專利名稱：多孔菌抗sars病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌抗病毒活性物質(zhì)的提取方法，尤其涉及真菌中多孔菌(Polyporales)抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法。
背景技術(shù)：
關(guān)于多孔菌活性物質(zhì)提取物的制備方法，經(jīng)檢索到的相關(guān)專利有中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?9112556.8灰樹(shù)花發(fā)酵液多糖提取方法，02136517.2灰樹(shù)花發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，89105471一種云芝糖肽(PSP)的生產(chǎn)方法，92109345香菇多糖及香菇菌多糖提取工藝，96109095中國(guó)靈芝保健飲料，92111030靈芝營(yíng)養(yǎng)保健液及其制法，93103116靈芝口服液等專利，這些專利內(nèi)容大多以提取多糖為主要目的，其中屬于多孔菌的，只有灰樹(shù)花、云芝和靈芝三種，其制備的活性物質(zhì)提取物具有抗腫瘤、抗高血壓、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎等藥效，但對(duì)于抗病毒作用鮮有報(bào)道，而對(duì)于抗SARS病毒的報(bào)道更是沒(méi)有檢索到。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的問(wèn)題是，針對(duì)上述多孔菌活性物質(zhì)提取物的制備方法以及其制備的活性物質(zhì)提取物的藥理作用所存在的不足，提供一種多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法。利用本發(fā)明的方法提取的多孔菌粗提物對(duì)SARS病毒具有完全的抑制作用，并且對(duì)正常細(xì)胞具有保護(hù)作用，且該方法具有工藝簡(jiǎn)便、產(chǎn)量高、成本低的特點(diǎn)。
本發(fā)明的多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法，有三種制備形式其一為直接從多孔菌發(fā)酵全液包括菌絲體與澄清液中分離出抗SARS病毒活性物質(zhì)；其二為先將多孔菌發(fā)酵全液分離成菌絲體與澄清液，再?gòu)乃镁z體中分離出抗SARS病毒活性物質(zhì)；其三為先將多孔菌發(fā)酵全液分離成菌絲體與澄清液，再?gòu)乃贸吻逡褐蟹蛛x出抗SARS病毒活性物質(zhì)；上述多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法由以下步驟組成(1)加熱過(guò)濾取經(jīng)液體發(fā)酵的多孔菌發(fā)酵全液或菌絲體或澄清液放于容器內(nèi)，調(diào)整其pH值為8～12，置60～120℃下加熱30～240分鐘，之后冷卻、以180～200目的篩網(wǎng)過(guò)濾多孔菌發(fā)酵全液或菌絲體或澄清液，收集濾液，濾渣以其4～8倍體積的蒸餾水稀釋，重復(fù)上述操作1～2遍，再收集濾液；(2)減壓濃縮離心完畢后棄去濾渣，合并收集的濾液，在溫度50～70℃，壓力0.2～0.6Kg/cm2，真空度為0.02～0.06Mpa的條件下進(jìn)行減壓濃縮，使濾液濃縮至原有體積的1/10～1/30；(3)醇析在濃縮濾液中，加入量為其體積4～8倍的醇溶液并不斷攪拌，攪拌速度為60r/min，5～10分鐘后，靜置24～48小時(shí)進(jìn)行醇析；(4)離心分離醇析后棄上清液，沉淀物移入離心管中，以轉(zhuǎn)速為5000～6000r/min離心15～30min，離心后棄去上清液，收集離心沉淀物；(5)收集物干燥將上述收集的離心沉淀物，在50～70℃溫度條件下干燥12～36小時(shí)；(6)收集物粉碎取上述烘干的收集物，進(jìn)行粉碎，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)篩后，即為多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物。
上述步驟(1)所述的多孔菌發(fā)酵全液或菌絲體或澄清液是指灰樹(shù)花(Grifolafrondosa)、靈芝(Ganoderma lucidum)、桑黃(Phellinus ignirius)、薄樹(shù)靈芝(Ganoderma capense)、香栓菌(Trametes suaveloens)菌株之一的發(fā)酵全液或菌絲體或澄清液或其多菌株混合的集合體。
即，步驟(1)所述的多孔菌發(fā)酵全液是指灰樹(shù)花(Grifola frondosa)、靈芝(Ganoderma lucidum)、桑黃(Phellinus ignirius)、薄樹(shù)靈芝(Ganodermacapense)、香栓菌(Trametes suaveloens)菌株之一或其混合的發(fā)酵液與菌絲體的集合體。
步驟(1)所述的多孔菌發(fā)酵后澄清液是指灰樹(shù)花(Grifola frondosa)、靈芝(Ganoderma lucidum)、桑黃(Phellinus ignirius)、薄樹(shù)靈芝(Ganodermacapense)、香栓菌(Trametes suaveloens)菌株之一的發(fā)酵后澄清液或多菌株發(fā)酵后澄清液的集合體。
步驟(1)所述的多孔菌發(fā)酵所得菌絲體是指灰樹(shù)花(Grifola frondosa)、靈芝(Ganoderma lucidum)、桑黃(Phellinus ignirius)、薄樹(shù)靈芝(Ganodermacapense)、香栓菌(Trametes suaveloens)菌株之一發(fā)酵所得菌絲體或多菌株發(fā)酵所得菌絲體的集合體。
其中，步驟(1)所述的pH值為10～12。
其中，步驟(1)所述加熱溫度是90～100℃。
其中，步驟(1)所述加熱時(shí)間是120～240分鐘。
其中，步驟(2)所述的減壓濃縮條件是，溫度50～60℃，壓力0.5Kg/cm2，真空度為0.04～0.06Mpa。
其中，步驟(3)所述的醇溶液是甲醇或乙醇，濃度為60～95％。
其中，步驟(3)所述醇析的時(shí)間為24～36小時(shí)。
其中，步驟(5)所述的收集物干燥用真空干燥，其條件為真空度0.02～0.06Mpa，溫度50～70℃，時(shí)間15～36小時(shí)。
其中，步驟(6)所述的粉碎是采用200目的中藥粉碎機(jī)對(duì)收集物進(jìn)行粉碎。
采用本發(fā)明的多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法，具有工藝簡(jiǎn)便、產(chǎn)量高、成本低的特點(diǎn)。該方法采用真菌中多孔菌的發(fā)酵液、菌絲體及子實(shí)體進(jìn)行活性物質(zhì)提取，大大降低了灰樹(shù)花子體及菌絲人工培養(yǎng)的難度、降低了原料成本、生產(chǎn)成本，增加了產(chǎn)量，提高了產(chǎn)率。
采用本發(fā)明的方法提取的多孔菌粗提物，經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所體外抗SARS病毒藥物初篩試驗(yàn)，結(jié)果顯示對(duì)SARS病毒具有完全的抑制作用，并且對(duì)正常細(xì)胞具有保護(hù)作用。
所作體外抗SARS病毒藥物初篩試驗(yàn)的具體方法如下I、實(shí)驗(yàn)材料1、細(xì)胞VetoE6細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)
2、病毒SARS病毒，BJ-01株3、培養(yǎng)液含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液II、實(shí)驗(yàn)條件生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室III、實(shí)驗(yàn)步驟1、CPE法測(cè)定病毒對(duì)VeroE6細(xì)胞半數(shù)毒性濃度(TCID50)2、CPE法結(jié)合MTT法確定藥物對(duì)細(xì)胞的無(wú)毒濃度3、藥物的最大無(wú)毒濃度對(duì)SARS病毒的藥效測(cè)定IV、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、病毒的TCID50為10-7。
2、藥物取5個(gè)濃度即1000、500、250、125和62.5ug/m1進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定，每濃度做4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照。結(jié)果顯示最大無(wú)毒濃度為125ug/ml。
3、取125ug/ml藥液，做4個(gè)復(fù)孔，觀察對(duì)SARS病毒的抑制作用。試驗(yàn)設(shè)病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照。結(jié)果顯示該濃度藥物對(duì)SARS病毒有完全抑制作用。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1(1)加熱過(guò)濾取經(jīng)液體發(fā)酵的多孔菌灰樹(shù)花(Grifola frondosa)ATCC48141菌株發(fā)酵全液2000ml，放于3000ml容器內(nèi)，調(diào)整其pH值為10，置100℃下加熱120分鐘，之后冷卻至30℃、以180目的篩網(wǎng)過(guò)濾多孔菌發(fā)酵全液，收集濾液，濾渣以其6倍體積的蒸餾水稀釋，重復(fù)上述操作1遍，再收集濾液；(2)減壓濃縮離心完畢后棄去濾渣，合并收集的濾液，在溫度60℃，壓力0.5Kg/cm2，真空度為0.04Mpa的條件下進(jìn)行減壓濃縮，使濾液濃縮至原有體積的1/10；(3)醇析在濃縮濾液中，加入量為其體積5倍的95％的乙醇并不斷攪拌，攪拌速度為60r/min，8分鐘后，靜置24小時(shí)進(jìn)行醇析；(4)離心分離醇析后棄上清液，沉淀物移入離心管中，以轉(zhuǎn)速為5000r/min離心15分鐘，離心后棄去上清液，收集離心沉淀物；(5)收集物干燥將上述收集的離心沉淀物，在60℃溫度條件下的置鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥24小時(shí)；(6)收集物粉碎取上述烘干的收集物，進(jìn)行粉碎，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)篩后，即得多孔菌發(fā)酵液抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物4.57克，該抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的顏色為棕色、光密度在波長(zhǎng)520nm時(shí)為1.1、pH為7.0。
實(shí)施例2將300L混有灰樹(shù)花(Grifola frondosa)ATCC48688菌株、薄樹(shù)靈芝(Ganodermacapense)ATCC76613菌株的發(fā)酵全液，通過(guò)移液管道移到提取罐中，調(diào)整發(fā)酵全液pH至12左右，向提取罐夾套通蒸汽升溫，當(dāng)溫度升至90℃時(shí)，計(jì)時(shí)，維持4小時(shí)后停止升溫，向夾套內(nèi)打入循環(huán)水降溫。當(dāng)溫度降到60℃左右，將提取液通過(guò)二次200目的篩網(wǎng)過(guò)濾后移到濃縮罐內(nèi)，進(jìn)行減壓濃縮，濃縮溫度控制在50℃，真空度為0.06Mpa罐壓控制在0.6Kg/cm2，濃縮時(shí)加入消泡劑(豆油)0.5斤/300L，當(dāng)提取液濃縮到10L左右時(shí)，將其移到醇提罐內(nèi)，并加入95％得甲醇60L，輕輕攪拌，攪拌速度為60r/min，5分鐘以后，靜置醇析，36小時(shí)以后，將上清液通過(guò)管道移至廢液罐內(nèi)貯放，沉淀物放出后進(jìn)行離心，離心采用低速大容量離心機(jī)，轉(zhuǎn)速為5000r/min，時(shí)間控制在20分鐘，離心后將離心沉淀物放在不銹鋼盤內(nèi)進(jìn)行真空干燥，干燥時(shí)真空度為0.05Mpa，溫度控制在60℃之間，24小時(shí)以后，將提取物取出，用200目的中藥粉碎機(jī)粉碎后，稱重量為1260克，該抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的顏色為棕色、光密度在波長(zhǎng)520nm時(shí)為1.0、pH為7.2。
實(shí)施例3(1)加熱過(guò)濾取經(jīng)液體發(fā)酵的多孔菌灰樹(shù)花(Grifola frondosa)ATCC48141菌株發(fā)酵所得菌絲體1350克，靈芝(Ganoderma lucidum)的發(fā)酵后澄清液1000ml，放于3000ml容器內(nèi)，調(diào)整其pH值為11，置95℃下加熱180分鐘，之后冷卻至37℃、以180目的篩網(wǎng)過(guò)濾多孔菌發(fā)酵全液，收集濾液，濾渣以其6倍體積的蒸餾水稀釋，重復(fù)上述操作1遍，再收集濾液；(2)減壓濃縮離心完畢后棄去濾渣，合并收集的濾液，在溫度50℃，壓力0.5Kg/cm2，真空度為0.06Mpa的條件下進(jìn)行減壓濃縮，使濾液濃縮至原有體積的1/30；(3)醇析在濃縮濾液中，加入量為其體積5倍的95％的乙醇并不斷攪拌，攪拌速度為80r/min，8分鐘后，靜置24小時(shí)進(jìn)行醇析；(4)離心分離醇析后棄上清液，沉淀物移入離心管中，以轉(zhuǎn)速為5000r/min離心15分鐘，離心后棄去上清液，收集離心沉淀物；(5)收集物干燥將上述收集的離心沉淀物，在60℃溫度條件下的置鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥30小時(shí)；(6)收集物粉碎取上述烘干的收集物，進(jìn)行粉碎，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)篩后，即得多孔菌發(fā)酵液抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物4.13克，該抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的顏色為棕色、光密度在波長(zhǎng)520nm時(shí)為1.2、pH為7.1。
實(shí)施例4采用實(shí)施例1的方法提取的多孔菌發(fā)酵液抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物，以VetoE6細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)、SARS病毒(BJ-01株)、含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液為實(shí)驗(yàn)材料，以CPE法測(cè)定病毒對(duì)VeroE6細(xì)胞半數(shù)毒性濃度(TCID50)、CPE法結(jié)合MTT法確定藥物對(duì)細(xì)胞的無(wú)毒濃度、藥物的最大無(wú)毒濃度對(duì)SARS病毒的藥效測(cè)定等實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)行體外抗SARS病毒藥物初篩試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下1、病毒的TCID50為10-7。
2、藥物取5個(gè)濃度即1000、500、250、125和62.5ug/ml進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定，每濃度做4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照。結(jié)果顯示最大無(wú)毒濃度為125ug/ml。
3、取125ug/ml藥液，做4個(gè)復(fù)孔，觀察對(duì)SARS病毒的抑制作用。試驗(yàn)設(shè)病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照。結(jié)果顯示該濃度藥物對(duì)SARS病毒有完全抑制作用。
權(quán)利要求
1.一種多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法，有三種制備形式；其一為直接從多孔菌發(fā)酵全液包括菌絲體與澄清液中分離出抗SARS病毒活性物質(zhì)；其二為先將多孔菌發(fā)酵全液分離成菌絲體與澄清液，再?gòu)乃镁z體中分離出抗SARS病毒活性物質(zhì)；其三為先將多孔菌發(fā)酵全液分離成菌絲體與澄清液，再?gòu)乃贸吻逡褐蟹蛛x出抗SARS病毒活性物質(zhì)；上述多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法由以下步驟組成(1)加熱過(guò)濾取經(jīng)液體發(fā)酵的多孔菌發(fā)酵全液或菌絲體或澄清液放于容器內(nèi)，調(diào)整其pH值為8～12，置60～120℃下加熱30～240分鐘，之后冷卻、以180～200目的篩網(wǎng)過(guò)濾多孔菌發(fā)酵全液或菌絲體或澄清液，收集濾液，濾渣以其4～8倍體積的蒸餾水稀釋，重復(fù)上述操作1～2遍，再收集濾液；(2)減壓濃縮離心完畢后棄去濾渣，合并收集的濾液，在溫度50～70℃，壓力0.2～0.6Kg/cm2，真空度為0.02～0.06Mpa的條件下進(jìn)行減壓濃縮，使濾液濃縮至原有體積的1/10～1/30；(3)醇析在濃縮濾液中，加入量為其體積4～8倍的醇溶液并不斷攪拌，攪拌速度為60r/min，5～10分鐘后，靜置24～48小時(shí)進(jìn)行醇析；(4)離心分離醇析后棄上清液，沉淀物移入離心管中，以轉(zhuǎn)速為5000～6000r/min離心15～30min，離心后棄去上清液，收集離心沉淀物；(5)收集物干燥將上述收集的離心沉淀物，在50～70℃溫度條件下干燥12～36小時(shí)；(6)收集物粉碎取上述烘干的收集物，進(jìn)行粉碎，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)篩后，即為多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物。
2.如權(quán)利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的多孔菌發(fā)酵全液或菌絲體或澄清液是指灰樹(shù)花(Grifola frondosa)、靈芝(Ganoderma lucidum)、桑黃(Phellinus ignirius)、薄樹(shù)靈芝(Ganodermacapense)、香栓菌(Trametes suaveloens)菌株之一的發(fā)酵全液或菌絲體或澄清液或其多菌株混合的集合體。
3.如權(quán)利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的pH值為10～12。
4.如權(quán)利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述加熱溫度是90～100℃。
5.如權(quán)利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述加熱時(shí)間是120～240分鐘。
6.如權(quán)利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的減壓濃縮條件是，溫度50～60℃，壓力0.5Kg/cm2，真空度為0.04～0.06Mpa。
7.如權(quán)利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述的醇溶液是甲醇或乙醇，濃度為60～95％。
8.如權(quán)利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述醇析的時(shí)間為24～36小時(shí)。
9.如權(quán)利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法，其特征在于，步驟(5)所述的收集物干燥用真空干燥，其條件為真空度0.02～0.06Mpa，溫度50～70℃，時(shí)間15～36小時(shí)。
10.如權(quán)利要求1所述的多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法，其特征在于，步驟(6)所述的粉碎是采用200目的中藥粉碎機(jī)對(duì)收集物進(jìn)行粉碎。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種多孔菌抗SARS病毒活性物質(zhì)粗提物的制備方法，其方法包括多孔菌發(fā)酵全液或發(fā)酵后澄清液或菌絲體經(jīng)過(guò)加熱過(guò)濾、減壓濃縮、醇析、離心分離、收集物干燥、收集物粉碎等步驟。本發(fā)明的方法提取的多孔菌粗提物對(duì)SARS病毒具有完全的抑制作用，并且對(duì)正常細(xì)胞具有保護(hù)作用，且該方法具有工藝簡(jiǎn)便、產(chǎn)量高、成本低的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P11/00GK1486741SQ0313898
公開(kāi)日2004年4月7日 申請(qǐng)日期2003年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月5日
發(fā)明者宋愛(ài)榮, 隋方功, 趙晨, 田雪梅 申請(qǐng)人:萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院