專利名稱：特異性抗幽門(mén)螺桿菌卵黃抗體、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗體及其應(yīng)用，特別是涉及一種抗幽門(mén)螺桿菌特有抗原的復(fù)合卵黃抗體的制備及其在食品、保健食品和醫(yī)藥上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1982年，Warren和Marshall從一名十二指腸潰瘍患者的胃活檢組織中分離到一種新的細(xì)菌，現(xiàn)稱之為幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori，簡(jiǎn)稱HP)，并提出它就是消化性潰瘍的致病因子。經(jīng)過(guò)十四年的研究證實(shí)了這個(gè)假說(shuō)。1994年2月，在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)主持的一次專題會(huì)議上，一個(gè)獨(dú)立的專家小組宣布消化性潰瘍是一個(gè)感染性疾病，建議用抗菌素治療替代以往的制酸治療。
幽門(mén)螺桿菌感染遍及全球，經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)感染率高，并隨年齡增長(zhǎng)而遞增。感染持續(xù)時(shí)間也很長(zhǎng)，甚至終生。發(fā)展中國(guó)家的感染率高于發(fā)達(dá)國(guó)家，中國(guó)的感染率約為70％。幽門(mén)螺桿菌感染后常導(dǎo)致持續(xù)數(shù)周至數(shù)月的急性胃炎，然后發(fā)展為慢性活動(dòng)性胃炎，它常持續(xù)終生。在感染后的數(shù)年至數(shù)十年里，慢性胃炎可以無(wú)癥狀，也可發(fā)展為消化性潰瘍、萎縮性胃炎甚至胃癌。研究表明90％以上的十二指腸潰瘍，70％以上的胃潰瘍是由幽門(mén)螺桿菌感染所致，胃癌的發(fā)生也與幽門(mén)螺桿菌感染有關(guān)。
目前幽門(mén)螺桿菌感染一般采用抗菌素治療，常規(guī)是三聯(lián)療法，療程不超過(guò)14天。但抗菌素治療存在許多缺點(diǎn)，如療程長(zhǎng)毒副作用大，因耐藥的幽門(mén)螺桿菌的產(chǎn)生感染易反復(fù)。因此，醫(yī)藥界都在尋求更徹底更有效的解決方法，如疫苗和抗體等生物治療手段。
雞卵黃免疫球蛋白G抗體是一種7S免疫球蛋白.與哺乳動(dòng)物IgG略有不同。該蛋白質(zhì)分子量約為180kDa，含兩個(gè)亞單位，即67-70kDa的重鏈和22-30kDa的輕鏈，又稱IgY(Yolk Immlmoglobulin)，存在于免疫后母雞的卵黃中。實(shí)驗(yàn)證明。受免疫刺激后，母雞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，在輸卵管內(nèi)卵黃成熟期，血液中IgG可被選擇性地轉(zhuǎn)移到卵黃中，而且是卵黃中唯一的免疫球蛋白類(lèi)。
因IgY抗體耐酸、耐熱且性能穩(wěn)定，可經(jīng)口服用于預(yù)防或治療年幼動(dòng)物或人類(lèi)的腸道傳染病，如嬰兒防病食品，齲齒預(yù)防，新生乳豬致死性大腸桿菌感染的預(yù)防，以及魚(yú)病治療等。特別是抗生素或其它藥物的使用存在問(wèn)題時(shí)，IgY成為首選。Farrely等用產(chǎn)毒性大腸桿菌免疫制備特異屯Y抗體經(jīng)口給藥預(yù)防兔腹瀉病。其中陰性對(duì)照組在用產(chǎn)毒性大腸桿菌攻擊后，72h內(nèi)全部發(fā)生嚴(yán)重腹瀉；實(shí)驗(yàn)組在攻擊前4天開(kāi)始喂飼卵黃，攻擊后未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)還表明正常卵黃有部分保護(hù)作用4只家兔喂以正常卵黃，其中3只發(fā)展為中度腹瀉，1只完全正常，不發(fā)病。該研究小組還進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，表明1，IgY干擾E.coli與提純的小腸粘膜蛋白結(jié)合；2，IgY的此項(xiàng)干擾作用優(yōu)于雞血清IgG抗體。Yokoyama等進(jìn)行了IgY經(jīng)口服抗感染的保護(hù)性試驗(yàn)。4日齡新生小牛經(jīng)口接種致死性傷寒沙門(mén)氏菌，并在同一天開(kāi)始給予IgY口服，每日3次連服7-10天。結(jié)果對(duì)照組小牛全部死亡，低劑量IgY組死亡率60％-100％，高劑量組無(wú)一死亡，僅出現(xiàn)發(fā)熱或腹瀉，成功地用IgY抗小牛致死性傷寒沙門(mén)氏茵感染。Robert用卵黃及其提取物成功地抑制組織細(xì)胞培養(yǎng)的輪狀病毒生長(zhǎng)。在感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，特異IgY可防止動(dòng)物發(fā)展為輪狀病毒性胃腸炎，表明卵黃提取物可作為抗病毒抗體來(lái)源，防治嬰幼兒輪狀病毒腹瀉。
用HP免疫產(chǎn)蛋雞制備IgY的研究也有少量報(bào)道，但他們所用抗原為HP全菌抗原或粗提抗原，其結(jié)果是特異性差，口服后易于人體腸道正常菌群起反應(yīng)，引起腸道菌群生態(tài)失衡。
發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供了一種含有抗幽門(mén)螺桿菌(HP)特有蛋白質(zhì)抗原的復(fù)合卵黃抗體(抗--HPSlgY)的雞蛋。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供上述含有抗幽門(mén)螺桿菌(HP)特有蛋白質(zhì)抗原的復(fù)合卵黃抗體(抗--HPSlgY)雞蛋的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供了一種抗HP特有蛋白質(zhì)抗原的復(fù)合卵黃抗體(抗--HPSlgY)。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之四是提供上述抗--HPSlgY的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之五是提供上述含抗HP特有蛋白質(zhì)抗原的復(fù)合卵黃抗體的雞蛋在食品、食品添加劑、醫(yī)藥、保健食品和診斷中的應(yīng)用。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之六是提供上述抗--HPSlgY在食品、食品添加劑、醫(yī)藥、保健食品和診斷中的應(yīng)用。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題之一的技術(shù)方案是一種含有抗幽門(mén)螺桿菌(HP)特有蛋白質(zhì)抗原的復(fù)合卵黃抗體(抗--HPSlgY)的雞蛋，所述雞蛋是用HP復(fù)合抗原免疫下蛋雞所產(chǎn)的蛋。它的生產(chǎn)是按如下步驟完成(1)采用基因工程重組方法制備HP特有的蛋白質(zhì)抗原；(2)免疫產(chǎn)卵母雞選用10-40周齡健康產(chǎn)卵母雞隔離飼養(yǎng)，進(jìn)行雞皮下注射，每只母雞注射點(diǎn)為2-8個(gè)，免疫用抗原濃度為100-500μg/ml，并加等量福氏佐劑，每只母雞每次免疫劑量為100-600μg抗原，首次免疫后，每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次，共計(jì)免疫8次；(3)收集最后一次免疫之后所產(chǎn)的雞蛋。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題之二的技術(shù)方案是含有抗幽門(mén)螺桿菌(HP)特有蛋白質(zhì)抗原的復(fù)合卵黃抗體(抗--HPSlgY)雞蛋的生產(chǎn)方法，它的生產(chǎn)方法包括如下步驟(1)采用基因工程重組方法制備HP特有的蛋白質(zhì)抗原；(2)免疫產(chǎn)卵母雞選用10-40周齡健康產(chǎn)卵母雞隔離飼養(yǎng)，進(jìn)行雞皮下注射，每只母雞注射點(diǎn)為2-8個(gè)，免疫用抗原濃度為100-500μg/ml，并加等量福氏佐劑，每只母雞每次免疫劑量為100-600μg抗原，首次免疫后，每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次，共計(jì)免疫8次；(3)收集最后一次免疫之后所產(chǎn)的雞蛋。
所述HP特有的蛋白質(zhì)抗原包括尿素酶B亞單位(urease β-subunit，UreB)、熱休克蛋白60(heat-shock protein 60，Hsp60)、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(Cytotoxin associated gene A，CagA)、細(xì)胞空泡毒素A蛋白(vacuolating cytotoxin A，VacA)。所述HP特有的蛋白質(zhì)抗原是采用基因工程重組方法獲得。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題之三的技術(shù)方案是一種抗HP特有的蛋白質(zhì)抗原的復(fù)合卵黃抗體(抗--HPSlgY)，所述抗體只與HP或HP特有的抗原起抗原抗體反應(yīng)，而不與人體腸道的的正常菌群或其抗原起抗原抗體反應(yīng)。它的制備方法包括如下步驟(1)采用基因工程重組方法制備HP特有的蛋白質(zhì)抗原；(2)免疫產(chǎn)卵母雞選用10-40周齡健康產(chǎn)卵母雞隔離飼養(yǎng)，進(jìn)行雞皮下注射，每只母雞注射點(diǎn)為2-8個(gè)，免疫用抗原濃度為100-500μg/ml，并加等量福氏佐劑，每只母雞每次免疫劑量為100-600μg抗原，首次免疫后，每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次，共計(jì)免疫8次；(3)收集最后一次免疫之后所產(chǎn)的雞蛋；(4)從免疫雞蛋黃中分離純化抗體。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題之四的技術(shù)方案是抗--HPSlgY的生產(chǎn)方法，它的制備方法包括如下步驟(1)采用基因工程方法制備HP特有的蛋白質(zhì)抗原；(2)免疫產(chǎn)卵母雞選用10-40周齡健康產(chǎn)卵母雞隔離飼養(yǎng)，進(jìn)行雞皮下注射，每只母雞注射點(diǎn)為2-8個(gè)，免疫用抗原濃度為100-500μg/ml，并加等量福氏佐劑，每只母雞每次免疫劑量為100-600μg抗原，首次免疫后，每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次，共計(jì)免疫8次；(3)收集最后一次免疫之后所產(chǎn)的雞蛋；(4)從免疫雞蛋黃中分離純化抗體。
本發(fā)明所提供的上述含抗HP特有蛋白質(zhì)抗原的復(fù)合卵黃抗體(抗--HPSlgY)雞蛋和抗-HPSlgY抗體可廣泛應(yīng)用于食品、食品添加劑、醫(yī)藥和保健食品中，對(duì)防治幽門(mén)螺桿菌感染引起的相關(guān)疾病具有良好的效果。由于免疫下蛋雞所用的抗原是采用基因工程重組方法獲得的，而且是HP特有的，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是特異性好，即所述抗體只與HP起抗原抗體反應(yīng)，從而起到殺滅HP或阻止HP感染的作用，而不會(huì)對(duì)人體腸道的正常菌群起破壞作用。另外本發(fā)明采用母雞所產(chǎn)雞卵為載體，安全無(wú)毒，易于產(chǎn)業(yè)化，成本低。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的作進(jìn)一步的說(shuō)明實(shí)施例1抗HP特有的蛋白質(zhì)抗原的復(fù)合卵黃抗體(抗--HPSlgY)可以通過(guò)以下步驟獲得(1)采用基因工程方法制備HP特有的蛋白質(zhì)抗原；(2)免疫產(chǎn)卵母雞選用10-40周齡健康產(chǎn)卵母雞隔離飼養(yǎng)，進(jìn)行雞皮下注射，每只母雞注射點(diǎn)為2-8個(gè)，免疫用抗原濃度為100-500μg/ml，并加等量福氏佐劑，每只母雞每次免疫劑量為100-600μg抗原，首次免疫后，每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次，共計(jì)免疫8次；(3)收集最后一次免疫之后所產(chǎn)的雞蛋；(4)從免疫雞蛋黃中分離純化抗體。
實(shí)施例2用基因工程重組方法制備HP特有的蛋白質(zhì)抗原用胃鏡從HP感染陽(yáng)性的胃潰瘍患者夾取胃粘膜組織，涂布于HP選擇培養(yǎng)布氏瓊脂平皿上，37℃微需氧培養(yǎng)5天，收集菌落，常規(guī)方法抽提HP的DNA，PCR擴(kuò)增HP的UreB、Hsp60、CagA、VacA基因，將上述4條基因克隆到大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，發(fā)酵重組大腸桿菌，用色譜法純化大腸桿菌中的UreB、Hsp60、CagA、VacA蛋白。
實(shí)施例3免疫產(chǎn)卵母雞選用10周齡健康產(chǎn)卵母雞隔離飼養(yǎng)，進(jìn)行雞皮下注射，每只母雞注射點(diǎn)為2個(gè)，免疫用抗原濃度為100μg/ml，并加等量福氏佐劑，每只母雞每次免疫劑量為100μg抗原，首次免疫后，每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次，共計(jì)免疫8次；實(shí)施例4免疫產(chǎn)卵母雞選用40周齡健康產(chǎn)卵母雞隔離飼養(yǎng)，進(jìn)行雞皮下注射，每只母雞注射點(diǎn)為8個(gè)，免疫用抗原濃度為500μg/ml，并加等量福氏佐劑，每只母雞每次免疫劑量為600μg抗原，首次免疫后，每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次，共計(jì)免疫8次；實(shí)施例5免疫產(chǎn)卵母雞選用30周齡健康產(chǎn)卵母雞隔離飼養(yǎng)，進(jìn)行雞皮下注射，每只母雞注射點(diǎn)為4個(gè)，免疫用抗原濃度為200μg/ml，并加等量福氏佐劑，每只母雞每次免疫劑量為400μg抗原，首次免疫后，每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次，共計(jì)免疫8次；實(shí)施例6從免疫雞蛋中分離蛋黃采集含抗--HPSlgY免疫蛋，分離蛋黃，噴霧干燥得含抗-HPSlgY的蛋黃粉。
實(shí)施例7純化抗體采集含抗--HPSlgY免疫蛋，分離蛋黃并用10倍的水溶解，調(diào)節(jié)pH值至5.0，4℃放置8小時(shí)，沉淀去除脂蛋白后即得到雞卵黃水溶性部分(WSF)，用濃度為40％的硫酸銨沉淀，沉淀物用適量生理鹽水溶解，并在生理鹽水中透析24小時(shí)，冷凍干燥即得到抗-HPSlgY。
實(shí)施例8取實(shí)施例1、6、7中任何一種產(chǎn)品進(jìn)行IgY效價(jià)測(cè)定采用單向免疫擴(kuò)散法進(jìn)行IgY效價(jià)測(cè)定，IgY效價(jià)為1∶512-1∶32768。
實(shí)施例9每100克奶粉中加入10克含抗-HPSlgY的蛋黃粉，所得產(chǎn)品可用于嬰幼兒和成人預(yù)防HP感染，或已感染HP的患者的輔助治療。
實(shí)施例10每100克奶粉中加入1克純化的抗-HPSlgY凍干粉，所得產(chǎn)品可用于嬰幼兒和成人預(yù)防HP感染，或已感染HP的患者的輔助治療。
實(shí)施例11每100ml鮮奶中加入1克純化的抗-HPSlgY凍干粉，所得產(chǎn)品可用于嬰幼兒和成人預(yù)防HP感染，或已感染HP的患者的輔助治療。
實(shí)施例12抗-HPSlgY凍干粉與猴頭菇多糖按1∶5的比例混合，灌裝膠囊，可用于保護(hù)胃粘膜的保健食品。
實(shí)施例13抗-HPSlgY凍干粉加制劑輔料，灌裝膠囊，可用于治療HP感染的藥物。
權(quán)利要求
1.一種含有抗幽門(mén)螺桿菌(HP)特有蛋白質(zhì)抗原的復(fù)合卵黃抗體(抗-HPSlgY)的雞蛋，其特征是，所述雞蛋是用HP復(fù)合抗原免疫下蛋雞所產(chǎn)的蛋。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞蛋，其特征是，它的生產(chǎn)方法包括如下步驟(1)采用基因工程重組方法制備HP特有的蛋白質(zhì)抗原；(2)免疫產(chǎn)卵母雞選用10-40周齡健康產(chǎn)卵母雞隔離飼養(yǎng)，進(jìn)行雞皮下注射，每只母雞注射點(diǎn)為2-8個(gè)，免疫用抗原濃度為100-500μg/ml，并加等量福氏佐劑，每只母雞每次免疫劑量為100-600μg抗原，首次免疫后，每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次，共計(jì)免疫8次；(3)收集最后一次免疫之后所產(chǎn)的雞蛋。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述HP特有的蛋白質(zhì)抗原包括尿素酶B亞單位(ureaseβ-subunit，UreB)、熱休克蛋白60(heat-shock protein60，Hsp60)、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(Cytotoxin associated gene A，CagA)、細(xì)胞空泡毒素A蛋白(vacuolating cytotoxin A，VacA)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述HP特有的蛋白質(zhì)抗原是采用基因工程重組方法獲得。
5.一種抗HP特有的蛋白質(zhì)抗原的復(fù)合卵黃抗體(抗--HPSlgY)，其特征是，所述抗體只與HP或HP特有的抗原起抗原抗體反應(yīng)，而不與人體腸道的正常菌群或其抗原起抗原抗體反應(yīng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體，其特征是，所述抗體能特異地與HP的UreB、Hsp60、CagA、VacA抗原起特異的抗原抗體反應(yīng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體，其特征是，它的制備方法包括如下步驟(1)采用基因工程方法制備HP特有的蛋白質(zhì)抗原；(2)免疫產(chǎn)卵母雞選用10-40周齡(30)健康產(chǎn)卵母雞隔離飼養(yǎng)，進(jìn)行雞皮下注射，每只母雞注射點(diǎn)為2-8個(gè)，免疫用抗原濃度為100-500μg/ml(200)，并加等量福氏佐劑，每只母雞每次免疫劑量為100-600μg抗原，首次免疫后，每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次，共計(jì)免疫8次；(3)收集最后一次免疫之后所產(chǎn)的雞蛋；(4)從免疫雞蛋黃中分離純化抗體。
8.權(quán)利要求1所述的雞蛋在下列領(lǐng)域但不限于中的應(yīng)用食品、食品添加劑、醫(yī)藥、保健食品和診斷。
9.權(quán)利要求5所述的抗體在下列領(lǐng)域但不限于中的應(yīng)用食品、食品添加劑、醫(yī)藥、保健食品和診斷。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種特異性抗幽門(mén)螺桿菌卵黃抗體、制備方法及其應(yīng)用。采用多價(jià)基因重組的HP特有蛋白質(zhì)抗原，免疫產(chǎn)卵母雞，并從其產(chǎn)出的卵中提取復(fù)合卵黃抗體(抗－HPSlgY)。應(yīng)用本發(fā)明將含復(fù)合卵黃抗體(抗－HPSlgY)的蛋黃粉添加于食品或制成保健食品，可用于輔助防治因幽門(mén)螺桿菌感染引起的相關(guān)疾?。患兓髲?fù)合卵黃抗體(抗－HPSlgY)可制成藥品，用于防治因幽門(mén)螺桿菌感染引起的相關(guān)疾病。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1594362SQ03150870
公開(kāi)日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2003年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月9日
發(fā)明者許春娣, 徐帆洪 申請(qǐng)人:上海立泰哲田生命科技有限公司