號(hào)。所有3組樣品都顯示出高ODN傳遞效率。C3L1、C2L3、C1L3顯示出的傳遞效率比BPEI25K稍低，而其細(xì)胞毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于BPEI25K。C3L1、C2L3、C1L3的ODN傳遞效率均高于Lipofectamine(圖10)。
權(quán)利要求
1.一種可降解的陽(yáng)離子聚合物，該聚合物包含多個(gè)陽(yáng)離子分子和至少一個(gè)通過(guò)支鏈方式與所述陽(yáng)離子分子連接的鏈接劑分子，其中所述的陽(yáng)離子分子選自
(i)式1的陽(yáng)離子化合物
式1
其中
R1是氫原子，含2-10個(gè)碳原子的烷基或雜烷基，含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基，或者另一個(gè)式1的化合物；
R2是氫原子，含2-10個(gè)碳原子的烷基或雜烷基，或者含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基；
R3是氫原子，含2-10個(gè)碳原子的烷基或雜烷基，或者含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基；
R4是氫原子，含2-10個(gè)碳原子的烷基或雜烷基，含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基，或者另一個(gè)式1的化合物；
R5是氫原子，含2-10個(gè)碳原子的烷基或雜烷基，含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基，或者另一個(gè)式1的化合物；
(ii)陽(yáng)離子聚氨酸；和
(iii)陽(yáng)離子聚合碳水化合物；
并且其中所述的可降解的鏈接劑分子由下式表示
CLn
其中C是間隔部分，其可以是含2-10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基或雜烷基，或者含5-30個(gè)原子的芳基或雜芳基，且可以包含帶有或不帶有雜原子的醚、酯、酰胺、亞酰胺、羰基；L是丙烯酸酯或異丁烯酸酯部分，且n是大于或等于二的整數(shù)；并且其中的C和L以共價(jià)鍵結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物，其中所述聚合物是通過(guò)水解、酶裂解、還原、光裂解或者聲波降解法來(lái)降解的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物，其中所述陽(yáng)離子分子選自聚乙烯亞胺(PEI)、聚丙烯亞胺(PPI)、五亞乙基六胺、N，N-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺、N-(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺、N-(2-氨基丙基)-1，3-丙二胺、精胺、亞精胺、1，4-雙(3-氨基丙基)哌嗪、1-(2-氨基乙基)哌嗪、三(2-氨基乙基)胺、支化或樹(shù)枝狀聚酰胺胺(PAMAM)、聚(L-賴氨酸)(PLL)、和殼聚糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物，其中所述鏈接劑分子選自二丙烯酸1，3-丁二酯、二丙烯酸1，4-丁二酯、二丙烯酸1，6-己二酯、二丙烯酸二(乙二醇)酯、二丙烯酸聚(乙二醇)酯、二丙烯酸-2，4-戊二酯、二丙烯酸-2-甲基-2，4-異戊二酯、二丙烯酸-2，5-二甲基-2，5-己二酯、三丙烯酸三羥甲基丙烷酯、四丙烯酸季戊四酯、二(三羥甲基丙烷)四丙烯酸酯、二季戊四醇五丙烯酸酯和含至少三個(gè)丙烯酸酯或丙烯酰胺側(cè)基的聚酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物，其中所述聚合物的分子量是500Da到1,000,000Da。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物，其中所述聚合物的分子量是2,000Da到200,000Da。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物，其中所述陽(yáng)離子化合物的分子量是50Da到10,000Da。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物，其中所述鏈接劑分子的分子量是100Da到40,000Da。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物，其中所述聚合物上還配合了一種生物分子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物，其中所述生物分子選自核酸、蛋白質(zhì)、縮氨酸、脂類和碳水化合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物，其中所述核酸選自DNA、單鏈或雙鏈RNA、核酶、DNA-RNA雜交體和反義DNA。
12.一種對(duì)需要治療的患者的基因治療方法，該方法包括對(duì)患者施以權(quán)利要求11所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物。
13.一種轉(zhuǎn)染真核生物細(xì)胞的方法，該方法包括用權(quán)利要求11所述的聚合物接觸所述細(xì)胞。
14.一種將診斷造影組合物傳遞至個(gè)體的方法，該方法包括將診斷造影組合物共軛結(jié)合到權(quán)利要求1所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物上，并將結(jié)合后的聚合物施加于該個(gè)體。
15.一個(gè)包括多種根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物的聚合物庫(kù)，其中所述聚合物包含不同比例的陽(yáng)離子化合物與鏈接劑分子。
16.一個(gè)包括多種根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物的聚合物庫(kù)，其中所述聚合物每個(gè)都包含一種不同的鏈接劑分子。
17.一個(gè)包括多種根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物的聚合物庫(kù)，其中每個(gè)所述聚合物都包含一種不同的陽(yáng)離子低聚物。
18.一個(gè)生物材料傳遞系統(tǒng)，包括
至少一種生物分子；
權(quán)利要求1所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物，其中所述聚合物對(duì)所述生物分子具有親合力；和
至少一種可內(nèi)在化進(jìn)入真核生物細(xì)胞內(nèi)的傳遞增強(qiáng)劑，該增強(qiáng)劑可以促進(jìn)所述真核生物細(xì)胞內(nèi)的受體識(shí)別、內(nèi)在化、生物分子從內(nèi)層中選出、細(xì)胞核定位、生物分子釋放、或系統(tǒng)穩(wěn)定。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的生物分子，其中所述生物分子是核酸、縮氨酸、蛋白質(zhì)或碳水化合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的傳遞增強(qiáng)劑，其中所述傳遞增強(qiáng)劑偶合在所述可降解的陽(yáng)離子聚合物上。
21.一個(gè)醫(yī)療診斷系統(tǒng)，包括
造影對(duì)比劑，
權(quán)利要求1所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物，其中所述聚合物對(duì)生物分子具有親合力，和
可識(shí)別真核生物細(xì)胞、組織或器官的特異受體的配體、抗體或試劑，其中所述配體、抗體或試劑與所述可降解的陽(yáng)離子聚合物偶合。
22.一種藥物組合物，包括
可被光或其它物理刺激觸發(fā)其功能的敏化劑；和
權(quán)利要求1所述的可降解的陽(yáng)離子聚合物，其中所述聚合物對(duì)生物分子具有親合力。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可控降解的陽(yáng)離子聚合物，該聚合物用于傳遞生物分子(核酸、縮氨酸等)、藥物、醫(yī)學(xué)造影應(yīng)用中使用的分子、癌癥治療中使用的敏化劑及組織工程中使用的分子。本發(fā)明還提供一種合成本發(fā)明所述聚合物的方法。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1646174SQ03808319
公開(kāi)日2005年7月27日 申請(qǐng)日期2003年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月14日
發(fā)明者俞磊, 杜福勝, 季守平, 松本健一 申請(qǐng)人:日東電工株式會(huì)社