干擾素γ多肽變體的制作方法

專利名稱：干擾素γ多肽變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有干擾素γ(IFNG)活性的新的干擾素γ多肽變體，其制備方法，含有該多肽變體的藥物組合物及其在疾病治療中的用途，尤其是在治療間質(zhì)性肺疾病，如自發(fā)性肺纖維化中的用途。
背景技術(shù)：
干擾素-γ(IFNG)是由T-淋巴細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子且以兩個(gè)非共價(jià)結(jié)合的多肽亞基的同型二聚體存在。每一二聚體的成熟形式含有143個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO 2所示)，其前體形式包括166個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)序列(SEQ ID NO 1所示)。
各亞基具有兩個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)(Aggarwal等，人類細(xì)胞因子，Blackwell科學(xué)出版社，1992)在位置25和97。根據(jù)糖基化的程度，二聚體形式的IFNG分子量是34-50kDa(Farrar等，免疫學(xué)年鑒，1993，11571-611)。
Gray等(自然，298859-863，1982)，Taya等(EMBO J.1953-958，1982)，Devos等(核酸研究，102487-2501，1982)和Rinderknecht等(生物學(xué)化學(xué)雜志，2596790-6797，1984)及在EP 77670，EP 89676和EP 110044中已報(bào)導(dǎo)了野生型人IFNG(huIFNG)的一級(jí)序列。Ealick等(科學(xué)，252698-702，1991)報(bào)導(dǎo)了huIFNG的三維結(jié)構(gòu)。
已報(bào)導(dǎo)了IFNG亞基多肽的各種天然存在的或突變的形式，包括一種包含Cys-Tyr-Cys N-末端氨基酸序列(相對(duì)于SEQ ID NO 17的位置(-3)-(-1))的形式，一種包含N-末端甲硫氨酸(相對(duì)于SEQ ID NO 17的位置-1)的形式，和含有127-134氨基酸殘基的各種C-末端截短形式。已知可從C-末端缺失1-15個(gè)氨基酸殘基而不破壞該分子的IFNG活性。而且，Pan等(歐洲生物化學(xué)雜志，166145-149，1987)已描述了huIFNG C-末端的異質(zhì)性。
Slodowski等(歐洲生物學(xué)化學(xué)雜志，2021133-1140，1991)，Luk等(生物學(xué)化學(xué)雜志，26513314-13319，1990)，Seelig等，(生物化學(xué)，271981-1987，1988)，Trousdale等(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，261244-1251，1985)，和在EP 146354中報(bào)導(dǎo)了HuIFNG突變蛋白。Nishi等(生物化學(xué)雜志，97153-159，1985)報(bào)導(dǎo)了天然huIFNG變體。
US 6,046,034公開了插入4對(duì)半胱氨酸殘基使得二硫鍵形成且因此以同型二聚體的形式穩(wěn)定IFNG變體的耐熱重組huIFNG(rhuIFNG)變體。
WO 92/08737公開了在野生型人IFNG的全長(zhǎng)(殘基1-143)或部分(殘基1-132)氨基酸序列的N末端含有添加的甲硫氨酸的IFNG變體。EP 219781公開了含有氨基酸殘基3-124(SEQ ID NO 17中)的部分huIFNG序列。US4,832,959公開了含有氨基酸序列的殘基1-127，5-146和5-127的部分huIFNG序列，該序列與SEQ ID NO 2相比具有3個(gè)添加的N-末端氨基酸殘基(CYC)。US 5,004,689公開了編碼無(wú)3個(gè)N-末端氨基酸殘基CYC的huIFNG的DNA序列及其在大腸桿菌中的表達(dá)。EP 446582公開了大腸桿菌產(chǎn)生的不含N-末端甲硫氨酸的rhuIFNG。US 6,120,762公開了含有其殘基95-134(相對(duì)于SEQ ID NO 18)的huIFNG肽片段。
Wang等(Sci.Sin.B 241076-1084，1994)報(bào)導(dǎo)了rhuIFNG的高水平表達(dá)。
Curling等(生物化學(xué)雜志，272333-337，1990)和Hooker等，(干擾素和細(xì)胞因子研究雜志，1998，18287-295)報(bào)導(dǎo)了rhuIFNG中的糖基化變體。
Kita等(Drug Des.Deliv.，6157-167，1990)，和在EP 236987和US5109120中報(bào)導(dǎo)了rhuIFNG的聚合物修飾。
WO 92/22310報(bào)導(dǎo)了干擾素，特別是huIFNG的脫唾液酸糖蛋白偶聯(lián)物的衍生物。
IFNG融合蛋白已有描述。例如，EP 237019公開了具有表現(xiàn)出干擾素β活性的區(qū)域和一個(gè)表現(xiàn)出IFNG活性的區(qū)域的單鏈多肽。
EP 0158198公開了具有表現(xiàn)出IFNG活性的區(qū)域和表現(xiàn)出IL-2活性的區(qū)域的單鏈多肽。一些文獻(xiàn)描述了單鏈二聚體IFNG蛋白質(zhì)，例如Landar等(分子生物學(xué)雜志，2000，299169-179)。
WO 99/02710公開了單鏈多肽，其中的一個(gè)例子是IFNG。
WO 99/03887公開了屬于生長(zhǎng)激素超家族的多肽的PEG連接的變體，其中，位于多肽特定區(qū)域的一個(gè)非必需氨基酸殘基被一個(gè)半胱氨酸殘基取代。IFNG作為生長(zhǎng)激素超家族成員的一個(gè)例子被提及，但沒(méi)有詳細(xì)討論其修飾。
已有建議將IFNG用于治療間質(zhì)性肺疾病(也稱為間質(zhì)性肺纖維癥(IPF))(Ziesche等(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，3411264-1269，1999和胸科，110增刊25S，1996)和EP 795332)，為此可將IFNG與脫氫皮質(zhì)甾醇結(jié)合使用。除了IPF外，肉芽腫性疾病(Bolinger等，臨床藥物學(xué)，1992，11834-850)，某些分支桿菌感染(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，3301348-1355，1994)，腎癌(泌尿?qū)W雜志，152841-845，1994)，石骨癥(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，3321594-1599，1995)，硬皮病(風(fēng)濕病學(xué)雜志，23654-658，1996)，乙型肝炎(肝胃腸學(xué)，452282-2294，1998)，丙型肝炎(國(guó)際肝學(xué)通信，6264-273，1997)，膿毒性休克(自然醫(yī)學(xué)，3678-681，1997)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎也可用IFNG治療。
作為藥用化合物，rhuIFNG被用于，例如抵抗某些病毒感染和腫瘤取得了一定的成功。rhuIFNG通常經(jīng)過(guò)腸胃外使用，優(yōu)選通過(guò)皮下，注射使用。7小時(shí)后發(fā)現(xiàn)最大血清濃度，血漿半壽期是在靜脈注射給藥后30分鐘。因此用rhuIFNG進(jìn)行有效治療需要經(jīng)常注射。主要的有害作用包括發(fā)燒，寒戰(zhàn)，出汗，頭痛，肌痛和嗜睡。這些效應(yīng)與注射rhuIFNG相聯(lián)系且在注射后第一個(gè)小時(shí)內(nèi)觀察到。罕見的副作用是局部疼痛和紅斑，肝臟酶升高，可逆的粒細(xì)胞和血小板減少癥及心臟毒性。
WO 01/36001公開了新的IFNG偶聯(lián)物，它包含與IFNG多肽相連的非多肽組分，其中所述的IFNG多肽通過(guò)引入和/或刪除針對(duì)上述非多肽組分(如PEG)的連接位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)而被修飾。
眾所周知，當(dāng)N-糖基化分子(如IFNG)在糖基化宿主中產(chǎn)生時(shí)，并非所有潛在的糖基化位點(diǎn)都被利用。這意味著常常獲得具有不同程度的體內(nèi)N-糖基化的蛋白混合物，導(dǎo)致必需隨后進(jìn)行純化。而且，分離具有不同的糖基化程度的相同蛋白常常是耗時(shí)且棘手的?，F(xiàn)在意外發(fā)現(xiàn)，通過(guò)取代體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)(無(wú)論所述體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)是IFNG中的天然位點(diǎn)還是如WO 01/36001所述的引入的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn))附近的一或多個(gè)氨基酸殘基，有可能促進(jìn)對(duì)完整糖基化IFNG分子的分級(jí)分離。尤其是發(fā)現(xiàn)，將hIFNG中第97，98和99位的天然N-糖基化位點(diǎn)N-Y-S替換為N-Y-T，大大促進(jìn)對(duì)完整糖基化IFNG分子的分級(jí)分離。
發(fā)明簡(jiǎn)述因此，本發(fā)明第一方面涉及干擾素γ多肽變體，其具有IFNG活性，并具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列([S99T]huIFNG)，或其具有IFNG活性的片段。
本發(fā)明另一方面涉及SEQ ID NO1的變體，包括SEQ ID NO1的片段(如SEQ ID NO2-16)的變體，其中所述變體包含至少一個(gè)另外的修飾并表現(xiàn)出IFNG活性。
本發(fā)明還有一方面涉及編碼本發(fā)明變體多肽的核苷酸序列。
本發(fā)明還有一方面涉及包含本發(fā)明核苷酸序列的表達(dá)載體，以及包含恩發(fā)明核苷酸序列或本發(fā)明表達(dá)載體的糖基化宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多肽變體的藥物組合物，以及本發(fā)明多肽變體或本發(fā)明藥物組合物的醫(yī)藥用途。
本發(fā)明還有一方面涉及本發(fā)明多肽變體或本發(fā)明藥物組合物在制備治療間質(zhì)性肺疾病的藥物中的用途。
類似地，本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防間質(zhì)性肺疾病的方法，所述方法包括對(duì)有相應(yīng)需要的哺乳動(dòng)物，尤其是人類，施用有效量的本發(fā)明多肽變體或本發(fā)明藥物組合物。
本發(fā)明還有一方面涉及IFNG多肽變體的群體，或涉及包含IFNG多肽變體的群體的組合物，其中所述群體包含至少70％的本發(fā)明IFNG多肽變體。
本發(fā)明另一方面涉及增加親本IFNG多肽的體內(nèi)N-糖基化程度的方法，所述親本IFNG多肽包含至少一個(gè)具有氨基酸序列N-X-S的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)，其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，所述方法包括將所述N-X-S氨基酸序列中的絲氨酸殘基用蘇氨酸殘基取代，以獲得IFNG變體。
本發(fā)明還有一方面涉及制備本發(fā)明IFNG多肽變體的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)糖基化宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含編碼本發(fā)明IFNG多肽變體的核苷酸序列，所用的培養(yǎng)條件有利于所述多肽變體的表達(dá)；(b)任選地，使所述多肽變體與一種非多肽組分在體外有利于進(jìn)行偶聯(lián)的條件下反應(yīng)；以及(c)回收所述多肽變體。
本發(fā)明的其它方面可從以下描述中明顯看出。


圖1是rhuIFNG的經(jīng)優(yōu)化的糖基化變體Western印跡的結(jié)果。左側(cè)Western印跡泳道1標(biāo)準(zhǔn)品，泳道2Actimmune，泳道3rhuIFNG，泳道4[E38N]rhuIFNG。中部Western印跡泳道1標(biāo)準(zhǔn)品，泳道2rhuIFNG，泳道3[E38N+S40T]rhuIFNG。右側(cè)Western印跡泳道1標(biāo)準(zhǔn)品，泳道2rhuIFNG，泳道3[S99T]rhuIFNG，泳道4[E38N+S40T+S99T]rhuIFNG。
圖2顯示對(duì)大鼠皮下給藥后，血清-時(shí)間曲線中的IFNG活性?！馎ctimmune，■rhuIFNG，▲[E38N+S40T+S99T]rhuIFNG。
所有化合物施用相同的劑量(1.15×107AU/kg)。
圖3顯示對(duì)大鼠皮下給藥后，血清-時(shí)間曲線中的IFNG活性?！馵N16C+S99T]rhuIFNG(與5kDa mPEG相連)，■[N16C+S99T]rhuIFNG(與10kDa mPEG相連)，▲[E38N+S40T+S99T]rhuIFNG。
變體的給藥劑量為1.15×107AU/kg，而兩種PEG化變體的給藥劑量為4.6×106AU/kg。
發(fā)明詳述定義在本申請(qǐng)和發(fā)明的說(shuō)明書中使用了下列定義術(shù)語(yǔ)“偶聯(lián)物”(或可互換的“偶聯(lián)的多肽”)意指由一個(gè)或多個(gè)多肽共價(jià)連接到一個(gè)或多個(gè)非多肽組分上形成的雜合的(指復(fù)合或嵌合的意義)分子。術(shù)語(yǔ)共價(jià)連接的意思是多肽和非多肽組分直接共價(jià)連接到另一組分上，或者通過(guò)諸如橋，間隔，或連接組分等一個(gè)或多個(gè)間插組分間接共價(jià)連接到另一組分上。優(yōu)選的是，偶聯(lián)物在有關(guān)濃度和條件下是可溶的，即在諸如血液等生理學(xué)液體中是可溶的。本發(fā)明的偶聯(lián)多肽的例子包括糖基化和/或PEG連接的多肽。對(duì)于偶聯(lián)物的多肽部分可使用術(shù)語(yǔ)“未偶聯(lián)的多肽”。
術(shù)語(yǔ)“非多肽組分”意指能偶聯(lián)到IFNG多肽的連接基團(tuán)上的分子。該分子的優(yōu)選例子包括聚合物分子，親脂性化合物，糖組分或有機(jī)衍生物。當(dāng)在本發(fā)明的偶聯(lián)物環(huán)境中使用時(shí)應(yīng)理解非多肽組分通過(guò)多肽的連接基團(tuán)連接到偶聯(lián)物的多肽部分上。
術(shù)語(yǔ)“聚合物分子”定義為由兩個(gè)或多個(gè)單體共價(jià)連接形成的分子，其中沒(méi)有一個(gè)單體是氨基酸殘基，除非該聚合物是人白蛋白或另一高豐度血漿蛋白。術(shù)語(yǔ)“聚合物”可與術(shù)語(yǔ)“聚合物分子”互換使用。
術(shù)語(yǔ)“糖組分”意指通過(guò)體內(nèi)或體外糖基化，例如N-或O-糖基化連接的碳水化合物分子。
“N-糖基化位點(diǎn)”具有序列N-X-S/T/C，其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，N是天冬酰胺，S/T/C是絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸，優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸，最優(yōu)選蘇氨酸。“O-糖基化位點(diǎn)”是絲氨酸或蘇氨酸殘基的-OH基。
術(shù)語(yǔ)“連接基團(tuán)”意指能偶聯(lián)到諸如聚合物分子或糖組分的有關(guān)非多肽組分上的氨基酸殘基基團(tuán)。有用的連接基團(tuán)及其匹配的非多肽組分從下表中是顯而易見的。

對(duì)于體內(nèi)N-糖基化而言，術(shù)語(yǔ)“連接基團(tuán)”以非傳統(tǒng)的方式使用，指組成N-糖基化位點(diǎn)(具有序列N-X-S/T/C，其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸殘基，N是天冬酰胺，S/T/C是絲氨酸，蘇氨酸或半胱氨酸，優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸，且最優(yōu)選蘇氨酸)的氨基酸殘基。盡管N-糖基化位點(diǎn)的天冬酰胺殘基是糖基化期間連接糖組分的殘基，但除非存在N-糖基化位點(diǎn)的其它氨基酸殘基，否則將不能實(shí)現(xiàn)該連接。因此，當(dāng)非多肽組分是糖組分，且偶聯(lián)是通過(guò)N-糖基化實(shí)現(xiàn)時(shí)，與IFNG多肽的氨基酸序列改變相聯(lián)使用的術(shù)語(yǔ)“含有非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基”應(yīng)理解為，組成N-糖基化位點(diǎn)的一個(gè)，兩個(gè)或所有氨基酸殘基以這樣的方式改變，即將功能性N-糖基化位點(diǎn)引入氨基酸序列或從所述序列中去掉該位點(diǎn)，或在所述氨基酸序列中保留了一個(gè)功能性N-糖基化位點(diǎn)(例如，通過(guò)用蘇氨酸殘基取代作為N-糖基化位點(diǎn)一部分的絲氨酸殘基，反之亦然)。
氨基酸的命名和原子的命名(如，CA、CB、CD、CG、SG、NZ、N、O、C等)按蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)(www.pdb.org)的定義來(lái)用，這些名稱是根據(jù)IUPAC命名法命名的(IUPAC Nomenclature和Symbolism for Amino Acids和Peptides(residue names，atom names etc.)，Eur.J.Biochem.138，9-37(1984)，并在Eur.J.Biochem.152，1(1985)中對(duì)它們進(jìn)行更正。術(shù)語(yǔ)“氨基酸殘基”表示包含在下組中的氨基酸殘基丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、組氨酸(His或H)、異亮氨酸(Ile或I)、賴氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、纈氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)殘基。
在本文中氨基酸殘基的編號(hào)從不含信號(hào)肽的[S99T]huIFNG(即SEQ IDNO 1)的N-末端開始，或相當(dāng)于從不含信號(hào)肽的huIFNG(即SEQ ID NO 17)的N-末端開始。
用于鑒定氨基酸位置/取代的術(shù)語(yǔ)舉例說(shuō)明如下G18表示SEQ ID NO.1或17所示氨基酸序列中第18位的氨基酸。G18N表示第18位的Gly殘基被Asn取代。多重取代用“+”表示，如G18N+S20T表示一種氨基酸序列，其中第18位的Gly殘基被Asn取代，且第20位的Ser殘基被Thr取代。備選取代可用“/”表示，如G18S/T表示以下各個(gè)取代G18S和G18T。缺失以星號(hào)表示。例如，G18*表示第18位的Gly缺失。插入如下表示在第18位的Gly殘基之后插入一個(gè)Ser殘基，表示為G18GS。取代和插入的組合如下表示第18位的Gly殘基被Ser殘基取代，且在第18位之后插入Ala殘基，表示為G18SA。
術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”意指兩個(gè)或多個(gè)核苷酸分子的連續(xù)鏈。核苷酸序列可以是基因組，cDNA，RNA，半合成的，合成來(lái)源，或其任意組合的核苷酸序列。
術(shù)語(yǔ)“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”或“PCR”一般指體外擴(kuò)增所需核苷酸序列的方法，例如，如US 4,683,195所述。一般來(lái)說(shuō)，PCR方法涉及使用能與模板核酸優(yōu)先雜交的寡核苷酸引物進(jìn)行引物延伸合成的重復(fù)循環(huán)。
“細(xì)胞”，“宿主細(xì)胞”，“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”在本文中可互換使用且所有這些術(shù)語(yǔ)應(yīng)理解為包括細(xì)胞生長(zhǎng)或培養(yǎng)產(chǎn)生的后代。
“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”可互換使用，指將DNA引入細(xì)胞的過(guò)程。
“可操作地連接”指通過(guò)酶連接或者互相之間的構(gòu)型使得可行使序列的正常功能的方式將兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列共價(jià)連接。例如，如果編碼前序列或分泌先導(dǎo)序列的核苷酸序列作為參與多肽分泌的前蛋白表達(dá)則它與多肽的核苷酸序列可操作地連接；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄則它與編碼序列可操作地連接；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置有助于翻譯，則它與編碼序列可操作地連接。一般來(lái)說(shuō)，“可操作地連接”意味著連接的核苷酸序列是連續(xù)的，且對(duì)于分泌的先導(dǎo)序列而言是連續(xù)的且在閱讀相(reading phase)中。經(jīng)過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)連接來(lái)實(shí)現(xiàn)該連接。如果不存在該位點(diǎn)，那么可結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)重組DNA方法使用合成寡核苷酸連接物或接頭。
術(shù)語(yǔ)“修飾”在本文中包括取代，插入和缺失。
術(shù)語(yǔ)“突變”和“取代”在本文中可互換使用。
術(shù)語(yǔ)“引入”首先是指現(xiàn)有氨基酸殘基的取代，但也可指插入其它的氨基酸殘基。
術(shù)語(yǔ)“去掉”首先是指被去掉的氨基酸殘基被另一氨基酸殘基取代，但也指缺失(沒(méi)有取代)去掉的氨基酸殘基。
術(shù)語(yǔ)“含有非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基”是與非多肽組分結(jié)合的氨基酸殘基(對(duì)于引入的氨基酸殘基而言)，或曾經(jīng)與之結(jié)合的氨基酸殘基(對(duì)于除去的氨基酸殘基而言)。
術(shù)語(yǔ)“一個(gè)區(qū)別”或“區(qū)別于”與特定修飾連用時(shí)，是指允許除制定的氨基酸區(qū)別以外還存在其它的區(qū)別。因此，除了本文中公開的旨在優(yōu)化糖基化位點(diǎn)的利用或者除去和/或引入帶有非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基的一些改變以外，必要時(shí)，IFNG多肽變體可包含與上述改變無(wú)關(guān)的其他修飾。這可能包括，例如，C-末端截短一或多個(gè)氨基酸殘基，N-和/或C-末端添加一或多個(gè)額外的殘基，例如，在N-末端添加一個(gè)Met殘基，在N-末端添加氨基酸序列Cys-Tyr-Cys，以及“保守氨基酸取代”，即，在具有相似特性的氨基酸組團(tuán)內(nèi)進(jìn)行的取代，所述組團(tuán)如小分子氨基酸，酸性氨基酸，極性氨基酸，堿性氨基酸，疏水氨基酸和芳香族氨基酸。本發(fā)明保守取代的實(shí)例具體可選自下表。

術(shù)語(yǔ)“至少一個(gè)”用于非多肽組分，氨基酸殘基，取代等情況時(shí)，是指一或多個(gè)。
術(shù)語(yǔ)“AUCsc”或“皮下給藥的曲線下面積”用其常規(guī)含義，即血清-時(shí)間曲線中IFNG活性以下的面積，這里所述的IFNG多肽變體為皮下給藥，具體是在大鼠中皮下給藥。一旦通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了IFNG活性-時(shí)間點(diǎn)，就可利用計(jì)算機(jī)程序，如GraphPad Prism 3.01，常規(guī)計(jì)算AUCsc。
術(shù)語(yǔ)“功能性體內(nèi)半壽期”使用其通常的含義，即多肽在體內(nèi)/靶器官中仍具有50％生物活性的時(shí)間，或者多肽的活性為最初活性的50％的時(shí)間。
作為功能性體內(nèi)半壽期測(cè)定法的備選方法，可測(cè)定“血清半壽期”，即，50％的多肽或偶聯(lián)物分子在被清除之前在血漿或血流中循環(huán)的時(shí)間。血清半壽期的測(cè)定常常比功能性體內(nèi)半壽期的測(cè)定簡(jiǎn)單，并且血清半壽期的大小通?？梢院芎玫卣f(shuō)明功能性體內(nèi)半壽期大小。血清半壽期的其它可替換術(shù)語(yǔ)包括“血漿半壽期”、“循環(huán)半壽期”、“血清清除”、“血漿清除”和“清除半壽期”。血清半壽期可按照常規(guī)方法在大鼠中測(cè)定，參見本文材料和方法章節(jié)。重要的是應(yīng)注意本文中，給定的IFNG多肽變體的“血清半壽期”必須用靜脈(iv)給藥的樣品來(lái)測(cè)定。
術(shù)語(yǔ)“血清”使用其通常的含義，即不含纖維蛋白原和其它凝血因子的血漿。
多肽一般通過(guò)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)、腎、脾或肝中一個(gè)或多個(gè)的作用，或通過(guò)特異或非特異的蛋白水解作用而清除。術(shù)語(yǔ)“腎清除”使用其通常的含義，即發(fā)生在腎的任何清除，例如，通過(guò)腎小球過(guò)濾、腎小管排泄或在腎小管細(xì)胞中的降解來(lái)完成。通常，腎清除取決于多肽的物理特性，包括分子量、大小(相對(duì)于腎小球過(guò)濾的截留值而言)、對(duì)稱性、形狀/剛性和電荷，與之相連的糖鏈，以及該多肽的細(xì)胞性受體的存在。腎清除的截留值一般認(rèn)為是分子量約67kDa。腎清除可通過(guò)任何合適的試驗(yàn)來(lái)測(cè)定，如已建立的體內(nèi)試驗(yàn)。例如，可將標(biāo)記(如，放射標(biāo)記或熒光標(biāo)記)的偶聯(lián)多肽給予患者，并測(cè)定所收集的患者尿液中的標(biāo)記物活性來(lái)測(cè)定腎清除。腎清除的減少可經(jīng)過(guò)與參照分子，如huIFNG，[S99T]huIFNG或Actimmune進(jìn)行比較而確定。將要保留的功能通常選自抗病毒活性、抗增殖活性，免疫調(diào)節(jié)活性或IFNG受體結(jié)合活性。
涉及功能性體內(nèi)半壽期或血清半壽期的術(shù)語(yǔ)“增加”用于指，IFNG變體當(dāng)靜脈給藥并且在可比條件下測(cè)定時(shí)，相應(yīng)半壽期相對(duì)于參照分子有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加，所述參照分子如糖基化huIFNG(SEQ ID NO17)，糖基化[S99T]huIFNG(SEQ ID NO1)或Actimmune(SEQ ID NO34，產(chǎn)于大腸桿菌中)。因此，有興趣的IFNG多肽變體是，與上述參照分子相比，功能性體內(nèi)半壽期或血清半壽期增加的變體。
更具體地，所需IFNG變體是這樣的變體，當(dāng)靜脈給藥，尤其當(dāng)在大鼠中靜脈給藥時(shí)，它們與huIFNG或[S99T]huIFNG在糖基化形式時(shí)血清半壽期(或功能性體內(nèi)半壽期)的比率至少為1.25，更優(yōu)選至少1.5，如至少1.75，例如至少2，更優(yōu)選至少3，如至少4，例如至少5。
有興趣的IFNG變體的其它實(shí)例是這樣的變體，當(dāng)靜脈給藥，尤其當(dāng)在大鼠中靜脈給藥時(shí)，它們與Actimmune(SEQ ID NO34，產(chǎn)于大腸桿菌中)的血清半壽期(或功能性體內(nèi)半壽期)之比至少為2，優(yōu)選至少為3，如至少為4，例如至少為5，還優(yōu)選至少為6，如至少為7，例如至少為8，最優(yōu)選至少為9，如至少為10。
涉及AUCsc的術(shù)語(yǔ)“增加”用于指，當(dāng)靜脈給藥并且在可比條件下測(cè)定時(shí)，本發(fā)明IFNG變體的曲線下面積相對(duì)于參照分子的面積有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加，所述參照分子如糖基化huIFNG(SEQ ID NO17)，糖基化[S99T]huIFNG(SEQ ID NO1)或Actimmune(SEQ ID NO34，產(chǎn)于大腸桿菌中)。因此，優(yōu)選的IFNG變體是，與上述參照分子相比，AUCsc增加的變體。顯然，施用本發(fā)明IFNG變體的IFNG活性水平應(yīng)該與施用參照分子的相同。結(jié)果是，為了直接比較不同的IFNG分子，可將AUCsc值標(biāo)準(zhǔn)化，即它們可表示為AUCsc/施用劑量。
特別優(yōu)選的IFNG變體是這樣的變體，它們與糖基化huIFNG或糖基化[S99T]huIFNG的AUCsc之比至少為1.25，更優(yōu)選至少1.5，如至少2，更優(yōu)選至少3，如至少4，例如至少5或至少6，更優(yōu)選至少7，如至少8，例如至少9或至少10，最優(yōu)選至少12，如至少14，例如至少16，至少18或至少20，尤其當(dāng)在大鼠中(皮下)給藥時(shí)。
特別優(yōu)選的IFNG變體的其它實(shí)例是這樣的變體，它們與Actimmune(SEQ ID NO34，產(chǎn)于大腸桿菌中)的AUCsc之比至少為100，更優(yōu)選至少為150，如至少為200，例如至少為250，還優(yōu)選至少為300，如至少為400，例如至少為500，最優(yōu)選至少為750，如至少為1000，例如至少1500或至少2000，尤其當(dāng)在大鼠中靜脈給藥時(shí)。
術(shù)語(yǔ)“Tmax，sc”用于指IFNG活性的血清-時(shí)間曲線中，觀察到血清中最高水平IFNG活性的時(shí)間。本發(fā)明優(yōu)選的IFNG變體是這樣的變體，它們與Actimmune或與糖基化huIFNG相比，Tmax，sc增加。更具體地，所述優(yōu)選的變體的Tmax，sc(大鼠皮下給藥以后測(cè)定)至少為200分鐘，如至少為250分鐘，例如至少為300分鐘，更優(yōu)選至少為350分鐘，如至少為400分鐘。
術(shù)語(yǔ)“降低的免疫原性”是指本發(fā)明的IFNG多肽變體比在相當(dāng)條件下測(cè)定的參照分子，例如huIFNG或Actimmune產(chǎn)生可測(cè)定的更低的免疫反應(yīng)。免疫應(yīng)答可以是細(xì)胞或抗體介導(dǎo)的反應(yīng)(參見，例如，Roitt基礎(chǔ)免疫學(xué)(第8版，Blackwell)，可得到免疫原性的進(jìn)一步定義)。一般情況下，抗體的反應(yīng)性降低表明免疫原性降低。免疫原性降低可通過(guò)應(yīng)用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法，如體內(nèi)或體外方法來(lái)測(cè)定。
本文中術(shù)語(yǔ)“糖基化增加”，“體內(nèi)N-糖基化程度增加”或“N-糖基化程度增加”是指所連接的糖分子的水平增加，這通常是對(duì)糖基化位點(diǎn)的利用增加的結(jié)果。眾所周知(Hooker等，1998，J.Interferon和Cytokine Res.18，287-295；Sarenva等，1995，Biochem J.，308，9-14)，當(dāng)huIFNG在CHO細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，僅約50％的IFNG分子利用全部?jī)煞N糖基化位點(diǎn)，約40％利用一種糖基化位點(diǎn)(1N)，約10％未被糖基化(ON)。體內(nèi)N-糖基化程度的增加可通過(guò)本領(lǐng)域任何合適的方法，如SDS-PAGE來(lái)測(cè)定。測(cè)定增加的糖基化作用的一個(gè)便利試驗(yàn)是本文中材料和方法部分的“測(cè)定增加的糖基化”章節(jié)所述。
本文中術(shù)語(yǔ)“IFNG多肽變體群”或“包含本發(fā)明IFNG多肽的同質(zhì)群體的組合物”是指包含至少兩種有不同成都糖基化的IFNG多肽的組合物。正如所理解的那樣，本發(fā)明提供了獲得IFNG多肽群體的手段(means)，其中所述群體中不斷增多的IFNG分子被徹底糖基化。
因此，本發(fā)明還涉及本發(fā)明IFNG多肽的同質(zhì)群體(即這樣一個(gè)群體，其中大多是IFNG多肽都徹底糖基化)或包含本發(fā)明IFNG多肽的同質(zhì)群體的組合物。例如，所述IFNG多肽群體可能包含至少70％的本發(fā)明IFNG多肽，優(yōu)選至少75％，如至少80％，例如至少85％，更優(yōu)選至少90％，如至少95％，例如至少96％，還更優(yōu)選至少97％，如至少98％，例如至少99％。
術(shù)語(yǔ)“表現(xiàn)出IFNG活性”是指多肽具有天然huIFNG或rhuIFNG的一種或多種功能，包括體外或體內(nèi)測(cè)定的結(jié)合IFNG受體的能力和通過(guò)huIFNG與其受體結(jié)合而導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力(即體外或體內(nèi)生物活性)。Aguet等(Cell，55273-280，1988)和Calderon等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，854837-4841，1988)描述了IFNG受體。一個(gè)適于檢驗(yàn)IFNG活性的試驗(yàn)是本文中的“初步試驗(yàn)”。利用本文所述的“初步試驗(yàn)”時(shí)，“表現(xiàn)出IFNG活性”的多肽的比活性為rhuIFNG的至少5％。應(yīng)該理解，由于具體修飾的不同(例如所述變體是否PEG化)，活性可以在一個(gè)較寬的范圍內(nèi)。因此，相對(duì)于rhuIFNG的比活性可以低至5％或者高至150％。例如，所述比活性可以是rhuIFNG的10％(例如10-125％)，如至少15％(例如15-125％)，如至少20％(如20-125％)，至少25％(例如25-125％)，至少30％(例如30-125％)，至少35％(例如35-125％)，至少40％(例如40-125％)，至少45％(例如45-125％)，至少50％(例如50-125％)，至少55％(例如55-125％)，至少60％(例如60-125％)，至少65％(例如65-125％)，至少70％(例如70-125％)，至少75％(例如75-125％)，至少80％(例如80-125％)或至少90％(例如90-110％)。
“IFNG多肽”是表現(xiàn)出IFNG活性的多肽，即，術(shù)語(yǔ)“IFNG多肽”用于指任何IFNG分子(無(wú)論該分子是huIFNG，其截短型，或其變體)，只要該IFNG分子表現(xiàn)出本文所述的IFNG活性。術(shù)語(yǔ)“IFNG多肽”在本文中按需要用于表示單體或二聚體形式的多肽。例如，當(dāng)表示具體的取代時(shí)，它們通常表示huIFNG多肽單體的取代。當(dāng)涉及本發(fā)明IFNG分子時(shí)，一般是二聚體形式(且因此，例如，包含兩個(gè)按所述修飾的IFNG多肽單體)。IFNG多肽的二聚體形式可通過(guò)兩個(gè)單體的正常結(jié)合來(lái)提供，或者以單鏈二聚體IFNG多肽的形式來(lái)提供。
術(shù)語(yǔ)“親本”是指根據(jù)本發(fā)明改進(jìn)了糖基化位點(diǎn)的IFNG多肽。通過(guò)本發(fā)明進(jìn)行修飾的親本多肽可以是任何IFNG多肽，并因此可以源自任何來(lái)源，例如非人哺乳動(dòng)物來(lái)源，但優(yōu)選親本多肽是具有氨基酸序列SEQ IDNO17或其片段的huIFNG多肽。
“片段”是全長(zhǎng)IFNG多肽序列中表現(xiàn)IFNG活性的一部分(例如，全長(zhǎng)huIFNG多肽的一種片段如SEQ ID NO17所示，全長(zhǎng)[S99T]huIFNG多肽變體的一種片段如SEQ ID NO1所示)，例如其C-末端或N-末端截短型。IFNG多肽變體片段的具體實(shí)例包括，C-末端截短1-15個(gè)氨基酸殘基的[S99T]huIFNG，例如截短1個(gè)氨基酸殘基(SEQ ED NO2)，2個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO3)，3個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO4)，4個(gè)氨基酸殘基(SEQ IDNO5)，5個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO6)，6個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO7)，7個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO8)，8個(gè)氨基酸殘基(SEQ DD NO9)，9個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO10)，10個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO11)，11個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO12)，12個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO13)，13個(gè)氨基酸殘基(SEQID NO14)，14個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO15)或15個(gè)氨基酸殘基(SEQ IDNO16)，和/或N-末端截短1-3個(gè)氨基酸殘基的[S99T]huIFNG。huIFNG片段的具體實(shí)例包括，C-末端截短1-15個(gè)氨基酸殘基的huIFNG，例如截短1個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO19)，2個(gè)氨基酸殘基(SEQ H)NO10)，3個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO21)，4個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO22)，5個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO23)，6個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO24)，7個(gè)氨基酸殘基(SEQ IDNO25)，8個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO26)，9個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO27)，10個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO28)，11個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO29)，12個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO30)，13個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO31)，14個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO32)或15個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO33)，和/或N-末端截短1-3個(gè)氨基酸殘基的huIFNG。
如上所述，IFNG多肽變體除了S99T取代以外，還可包含至少一個(gè)另外的修飾，只要該變體表現(xiàn)出IFNG活性，即所述變體可以是[S99T]huIFNG的變體，或[S99T]huIFNG的片段的變體。這類變體的具體實(shí)例包括引入和/或去除了氨基酸殘基、包含非多肽組分連接基團(tuán)的變體。[S99T]huIFNG(及其片段)的變體的其它實(shí)例包括以上“背景技術(shù)”章節(jié)中所述的變體，例如包括N-末端添加了的Cys-Tyr-Cys或添加了Met的[S99T]huIFNG，以及US6,046,034中公開的半胱氨酸修飾的變體。
一般情況下，本發(fā)明的變體由核苷酸序列編碼，該核苷酸序列與親本IFNG多肽的編碼序列相比，已經(jīng)按照本發(fā)明進(jìn)行了修飾。
但并不總是如此，因?yàn)樗鲎凅w多肽可以在翻譯后加工過(guò)程中進(jìn)行C-末端或N-末端截短，例如在細(xì)胞中、表達(dá)介質(zhì)中、純化期間等被蛋白酶從C-末端或N-末端裂解，導(dǎo)致所得變體多肽為最初產(chǎn)生的變體多肽的截短型(例如，盡管最初產(chǎn)生的是全長(zhǎng)變體，但由于對(duì)該全長(zhǎng)變體多肽的翻譯后加工，可以獲得C-末端截短的變體多肽)。在這種情況下，術(shù)語(yǔ)“親本”應(yīng)理解為將要按照本發(fā)明進(jìn)行修飾的截短形式。
“變體”是一種多肽，它與其親本多肽(正常情況下是SEQ ID NO17或其截短型，如SEQ ID NOS19-33所示)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的區(qū)別，一般是1-15個(gè)氨基酸殘基(如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個(gè)氨基酸殘基)的區(qū)別，例如1-10個(gè)氨基酸殘基，1-5個(gè)氨基酸殘基，或1-3個(gè)氨基酸殘基。
術(shù)語(yǔ)“功能性位點(diǎn)”是指IFNG的功能或功效所必需的或者與之相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。該氨基酸殘基“位于”功能性位點(diǎn)。功能性位點(diǎn)可用本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定且優(yōu)選經(jīng)過(guò)分析與諸如IFNG受體的相關(guān)受體復(fù)合的多肽結(jié)構(gòu)來(lái)鑒定。
術(shù)語(yǔ)“huIFNG”是指野生型人IFNG的具有氨基酸序列SEQ ID NO17的成熟形式。
術(shù)語(yǔ)“rhuIFNG”是指通過(guò)重組手段制備的、野生型人IFNG的具有氨基酸序列SEQ ID NO17的成熟形式。
術(shù)語(yǔ)“[S99T]huIFNG”是指野生型人IFNG中第99位的絲氨酸殘基已經(jīng)被蘇氨酸殘基取代了的成熟形式(見SEQ ID NO1)。
本文中術(shù)語(yǔ)“糖基化huIFNG”是指所述hulFNG多肽中能使其糖基化的細(xì)胞中產(chǎn)生，并因此在其天然N-糖基化位點(diǎn)(SEQ ID NO17的第25和97位)被糖基化。
類似地，術(shù)語(yǔ)“糖基化huIFNG變體”是指所述IFNG多肽變體中能使其糖基化的細(xì)胞中產(chǎn)生。
本文中術(shù)語(yǔ)“Actimmune”是指IFNG的140個(gè)氨基酸的形式(Actimmune在C-末端截短了4個(gè)氨基酸并且在N-末端包括一個(gè)Met殘基)(見SEQ ID NO34)，它通過(guò)使遺傳工程化大腸桿菌發(fā)酵而獲得。關(guān)于Actimmune的進(jìn)一步信息見www.actimmune.Com。
本發(fā)明的干擾素γ多肽變體具有優(yōu)化的體內(nèi)糖基化位點(diǎn)的本發(fā)明IFNG變體如上文所述，意外發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將huIFNG(或其片段)第99位的絲氨酸殘基替換為蘇氨酸殘基，可以使huIFNG第97位的天然N-糖基化位點(diǎn)的糖基化增多，即可使徹底糖基化或基本上徹底糖基化的IFNG分子所占比例增加。圖1顯示，襯底糖基化的IFNG多肽的顯著增加是可以實(shí)現(xiàn)的。在[S99T]huIFNG(SEQ ID NO1)多肽變體的情況中可以觀察到，培養(yǎng)基中收獲的這種多肽變體約90％利用了全部?jī)煞NN-糖基化位點(diǎn)，而培養(yǎng)基中收獲的rhuIFNG多肽僅有約60％被徹底糖基化。
相應(yīng)地，本發(fā)明一個(gè)方面涉及表現(xiàn)出IFNG活性并具有氨基酸序列SEQID NO1的IFNG多肽變體(即[S99T]huIFNG)，或其具有IFNG活性的片段。
如上文所述，已知huIFNG的C-末端截短形式與hulFNG相比，仍保留活性，在有些情況下甚至還增強(qiáng)活性。因此，本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的IFNG多肽變體是SEQ ID NO1的片段，該片段在C-末端截短了1-15個(gè)氨基酸殘基，通常在C-末端截短1-10個(gè)氨基酸殘基。SEQ ID NO1的這類C-末端截短形式的具體實(shí)例參見SEQ ID NOS2-16。本發(fā)明這一實(shí)施方案中的IFNG多肽片段具有IFNG活性。
應(yīng)理解，這方面的糖基化IFNG多肽變體應(yīng)在糖基化宿主細(xì)胞中重組表達(dá)，優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，如在“與糖組分的偶聯(lián)”一節(jié)中提到的那些細(xì)胞。
如上文所解釋的，rhuIFNG在CHO細(xì)胞中時(shí)，所表達(dá)的IFNG多肽群體中僅約50-60％被徹底糖基化。因此，本發(fā)明IFNG多肽變體的主要優(yōu)點(diǎn)之一是對(duì)第97位的體內(nèi)糖基化位點(diǎn)的高度利用，這導(dǎo)致獲得相對(duì)于huIFNG更均一的群體。由于該更均一的群體，包含這樣的IFNG多肽變體群體的組合物(如收獲在培養(yǎng)基中的)無(wú)需象rhuIFNG那樣進(jìn)行繁瑣而耗時(shí)的純化。
因此，本發(fā)明另一方面涉及IFNG多肽變體的群體，或包含IFNG多肽變體群體的組合物，其中所述群體包含至少約70％的本發(fā)明IFNG多肽變體。優(yōu)選所述組合物包含至少75％，更優(yōu)選至少80％，還更優(yōu)選至少85％，如至少約90％的本發(fā)明IFNG多肽變體。
更尤其，本發(fā)明涉及IFNG多肽變體的群體，或包含IFNG多肽變體群體的組合物，其中所述群體包含至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，還更優(yōu)選至少85％，如至少約90％的具有氨基酸序列SEQ ID NO1的本發(fā)明IFNG多肽變體。
類似地，本發(fā)明還涉及IFNG多肽變體的群體，或包含IFNG多肽變體群體的組合物，其中所述群體包含至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，還更優(yōu)選至少85％，如至少約90％的具有選自下組的氨基酸序列的本發(fā)明IFNG多肽變體SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQBD NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ IDNO14，SEQ ID NO15或SEQ ID NO16。
除了上文提到的、優(yōu)化rhuIFNG中第97位的體內(nèi)糖基化位點(diǎn)所需的S99T突變，還可優(yōu)化已引入SEQ ID NO1或其片段(例如，為了增加血清半壽期和/或增加AUCsc)的其它體內(nèi)糖基化位點(diǎn)。一般情況下，所述體內(nèi)糖基化位點(diǎn)為N-糖基化位點(diǎn)，但本發(fā)明也涉及O-糖基化位點(diǎn)。所述優(yōu)化可通過(guò)在靠近糖基化位點(diǎn)(尤其靠近體內(nèi)糖基化位點(diǎn))的位置進(jìn)行修飾(優(yōu)選取代)而實(shí)現(xiàn)。通常，這樣的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)是引入的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)。適于引入體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)的合適位置可參見WO 01/36001，并將在下文描述。
“靠近”糖基化位點(diǎn)的氨基酸殘基通常位于位置-4，-3，-2，-1，+1，+2，+3或+4(相對(duì)于與糖相連的糖基化位點(diǎn)的氨基酸殘基而言)，優(yōu)選位置-1，+1，或+3，尤其位置+1或+3?？拷w內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)(具有序列N-X-S/T/C)的氨基酸殘基可以位于位置-4，-3，-2，-1，+1，+2，+3或+4(相對(duì)于N-殘基而言)。
當(dāng)相對(duì)于N-殘基而言的位置+2被修飾時(shí)，應(yīng)理解僅有限量的修飾有可能發(fā)生，因?yàn)闉榱司S持/引入體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)，該位置的氨基酸殘基必需是Ser，Thr或Cys。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在相對(duì)于N-殘基而言的位置+2進(jìn)行的修飾是取代，其中目標(biāo)氨基酸殘基被Thr殘基取代。但如果該氨基酸殘基已經(jīng)是Thr殘基，通常并不優(yōu)選或必需在該位置進(jìn)行任何取代。當(dāng)X被修飾，X應(yīng)不是Pro，優(yōu)選不是Trp，Asp，Glu或Leu。被引入的氨基酸殘基優(yōu)選選自Phe，Asn，Gln，Tyr，Val，Ala，Met，Ile，Lys，Gly，Arg，Thr，His，Cys或Ser，更優(yōu)選Ala，Met，Ile，Lys，Gly，Arg，Thr，His，Cys或Ser，尤其Ala或Ser。
當(dāng)相對(duì)于N-殘基而言的位置+3被修飾時(shí)，將要引入的氨基酸殘基優(yōu)選選自His，Asp，Ala，Met，Asn，Thr，Arg，Ser或Cys，更優(yōu)選Thr，Arg，Ser或Cys。當(dāng)X殘基是Ser殘基時(shí)，特別優(yōu)選上述修飾。
因此，在天然體內(nèi)N-糖基化方面，第97位的N-糖基化位點(diǎn)可以通過(guò)在選自下組的位點(diǎn)進(jìn)行修飾(如取代)而被進(jìn)一步優(yōu)化E93，K94，L95，T96，Y98，V100或T101(即，相對(duì)N97而言的位置-4，-3，-2，-1，+1，+3或+4)。在SEQID NO1(或其片段)的第98位進(jìn)行取代的具體實(shí)例包括Y98F，Y98N，Y98Q，Y98V，Y98A，Y98M，Y98I，Y98K，Y98G，Y98R，Y98T，Y98H，Y98C或Y98S，優(yōu)選Y98A，Y98M，Y98I，Y98K，Y98G，Y98R，Y98T，Y98H，Y98C或Y98S，尤其Y98S。在SEQ ID NO1(或其片段)的第100位進(jìn)行取代的具體實(shí)例包括V100H，V100D，V100A，V100M，V100N，V100T，V100R，V100S，或V100C，尤其V100T，V100R，V100S或V100C。
類似地，第25位的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)可以通過(guò)在選自下組的位點(diǎn)進(jìn)行修飾(如取代)而被進(jìn)一步優(yōu)化D21，V22，A23，D24，G26，L28或F29(即，相對(duì)于N25而言的位置-4，-3，-2，-1，+1，+3或+4)。在SEQ ID NO1(或其片段)的第26位進(jìn)行取代的具體實(shí)例包括G26F，G26N，G26Y，G26Q，G26V，G26A，G26M，G26I，G26K，G26R，G26T，G26H，G26C或G26S，優(yōu)選G26A，G26M，G26I，G26K，G26R，G26T，G26H，G26C或G26S，更優(yōu)選G26A或G26S，尤其G26A。在SEQ ID NO1(或其片段)的第28位進(jìn)行取代的具體實(shí)例包括G28H，G28D，G28A，G28M，G28N，G28T，G28R，G28S，或G28S，尤其G28A，G28T，G28R，G28S或G28C。
顯然，上述與優(yōu)化位置97的糖基化相關(guān)的任何修飾可以與上述與優(yōu)化位置25的糖基化相關(guān)的任何修飾組合。
AUCsc增加和/或血清半壽期增加的本發(fā)明IFNG變體本發(fā)明另一方面涉及具有氨基酸序列SEQ ID NO1的IFNG多肽變體，所述變體具有IFNG活性。
本發(fā)明還涉及IFNG多肽片段的變體，它具有選自下列的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15或SEQID NO16，其中所述變體具有IFNG活性。
因此，所述變體與SEQ ID NOS1-16相比包含至少一個(gè)進(jìn)一步的修飾。
為了避免過(guò)多破壞[S99T]huIFNG多肽變體(或其片段)的結(jié)構(gòu)和功能，按照本發(fā)明修飾的氨基酸殘基的總數(shù)一般不超過(guò)15個(gè)。通常，IFNG多肽變體相對(duì)于氨基酸序列SEQ ID NO 1有1-10個(gè)修飾，例如1-8，2-8，1-5，1-3或2-5個(gè)修飾。優(yōu)選所述修飾為取代。應(yīng)理解，類似的考慮對(duì)于具有氨基酸序列SEQ ID NO1的IFNG多肽變體的片段的變體也是適用的。因此，當(dāng)所述變體是SEQ ID NOS2-16中任一種序列的變體時(shí)，這樣的變體與SEQ ID NOS2-16所示的相關(guān)氨基酸序列相比，常常有不到15處修飾，通常1-10處修飾，例如1-8，2-8，1-5，1-3或2-5個(gè)修飾。優(yōu)選所述修飾是取代。
因此，正常情況下IFNG多肽變體(即除了S99T取代以外還包含至少一個(gè)修飾的變體)包含下述氨基酸序列，該序列與氨基酸序列SEQ ID NO1(或其片段)有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個(gè)氨基酸殘基不同。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選是實(shí)施方案中，所述IFNG變體(進(jìn)一步)引入和/或除去至少一個(gè)氨基酸殘基，該殘基含有非多肽組分的連接基團(tuán)。
通過(guò)除去或引入包含非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基，有可能使該多肽進(jìn)行特別適應(yīng)，以便制備出更易于與所選非多肽組分進(jìn)行偶聯(lián)的分子，從而優(yōu)化偶聯(lián)模式(如確保非多肽組分在IFNG多肽變體表面的優(yōu)化分布)，并因此獲得具有IFNG活性的新偶聯(lián)分子，此分子具有另外一或多種比基于huIFNG或rhuIFNG的現(xiàn)有分子改進(jìn)的特性。例如，通過(guò)引入連接基團(tuán)，IFNG多肽變體可強(qiáng)化或改變與相關(guān)非多肽組分結(jié)合的特異性氨基酸殘基的含量，從而獲得更有效、更專一和/或更廣泛的偶聯(lián)。通過(guò)除去一或多個(gè)連接基團(tuán)，有可能在多肽上與非多肽組分偶聯(lián)有不利后果的部位避免這樣的偶聯(lián)，所述部位如該多肽的功能性位點(diǎn)或其附近的氨基酸殘基(因?yàn)樵谶@樣的位點(diǎn)進(jìn)行偶聯(lián)可能導(dǎo)致所得偶聯(lián)多肽由于受體識(shí)別能力受損而失活或IFNG活性減弱)。此外，將靠近另一連接基團(tuán)的連接基團(tuán)除去可能有利于避免與這種基團(tuán)發(fā)生不均一性偶聯(lián)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，IFNG多肽的不止一個(gè)氨基酸殘基被改變，例如所述改變涉及除去或引入帶有所選非多肽組分的連接基團(tuán)的氨基酸殘基。該實(shí)施方案特別優(yōu)選，因?yàn)樗锌赡芴禺愋栽O(shè)計(jì)IFNG多肽變體，從而獲得與非多肽組分的優(yōu)化偶聯(lián)。
除了引入和/或除去氨基酸殘基，所述多肽變體還可包含不改變帶有非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基的引入和/或去除的其它修飾，如取代。這類修飾的實(shí)例包括保守氨基酸取代和/或?qū)ys-Tyr-Cys或Met引入N-末端。
可用于偶聯(lián)的以及出現(xiàn)在二聚化IFNG多肽變體中的連接基團(tuán)的確切數(shù)目取決于偶聯(lián)所要達(dá)到的效果。而所要達(dá)到的效果取決于，例如偶聯(lián)的性質(zhì)和程度(例如，非多肽組分的同一性，在應(yīng)進(jìn)行偶聯(lián)或應(yīng)避免偶聯(lián)的情況中希望或可能與多肽偶聯(lián)的非多肽組分的數(shù)量，等)。
應(yīng)理解，帶有非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基，無(wú)論是被除去還是被引入，對(duì)它的選擇都基于所選非多肽組分的特性，并且在大多數(shù)情況中，基于所用的偶聯(lián)方法。例如，當(dāng)非多肽組分是聚合物分子如聚乙二醇-衍生的或聚環(huán)氧乙烷驗(yàn)收的分子時(shí)，能作為連接基團(tuán)的氨基酸殘基選自半胱氨酸，賴氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或精氨酸。特別優(yōu)選半胱氨酸。當(dāng)非多肽組分是糖組分時(shí)，連接基團(tuán)例如是體內(nèi)糖基化位點(diǎn)，優(yōu)選N-糖基化位點(diǎn)。
每當(dāng)在具有氨基酸序列SEQ ID NO1(或其片段)的IFNG多肽中引入或除去非多肽組分的連接基團(tuán)時(shí)，需修飾的多肽位置按如下進(jìn)行適當(dāng)選擇該位置優(yōu)選位于IFNG多肽的表面，更優(yōu)選該位置由有至少25％的側(cè)鏈暴露于溶劑(優(yōu)選至少50％的側(cè)鏈暴露于溶劑的氨基酸殘基占據(jù)，該氨基酸殘基)，如基于二聚化IFNG的三維結(jié)構(gòu)或模型所測(cè)定的那樣，該結(jié)構(gòu)或模型任選進(jìn)一步包含一個(gè)或兩個(gè)IFNG受體分子。這樣的位置列于本文實(shí)施例1中。
另外感興趣的是修飾親本IFNG的任意23個(gè)C-末端氨基酸殘基(尤其通過(guò)引入含有非多肽組分的連接基團(tuán)的氨基酸殘基)，因?yàn)閾?jù)信這樣的殘基位于IFNG多肽的表面。
另外，優(yōu)選對(duì)IFNG多肽環(huán)區(qū)的一或多個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行修飾，因?yàn)檫@些環(huán)區(qū)中的大多數(shù)氨基酸殘基都暴露在表面且離功能性位點(diǎn)足夠遠(yuǎn)，遠(yuǎn)到引入非多肽組分(如聚合物分子，尤其PEG分子)和/或N-糖基化位點(diǎn)不會(huì)影響該分子的功能。這樣的環(huán)區(qū)可以通過(guò)觀察huIFNG的三維結(jié)構(gòu)來(lái)確定。組成所述環(huán)區(qū)的氨基酸殘基是殘基N16-K37(A-B環(huán))，F(xiàn)60-S65(B-C環(huán))，N83-S84(C-D環(huán))和Y98 L103(D-E環(huán))。
組成IFNG受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基是Q1，D2，Y4，V5，E9，K12，G18，H19，S20，D21，V22，A23，D24，N25，G26，T27，L30，K34，K37，K108，H111，E112，I114，Q115，A118，E119(見本文實(shí)施例2)。通常優(yōu)選不將一個(gè)非多肽組分的多個(gè)連接基團(tuán)(如額外的N-糖基化位點(diǎn)和/或半胱氨酸殘基)引入該分子的這一位點(diǎn)。
為了測(cè)定連接基團(tuán)的優(yōu)化分布，根據(jù)IFNG二聚體多肽的三維結(jié)構(gòu)計(jì)算位于IFNG多肽表面的氨基酸殘基之間的距離。更具體地，測(cè)定含有所述連接基團(tuán)的氨基酸殘基的CB之間的距離，或者測(cè)定其中一個(gè)氨基酸殘基的官能團(tuán)(賴氨酸的NZ，天冬氨酸的CG，谷氨酸的CD，半胱氨酸的SG)與含有連接基團(tuán)的另一氨基酸殘基的CB之間的距離。在甘氨酸的情況中，用CA代替CB。在本發(fā)明的IFNG多肽部分中，任何所述的距離優(yōu)選超過(guò)8，特別是超過(guò)10，以避免或減少不均一性偶聯(lián)。
另外，IFNG多肽變體的氨基酸序列與SEQ ID NO1(或其片段)的區(qū)別在于，除去了組成表位的一部分的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選通過(guò)取代含有非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基來(lái)除去，以便破壞或滅活該表位。通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的方法，也稱為表位定位法，可鑒定[S99T]huIFNG，huIFNG或rhuIFNG的表位，參見，例如Romagnoli et al.，Biol Chem，1999，380(5)553-9，DeLisser EN，Methods Mol Biol，1999，9611-20，Van de Water et al.，Clin Immunol Immunopathol，1997，85(3)229-35，Saint-Remy JM，Toxicology，1997，119(1)77-81，and Lane DP和Stephen CW，Curr Opin Immunol，1993，5(2)268-71。一種方法是建立表達(dá)例如9個(gè)氨基酸殘基的隨機(jī)寡肽的噬菌體展示文庫(kù)。通過(guò)免疫沉淀法從抗[S99T]huIFNG，huIFNG或rhuIFNG的特異性抗血清純化IgGl抗體，通過(guò)免疫印跡鑒定反應(yīng)性噬菌體。通過(guò)測(cè)定純化的反應(yīng)性噬菌體的DNA序列，可測(cè)定寡肽的序列，隨后在IFNG的三維結(jié)構(gòu)上定位該序列。由此鑒定的該結(jié)構(gòu)上的區(qū)域構(gòu)成表位，然后可選擇該表位作為導(dǎo)入非多肽組分的連接基團(tuán)的靶區(qū)域。
功能性體內(nèi)半壽期和血清半壽期取決于，例如，多肽變體的分子量，而使半壽期增加所需的連接基團(tuán)數(shù)目取決于所選非多肽組分的分子量。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)Laemmli，U.K.，Nature Vol 227(1970)，p680-85所述的SDS-PAGE測(cè)定，本發(fā)明的IFNG多肽變體具有至少67kDa的分子量，尤其至少70kDa。IFNG的分子量范圍是大約34-50kDa，因此還需要約20-40kDa以獲得所需的效果。這可以，例如，由2-4個(gè)10kDa的PEG分子或組合額外的體內(nèi)糖基化位點(diǎn)和額外的PEG分子來(lái)提供，如本文其它部分所述。
優(yōu)選本發(fā)明的偶聯(lián)的IFNG多肽變體有1-10個(gè)(額外的)非多肽組分，如1-8，2-8，1-5，1-3或2-5個(gè)(額外的)非多肽組分。通常，偶聯(lián)的變體有1-3個(gè)(額外的)非多肽組分，如1，2或3個(gè)(額外的)非多肽組分。
如上所述，在生理?xiàng)l件下，huIFNG為二聚體多肽。所述多肽通常是同型二聚體形式(例如，通過(guò)與按本文所述制備的兩個(gè)IFNG多肽分子結(jié)合來(lái)制備)。然而，如果需要，IFNG多肽變體可以以單鏈形式提供，其中兩個(gè)IFNG多肽單體可通過(guò)肽鍵或肽接頭連接。以單鏈形式提供IFNG多肽變體的優(yōu)勢(shì)在于，其中的兩個(gè)IFNG多肽可以不同，這種不同有利于，例如，允許多肽的不對(duì)稱誘變。例如，從其中一個(gè)單體的受體結(jié)合位點(diǎn)去掉PEG化位點(diǎn)，但保留另一個(gè)單體的位點(diǎn)。這樣一來(lái)，PEG化后，一個(gè)單體具有完整的受體結(jié)合位點(diǎn)，而另一個(gè)被徹底PEG化(且因此提供顯著增大的分子量)。
非多肽組分是糖組分時(shí)的本發(fā)明IFNG變體在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，SEQ ID NO1(或其片段)所示IFNG變體至少引入和/或除去至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)。優(yōu)選該糖基化位點(diǎn)為體內(nèi)糖基化位點(diǎn)，即非多肽組分是糖組分，例如O-連接的或N-連接的糖組分，優(yōu)選N-連接的糖組分。
在本發(fā)明一個(gè)感興趣的實(shí)施方案中，所述變體引入至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)，尤其一個(gè)體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)。優(yōu)選引入的糖基化位點(diǎn)通過(guò)取代而引入。
例如，可將體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)引入SEQ ID NO1(或其片段)所示IFNG多肽中的一個(gè)位置，所述多肽有暴露在表面的氨基酸殘基，優(yōu)先該氨基酸殘基有至少25％的側(cè)鏈暴露于表面，尤其至少50％的側(cè)鏈暴露于表面。對(duì)這類位置的測(cè)定詳見本文實(shí)施例1。
引入N-糖基化位點(diǎn)，所用的引入方式使該位點(diǎn)的N-殘基位于所述位置中。類似地，引入O-糖基化位點(diǎn)，使組成該位點(diǎn)的S或T殘基位于所述位置中。應(yīng)理解，術(shù)語(yǔ)“至少25％(或至少50％)的側(cè)鏈暴露在表面”當(dāng)與體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)的引入聯(lián)用時(shí)，它表示實(shí)際上與糖組分連接的位置中氨基酸側(cè)鏈的表面可接近特性。在很多情況下，必須在相對(duì)于實(shí)際上與糖組分相連的天冬酰胺殘基而言為+2的位置上引入絲氨酸或蘇氨酸殘基(當(dāng)然，除非此位置已被絲氨酸或蘇氨酸殘基占據(jù))，這些引入了絲氨酸或蘇氨酸殘基的位置可以被掩蓋，即它有不到25％的側(cè)鏈暴露在表面。
另外，為了保證有效糖基化，優(yōu)選體內(nèi)糖基化位點(diǎn)，特別是N-糖基化位點(diǎn)的N殘基或O-糖基化位點(diǎn)的S或T殘基位于IFNG多肽的118個(gè)N-末端氨基酸殘基內(nèi)，更優(yōu)選在97個(gè)N-末端氨基酸殘基內(nèi)。另外更優(yōu)選的是，體內(nèi)糖基化位點(diǎn)引入的位置是只需要一個(gè)突變就可產(chǎn)生該位點(diǎn)的位置(即，產(chǎn)生功能性糖基化位點(diǎn)所需的任何其它氨基酸殘基已存在于該分子中)。
例如，導(dǎo)致在暴露于IFNG多肽表面并被有至少25％的側(cè)鏈暴露于該表面的氨基酸殘基占據(jù)的位置引入另一N-糖基化位點(diǎn)的取代包括Q1N+P3S/T，P3N+V5S/T，K6N+A8S/T，E9N+L11S/T，K12S/T，K13N+F15S/T，Y14N+N16S/T，G18S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，D21N+A23S/T，G26N+L28S/T，G31N+L33S/T，K34N+W36S/T，K37S/T，K37N+E39S/T，E38N，E38N+S40T，E39N+D41S/T，S40N+R42S/T，K55N+F57S/T，K58N+F60S/T，K61S/T，K61N+D63S/T，D62N+Q64S/T，D63N，D63N+S65T，Q64N+I66S/T，S65N+Q67S/T，Q67N，Q67N+S69T，K68N+V70S/T，E71N+I73S/T，T72N+K74S/T，K74N+D76S/T，E75N+M77S/T，K80S/T，V79N+F81S/T，K80N+F82S/T，N85S/T，S84N+K86S/T，K87S/T，K86N+K88S/T，K87N+R89S/T，D90N+F92S/T，E93N+L95S/T，K94N，K94N+T96S，T101N+L103S/T，D102N+N104S/T，L103N+V105S/T，Q106S/T，E119N，E119N+S121T，P122N+A124S/T，A123N+K125S/T，A124N，A124N+T126S，K125N+G127S/T，T126N+K128S/T，G127N+R129S/T，K128N+K130S/T，R129N+R131S/T，K130N，K130N+S132T，R131N+Q133S/T，S132N+M134S/T，Q133N+L135S/T，M134N+F136S/T，L135N+R137S/T，F(xiàn)136N+G138S/T，R137N+R139S/T，G138N+R140S/T，R139N+A141S/T，R140N或R140N+S142T，所示的取代相對(duì)于具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的[S99T]huIFNG(或相對(duì)于其具有氨基酸序列SEQ ID NOS2-16的相關(guān)片段)。S/T表示取代為絲氨酸或蘇氨酸殘基，優(yōu)選蘇氨酸殘基。
導(dǎo)致在暴露于IFNG多肽(其具有至少50％的側(cè)鏈暴露于表面(在具有受體分子的結(jié)構(gòu)中))表面的位置導(dǎo)入另一N-糖基化位點(diǎn)的取代包括P3N+V5S/T，K6N+A8S/T，K12S/T，K13N+F15S/T，G18S/T，D21N+A23S/T，G26N+L28S/T，G31N+L33S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，E38N，E38N+S40S/T，E39N+D41S/T，K55N+F57S/T，K58N+F60S/T，K61S/T，D62N+Q64S/T，Q64N+I66S/T，S65N+Q67S/T，K68N+V70S/T，E71N+I73S/T，E75N+M77S/T，N85S/T，S84N+K86S/T，K86N+K88S/T，K87N+R89S/T，K94N，K94N+T96S，T101N+L103S/T，D102N+N104S/T，L103N+V105S/T，Q106S/T，P122N+A124S/T，A123N+K125S/T，A124N，A124N+T126S，K125N+G127S/T，T126N+K128S/T，G127N+R129S/T，K128N+K130S/T，R129N+R131S/T，K130N，K130N+S132T，R131N+Q133S/T，S132N+M134S/T，Q133N+L135S/T，M134N+F136S/T，L135N+R137S/T，F(xiàn)136N+G138S/T，R137N+R139S/T，G138N+R140S/T，R139N+A141S/T，R140N和R140N+S142T，所示的取代相對(duì)于具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的[S99T]huIFNG(或相對(duì)于其具有氨基酸序列SEQ ID NOS2-16的相關(guān)片段)。S/T表示取代為絲氨酸或蘇氨酸殘基，優(yōu)選蘇氨酸殘基。
導(dǎo)入一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)時(shí)僅需要一個(gè)氨基酸突變的那些取代包括K12S/T，G18S/T，G18N，K37S/T，E38N，M45N，I49N，K61S/T，D63N，Q67N，V70N，K80S/T，F(xiàn)82N，N85S/T，K87S/T，K94N，Q106S/T，E119N，A124N，K130N和R140N，尤其K12S/T，G18N，G18S/T，K37S/T，E38N，K61S/T，D63N，Q67N，K80S/T，N85S/T，K94N，Q106S/T，A124N，K130N，和R140N(具有超過(guò)25％的側(cè)鏈暴露于表面(在不含受體分子的結(jié)構(gòu)中)的位置)，或更優(yōu)選G18N，E38N，D63N，Q67N，K94N，S99N，A124N，K130N和R140N(在不含受體分子的結(jié)構(gòu)中具有超過(guò)50％的側(cè)鏈暴露于表面)。
通常，不優(yōu)選將N-糖基化位點(diǎn)引入構(gòu)成受體結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域中(除了在特殊情況下，參見題為“受體親和力降低了的變體”)。相應(yīng)地，通常不應(yīng)實(shí)施突變Q1N+P3S/T，E9N+L11S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，D21N+A23S/T，G26N+L28S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，E119N或E119N+S121T，除非希望受體親和力降低。
本發(fā)明特別優(yōu)選的變體包括SEQ ID NO1(或其具有氨基酸序列SEQID NOS2-16的片段)，其中所述變體具有IFNG活性并包含至少一個(gè)選自下組的取代K12S，K12T，G18S，G18T，E38N，E38N+S40T，K61S，K61T，N85S，N85T，K94N，Q106S或Q106T，更優(yōu)選選自K12T，G18T，E38N+S40T，K61T，N85T，K94N或Q106T，還更優(yōu)選選自K12T，G18T，E38N+S40T，K61T或N85T，尤其E38N+S40T。
在本發(fā)明另一感興趣的實(shí)施方案中，SEQ ID NO1(或其具有氨基酸序列SEQ ID NOS2-16的片段)包含至少兩個(gè)引入的糖基化位點(diǎn)，尤其至少兩個(gè)引入的N-糖基化位點(diǎn)。導(dǎo)致引入至少兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的至少兩個(gè)修飾(尤其取代)優(yōu)選選自K12S，K12T，G18S，G18T，E38N，E38N+S40T，K61S，K61T，N85S，N85T，K94N，Q106S或Q106T，更優(yōu)選選自K12T，G18T，E38N+S40T，K61T，N85T，K94N或Q106T，還更優(yōu)選選自K12T，G18T，E38N+S40T，K61T或N85T。產(chǎn)生變體(其包含至少兩個(gè)額外的N-糖基化位點(diǎn))的這類取代的具體實(shí)例包括K12T+G18T，K12T+E38N+S40T，K12T+K61T，K12T+N85T，G18T+E38N+S40T，G18T+K61T，G18T+N85T，E38N+S40T+K61T，E38N+S40T+N85T和K61T+N85T。
從上面所列的取代中，優(yōu)選選擇位于118個(gè)N-末端氨基酸殘基內(nèi)的取代，特別是位于97個(gè)N-末端氨基酸殘基內(nèi)的取代。
本發(fā)明的IFNG多肽變體每個(gè)單體可含有單個(gè)體內(nèi)糖基化位點(diǎn)(與SEQID NO1或其片段相比)。然而，為了變成足夠大小以增加血清半壽期，通常需要該多肽包含不止一個(gè)額外的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)，特別是2-7個(gè)或2-5個(gè)額外的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)，例如2，3，4，5，6或7個(gè)體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)。這樣的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)優(yōu)選通過(guò)上文所列的一或多個(gè)取代來(lái)引入。
此外，應(yīng)理解，上述任一種修飾可與“具有優(yōu)化的體內(nèi)糖基化位點(diǎn)的本發(fā)明IFNG變體”一節(jié)所公開的任何修飾組合，尤其與取代G26A組合。
本發(fā)明的IFNG變體，其中非多肽組分是具有半胱氨酸作為連接基團(tuán)的分子在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，SEQ ID NO1(或其片段)所示本發(fā)明IFNG變體包含至少兩個(gè)引入的半胱氨酸殘基。例如，可將半胱氨酸殘基引入具有SEQ ID NO1(或其片段)且有暴露在表面的氨基酸殘基的IFNG多肽中。優(yōu)選所述暴露在表面的氨基酸殘基有至少25％的側(cè)鏈暴露在表面，尤其至少50％的側(cè)鏈暴露在表面。對(duì)這類位置的確定詳見本文實(shí)施例1。
例如，導(dǎo)致在暴露于IFNG多肽表面并被有至少25％的側(cè)鏈暴露于該表面的氨基酸殘基占據(jù)的位置(在具有受體分子的結(jié)構(gòu)中)引入一個(gè)半胱氨酸殘基的取代包括Q1C，D2C，P3C，K6C，E9C，N10C，K13C，Y14C，N16C，G18C，H19C，D21C，N25C，G26C，G31C，K34C，N35C，K37C，E38C，E39C，S40C，K55C，K58C，N59C，K61C，D62C，D63C，Q64C，S65C，Q67C，K68C，E71C，T72C，K74C，E75C，N78C，V79C，K80C，N83C，S84C，N85C，K86C，K87C，D90C，E93C，K94C，T101C，D102C，L103C，N104C或E119C，所示的取代相對(duì)于具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的[S99T]huIFNG(或相對(duì)于其具有氨基酸序列SEQ ID NOS2-16的相關(guān)片段)。
導(dǎo)致在暴露于IFNG多肽表面并被有至少50％的側(cè)鏈暴露于該表面的氨基酸殘基占據(jù)的位置(在具有受體分子的結(jié)構(gòu)中)引入一個(gè)半胱氨酸殘基的取代包括P3C，K6C，N10C，K13C，N16C，D21C，N25C，G26C，G31C，K34C，K37C，E38C，E39C，K55C，K58C，N59C，D62C，Q64C，S65C，K68C，E71C，E75C，N83C，S84C，K86C，K87C，K94C，T101C，D102C，L103C或N104C，所示的取代相對(duì)于具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的[S99T]huIFNG(或相對(duì)于其具有氨基酸序列SEQ ID NOS2-16的相關(guān)片段)。
通常，不優(yōu)選將半胱氨酸殘基引入構(gòu)成受體結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域中(并隨后將該半胱氨酸殘基與非多肽組分連接)(除了在特殊情況下，參見題為“受體親和力降低了的變體”)。相應(yīng)地，通常不應(yīng)實(shí)施突變Q1C，E9C，G18C，H19C，D21C，G26C，K34C，K37C和E119C，除非希望降低受體親和力。
更優(yōu)選所述半胱氨酸殘基通過(guò)選自N10C，N16C，E38C，N59C，N83C，K94C，N104C或A124C的取代來(lái)引入。
在本發(fā)明另一感興趣的實(shí)施方案中，SEQ ID NO1(或其具有氨基酸序列SEQ ID NOS2-16的片段)包含至少兩個(gè)引入的半胱氨酸殘基。導(dǎo)致引入至少兩個(gè)半胱氨酸殘基的至少兩個(gè)修飾(尤其取代)優(yōu)選選自N10C，N16C，E38C，N59C，N83C，K94C，N104C或A124C。產(chǎn)生變體(其包含至少兩個(gè)引入的半胱氨酸殘基)的這類取代的具體實(shí)例包括N10C+N16C，N10C+E38C，N10C+N59C，N10C+N83C，N10C+K94C，N10C+N104C，N10C+A124C，N16C+E38C，N16C+N59C，N16C+N83C，N16C+K94C，N16C+N104C，N16C+A124C，E38C+N59C，E38C+N83C，E38C+K94C，E38C+N104C，E38N+A124C，N59C+N83C，N59C+K94C，N59C+N104C，N59C+A124C，N83C+K94C，N83C+K94C，N83C+N104C，N83C+A124C，K94C+N104C，K94C+A124C和N104C+A124C。
可以理解，優(yōu)選使引入的半胱氨酸殘基與非多肽組分(PEG或更優(yōu)選mPEG)偶聯(lián)。含半胱氨酸的多肽變體與聚合物分子的偶聯(lián)可用任何適當(dāng)?shù)姆绞綄?shí)現(xiàn)，如“與聚合物分子的偶聯(lián)”一節(jié)所述的方式，例如該節(jié)所述的一步法或逐步的方式。使IFNG多肽變體PEG化的優(yōu)選方法是，用半胱氨酸反應(yīng)性PEG使PEG與半胱氨酸殘基共價(jià)連接。目前市場(chǎng)上已有多種帶有不同基團(tuán)的高特異性、半胱氨酸反應(yīng)性PEG(如，正吡啶基-二硫化物，馬來(lái)酰亞胺和乙烯砜)和大小不同的PEG(2-20kDa，如5kDa，10kDa，12kDa或15kDa)，例如Shearwater Polymers Inc.，Huntsville，AL，USA的產(chǎn)品。
應(yīng)理解，上述任一種修飾可與“具有優(yōu)化的體內(nèi)糖基化位點(diǎn)的本發(fā)明IFNG變體”一節(jié)所公開的任何修飾組合，尤其與取代G26A組合。
本發(fā)明的IFNG變體，其中第一種非多肽組分是糖組分，第二種非多肽組分是具有半胱氨酸殘基作為連接基團(tuán)的分子在優(yōu)選實(shí)施方案中，SEQ ID NO1(或其片段)所示的本發(fā)明IFNG變體包含至少一個(gè)引入的N-糖基化位點(diǎn)和至少一個(gè)引入的半管氨酸殘基。所述變體可通過(guò)選擇前兩節(jié)中所述、分別適于引入N-糖基化位點(diǎn)和半胱氨酸殘基的殘基來(lái)制備。但在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述變體包含選自以下的取代K12T+N16C，K12T+E38C，K12T+N59C，K12T+N83C，K12T+K94C，K12T+N104C，K12T+A124C，G18T+N10C，G18T+E38C，G18T+N59C，G18T+N83C，G18T+K94C，G18T+N104C，G18T+A124C，E38N+S40T+N10C，E38N+S40T+N16C，E38N+S40T+N59C，E38N+S40T+N83C，E38N+S40T+K94C，E38N+S40T+N104C，E38N+S40T+A124C，K61T+N10C，K61T+N16C，K61T+E38C，K61T+N83C，K61T+K94C，K61T+N104C，K61T+A124C，N85T+N10C，N85T+N16C，N85T+E38C，N85T+N59C，N85T+K94C，N85T+N104C，N85T+A124C，K94N+N10C，K94N+N16C，K94N+E38C，K94N+N59C，K94N+N83C，K94N+N104C，K94N+A124C，Q106T+N10C，Q106T+N16C，Q106T+E38C，Q106T+N59C，Q106T+N83C，Q106T+K94C或Q106T+A124C，更優(yōu)選選自E38N+S40T+N10C，E38N+S40T+N16C，E38N+S40T+N59C，E38N+S40T+N83C，E38N+S40T+K94C或E38N+S40T+N104C。
可以理解，優(yōu)選使引入的半胱氨酸殘基與非多肽組分(PEG或更優(yōu)選mPEG)偶聯(lián)。含半胱氨酸的多肽變體與聚合物分子的偶聯(lián)可用任何適當(dāng)?shù)姆绞綄?shí)現(xiàn)，如，“與聚合物分子的偶聯(lián)”一節(jié)所述的方式，例如該節(jié)所述的一步法或逐步的方式。適當(dāng)?shù)木酆衔锸荲S-mPEG或OPSS-mPEG。
此外，應(yīng)理解，上述任一種修飾可與“具有優(yōu)化的體內(nèi)糖基化位點(diǎn)的本發(fā)明IFNG變體”一節(jié)所公開的任何修飾組合，尤其與取代G26A組合。
具有降低的受體親和力的IFNG變體增加IFNG多肽的血清半壽期的一種方法是減少受體介導(dǎo)的內(nèi)化作用并因此降低受體介導(dǎo)的清除。
受體介導(dǎo)的內(nèi)化作用取決于IFNG二聚體與IFNG受體復(fù)合物的親和力，因此預(yù)計(jì)，與IFNG受體復(fù)合物的親和力降低了的IFNG變體被內(nèi)化并因此被清除的程度減弱。
IFNG二聚體與其受體復(fù)合物的親和力可通過(guò)在IFNG多肽的受體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行一或多個(gè)修飾(尤其取代)而降低。構(gòu)成受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基見本文實(shí)施例2。有可能實(shí)施的一類取代是保守的氨基酸取代。在另一實(shí)施方案中，所述取代導(dǎo)致引入N-糖基化位點(diǎn)。
故，在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，SEQ ID NO1(或其片段)所示本發(fā)明IFNG變體在受體結(jié)合位點(diǎn)(如本文所述)包含至少一個(gè)修飾，如取代。更具體地，IFNG多肽在所述受體結(jié)合位點(diǎn)包含至少一個(gè)能產(chǎn)生體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)的修飾，如取代。例如，所述取代選自Q1N+P3S/T，D2N+Y4S/T，Y4N+K6S/T，V5N+E7S/T，E9N+L11S/T，K12N+Y14S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，S20N+V22S/T，D21N+A23S/T，V22N+D24S/T，D24N+G26S/T，G26N+L28S/T，L30N+I32S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，K108N+I110S/T，H111N+L113S/T，E112N+I114S/T，I114N+V116S/T，Q115N+M117S/T，A118N+L120S/T，E119N或E119N+S121T，優(yōu)選選自Q1N+P3S/T，D2N+Y4S/T，E9N+L11S/T，K12N+Y14S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，S20N+V22S/T，D21N+A23S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，H111N+L113S/T，Q115N+M117S/T，A118N+L120S/T，E119N或E119N+S121T(將N-糖基化位點(diǎn)引入包含下述氨基酸殘基的位置，該氨基酸殘基有至少25％的側(cè)鏈暴露在表面)，更優(yōu)選選自Q1N+P3S/T，D2N+Y4S/T，E9N+L11S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，S20N+V22S/T，D21N+A23S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，Q115N+M117S/T，A118N+L120S/T，E119N或E119N+S121T(將N-糖基化位點(diǎn)引入包含下述氨基酸殘基的位置，該氨基酸殘基有至少50％的側(cè)鏈暴露在表面)，還更優(yōu)選選自Q1N+P3T，D2N+Y4T，E9N+L11T，G18N+S20T，H19N+D21T，S20N+V22T，D21N+A23T，K34N+W36T，K37N+E39T，Q115N+M117T，A118N+L120T或E119N+S121T，最優(yōu)選選自G18N+S20T，H19N+D21T，D21N+A23T或E119N+S121T，尤其D21N+A23T。
所述變體被認(rèn)為與hulFNG或Actimmune相比受體親和力降低。受體親和力可通過(guò)任何合適的試驗(yàn)和本領(lǐng)域已知的試驗(yàn)來(lái)測(cè)定。適于測(cè)定受體結(jié)合親和力的一種試驗(yàn)是Michiels et al.Int.J.Biochem.Cell Biol.30505-516(1998)所述的BIAcore試驗(yàn)。通過(guò)利用上述試驗(yàn)，被認(rèn)為可用于本發(fā)明目的的IFNG變體是這樣的IFNG變體，其結(jié)合親和力(Kd)是糖基化[S99T]huIFNG或Actimmune的Kd值的1-95％。例如，IFNG多肽的Kd值是糖基化[S99T]huIFNG或Actimmune的Kd值的1-75％或1-50％，如1-25％，例如1-20％或甚至低至1-15％，1-10％或1-5％。
通常，當(dāng)在，例如，本文所述“初步試驗(yàn)”中檢測(cè)時(shí)，這種降低了受體親和力的IFNG變體具有減弱的IFNG活性。例如，這種IFNG多肽變體具有Actimunne或rhuIFNG的比活性的1-95％，例如1-75％，如1-50％，例如1-20％或1-10％。
如上所述，這樣的IFNG變體被認(rèn)為由于受體介導(dǎo)的清除而導(dǎo)致其血清半壽期增加。因此，本發(fā)明這一方面的IFNG多肽變體被認(rèn)為符合前文對(duì)增加的血清半壽期的定義中關(guān)于增加的血清半壽期的要求。
顯然，導(dǎo)致受體結(jié)合親和力的上述任一種修飾可與本文公開的任一種其它修飾組合，尤其與在下述章節(jié)中提到的修飾組合“具有優(yōu)化的N-糖基化位點(diǎn)的本發(fā)明IFNG變體”，“本發(fā)明的IFNG變體，其中的非多肽組分是具有半胱氨酸殘基作為連接基團(tuán)的分子”以及“本發(fā)明的IFNG變體，其中第一種非多肽組分是糖組分，第二種非多肽組分是具有半胱氨酸殘基作為連接基團(tuán)的分子”，如與G26A，E38N+S40T及其組合的組合。
偶聯(lián)方法非多肽組分如上所述，本發(fā)明偶聯(lián)物的非多肽組分優(yōu)選選自聚合物分子、親脂性化合物、糖組分(通過(guò)體內(nèi)糖基化的方式)和有機(jī)衍生劑。所有這些物質(zhì)都可為IFNG多肽變體提供所需特性，特別是增加AUCsc，增加血清半壽期和/或減弱免疫原性。所述多肽變體通常僅與一種類型的非多肽組分偶聯(lián)，但也可以與兩種或多種不同類型的非多肽組分偶聯(lián)，例如，與聚合物分子和糖組分偶聯(lián)，與親脂性基團(tuán)和糖組分偶聯(lián)，與有機(jī)衍生劑和糖組分偶聯(lián)，與親脂性基團(tuán)和聚合物分子偶聯(lián)，等。當(dāng)與兩種不同類型的非多肽組分偶聯(lián)時(shí)，優(yōu)選糖組分和聚合物組分。在下列章節(jié)“與親脂化合物的偶聯(lián)”，“與聚合物分子的偶聯(lián)”，“與糖組分的偶聯(lián)”和“與有機(jī)衍生劑的偶聯(lián)”中描述與各種類型非多肽組分的偶聯(lián)。
與親脂化合物的偶聯(lián)多肽和親脂化合物可直接或者通過(guò)使用接頭互相偶聯(lián)。親脂化合物可以是天然化合物，例如飽和或不飽和脂肪酸，脂肪酸二酮，萜烯，前列腺素，維生素，類胡蘿卜素或類固醇，或者是合成化合物，例如具有一個(gè)或多個(gè)烷基，芳香基，鏈烯基或其他多個(gè)不飽和化合物的羧酸，醇，胺和磺酸。多肽和親脂化合物之間任選通過(guò)接頭的偶聯(lián)可按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，例如，Bodanszky在肽的合成，John Wiley，紐約，1976和在WO96/12505中所述。
與聚合物分子的偶聯(lián)與多肽變體偶聯(lián)的聚合物分子可以是任意合適的聚合物分子，例如天然或合成同型聚合物或雜聚物，一般具有的分子量范圍是300-100,000Da或1000-50,000Da，如2000-40,000Da或2000-30,000Da，例如2000-20,000Da，2000-10,000或10005000Da。更優(yōu)選，所述聚合物分子，如PEG，尤其mPEG通常的分子量約為2，5，10，12，15，20，30，40或50kDa，尤其約5kDa，約10kDa，約12kDa，約15kDa或約20kDa。
本文中提到聚合物分子時(shí)的“約”是指近似平均分子量，它反映了在給定的聚合物制劑中通常有一定程度的分子量分布的事實(shí)。
均聚物的實(shí)例包括聚醇(即，聚-OH)、聚胺(即，聚-NH2)和聚羧酸(即，聚-COOH)。雜聚物是含不同偶聯(lián)基團(tuán)(如羥基和氨基)的聚合物。
合適的聚合物分子的實(shí)例包括選自以下的聚合物分子聚環(huán)氧烷(PAO)，包括聚亞烷基二醇(PAG)，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，分支的PEG，聚乙烯醇(PVA)，聚碳酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯共馬來(lái)酸酐，聚苯乙烯共馬來(lái)酸酐，葡聚糖包括羧甲基葡聚糖，或任何其它適于減小免疫原性和/或增加功能性體內(nèi)半壽期和/或血清半壽期的生物聚合物。聚合物分子的另一實(shí)例是人白蛋白或另一豐富的血漿蛋白。一般來(lái)說(shuō)，聚亞烷基二醇衍生的聚合物是生物相容的、無(wú)毒的、無(wú)抗原性的、無(wú)免疫原性的，具有各種水溶性特性并易于從活的生物中分泌。
PEG是優(yōu)選的聚合物分子，因?yàn)槠渑c，例如多糖如葡聚糖相比僅僅具有極少量的能交聯(lián)的反應(yīng)基團(tuán)。特別感興趣的是單功能PEG，如單甲氧基聚乙二醇(mPEG)，因?yàn)樗呐悸?lián)化學(xué)相對(duì)簡(jiǎn)單(僅僅一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)可用于與多糖上的連接基團(tuán)偶聯(lián))。因此，消除了交聯(lián)的風(fēng)險(xiǎn)，所得的偶聯(lián)型多肽變體均一性更好且聚合物分子與該多肽的反應(yīng)更易于控制。
為了實(shí)現(xiàn)聚合物分子與多肽變體的共價(jià)連接，聚合物分子的羥基末端基團(tuán)必須以活化形式提供，即，具有反應(yīng)性官能團(tuán)(該基團(tuán)的例子包括伯胺基團(tuán)，酰肼(HZ)，巰基，琥珀酸酯(SUC)，琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(SS)，琥珀酰亞胺基琥珀酰胺(SSA)，琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA)，羧甲基化琥珀酰亞胺(SCM)，苯并三唑碳酸酯(BTC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，醛，硝基苯碳酸酯(NPC)，和tresylate(TRES))。適當(dāng)活化的聚合物分子是商業(yè)上可獲得的，例如從Shearwater Polymer，Inc.，Huntsville，AL，USA獲得。另外，聚合物分子可通過(guò)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法活化，例如按WO 90/13540公開的方法。用于本發(fā)明的活化的線性或分支聚合物分子的具體例子在ShearwaterPolymer，Inc.1997和2000年產(chǎn)品目錄(用于研究和制藥的功能化生物相容性聚合物，聚乙二醇和衍生物，本文引用以供參考)中描述?；罨腜EG聚合物的具體例子包括下列線性PEGsNHS-PEG(例如SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG，和SCM-PEG)，和NOR-PEG，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG，以及分支PEGs，例如PEG2-NHS和在US 5,932,462和US 5,643,575中公開的那些分子，本文引用這兩篇文獻(xiàn)以供參考。另外，本文作為參考文獻(xiàn)引用的下列文獻(xiàn)公開了有用的聚合物分子和/或PEG連接的化學(xué)性質(zhì)US 5,824,778，US 5,476,653，WO 97/32607，EP 229,108，EP 402,378，US 4,902,502，US 5,281,698，US 5,122,614，US 5,219,564，WO 92/16555，WO 94/04193，WO 94/14758，WO 94/17039，WO 94/18247，WO 94/28024，WO 95/00162，WO 95/11924，W095/13090，WO 95/33490，WO 96/00080，WO 97/18832，WO 98/41562，WO 98/48837，WO 99/32134，WO 99/32139，WO 99/32140，WO 96/40791，WO 98/32466，WO 95/06058，EP 439,508，WO 97/03106，WO 96/21469，WO 95/13312，EP 921,131，US 5,736,625，WO 98/05363，EP 809996，US 5,629,384，WO 96/41813，WO 96/07670，US 5,473,034，US 5,516,673，EP 605963，US 5,382,657，EP 510356，EP 400472，EP 183503和EP 154316。
特別優(yōu)選與半胱氨酸殘基偶聯(lián)的活化型PEG聚合物分子的具體實(shí)例，包括以下線性PEG乙烯砜-PEG(VS-PEG)，優(yōu)選乙烯砜-mPEG(VS-mPEG)；馬來(lái)酰亞胺-PEG(MAL-PEG)，優(yōu)選馬來(lái)酰亞胺-mPEG(MAL-mPEG)以及正吡啶基-二硫化物-PEG(OPSS-PEG)，優(yōu)選正吡啶基-二硫化物-mPEG(OPSS-mPEG)。所述PEG或mPEG聚合物的大小通常約5kDa，約10kD，約12kDa或約20kDa。
多肽變體與活化的聚合物分子的偶聯(lián)可用任何常規(guī)方法進(jìn)行，例如，按下列參考文獻(xiàn)所述(所述參考文獻(xiàn)中也描述了活化聚合物分子的適宜方法)進(jìn)行R.F.Taylor，(1991)，“Protein immobilisation.Fundamental和applications”，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，“Chemistry of Protein Conjugation和Crosslinking”，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson等，(1993)，“Imnobilized Affinity Ligand Techniques”，Academic Press，N.Y.)。為了使半胱氨酸殘基PEG化(見上文)，所述IFNG通常先用還原劑，如二硫蘇糖醇(DDT)處理，然后再進(jìn)行PEG化。還原劑隨后通過(guò)任何常規(guī)方法，如脫鹽法除去。PEG與半胱氨酸通常在合適的緩沖液中，在pH6-9、4-25℃保持最多16小時(shí)而發(fā)生偶聯(lián)。
技術(shù)人員知道，將要使用的活化方法和/或偶聯(lián)化學(xué)取決于所述多肽的連接基團(tuán)(以上已給出實(shí)例)以及聚合物的功能基(例如，是胺、羥基、羧基、醛，sulfydryl，琥珀酰亞胺，馬來(lái)酰亞胺，vinysulfone或鹵代醋酸鹽)。PEG化可涉及與多肽上的所有可利用的連接基團(tuán)(即，暴露于多肽表面的連接基團(tuán))偶聯(lián)，或可與一個(gè)或多個(gè)特定的連接基團(tuán)如，N-末端胺基直接偶聯(lián)(如US 5,985,265所述)。而且，偶聯(lián)可以在一步中完成或以多步方式來(lái)完成(如，WO 99/55377所述)。
應(yīng)理解，PEG化作用可設(shè)計(jì)為，使所得分子在連接的PEG分子的數(shù)目、這些分子的大小和形式(如，線性還是分支)，以及多肽分子的連接誒位點(diǎn)各方面最佳。例如，可根據(jù)需達(dá)到的效果來(lái)選擇所使用的聚合物的分子量。。例如，如果偶聯(lián)的首要目的是實(shí)現(xiàn)具有高分子量的偶聯(lián)(例如，以便降低腎臟清除率)，通常需要偶聯(lián)盡可能少的高分子量的聚合物分子以獲得所需分子量。當(dāng)需要高度屏蔽表位時(shí)，可通過(guò)使用足夠多數(shù)量的低分子量聚合物(例如，具有大約5,000Da的分子量)以有效屏蔽該多肽的所有或大多數(shù)表位來(lái)獲得。例如，可使用2-8個(gè)，例如3-6個(gè)該聚合物。
僅與蛋白質(zhì)上的單個(gè)連接基團(tuán)偶聯(lián)時(shí)(如US 5,985,265中所述)，優(yōu)選線性或分支的聚合物分子具有高分子量，例如，大約20kDa。
一般來(lái)說(shuō)，在能使聚合物的所有可利用的連接基團(tuán)與聚合物分子反應(yīng)的條件下進(jìn)行聚合物偶聯(lián)。典型的是，活化型聚合物分子與多肽的摩爾比是1000-1，特別是200-1，優(yōu)選100-1，例如10-1或5-1以便獲得最佳反應(yīng)。然而，也可使用等摩爾比率。
根據(jù)本發(fā)明還包括通過(guò)接頭偶聯(lián)聚合物分子與多肽。合適的接頭是技術(shù)人員熟知的。優(yōu)選的例子是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，生物學(xué)化學(xué)雜志，252，3578-3581；US 4,179,337；Shafer等，(1986)，高分子科學(xué)和高分子化學(xué)雜志，編輯，24，375-378)。
偶聯(lián)后，按照本領(lǐng)域已知的方法，例如，通過(guò)向反應(yīng)混合物中加入伯胺以封閉殘余的活化型聚合物分子，并通過(guò)合適的方法去除所得的失活型聚合物分子。
與糖組分的偶聯(lián)糖組分的偶聯(lián)可在體內(nèi)或者體外發(fā)生。為了實(shí)現(xiàn)經(jīng)過(guò)修飾已導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)體內(nèi)糖基化位點(diǎn)(見“本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中非多肽組分是糖組分”部分)的具有IFNG活性的多肽的體內(nèi)糖基化，將編碼偶聯(lián)物的多肽部分的核苷酸序列插入糖基化的真核表達(dá)宿主中。表達(dá)宿主細(xì)胞可選自真菌(絲狀真菌或酵母)，昆蟲或動(dòng)物細(xì)胞或者選自轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。另外，當(dāng)在基因治療中使用編碼本發(fā)明的偶聯(lián)物的多肽部分或本發(fā)明的多肽的核苷酸序列時(shí)可在人體內(nèi)實(shí)現(xiàn)糖基化。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞，BHK或者HEK細(xì)胞，例如HEK293，或昆蟲細(xì)胞，例如SF9細(xì)胞，或者酵母細(xì)胞，例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，Pichiapastoris或者任何其他合適的糖基化宿主，例如，如下所述。任選的是，經(jīng)過(guò)體內(nèi)糖基化連接到IFNG多肽上的糖組分可通過(guò)使用糖基轉(zhuǎn)移酶，例如，使用Neose，Horsham，PA，USA上市的glycoAdvanceTM技術(shù)進(jìn)一步修飾。從而可以增加，例如表達(dá)后糖基化的IFNG多肽的唾液酸化和CHO細(xì)胞的體內(nèi)糖基化。
可使用糖苷與IFNG多肽的氨基酸殘基的共價(jià)體外偶聯(lián)來(lái)修飾或增加糖組分的數(shù)目或特性。根據(jù)使用的偶聯(lián)方式，糖類可連接到a)精氨酸和組氨酸上，b)游離羧基上，c)游離巰基，例如半胱氨酸的游離巰基上，d)游離羥基，例如絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸或羥脯氨酸的游離羥基上，e)芳香族殘基，例如苯丙氨酸或色氨酸的芳香基上或者f)谷氨酰胺的酰胺基上。這些氨基酸殘基組成糖組分的連接基團(tuán)的例子，可在本發(fā)明的偶聯(lián)物的IFNG多肽中導(dǎo)入和/或去掉該殘基。體外偶聯(lián)的合適方法在例如，WO 87/05330和Aplin等，CRC生物化學(xué)的重點(diǎn)回顧，第259-306頁(yè)，1981中描述。糖組分或PEG與蛋白質(zhì)和肽結(jié)合的Gln-殘基的體外偶聯(lián)可通過(guò)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGases)實(shí)現(xiàn)，例如，按Sato等，1996，生物化學(xué)，35，13072-13080或在EP 725145中所述。
與有機(jī)衍生試劑的偶聯(lián)IFNG多肽變體的共價(jià)修飾可通過(guò)使多肽的連接基團(tuán)與有機(jī)衍生試劑反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。合適的衍生劑和方法在本領(lǐng)域中是已知的。例如，半胱氨?；鶜埢畛Ｅcα-鹵代乙酸酯(和相應(yīng)的胺)，如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)，產(chǎn)生羧甲基或羧基酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰基殘基也可與以下物質(zhì)反應(yīng)而衍生溴三氟丙酮、α-溴-β-(4-咪唑基)丙酸、氯乙?；姿狨ァ-烷基馬來(lái)酰亞胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物、甲基2-吡啶二硫化物、對(duì)氯汞基苯甲酸鹽、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑。組氨酰基殘基通過(guò)與二乙基焦碳酸酯在pH5.5-7.0反應(yīng)進(jìn)行衍生，因?yàn)樵撛噭┫鄬?duì)特異于組氨酰基側(cè)鏈。對(duì)溴苯甲酰甲基溴化物也有效；該反應(yīng)優(yōu)選在pH6.0的0.1M卡可酸鈉中反應(yīng)。賴氨?；桶被┒藲埢膳c琥珀酸酐或其它羧酸酐反應(yīng)。用這些試劑進(jìn)行衍生具有使賴氨?；鶜埢碾姾赡孓D(zhuǎn)的作用。適于使含α-氨基的殘基衍生的其它試劑包括亞氨基酯如甲基吡啶亞酰胺(methylpicolinimidate)、磷酸吡多醛、吡多醛、氯代氫硼化物、三硝基苯磺酸、鄰甲基異脲、2，4-戊二酮和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸鹽的反應(yīng)。精氨酰基殘基通過(guò)與一種或多種常規(guī)試劑的反應(yīng)來(lái)修飾，所述試劑包括苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己二酮和茚三酮。精氨酸殘基的衍生要求反應(yīng)在堿性條件下進(jìn)行，因?yàn)殡夜δ芑膒Ka較高。此外，這些試劑可與賴氨酸以及精氨酸胍基反應(yīng)。羧基側(cè)基(天冬氨?；蚬劝滨；?通過(guò)與碳二亞胺(R-N＝C＝N-R′)反應(yīng)來(lái)進(jìn)行選擇性修飾，其中R和R′是不同的烷基，如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺。而且，天冬氨?；凸劝滨；ㄟ^(guò)與銨離子反應(yīng)轉(zhuǎn)化為天冬酰酰胺基(asparaginyl)和谷氨酰酰胺基(glutaminyl)。
功能性位點(diǎn)的封閉已有報(bào)道過(guò)多的聚合物偶聯(lián)可導(dǎo)致與聚合物偶聯(lián)的多肽喪失活性。該問(wèn)題可通過(guò)例如，去掉位于功能性位點(diǎn)的連接基團(tuán)或者通過(guò)在偶聯(lián)前封閉功能性位點(diǎn)而消除。在后的策略組成本發(fā)明的其他實(shí)施方案，第一種策略在上文舉例說(shuō)明，例如方法是去掉靠近功能性位點(diǎn)的賴氨酸殘基和/或在不干擾功能性位點(diǎn)的位置引入半胱氨酸殘基和/或體內(nèi)糖基化位點(diǎn)。
更具體的說(shuō)，根據(jù)第二種策略，多肽變體和非多肽組分之間的偶聯(lián)在能與IFNG多肽變體的功能性位點(diǎn)結(jié)合的輔助分子封閉該多肽變體的功能性位點(diǎn)的條件下進(jìn)行。優(yōu)選的，輔助分子是特異性識(shí)別多肽變體的功能性位點(diǎn)的分子，例如受體?；蛘?，輔助分子可以是抗體，特別是識(shí)別該多肽變體的單克隆抗體。具體地說(shuō)，輔助分子可以是具有中和作用的單克隆抗體。
然后，在實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)前使多肽變體與輔助分子相互作用。這樣保證多肽變體的功能性位點(diǎn)被屏蔽或保護(hù)且隨后不能被諸如聚合物等非多肽組分衍生化。其從輔助分子洗脫后，可回收非多肽組分和多肽變體之間的偶聯(lián)物，其至少具有部分地保守的功能性位點(diǎn)。
隨后，具有已封閉的功能性位點(diǎn)的多肽與聚合物，親脂化合物，糖組分，有機(jī)衍生試劑或任意其他化合物以正常方式偶聯(lián)，例如，按標(biāo)題為“與....偶聯(lián)”的上述部分所述進(jìn)行。
在另一實(shí)施方案中，輔助分子首先共價(jià)偶聯(lián)到諸如柱填充材料，例如交聯(lián)葡聚糖或瓊脂糖珠的固相上，或者表面上，例如反應(yīng)器表面。隨后，將多肽上樣到攜帶輔助分子的柱材料上且按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行偶聯(lián)，例如，按標(biāo)題為“與....偶聯(lián)”的上述部分所述進(jìn)行。該方法允許通過(guò)洗脫從輔助分子分離多肽偶聯(lián)物。在不導(dǎo)致多肽偶聯(lián)物大量降解的物理化學(xué)條件下以常規(guī)技術(shù)洗脫該多肽偶聯(lián)物。含有多肽偶聯(lián)物的液相從輔助分子保持共價(jià)連接在其上的固相上分離。分離可用其他方式實(shí)現(xiàn)例如，用可被特異性結(jié)合劑(例如鏈霉抗生物素蛋白)識(shí)別的第二分子(例如生物素)衍生化輔助分子。特異性結(jié)合劑可連接到固相上，從而允許通過(guò)在隨后洗脫時(shí)滯留輔助分子-第二分子復(fù)合物而不是多肽偶聯(lián)物的第二輔助分子固相柱中過(guò)柱從輔助分子-第二分子復(fù)合物中分離多肽偶聯(lián)物?？捎萌魏魏线m的方式從輔助分子釋放多肽偶聯(lián)物。通過(guò)提供輔助分子從其結(jié)合的IFNG功能性位點(diǎn)解離的條件實(shí)現(xiàn)去保護(hù)。例如，偶聯(lián)聚合物的抗體與抗獨(dú)特型抗體之間的復(fù)合物可通過(guò)將pH調(diào)到酸性或堿性pH來(lái)解離。
經(jīng)標(biāo)記的多肽變體的偶聯(lián)在另一實(shí)施方案中，IFNG多肽變體可以表達(dá)為與標(biāo)記物的融合蛋白，即通常由1-30，如1-20個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列或肽段。除了能快速和容易地進(jìn)行純化，標(biāo)記物是完成標(biāo)記多肽和非多肽組分之間偶聯(lián)的便利工具。特別是，標(biāo)記物可用于在微滴定板或其它載體如順磁珠上完成偶聯(lián)，這樣標(biāo)記的多肽可通過(guò)標(biāo)記物來(lái)固定。在，例如，微滴定板上與標(biāo)記的多肽偶聯(lián)的優(yōu)點(diǎn)是，標(biāo)記的多肽可從培養(yǎng)肉湯直接固定到微滴定板上(原則上不經(jīng)任何純化)并進(jìn)行偶聯(lián)。因此，可減少操作步驟(從表達(dá)到偶聯(lián))的總數(shù)。而且，標(biāo)記物可起間隔臂分子的作用以確保使固定的多肽更易于偶聯(lián)。使用標(biāo)記多肽進(jìn)行的偶聯(lián)可以是與本文中公開的任何非多肽組分的偶聯(lián)，如與聚合物分子如PEG的偶聯(lián)。
使用何種具體標(biāo)記物不是關(guān)鍵，只要該標(biāo)記物能與多肽一起表達(dá)并且能固定在適宜的表面或載體物質(zhì)上即可。許多適宜的標(biāo)記物可通過(guò)商業(yè)渠道獲得，例如，可購(gòu)于Unizyme Laboratories，丹麥。例如，所述標(biāo)記物可以是下列任一序列His-His-His-His-His-His(SEQ ID NO35)Met-Lys-His-His-His-His-His-His(SEQ ID NO36)Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His(SEQ ID NO37)Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln(SEQ IDNO38)
(都可從丹麥，Unizyme實(shí)驗(yàn)室獲得)或下列任一序列EQKLI SEEDL(SEQ ID NO39)(描述于Mol.Cell.Biol.53610-16，1985的C-端標(biāo)記物)DYKDDDDK(SEQ ID NO40)(C-或N-端標(biāo)記物)YPYDVPDYA(SEQ ID NO41)抗上述標(biāo)記物的抗體通常可通過(guò)商業(yè)渠道獲得，例如購(gòu)于ADI，AvesLab和Research Diagnostics。
隨后可用市售酶從多肽上將標(biāo)記物切離。
制備本發(fā)明IFNG多肽變體的方法以本領(lǐng)域已知的任何合適的方法可生產(chǎn)IFNG多肽變體，任選以糖基化形式生產(chǎn)。該方法包括構(gòu)建編碼該多肽的核苷酸序列并在合適的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中表達(dá)該序列。然而，盡管效率不高，經(jīng)過(guò)化學(xué)合成或化學(xué)合成的組合或者化學(xué)合成與重組DNA技術(shù)的組合也可生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
編碼IFNG多肽變體(單體或單鏈形式)的本發(fā)明的核苷酸序列可如下構(gòu)建分離或合成編碼親本IFNG(例如具有氨基酸序列SEQ ID NO 17或其片段的huIFNG)的核苷酸序列，然后改變核苷酸序列以實(shí)現(xiàn)相關(guān)氨基酸殘基的引入(即插入或取代)或缺失(即去掉或取代)。
按照熟知的方法，參見例如，Mark等，“人成纖維細(xì)胞干擾素基因的定點(diǎn)誘變”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，第5662-66頁(yè)(1984)；和US4,588,585的方法經(jīng)過(guò)定點(diǎn)誘變可常規(guī)修飾核苷酸序列。
或者，經(jīng)過(guò)化學(xué)合成可制備核苷酸序列，例如，經(jīng)過(guò)使用寡核苷酸合成儀，其中根據(jù)目的多肽的氨基酸序列設(shè)計(jì)寡核苷酸，且優(yōu)選選擇那些在生產(chǎn)該重組多肽的宿主細(xì)胞中有利的密碼子。例如，經(jīng)過(guò)PCR，連接或者連接鏈反應(yīng)(LCR)可合成和組裝編碼目的多肽之部分的一些小寡核苷酸。單個(gè)寡核苷酸一般含有用于互補(bǔ)組裝的5’或3’突出端。
一旦組裝(經(jīng)過(guò)合成，定點(diǎn)誘變或另一方法)，編碼多肽的核苷酸序列可插入重組載體且與在所需轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中表達(dá)IFNG所必需的調(diào)控序列可操作地連接。
當(dāng)然應(yīng)明白為了表達(dá)編碼本文所述的IFNG多肽變體的核苷酸序列，并不是所有的載體和表達(dá)調(diào)控序列都能同樣較好地發(fā)揮功能。也不是所有的宿主用同一表達(dá)系統(tǒng)都能同樣較好地發(fā)揮功能。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在這些載體，表達(dá)調(diào)控序列和宿主中不需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)就可作出選擇。例如，在選擇載體時(shí)，必須考慮到宿主，因?yàn)檩d體必須在宿主中復(fù)制或者能整合進(jìn)染色體中。還應(yīng)考慮載體的拷貝數(shù)，控制該拷貝數(shù)的能力，和由該載體編碼的任何其他蛋白質(zhì)，例如抗生素標(biāo)記的表達(dá)。在表達(dá)調(diào)控序列的選擇中，也應(yīng)考慮各種因素。這些包括，例如，序列的相對(duì)長(zhǎng)度，其調(diào)控能力，其與編碼多肽的核苷酸序列的相容性，特別是要考慮到潛在的二級(jí)結(jié)構(gòu)。宿主的選擇應(yīng)考慮到其與選定載體的相容性，該核苷酸序列編碼的產(chǎn)物的毒性，其分泌特征，其正確折疊多肽的能力，其發(fā)酵或培養(yǎng)要求，和該核苷酸序列編碼的產(chǎn)物的純化簡(jiǎn)便性。
重組載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒。作為選擇，載體是引入宿主細(xì)胞時(shí)整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組且與其整合進(jìn)的染色體一起復(fù)制的載體。
該載體優(yōu)選是一種表達(dá)載體，其中編碼IFNG多肽變體的核苷酸序列可操作地連接到該核苷酸序列轉(zhuǎn)錄所需的其他片段上。該載體一般從質(zhì)?；虿《綝NA衍生。本文提及的用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的許多合適的表達(dá)載體是商業(yè)上可獲得的或在文獻(xiàn)中描述的。用于真核宿主的有用的表達(dá)載體包括，例如，含有來(lái)自SV40，牛乳頭瘤病毒，腺病毒和巨細(xì)胞病毒的表達(dá)調(diào)控序列的載體。具體載體是，例如，pCDNA3.1(+)\Hyg(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和pCI-neo(Stratagene，La Jola，CA，USA)。用于細(xì)菌宿主的有用表達(dá)載體包括已知的細(xì)菌質(zhì)粒，例如來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒，包括pBR322，pET3a和pET12a(兩者都來(lái)自Novagen Inc.，WI，USA)，廣譜宿主范圍的質(zhì)粒，例如RP4，噬菌體DNAs，例如，λ噬菌體的眾多衍生物，如NM989，和其他DNA噬菌體，如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體。酵母細(xì)胞的有用的表達(dá)載體包括2μ質(zhì)粒及其衍生物，POT1載體(US 4,931,373)，在(Okkels，紐約科學(xué)院年報(bào)，782，202-207，1996)中所述的pJSO37載體和pPICZ A，B或C(Invitrogen)。用于昆蟲細(xì)胞的有用的載體包括pVL941，pBG311(Cate等，“牛和人Mullerian抑制物質(zhì)基因的分離和在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)人基因”，細(xì)胞，45，第685-98頁(yè)(1986)，pBluebac 4.5和pMelbac(兩者都可從Invitrogen獲得)。
用于本發(fā)明的其他載體包括允許編碼IFNG多肽變體的核苷酸序列以拷貝數(shù)擴(kuò)增的那些載體。這些可擴(kuò)增的載體是本領(lǐng)域熟知的。它們包括，例如，能經(jīng)過(guò)DHFR擴(kuò)增(參見，例如Kaufman，美國(guó)專利號(hào)4,470,461，Kaufman和Sharp，“模塊二氫葉酸還原酶cDNA基因的構(gòu)建用于有效表達(dá)的信號(hào)分析”，分子細(xì)胞生物學(xué)，2，第1304-19頁(yè)(1982))和谷氨酰胺合成酶(“GS”)擴(kuò)增(參見，例如，US 5,122,464和EP 338,841)被擴(kuò)增的載體。
重組載體可進(jìn)一步包含能使載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。該序列的一個(gè)例子(當(dāng)宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí))是SV40的復(fù)制起點(diǎn)。當(dāng)宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞時(shí)，能使載體復(fù)制的合適序列是酵母質(zhì)粒2μ復(fù)制基因REP 1-3和復(fù)制起點(diǎn)。
載體也可包含選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物補(bǔ)充宿主細(xì)胞缺陷的基因，例如編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因或粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)的TPI基因(P.R.Russell，基因，40，1985，第125-130頁(yè)所述)，或者，提供對(duì)藥物，例如氨芐青霉素，卡那霉素，四環(huán)素，氯霉素，新霉素，潮霉素，或氨甲蝶呤抗性的基因。對(duì)于絲狀真菌，選擇標(biāo)記包括amdS，pyrG，arcB，niaD，sC。
本文定義的術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”包括表達(dá)IFNG多肽變體必須的或者有利的所有元件。各調(diào)控序列可以是天然的或者相對(duì)于編碼該多肽的核酸序列是外源的。該調(diào)控序列包括，但不限于前導(dǎo)序列，多聚腺苷化序列，前肽序列，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子或上游活化序列，信號(hào)肽序列，和轉(zhuǎn)錄終止子。最少，調(diào)控序列包括啟動(dòng)子。
本發(fā)明可使用各種各樣的表達(dá)調(diào)控序列。這種有用的表達(dá)調(diào)控序列包括與上述表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)基因相聯(lián)系的表達(dá)調(diào)控序列以及已知控制原核或真核細(xì)胞或其病毒基因表達(dá)的任意序列，及其各種組合。
用于指導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的合適的調(diào)控序列的例子包括SV40和腺病毒的早期和晚期啟動(dòng)子，例如，腺病毒2主要晚期啟動(dòng)子，MT-1(金屬硫蛋白基因)啟動(dòng)子，人巨細(xì)胞病毒立即早期基因啟動(dòng)子(CMV)，人延伸因子1α(EF-1α)啟動(dòng)子，果蠅屬最小型熱休克蛋白70啟動(dòng)子，勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子，人遍在蛋白質(zhì)C(UbC)啟動(dòng)子，人生長(zhǎng)激素終止子，SV40或腺病毒Elb區(qū)域多聚腺苷化信號(hào)和Kozak共有序列(Kozak，M.，分子生物學(xué)雜志，1987年8月20日；196(4)947-50)。
為了提高在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，可將合成的內(nèi)含子插入編碼IFNG多肽變體的核苷酸序列的5’非翻譯區(qū)。合成內(nèi)含子的例子是來(lái)自質(zhì)粒pCI-Neo(可從Promega Corporation，WI，USA獲得)的合成內(nèi)含子。
用于指導(dǎo)在昆蟲細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適的調(diào)控序列的例子包括多角體蛋白啟動(dòng)子，P10啟動(dòng)子，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)多角體病毒堿性蛋白啟動(dòng)子，桿狀病毒立即早期基因1啟動(dòng)子和桿狀病毒39K延遲-早期基因啟動(dòng)子，和SV40多聚腺苷化序列。
用于酵母宿主細(xì)胞的合適調(diào)控序列的例子包括酵母α-交配系統(tǒng)的啟動(dòng)子，酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)啟動(dòng)子，來(lái)自酵母糖酵解基因或乙醇脫氫酶基因的啟動(dòng)子，ADH2-4c啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型GAL啟動(dòng)子。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的合適的調(diào)控序列的例子包括ADH3啟動(dòng)子和終止子，來(lái)自編碼米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶丙糖磷酸異構(gòu)酶或堿性蛋白酶，黑色曲霉(A.niger)α-淀粉酶，黑色曲霉或構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)葡糖淀粉酶，構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶或脂酶基因的啟動(dòng)子，TPI1終止子和ADH3終止子。
用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的合適的調(diào)控序列的例子包括lac系統(tǒng)，trp系統(tǒng)，TAC或TRC系統(tǒng)的啟動(dòng)子，λ噬菌體的主要啟動(dòng)子區(qū)域。
本發(fā)明的核苷酸序列，不論是以定點(diǎn)誘變，合成還是以其它方法制備，都可以包含或者不含編碼信號(hào)肽的核苷酸序列。當(dāng)多肽需要從表達(dá)它的細(xì)胞中分泌時(shí)存在信號(hào)肽。如果存在的話，該信號(hào)肽應(yīng)是可被選擇表達(dá)該多肽的細(xì)胞識(shí)別的信號(hào)肽。信號(hào)肽可以是與該多肽同源的(例如一般與huIFNG相聯(lián))或異源的(即來(lái)自不同于huIFNG的另一來(lái)源)或者可以與宿主細(xì)胞是同源的或異源的，即從該宿主細(xì)胞正常表達(dá)的信號(hào)肽或一般不從該宿主細(xì)胞表達(dá)的信號(hào)肽。因此，信號(hào)肽可以是原核的，例如來(lái)自諸如大腸桿菌的細(xì)菌，或者可以是真核的，例如來(lái)自哺乳動(dòng)物，或昆蟲或酵母細(xì)胞。
信號(hào)肽是否存在依賴于，例如用于生產(chǎn)該多肽的表達(dá)宿主細(xì)胞，所要表達(dá)的蛋白質(zhì)(是細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外蛋白)和是否需要獲得分泌。為了用于絲狀真菌，信號(hào)肽可方便地來(lái)自于編碼曲霉屬種類淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因，編碼米赫根毛霉脂酶或蛋白酶或者Humicola lanuginosa脂酶的基因。信號(hào)肽優(yōu)選來(lái)自編碼米曲霉TAKA淀粉酶，黑色曲霉中性α-淀粉酶，黑色曲霉酸穩(wěn)定淀粉酶，或者黑色曲霉葡糖淀粉酶的基因。為了用于昆蟲細(xì)胞，信號(hào)肽可方便地來(lái)自于昆蟲基因(參見WO 90/05783)，例如鱗翅目昆蟲的煙草天蛾(Manduca sexta)脂動(dòng)激素前體(參見US 5,023,328)，蜜蜂的蜂毒肽(Invitrogen)，蛻皮甾類UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(egt)(Murphy等，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化，4，349-357(1993))或人胰腺脂酶(hpl)(酶學(xué)方法，284，第262-272頁(yè)，1997)。
用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的優(yōu)選信號(hào)肽是huIFNG的信號(hào)肽或鼠Igκ輕鏈信號(hào)肽(Coloma，M(1992)，免疫學(xué)方法雜志，15289-104)。為了用于酵母細(xì)胞，已發(fā)現(xiàn)合適的信號(hào)肽是來(lái)自啤酒糖酵母α-因子的信號(hào)肽(參見US 4,870,008)，小鼠唾液淀粉酶的信號(hào)肽(參見O.Hagenbuchle等，自然，289，1981，第643-646頁(yè))，修飾的羧肽酶信號(hào)肽(參見L.A.Valls等，細(xì)胞，48，1987，第887-897頁(yè))，酵母BAR1信號(hào)肽(參見WO 87/02670)，和酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信號(hào)肽(參見M.Egel-Mitani等，酵母6，1990，第127-137頁(yè))。
可以使用任何合適的宿主產(chǎn)生本發(fā)明的多肽或本發(fā)明偶聯(lián)物的多肽部分，包括細(xì)菌、真菌(包括酵母)、植物、昆蟲、哺乳動(dòng)物或其它合適的動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞系、以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物。細(xì)菌宿主細(xì)胞的實(shí)例包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌如芽孢桿菌屬，如短芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌、假單孢菌屬或鏈霉菌屬，或革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌菌株。將載體引入細(xì)菌宿主細(xì)胞可通過(guò)，例如，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見如Chang和Cohen，1979，Molecular GeneralGenetics 168111-115)、使用感受態(tài)細(xì)胞(參見如Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56209-221)、電穿孔(參見如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6742-751)、或偶聯(lián)(參見如Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 1695771-5278)來(lái)進(jìn)行。
合適的絲狀真菌宿主細(xì)胞的實(shí)例包括曲霉屬菌株，如米曲霉、黑曲霉或構(gòu)巢曲霉，鐮刀菌屬或木霉菌屬。真菌細(xì)胞可以通過(guò)涉及以下的過(guò)程轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁通過(guò)本身已知的方式再生。在EP238023和US5679543中描述了轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細(xì)胞的合適方法。在Malardier等人1989，Gene 78147-156和WO 96/00787中描述了轉(zhuǎn)化鐮刀菌屬的合適方法。合適的酵母宿主細(xì)胞的實(shí)例包括糖酵母屬的菌株(如釀酒酵母)、裂殖酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬(如巴斯德畢赤酵母或P.Methanolica)、漢遜酵母屬(如多形漢遜酵母)、或Yarrowia。酵母可使用Becker和Guarente，In Abelson，J.N.和Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics和Molecular Biology，Methods in Enzymology Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等人，1983，Journal of Bacteriology153163；和Hinnen等人1978，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 751920；以及由Clontech Laboratories，Inc，Palo Alto，CA，USA(YeastmakerTM酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)試劑盒的產(chǎn)品手冊(cè))中所述的方法來(lái)轉(zhuǎn)化。
適的酵母宿主細(xì)胞的實(shí)例包括糖酵母屬的菌株(如釀酒酵母)、裂殖酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬(如巴斯德畢赤酵母或P.Methanolica)、漢遜酵母屬(如多形漢遜酵母)、或Yarrowia。用異源性DNA轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞并從中生產(chǎn)異源性多肽的方法由Clontech實(shí)驗(yàn)室公司，Palo Alto，CA，USA(在YeastmakerTM酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)試劑盒的產(chǎn)品說(shuō)明中)，和由Reeves等，F(xiàn)EMSMicrobiology Letters，99，(1992)193-198，Manivasakam和Schiestl，NucleicAcids Research，1993，Vol.21，No.18，第4414-4415頁(yè)和Ganeva等，F(xiàn)EMSMicrobiology Letters 121(1994)159-164公開。
合適的昆蟲宿主細(xì)胞的例子包括鱗翅目細(xì)胞系，例如草地貪夜蛾(Sf9或Sf21)或粉紋夜蛾細(xì)胞(High Five)(US 5,077,214)。昆蟲細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和異源性多肽在其中的生產(chǎn)可按Invitrogen所述進(jìn)行。
合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的例子包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系，(例如CHO-K1；ATCC CCL-61)，綠猴細(xì)胞系(COS)(例如COS 1(ATCCCRL-1650)，COS 7(ATCC CRL-1651))；小鼠細(xì)胞(例如NS/O)，幼小倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞系(例如ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)，和人細(xì)胞(例如，HEK 293(ATCC CRL-1573))，以及組織培養(yǎng)物中的植物細(xì)胞。其它合適的細(xì)胞系是本領(lǐng)域已知的且可從公共保藏單位獲得，例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland。另外，可修飾諸如CHO細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞以表達(dá)唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如，1，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如，按US 5,047,335所述，以便提高IFNG多肽變體的糖基化。
將外源DNA引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的方法包括磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、病毒載體和由LifeTechnologies Ltd，Paisley，UK所述的使用Lipofectamin2000進(jìn)行的轉(zhuǎn)染方法。這些方法在本領(lǐng)域中是已知的，例如在Ausbel等人(eds.)，1996，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，USA中所述。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)按建立的方法進(jìn)行，例如參見Animal Cell Biotechnology，Methods和Protocols，Nigel Jenkins編，1999，Human Press Inc，Totowa，NewJersey，USA和Harrison MA和Rae IF，General Techniques of Cell Culture，Cambridge University Press 1997。
為了產(chǎn)生糖基化多肽，優(yōu)選使用真核宿主細(xì)胞，例如上述類型的真核宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，用本領(lǐng)域已知的方法在適于生產(chǎn)多肽變體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以在實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、成批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)或在合適培養(yǎng)基和允許表達(dá)和/或分離所述多肽變體的條件下進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵。培養(yǎng)在含有碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽的合適營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)進(jìn)行。合適的培養(yǎng)基可商購(gòu)或可以按公開的組成來(lái)制備(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中所述的)。如果多肽變體分泌在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽變體可從培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽變體不被分泌，可從細(xì)胞裂解物中回收。
可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)回收所得多肽變體。例如，可通過(guò)常規(guī)方法，包括但不限于離心、過(guò)濾、超濾、提取或沉淀，從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收多肽變體。
所述多肽變體可以用本領(lǐng)域已知的各種方法，包括但不限于，色譜法(例如，離子交換，親和，疏水，色譜聚焦，和大小排阻)，電泳方法(例如，制備型等電聚焦)，不同溶解性(例如，硫酸銨沉淀)，SDS-PAGE，或提取(參見，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden，editors，VCHPublishers，New York，1989)來(lái)純化。表現(xiàn)出IFNG活性的多肽的具體純化方法在EP 110044和未審日本專利申請(qǐng)186995/84中公開。
IFNG多肽變體的生物學(xué)活性可用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法測(cè)定。該測(cè)定法包括對(duì)抗病毒活性的抗體中和，對(duì)蛋白激酶，寡聚腺苷酸2，5-A合成酶或磷酸二酯酶活性的誘導(dǎo)，如EP 41313B1所述。該測(cè)定法還包括免疫調(diào)制測(cè)定法(參見，例如，US 4,753,795)，生長(zhǎng)抑制測(cè)定法，和測(cè)量與表達(dá)干擾素受體的細(xì)胞的結(jié)合。具體測(cè)定法在本文材料和方法部分描述。
藥物組合物及其用途本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防疾病，尤其炎癥性疾病的改進(jìn)方法，所述疾病，例如間質(zhì)性肺疾病，如自發(fā)性肺纖維化；也包括肉芽腫疾??；癌癥，尤其卵巢癌；感染，如肺非典型分枝桿菌感染；骨疾病(例如，骨代謝病，如惡性骨硬化病)；自身免疫病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；以及其它疾病，如多重耐藥性結(jié)核；隱球菌性腦膜炎；囊性纖維化和肝纖維化，尤其繼發(fā)于丙型肝炎的肝纖維化，所述方法包括對(duì)有相應(yīng)需要的哺乳動(dòng)物，尤其人類，施用有效量的本發(fā)明多肽變體或本發(fā)明組合物；最主要的優(yōu)勢(shì)是以較小頻率的低侵入性用藥實(shí)現(xiàn)更加有效的治療，而且還可能降低與治療性活性化合物發(fā)生免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)。
本發(fā)明的分子優(yōu)選在包含可藥用載體或賦形劑的組合物中用藥。在上下文中，“可藥用”意指在給藥的患者中不引起任何不想要或有害的作用的載體或賦形劑。這類可藥用載體和賦形劑在本領(lǐng)域中是已知的(參見，如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，MackPublishing Company ；Pharmaceutical Formulation Development ofPeptides和Proteins，S.Frokjaer和L.Hovgaard，Eds.，Taylor & Francis ；和Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press )。
本發(fā)明的分子可“以其原本的形式”和/或以其鹽的形式使用。合適的鹽包括但不限于，與堿金屬或堿土金屬，例如鈉，鉀，鈣和鎂的鹽以及例如鋅形成的鹽。這些鹽或復(fù)合物可以以結(jié)晶和/或無(wú)定形的結(jié)構(gòu)存在。。
本發(fā)明的偶聯(lián)物以大約相似于在用諸如Actimmune等已知的IFNG商業(yè)制劑實(shí)施的療法中所用的劑量或者按EP 795332中限定的劑量用藥。用藥的精確劑量依賴于具體情況。一般來(lái)說(shuō)，該劑量應(yīng)能夠防止或減輕所要治療的癥狀或適應(yīng)征的嚴(yán)重性或傳播。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見的是本發(fā)明的偶聯(lián)物或組合物的有效量依賴于，特別是疾病，劑量，用藥計(jì)劃，多肽或偶聯(lián)物或組合物是單獨(dú)還是與其它治療劑結(jié)合用藥，組合物的血清半壽期，和病人的總體健康狀態(tài)。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明IFNG多肽變體，或本發(fā)明藥物組合物，作為藥物的用途。
本發(fā)明還涉及，i)本發(fā)明IFNG多肽變體或ii)本發(fā)明藥物組合物，在制備藥物，藥物組合物或組配藥盒的用途，所述藥物，藥物組合物或組配藥盒用于治療間質(zhì)性肺疾病，尤其自發(fā)性肺纖維化；癌癥，尤其卵巢癌；感染，如肺非典型分枝桿菌感染；骨疾病(例如，骨代謝病，如惡性骨硬化病)；肉芽腫疾?。蛔陨砻庖卟?，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；多重耐藥性結(jié)核；隱球菌性腦膜炎；囊性纖維化和肝纖維化，尤其繼發(fā)于丙型肝炎的肝纖維化。最優(yōu)選所述疾病是間質(zhì)性肺疾病，尤其自發(fā)性肺纖維化。
本發(fā)明還公開了運(yùn)送所述分子或制劑(任選還含有糖皮質(zhì)激素)的改進(jìn)方法(means)。
優(yōu)選的劑量是每千克病人體重每劑量的多肽成分為1-4微克，更優(yōu)選2-3微克。優(yōu)選的劑量是每千克病人體重每劑量100-350微克，更優(yōu)選100-150微克糖皮質(zhì)激素。
本發(fā)明還涉及適用于治療間質(zhì)性肺疾病的組配藥盒，它包括含有上述活性成分i)或ii)的第一藥物組合物和含有至少一種糖皮質(zhì)激素的第二藥物組合物，每種組合物任選與可藥用載體和/或賦形劑一起。
本發(fā)明的變體可用熟知的方法配制成藥物組合物。合適的配制劑由E.W.Martin的Remington′s Pharmaceutical Sciences和US 5,183,746描述。
藥物組合物可配制成各種形式，包括液體，膠體，凍干品，粉末，壓縮固體，或任何其它合適形式。優(yōu)選的形式依賴于所治療的具體適應(yīng)征且對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
藥物組合物可通過(guò)口服，皮下，靜脈內(nèi)，大腦內(nèi)，鼻內(nèi)，經(jīng)皮膚，腹膜內(nèi)，肌肉內(nèi)，肺內(nèi)，陰道內(nèi)，直腸，眼內(nèi)或任何其它可接受的方式，例如使用PowderJect或ProLease技術(shù)來(lái)施用。盡管使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，例如泵或植入進(jìn)行大丸藥注射是可接受的，但該配制劑可通過(guò)輸注連續(xù)用藥。在某些情況下配制劑可作為溶液或噴霧劑直接應(yīng)用。優(yōu)選的用藥方式依賴于所治療的具體適應(yīng)征且對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
可結(jié)合其它治療劑施用本發(fā)明的藥物組合物。這些試劑可作為同一藥物組合物的部分摻入或者可同時(shí)或按照任何其它可接受的治療程序與本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物分開用藥。另外，本發(fā)明的多肽變體或藥物組合物可作為其它治療的輔助手段。特別是EP 795332所述與糖皮質(zhì)激素的組合。
在另一方面，本發(fā)明涉及治療具有抗huIFNG或rhuIFNG的循環(huán)抗體的哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括施用具有IFNG生物活性且不與所述抗體反應(yīng)的化合物。該化合物優(yōu)選是本文所述的偶聯(lián)物且哺乳動(dòng)物優(yōu)選是人類。所要治療的哺乳動(dòng)物可患有IFNG用作治療劑的任何上述疾病。另外，本發(fā)明涉及制備用于治療具有抗huIFNG或rhuIFNG循環(huán)抗體的哺乳動(dòng)物的藥物產(chǎn)品的方法，其中具有IFNG生物活性且不與其反應(yīng)的化合物配制成可注射的或其它合適的配制劑。術(shù)語(yǔ)“循環(huán)抗體”是指在哺乳動(dòng)物中相應(yīng)于用任何商業(yè)上可獲得的IFNG制劑進(jìn)行治療而形成的自體抗體。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明IFNG多肽變體的核苷酸序列在基因治療應(yīng)用中的用途。具體地說(shuō)，令人感興趣的是使用編碼上文標(biāo)題為“非多肽組分是糖組分時(shí)的本發(fā)明IFNG變體”一節(jié)所述的IFNG多肽變體的核苷酸序列。多肽變體的糖基化因此在基因治療的過(guò)程中，即在人體中表達(dá)該核苷酸序列后實(shí)現(xiàn)。
涉及的基因治療應(yīng)用包括治療預(yù)期該多肽可提供有效治療的那些疾病。
使用基因療法的IFNG變體的局部遞送可針對(duì)目標(biāo)區(qū)域提供治療劑，從而避免與非特異性用藥有關(guān)的潛在毒性問(wèn)題。
體外和體內(nèi)基因治療方法都是所涉及的。
向確定的細(xì)胞群體轉(zhuǎn)移潛在的治療性基因的一些方法是已知的。對(duì)于進(jìn)一步的參考文獻(xiàn)，可參見例如，Mulligan，“The Basic Science Of GeneTherapy”，Science，260，第926-31頁(yè)(1993)。這些方法包括直接基因轉(zhuǎn)移，例如按Wolff等，“Direct Gene transfer Into MouseMuscle In vivo”，Science 247，第1465-68頁(yè)(1990)所述；脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移，例如按Caplen等，“Liposome-mediated CFTRGene Transfer to the Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis”，NatureMed.，3，第39-46頁(yè)(1995)；Crystal，“The Gene As A Drug”，Nature Med.，1，第15-17(1995)；Gao和Huang，“A Novel Cationic Liposome Reagent ForEfficient Transfection of Mammalian Cells”，Biochem.Biophys Res.Comm.，179，第280-85頁(yè)(1991)所述；逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移，例如按Kay等，“In vivo Gene Therapy ofHemophilia BSustained Partial Correction In Factor IX-Deficient Dogs”，Science，262，第117-19頁(yè)(1993)；Anderson，“Human Gene Therapy”，Science，256，第808-13頁(yè)(1992)所述；DNA病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。這種DNA病毒包括腺病毒(優(yōu)選基于Ad-2或Ad-5的載體)，皰疹病毒(優(yōu)選基于單純皰疹病毒的載體)，和細(xì)小病毒屬(優(yōu)選基于“缺陷型”或非自主型細(xì)小病毒的載體，更優(yōu)選基于腺伴隨病毒的載體，最優(yōu)選基于AAV-2的載體)。參見例如，Ali等，“The Use Of DNAViruses as Vectors for Gene Therapy”，Gene Therapy，1，第367-84頁(yè)(1994)；US 4,797,368，和US 5,139,941。
非胃腸道給藥劑(Parentals)藥物組合物的實(shí)例是設(shè)計(jì)成非胃腸道給藥的溶液。盡管在很多情況下，藥物溶液配制劑可以以適用于立即使用的液體形式提供，但所述非胃腸道配制劑也可以以冷凍或凍干形式提供。在前者情況下，所述組合物在使用前必須解凍。后一劑型通常用于增強(qiáng)組合物中所包含的活性組分在各種貯存條件下的穩(wěn)定性，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那樣，凍干制劑通常比其液體相應(yīng)物更穩(wěn)定。所述凍干制劑在使用前通過(guò)加入一種或多種適宜的可藥用稀釋劑如無(wú)菌注射用水或無(wú)菌生理鹽水溶液重新配制。
在非胃腸道給藥的情況下，它們被制成凍干的配制劑或水溶液的形式，方法是根據(jù)需要，將具有所需純度的多肽與一種或多種本領(lǐng)域常用的可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(統(tǒng)稱為“賦形劑”)適當(dāng)混合，賦形劑如緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、等滲劑、非離子表面活性劑、抗氧化劑和/或其它各種添加劑。
緩沖劑有助于將pH維持在接近生理?xiàng)l件的范圍內(nèi)。它們通常以大約2mM-50mM的濃度范圍存在。本發(fā)明使用的合適緩沖劑包括有機(jī)和無(wú)機(jī)酸及其鹽如檸檬酸鹽緩沖劑(如，檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖劑(如，琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖劑(如，酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩沖劑(如，富馬酸-富馬酸一鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸一鈉-富馬酸二鈉混合物等)、葡萄糖酸鹽(gluconate)緩沖劑(如，葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物、葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖劑(如，草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖劑(如，乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)和乙酸鹽緩沖劑(如，乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。其它可能的緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑、組氨酸緩沖劑和三甲胺鹽如Tris。
可以加入防腐劑來(lái)阻滯微生物生長(zhǎng)，加入的量通常約為0.2％-1％(w/v)。本發(fā)明使用的合適防腐劑包括酚、苯甲醇、間甲酚、羥苯甲酸(paraben)甲酯、羥苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、苯亞甲基鎓鹵化物(如苯亞甲基鎓氯化物、溴化物或碘化物)、氯化己烷雙胺、羥苯甲酸烷基酯如甲酯或丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇和3-戊醇。
可以加入等滲劑來(lái)確保液體組合物的等滲性，等滲劑包括多羥糖醇，優(yōu)選三羥或更高級(jí)糖醇，如甘油、赤蘚醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。多羥基醇的量可為0.1％-25％重量比，通常為1％-5％，以相對(duì)其它組分的量計(jì)算。
穩(wěn)定劑涉及一大類賦形劑，其功能范圍從膨脹劑到溶解治療劑的或有助于防止變性或與容器壁粘附的添加劑。通常的穩(wěn)定劑可以是多羥糖醇(上文列舉的)；氨基酸如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、omithine、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等，有機(jī)糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括環(huán)醇如環(huán)己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，如脲，谷胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即＜10個(gè)殘基)；蛋白質(zhì)如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；單糖如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖，和多糖如葡聚糖。基于活性蛋白質(zhì)重量計(jì)算，穩(wěn)定劑通常的存在范圍為0.1-10000重量份。
可以存在非離子表面活性劑或去污劑(也稱作“濕潤(rùn)劑”)以有助于溶解治療劑以及保護(hù)治療性多肽以避免攪拌誘導(dǎo)的聚集，其也允許配制劑暴露于剪切表面壓力而不導(dǎo)致多肽變性。合適的非離子表面活性劑包括聚山梨酸酯(polysorbate)(20，80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic多元醇、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(Tween20、Tween80等)。
其它各種賦形劑包括膨脹劑或填充劑(如淀粉)、螯合劑(如EDTA)、抗氧化劑(如抗壞血酸、甲硫氨酸、維生素E)和共溶劑。
活性組分也可以被包裹在通過(guò)，例如coascervation技術(shù)或通過(guò)界面聚合所制備的微囊，如羥甲基纖維素、明膠或聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊中，包裹在膠體狀藥物運(yùn)送體系(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米膠囊)中，或包裹在大乳劑中。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(同上)中公開了這些技術(shù)。
體內(nèi)給藥所使用的非胃腸道制劑必須是無(wú)菌的。該過(guò)程可通過(guò)，例如，除菌濾膜的過(guò)濾而輕易完成。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含i)本發(fā)明的IFNG變體，ii)緩沖劑，尤其有機(jī)酸的鹽，它能將穩(wěn)定pH在5.0-6.5，iii)穩(wěn)定劑，尤其有機(jī)糖或糖醇，iv)非離子表面活性劑，和v)無(wú)菌水。更具體地，緩沖劑選自乙酸鹽，琥珀酸鹽，和檸檬酸鹽；穩(wěn)定劑為甘露醇或山梨醇，非離子表面活性劑為Tween-20或Tween-80。優(yōu)選藥物組合物不包括任何防腐劑。
持續(xù)釋放制劑持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有多肽或偶聯(lián)物的固體疏水聚合物的半滲透基質(zhì)、具有合適形式如膜或微囊的基質(zhì)。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基丙烯酸甲酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease技術(shù)或Lupron Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球)、和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能長(zhǎng)時(shí)間釋放分子如長(zhǎng)達(dá)或超過(guò)100天，某些水凝膠在較短時(shí)間內(nèi)釋放蛋白質(zhì)。當(dāng)包囊中的多肽長(zhǎng)時(shí)間保留在體內(nèi)時(shí)，它們因在37℃潮濕的環(huán)境中暴露而變性或聚集，導(dǎo)致生物活性喪失并且可能改變免疫原性。合理的穩(wěn)定策略可根據(jù)所涉及的機(jī)理設(shè)計(jì)。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)理是通過(guò)硫代二硫化物相互交換形成分子內(nèi)S-S鍵，那么可通過(guò)修飾巰基、將酸性溶液凍干、控制濕度、使用適宜的添加劑和開發(fā)特異性聚合物基質(zhì)組合物來(lái)達(dá)到穩(wěn)定。
口服用藥對(duì)于口服用藥，藥物組合物可以是固體或液體形式，例如，以膠囊，片劑，懸液，乳劑或溶液的形式。藥物組合物優(yōu)選以含有給定量活性成分的劑量單位的形式制備。用于人或其它哺乳動(dòng)物的合適的每日劑量可根據(jù)病人的情況和其它因素大幅度變化，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用常規(guī)方法測(cè)定。
口服用藥的固體劑型可包括膠囊，片劑，栓劑，粉末和顆粒。在該固體劑型中，活性化合物可與至少一種惰性稀釋劑，例如蔗糖，乳糖或淀粉混合。該劑型也可包括，如正常實(shí)踐中的添加物質(zhì)，例如潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂。對(duì)于膠囊，片劑和丸劑，劑型也可包括緩沖劑。片劑和丸劑還可用腸衣制備。
所述變體可與諸如乳糖，蔗糖，淀粉粉末，鏈烷酸的纖維素酯，硬脂酸，滑石，硬脂酸鎂，氧化鎂，磷酸和硫酸的鈉和鈣鹽，阿拉伯膠，明膠，藻酸鈉，聚乙烯-吡咯烷，和/或聚乙烯醇的佐劑混合，并作成片劑或包成膠囊用于常規(guī)用藥。作為選擇，它們可溶于鹽水，水，聚乙二醇，丙二醇，乙醇，油類(例如玉米油，花生油，棉子油或芝麻油)，黃芪膠，和/或各種緩沖液中。其它佐劑和用藥方式是制藥領(lǐng)域熟知的。載體或稀釋劑可包括時(shí)間延遲材料，例如單獨(dú)或與蠟一起的甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，或者本領(lǐng)域熟知的其它材料。
可對(duì)藥物組合物進(jìn)行諸如滅菌的常規(guī)制藥操作和/或藥物組合物可含有常規(guī)佐劑，例如防腐劑，穩(wěn)定劑，潤(rùn)濕劑，乳化劑，緩沖液，填充物，等，例如，如在本文別處所述。
口服用藥的液體劑型可包括含有諸如水的本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑的可藥用乳劑，溶液，懸液，糖漿和酏劑。該組合物也可佐劑，例如潤(rùn)濕劑，甜味劑，調(diào)味劑和香味劑。
局部用藥適用于局部用藥的配制劑包括適合于穿透皮膚的液態(tài)或半液態(tài)制劑(例如，擦劑，洗劑，軟膏，乳膏，或糊劑)和適合于眼，耳或者鼻給藥的滴劑。
肺部遞送適合于用噴射或者超聲噴霧器使用的配制劑一般包含溶于水的多肽變體，它的濃度為，例如每mL溶液大約0.01到25mg變體，優(yōu)選大約0.1到10mg/mL。配制劑也可包括緩沖劑和簡(jiǎn)單糖類(例如，用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定化和滲透壓調(diào)節(jié))，和/或濃度范圍從0.1到10mg/ml的人血清白蛋白。可使用的緩沖劑的例子是乙酸鈉，檸檬酸鹽和甘氨酸。優(yōu)選緩沖劑具有適合于將溶液調(diào)到pH為3至9范圍的組成成分和摩爾濃度。一般來(lái)說(shuō)，從1mM到50mM的緩沖劑摩爾濃度適合于該目的?？墒褂玫奶穷惖睦邮侨樘?，麥芽糖，甘露糖醇，山梨糖醇，海藻糖，和木糖，通常的含量范圍是配制劑重量的1％到10％。
噴霧配制劑也可含有表面活性劑以降低或防止在形成氣溶膠時(shí)由溶液的霧化引起的表面誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集?？墒褂酶鞣N常規(guī)表面活性劑，例如聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇，聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯。其含量范圍一般為配制劑重量的0.001％和4％之間。用于本發(fā)明目的的特別優(yōu)選的表面活性劑是聚氧化乙烯山梨聚糖單油酸酯。
具體配制劑和產(chǎn)生合適分散的本發(fā)明的液體顆粒的方法在WO94/20069，US 5,915,378，US 5,960,792，US 5,957,124，US 5,934,272，US 5,915,378，US 5,855,564，US 5,826,570和US 5,522,385中描述，在此引用以供參考。
與帶有劑量刻度的吸入器裝置一起使用的配制劑一般包含精細(xì)區(qū)分的粉末。該粉末可通過(guò)凍干并然后磨制液體偶聯(lián)物配制劑來(lái)生產(chǎn)且也可含有穩(wěn)定劑，例如人血清白蛋白(HSA)。一般來(lái)說(shuō)，加入超過(guò)0.5％(w/w)的HAS。另外，如果需要可向制劑中加入一種或多種糖或糖醇。其例子包括乳糖，麥芽糖，甘露糖醇，山梨糖醇，山梨糖，海藻糖，木糖醇，和木糖。加入配制劑中的該偶聯(lián)物的量的范圍從大約0.01到200％(w/w)，優(yōu)選從大約1到50％。然后凍干該配制劑并磨制成所需的顆粒大小。
然后將合適大小的顆粒借助于表面活性劑懸浮于推進(jìn)劑中。推進(jìn)劑可以是用于該目的的任何常規(guī)材料，例如氯氟碳，氫氯氟碳，氫氟碳，或碳?xì)浠衔?，包括三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇，?，1，1，2-四氟乙烷，或其組合。合適的表面活性劑包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性劑。然后將該混合物裝入遞送裝置中。適用于本發(fā)明的商業(yè)上可獲得的測(cè)定劑量的吸入器例子是由Glaxo Inc.，Research Triangle Park，N.C生產(chǎn)的Ventolin測(cè)定劑量的吸入器。
用于粉末吸入器的配制劑包含含有偶聯(lián)物的精細(xì)區(qū)分的干粉且也可包括膨脹劑，例如乳糖，山梨糖醇，蔗糖，或甘露糖醇，其含量可幫助粉末從裝置中散布，例如，占配制劑重量的50％到90％。粉末的顆粒在肺中應(yīng)具有空氣動(dòng)力學(xué)特性，相應(yīng)于具有大約1g/cm2密度的顆粒，具有小于10微米的平均直徑，優(yōu)選在0.5和5微米之間，最優(yōu)選在1.5和3.5微米之間。根據(jù)本文的教導(dǎo)適用的粉末吸入器的例子是由Fisons Corp.，Bedford，Mass生產(chǎn)的Spinhaler粉末吸入器。
以US 5,997,848，US 5,993,783，US 5,985,248，US 5,976574，US 5,922,354，US 5,785,049和US 5,654,007公開的方法可產(chǎn)生和/或遞送這些裝置中的粉末。
設(shè)計(jì)用于治療產(chǎn)品的肺部遞送的機(jī)械裝置包括但不限于噴霧器，測(cè)定劑量的吸入器，和粉末吸入器，所有這些都是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。適用于本發(fā)明實(shí)踐的商業(yè)上可獲得的裝置的具體例子是由Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Missouri生產(chǎn)的Ultravent噴霧器；由Marquest Medical Products，Englewood，Colorado生產(chǎn)的Acorn II噴霧器；由Glaxo Inc.，Research TrianglePark，North Carolina生產(chǎn)的Ventolin測(cè)定劑量的吸入器；由Fisons Corp.，Bedford，Massachusetts生產(chǎn)的Spinhaler粉末吸入器；Inhale TherapeuticSystems，Inc.，San Carlos，Calfornia的“standing cloud”裝置；Alkermes，Cambridge，Massachusetts生產(chǎn)的AIR吸入器；和Aradigm Corporation，Hayward，California生產(chǎn)的AERx肺部藥物遞送系統(tǒng)。
在下面實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明。該實(shí)施例不應(yīng)以任何方式理解為對(duì)本說(shuō)明書和權(quán)利要求書范圍的限制。
材料和方法材料CHO-K1細(xì)胞(獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC#CCL-61))。
HeLa細(xì)胞(獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC#CCL-2))。
ISRE-Luc獲自Stratagene，La Jolla USA。
pCDNA 3.1/hygro獲自Invitrogen，Carlsbad USA。
限制酶和聚合酶獲自New England Biolabs Inc.，Beverly，USA。
DMEM培養(yǎng)基Dulbecco改良型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，10％胎牛血清和潮霉素B獲自Life Technologies A/S，Copenhagen，Denmark。
LucLite底物獲自Packard Bioscience，Groningen，The Netherlands。
TopCount發(fā)光儀獲自Packard Bioscience，Groningen，The Netherlands。
生物素化多克隆抗-任IFNG抗體BAF285獲自R & D Systems Inc.，Minneapolis，USA。
辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)型鏈親和素P0397獲自DAKO，Copenhagen，Denmark。
TMB印跡試劑獲自KEM-EN-TEC，Copenhagen，Denmark。
方法干擾素試驗(yàn)概述以前已經(jīng)公開了IFNG與HeLa細(xì)胞上的IFNG受體相互作用并激活該受體。其結(jié)果是，在含有干擾素刺激應(yīng)答元件(ISRE)的啟動(dòng)子處激活轉(zhuǎn)錄。因此通過(guò)在HeLa細(xì)胞中使用與螢光素酶報(bào)告基因偶聯(lián)的ISRE(ISRE-luc)可篩選干擾素受體的激動(dòng)劑。
初步試驗(yàn)(primary assay)用ISRE-Luc和pCDNA 3.1/hygro共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，通過(guò)在含有潮霉素B的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇可建立轉(zhuǎn)化灶(細(xì)胞克隆)。在存在或不存在IFNG的條件下篩選細(xì)胞克隆的螢光素酶活性。顯示出刺激與未刺激的螢光素酶活性比率最高的那些克隆用于進(jìn)一步的試驗(yàn)。
為了篩選多肽變體，在96孔培養(yǎng)板中接種15,000個(gè)細(xì)胞/孔并在DMEM培養(yǎng)基中保溫過(guò)夜。在第二天以各種濃度向細(xì)胞中加入多肽變體以及已知的標(biāo)準(zhǔn)品。用Actimmune作為“已知的標(biāo)準(zhǔn)品”；將一小瓶Actimmune用DMEM，5％FBS稀釋至300IU/ml，貯存于-80℃?zhèn)溆谩?br> 平板在37℃、5％CO2氣體環(huán)境中培養(yǎng)6小時(shí)。隨后向各孔中加入LucLite底物(Packard Bioscience，Groningen，The Netherlands)。密封平板并在TopCount發(fā)光儀(Packard)中以SPC(單光子計(jì)數(shù))方式測(cè)量發(fā)光。
每個(gè)平板含有與IFNG一起保溫的孔作為受刺激的對(duì)照，含有正常培養(yǎng)基的另一些孔作為未刺激對(duì)照。用刺激的和未刺激的螢光素酶活性的比率作為IFNG活性和實(shí)驗(yàn)間誤差的內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算每一份IFNG樣品相對(duì)于Actimmune標(biāo)準(zhǔn)品的單位(unit)數(shù)，表示為AU。
測(cè)定糖基化程度的增加為了測(cè)定IFNG變體單體糖基化的不同程度，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行Western印跡，用生物素化多克隆抗人IFNG抗體(BAF285，來(lái)自R & D Systems)作為第一抗體，用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的鏈親和素(P0397來(lái)自DAKO)作為第二抗體，然后用TMB印跡試劑(KEM-EN-TEC，Copenhagen，Denmark)染色。糖基化程度不同的IFNG變體單體的分布可通過(guò)目測(cè)已被染色的膜來(lái)確定。
測(cè)定AUCscAUCsc通過(guò)以200μl大丸劑的形式將等量(基于活性)的本發(fā)明IFNG多肽變體皮下給與大鼠來(lái)測(cè)定。
在這些實(shí)驗(yàn)中，使用體重220-260g的雌性Sprag-Dawley大鼠。IFNG多肽用琥珀酸鈉(720mg/l)，甘露醇40g/l，polysorbat20(100mg/l)，pH6.0配制。
皮下給藥之前，從尾靜脈取一份血樣，以便確保不會(huì)檢測(cè)出背景IFNG活性。給藥后，于10min，20min，40min，60min，120min，240min，480min，720min，1440min，1620min，1920min和2880min(有時(shí)也包括3600min)時(shí)從尾靜脈取血樣。將血樣室溫靜置20min，使其凝固，然后室溫5000g離心20min，制得血清。然后分離出血清，-80℃貯存，以備用上述“初步試驗(yàn)”測(cè)定IFNG活性。應(yīng)注意，當(dāng)測(cè)定PK研究的大鼠血清樣品中的單位(unit)數(shù)時(shí)，將Actimmune標(biāo)準(zhǔn)品用DMEM，5％FBS和5％大鼠血清稀釋。
然后將血清中單位(AU/ml)的數(shù)量對(duì)時(shí)間(min)作圖，用GraphPad Prism3.01計(jì)算AUCsc。
對(duì)糖基化huIFNG和/或Actimmune進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)，以便評(píng)估本發(fā)明IFNG多肽變體與糖基化huIFNG和/或Actimmune相比的AUCsc的增加。
血清半壽期血清半壽期通過(guò)以200μl大丸劑的形式將等量(基于活性)的本發(fā)明IFNG多肽變體皮下給與大鼠來(lái)測(cè)定。
在這些實(shí)驗(yàn)中，使用體重220-260g的雌性Sprag-Dawley大鼠。IFNG多肽用琥珀酸鈉(720mg/l)，甘露醇40g/l，polysorbat20(100mg/l)，pH6.0配制。
皮下給藥之前，從尾靜脈取一份血樣，以便確保不會(huì)檢測(cè)出背景IFNG活性。給藥后，于5min，10min，20min，40min，60min，120min，240min，480min，720min，1440min，1620min，1920min和2880min時(shí)從尾靜脈取血樣。將血樣室溫靜置20min，使其凝固，然后室溫5000g離心20min，制得血清。然后分離出血清，-80℃貯存，以備用上述“初步試驗(yàn)”測(cè)定IFNG活性。應(yīng)注意，當(dāng)測(cè)定PK研究的大鼠血清樣品中的單位數(shù)時(shí)，將Actimmune標(biāo)準(zhǔn)品用DMEM，5％FBS和5％大鼠血清稀釋。
然后將血清中單位(AU/ml)的數(shù)量對(duì)時(shí)間(min)作圖，用WinNonLin Pro3.3計(jì)算血清半壽期。
對(duì)糖基化huIFNG和/或Actimmune進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)，以便評(píng)估本發(fā)明IFNG多肽變體與糖基化huIFNG和/或Actimmune相比的血清半壽期的增加。
暴露于表面的氨基酸殘基的鑒定結(jié)構(gòu)利用X-射線晶體學(xué)測(cè)定的huIFNG的實(shí)驗(yàn)性3D結(jié)構(gòu)見Ealick等，Science 252698-702(1991)的報(bào)道，其中指出了IFNG同型二聚體的C-α軌跡(trace)。Walter等，Nature 376230-235(1995)報(bào)道了與兩個(gè)可溶性IFNG受體分子復(fù)合的IFNG同型二聚體的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)的座標(biāo)從未公開過(guò)。Thiel等，Structure 8927-936(2000)報(bào)道了與兩個(gè)可溶性IFNG受體分子復(fù)合的IFNG同型二聚體的結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中第三個(gè)受體分子不與IFNG同型二聚體發(fā)生相互作用。
可接近的表面區(qū)域(ASA)用計(jì)算機(jī)程序Access(B.Lee和F.M.Richards，J.Mol.Biol.55379-400(1971))版本2(Copyright(c)1983 Yale University)計(jì)算該結(jié)構(gòu)中各原子的可接近的表面區(qū)域(ASA)。該方法一般使用1.4的探針大小，并將可接近的表面區(qū)域(ASA)定義為由探針中心形成的區(qū)域。計(jì)算前，從坐標(biāo)系(coordinateset)中去掉與該蛋白質(zhì)不直接相關(guān)的所有水分子，氫原子和其它原子。
側(cè)鏈的分部(fractional)ASA側(cè)鏈原子的分部ASA通過(guò)用側(cè)鏈中原子的ASA總和除以延伸的ALA-x-ALA三肽中代表該殘基類型的側(cè)鏈原子的ASA值來(lái)計(jì)算。參見Hubbard，Campbell & Thornton(1991)J.Mol.Biol.220，507-530。在該實(shí)例中，將CA原子視為甘氨酸殘基而非其它殘基的側(cè)鏈的一部分。下列值作為側(cè)鏈的標(biāo)準(zhǔn)100％ASA來(lái)用Ala 69.23 Leu140.76Arg 200.35 2Lys162.502Asn 106.25 2Met156.082Asp 102.06 2Phe163.902Cys 96.692Pro119.652Gln 140.58 2Ser78.16 2Glu 134.61 2Thr101.672Gly 32.282Trp210.892His 147.00 2Tyr176.612Ile 137.91 2Val114.142該結(jié)構(gòu)中未探測(cè)到的殘基被定義為100％暴露，因?yàn)榭梢哉J(rèn)為這些殘基位于彈性區(qū)域。
測(cè)定原子間的距離原子間的距離使用分子圖形軟件，例如InsightII v.98.0，MSI INC測(cè)定。
測(cè)定受體結(jié)合位點(diǎn)受體結(jié)合位點(diǎn)定義為所有下述殘基，它們能通過(guò)受體結(jié)合而改變它們的可接近的表面區(qū)域。這通過(guò)至少兩種ASA計(jì)算來(lái)測(cè)定一種在配體/受體復(fù)合物的分離(isolated)的配體上，一種在完整的配體/受體復(fù)合物上。
實(shí)施例實(shí)施例1-確定暴露在表面的氨基酸殘基所用X-線結(jié)構(gòu)是IFNG同型二聚體與兩分子可溶性IFNG受體復(fù)合的結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中具有不與IFNG同型二聚體發(fā)生相互作用的第三個(gè)IFNG受體分子，參見Thiel et.al.Structure 8927-936(2000)。所述結(jié)構(gòu)由這樣的IFNG同型二聚體組成，其中的兩個(gè)分子yong A和B標(biāo)記。為了進(jìn)行構(gòu)建，將另一個(gè)甲硫氨酸置于被M0標(biāo)記的IFNG序列之前，并在該序列的C-末端截短10個(gè)殘基(所構(gòu)建的分子中，Q133是最后一個(gè)殘基)。在本實(shí)施例的所有計(jì)算中，將M0從該結(jié)構(gòu)中去掉。兩個(gè)IFNG單體在殘基120之后的結(jié)構(gòu)具有極弱的電子密度，進(jìn)行對(duì)殘基進(jìn)行建模(modeled)，直至殘基T126。因此，在進(jìn)行本實(shí)施例的計(jì)算之前，殘基S121-T126已從該結(jié)構(gòu)中除去。標(biāo)有C和D的兩個(gè)受體片段直接作用于IFNG同型二聚體，標(biāo)有E的第三個(gè)受體分子不與IFNG同型二聚體接觸，也不包括在這些計(jì)算中。
表面暴露對(duì)不含M0和S121-T126的分子A和B的同型二聚體進(jìn)行分部ASA計(jì)算，結(jié)果在至少一個(gè)單體中下列殘基有超過(guò)25％的側(cè)鏈暴露在表面Q1，D2，P3，K6，E9，N10，K12，K13，Y14，N16，G18，H19，S20，D21，A23，D24，N25，G26，T27，G31，K34，N35，K37，E38，E39，S40，K55，K58，N59，K61，D62，D63，Q64，S65，Q67，K68，E71，T72，K74，E75，N78，V79，K80，N83，S84，N85，K86，K87，D90，E93，K94，N97，S99，T101，D102，L103，N104，H111，Q115，A118和E119。
在至少一個(gè)單體中下列殘基有超過(guò)50％的側(cè)鏈暴露在表面Q1，D2，P3，K6，E9，N10，K13，N16，G18，H19，S20，D21，A23，D24，N25，G26，T27，G31，K34，K37，E38，E39，K55，K58，N59，D62，Q64，S65，K68，E71，E75，N83，S84，K86，K87，K94，N97，S99，T101，D102，L103，N104，Q115，A118，E119。
對(duì)分子A和B(都不含M0和S121-T126且包括受體分子C和D)的同型二聚體進(jìn)行分部ASA計(jì)算，結(jié)果在至少一個(gè)單體中下列殘基有超過(guò)25％的側(cè)鏈暴露在表面Q1，D2，P3，K6，E9，N10，K13，Y14，N16，G18，H19，D21，N25，G26，G31，K34，N35，K37，E38，E39，S40，K55，K58，N59，K61，D62，D63，Q64，S65，Q67，K68，E71，T72，K74，E75，N78，V79，K80，N83，S84，N85，K86，K87，D90，E93，K94，N97，S99，T101，D102，L103，N104，E119。
在至少一個(gè)單體中下列殘基有超過(guò)50％的側(cè)鏈暴露于表面P3，K6，N10，K13，N16，D21，N25，G26，G31，K34，K37，E38，E39，K55，K58，N59，D62，Q64，S65，K68，E71，E75，N83，S84，K86，K87，K94，N97，S99，T101，D102，L103和N104。
所有上述位置都是本發(fā)明修飾所針對(duì)的靶。
比較這兩列殘基發(fā)現(xiàn)，通過(guò)受體結(jié)合，從所述超過(guò)25％側(cè)鏈的ASA列中去掉了K12，S20，A23，D24，T27，H111，Q115和A118，從所述超過(guò)50％側(cè)鏈的ASA列中去掉了Q1，D2，E9，G18，H19，S20，A23，D24，T27，Q115，A118和E119。
該結(jié)構(gòu)中未測(cè)定的殘基，即殘基S121，P122，A123，A124，K125，T126，G127，K128，R129，K130，R131，S132，Q133，M134，L135，F(xiàn)136，R137，G138，R139，R140，A141，S142，Q143，都按完全暴露在表面來(lái)處理。這些殘基也組成本發(fā)明引入連接基團(tuán)時(shí)的不同靶(或者可將其視為屬于暴露在表面的氨基酸殘基，例如具有超過(guò)25％或超過(guò)50％的暴露側(cè)鏈)。
實(shí)施例2-確定受體結(jié)合位點(diǎn)按上述進(jìn)行ASA計(jì)算發(fā)現(xiàn)，在上述復(fù)合物的至少一個(gè)單體中，IFNG分子的下列殘基與在分離的二聚體上的計(jì)算結(jié)果相比具有減少的ASAQ1，D2，Y4，V5，E9，K12，G18，H19，S20，D21，V22，A23，D24，N25，G26，T27，L30，K34，K37，K108，H111，E112，I114，Q115，A118，E119。
實(shí)施例3-設(shè)計(jì)能以經(jīng)過(guò)優(yōu)化的密碼子使用模式表達(dá)IFNG的表達(dá)盒GenBank登錄號(hào)為X13274的DNA序列包含編碼成熟huIFNG及其天然信號(hào)肽的全長(zhǎng)cDNA，對(duì)該DNA序列進(jìn)行修飾以便幫助在CHO細(xì)胞中進(jìn)行高效表達(dá)。對(duì)huIFNG核苷酸序列的密碼子進(jìn)行修飾，方法是使密碼子的應(yīng)用偏向常用于人(homo sapiens)的密碼子。隨后在該序列中的某些核苷酸用其它核苷酸取代以便引入DNA限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物以便合成該基因。
通過(guò)一步PCR將引物裝配成合成基因，其中用到Platinum Pfx-聚合酶試劑盒(Life Technologies)和標(biāo)準(zhǔn)三步PCR循環(huán)參數(shù)。經(jīng)裝配的基因通過(guò)使用相同條件的PCR進(jìn)行擴(kuò)增，它具有SEQ ID NO42所示的序列。將合成的基因克隆進(jìn)pcDNA3.1/hygro(In Vitrogen)的BamHI和XbaI位點(diǎn)之間，得到pIGY-22。
利用Lipofectaim2000(Life Technologies)作為轉(zhuǎn)染試劑將pIGY-22轉(zhuǎn)染至CHO K1細(xì)胞中。24小時(shí)后收獲培養(yǎng)基，用ELISA分析IFNG活性和濃度。用上述初步試驗(yàn)測(cè)得活性為1.4×107AU/ml。
實(shí)施例4-定點(diǎn)誘變制備糖基化變體為了將突變引入IFNG中，設(shè)計(jì)寡核苷酸，以便能通過(guò)傳統(tǒng)的兩步PCR法將由PCR產(chǎn)生的改變引入表達(dá)質(zhì)粒(pIGY-22)中。
用到兩種載體引物以及特異性突變引物ADJ0135′-GATGGCTGGCAACTAGAAG-3′(反義下游載體引物)(SEQID NO43)和ADJ0145′-TGTACGGTGGGAGGTCTAT-3′(SEQ ID NO44)(正義上游載體引物)。
S99T變體通過(guò)傳統(tǒng)的兩步PCR法制備，其以ADJ013和ADJ014為載體引物，以ADJ093(5′-GTTCAGGTCTGTCACGGTGTAATTGGTCAGCTT-3′)(SEQ ID NO45)和ADJ094(5′-AAGCTGACCAATTACACCGTGACAGACCTGAAC-3′)(SEQ ID NO46)為突變引物，并以pIGY-22為模板。用BamHI和Xbal將447bp的PCR產(chǎn)物亞克隆至pcDNA3.1/Hygro(In Vitrogen)中，得到質(zhì)粒pIGY-48。
用Lipofectaim2000(Life Technologies)作為轉(zhuǎn)染試劑，將pIGY-48轉(zhuǎn)染至CHO K1細(xì)胞中。24小時(shí)后收獲培養(yǎng)基，分析IFNG活性。通過(guò)本文所述初步試驗(yàn)測(cè)出以下活性5.1×106AU/ml。
E38N+S40T+S99T變體通過(guò)傳統(tǒng)的兩步PCR法制備，其以ADJ013和ADJ014為載體引物，以ADJ091(5′-CATGATCTTCCGATCGGTCTCGTTCTTCCAATT-3′)(SEQ ID NO47)和ADJ092(5′-AATTGGAAGAACGAGACC GATCGGAAGATCATG-3′)(SEQ ID NO48)為突變引物，并以pIGY-48為模板。用BamHI和Xbal將447bp的PCR產(chǎn)物亞克隆至pcDNA3.1/Hygro(In Vitrogen)中，得到質(zhì)粒pIGY-54。
用Lipofectaim2000(Life Technologies)作為轉(zhuǎn)染試劑，將pIGY-54轉(zhuǎn)染至CHO K1細(xì)胞中。24小時(shí)后收獲培養(yǎng)基，分析IFNG活性。通過(guò)本文所述初步試驗(yàn)測(cè)出以下活性1.3×107AU/ml。
用類似于上述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備出多種全長(zhǎng)IFNG糖基化變體。這些變體匯編于下表1中。
制備C-末端截短的IFNG變體有一種C-末端截短型IFNG變體在緊接Leu135的密碼子的下游有一個(gè)終止密碼子，它如下制備以pIGY-22，pIGY-48和pIGY-54為模板進(jìn)行一步PCR，然后用BamHI和XbaI將PCR產(chǎn)物亞克隆至pcDNA3.1/Hygro(In VItrogen)中。用于構(gòu)建這些變體的引物是ADJ014(見上文，上游)和5′-GAGTCTAGATTACAGCATCTGGCTTCTCTT-3′(SEQ ID NO49)(下游)。將所得質(zhì)粒稱為pIGY-72(野生型IFNG在Leu135之后的部分被截掉)，pIGY-73(S99T變體在Leu135之后的部分被截掉)和pIGY-74(E38N+S40T+S99T在Leu35之后的部分被截掉)。
制備含有半胱氨酸的IFNG變體含有半胱氨酸殘基的IFNG變體用Stratagene′s QuikChange′XL定點(diǎn)誘變?cè)噭┖邪凑諒S家說(shuō)明進(jìn)行制備。用pIGY-48作為模板得到7種IFNG變體，每種包含一個(gè)引入的半胱氨酸N10C+S99T，N16C+S99T，E38C+S99T，N59C+S99T，N83C+S99T，K94C+S99T和S99T+N104C。類似地，用pIGY-54作為模板得到6種IFNG變體，每種包含一個(gè)引入的半胱氨酸N10C+E38N+S40T+S99T，N16C+E38N+S40T+S99T，E38N+S40T+N59C+S99T，E38N+S40T+N83C+S99T，E38N+S40T+K94C+S99T和E38N+S40T+S99T+N104C。
實(shí)施例5-含有半胱氨酸的變體的PEG化所有緩沖液在使用前去離子化。蛋白濃度通過(guò)測(cè)量A280來(lái)評(píng)估。
利用OPSS偶聯(lián)化學(xué)進(jìn)行PEG化將1.3mg/ml的IFNG變體N16C+S99T(全長(zhǎng))在5mM琥珀酸鈉，4％甘露醇，0.01％Tween 20，pH6.0中的溶液7.2ml，與300μl 0.5M DTT室溫孵育30分鐘，使它還原。使IFNG變體脫鹽，方法是將3個(gè)2.5ml等份用緩沖液A(50mM磷酸鈉，1mM EDTA，pH8.1)加載NAP25凝膠過(guò)濾柱(Pharmacia)。每個(gè)等份洗脫為3.5ml。
將mPEG-OPSS(10KDa)溶于緩沖液A中至濃度為2mg/ml，將其以等量加入經(jīng)還原并脫鹽的IFNG變體中，于室溫溫和振蕩孵育60min。
將11ml反應(yīng)混合物用Vivaspin20柱(VivaScience)濃縮為1-6ml，剩余的mPEG用經(jīng)過(guò)緩沖液A平衡的Sephacryl S-100柱(Pharmacia)經(jīng)凝膠過(guò)濾除去。
將PEG化IFNG變體用Vivaspin 6柱(VivaScience)在5mM琥珀酸鈉，4％甘露醇，0.01％Tween 20，pH6.0中滲濾。純化的PEG化IFNG變體比活性為1.3×106AU/mg，如本文的初步試驗(yàn)所測(cè)(為相應(yīng)的未PEG化IFNG變體比活性的15％)。
利用MAL偶聯(lián)化學(xué)進(jìn)行PEG化將1.5mg/ml的IFNG變體N59C+S99T(全長(zhǎng))在5mM琥珀酸鈉，4％甘露醇，0.01％Tween 20，pH6.0中的溶液1.6ml，與64μl 0.5M DTT室溫孵育30分鐘，使它還原。用緩沖液A(50mM磷酸鈉，1mM EDTA，pH8.1)在NAP25凝膠過(guò)濾柱(Pharmacia)上使IFNG變體脫鹽。每個(gè)等份洗脫為3.5ml。
將mPEG-MAL(5kDa)溶于緩沖液A中至濃度為0.5mg/ml，將其以等量加入經(jīng)還原并脫鹽的IFNG變體中，于室溫溫和振蕩孵育120min。
添加硫酸銨至濃度為0.9M，將這種PEG化IFNG變體加載至已用緩沖液B(20mM磷酸鈉，0.9M硫酸銨，pH6.6)平衡的1ml Resource苯基柱(Pharmacia)上。用5個(gè)柱體積的緩沖液B洗柱，然后用0-50％線性梯度的緩沖液C(20mM磷酸鈉，pH6.6)以30個(gè)柱體積洗脫被結(jié)合的PEG化IFNG變體。PEG化IFNG變體在0.6M硫酸銨左右被洗脫。
將含有PEG化IFNG變體的級(jí)分匯總，在5mM琥珀酸鈉，4％甘露醇，0.01％Tween 20，pH6.0中用Vivaspin20柱(VivaScience)進(jìn)行滲濾。純化后的PEG化IFNG變體的比活性為2.4×106AU/mg，如本文的初步試驗(yàn)所測(cè)(為相應(yīng)的未PEG化IFNG變體比活性的15％)。
實(shí)施例6-IFNG和IFNG變體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)為了瞬時(shí)表達(dá)IFNG，細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至95％鋪滿，所述培養(yǎng)基為Dulbecco′s MEM/Nut.-mix F-12(Ham)L-谷氨酰胺，15mM Hepes，吡哆醇-HCl(Life Technologies目錄號(hào)31330-038)，其中含有1∶10的胎牛血清(Bio Whittaker目錄號(hào)02-701F)、1∶100的青霉素和鏈霉素(Bio Whittaker目錄號(hào)17-602E)。將編碼IFNG的質(zhì)粒用Lipofectaim2000(Life Technologies)按照廠家說(shuō)明轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。24小時(shí)后收獲培養(yǎng)基，分析IFNG活性。另外，為了定量所利用的糖基化位點(diǎn)的相對(duì)數(shù)量，用收獲的培養(yǎng)基進(jìn)行Western印跡。
表達(dá)IFNG的穩(wěn)定克隆如下制備用編碼IFNG的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO K1細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞在含0.36mg/ml潮霉素的培養(yǎng)基中孵育。分離出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。產(chǎn)生高水平IFNG的克隆通過(guò)ELISA鑒定。
實(shí)施例7-大規(guī)模制備將表達(dá)IFNG或變體的穩(wěn)定細(xì)胞系在1700cm2滾瓶(Corning，#431200)中的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至鋪滿，所述培養(yǎng)基為Dulbecco′s MEM/Nut.-mix F-12(Ham)L-谷氨酰胺，15mM Hepes，吡哆醇-HCl(Life Technologies目錄號(hào)31330-038)，其中含有1∶10的胎牛血清(Bio Whittaker目錄號(hào)02-701F)、1∶100的青霉素和鏈霉素(Bio Whittaker目錄號(hào)17-602E)。然后將培養(yǎng)基換成含有L-谷氨酰胺的300ml UltraCHO(Bio Whittaker目錄號(hào)12-724Q)，并向其中添加1∶500的EX-CYTE VLE(Serological Proteins Inc.#81-129)、1∶100的青霉素和鏈霉素(Bio Whittaker目錄號(hào)17-602E)。培養(yǎng)48小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成含有相同添加物的新鮮UltraCHO。再培養(yǎng)48小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成Dulbecco′s MEM/Nut.-mix F-12(Ham)L-谷氨酰胺，吡哆醇-HCl(LifeTechnologies目錄號(hào)21041-025)，其中添加1∶100的ITS-A(Gibco/BRL#51300-044)，1∶500的EX-CYTE VLE(Serological Proteins Inc.#81-129)和1∶100的青霉素和鏈霉素(Bio Whittaker目錄號(hào)17-602E)。然后每隔24小時(shí)收獲培養(yǎng)基，并代之以具有相同添加物的新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基。將收集的培養(yǎng)基濾過(guò)0.22μm濾膜以便除去細(xì)胞。
實(shí)施例8-純化過(guò)濾物經(jīng)顯微過(guò)濾(0.22μm)，然后用Millipore TFF系統(tǒng)超濾至約為1/15體積。在同一系統(tǒng)中，將該濃縮物用10mM Tris，pH7.6進(jìn)行滲濾。加入硫酸銨至濃度為1.7M，攪拌后，通過(guò)在Sorvall離心機(jī)中用GS3轉(zhuǎn)子以8000rpm離心25分鐘而將沉淀除去。
將上清加載至已用10mM Tris，1.7M硫酸銨，pH7.6平衡的25mlPhenyl High Performance(Pharmacia)柱中。然后用3個(gè)柱體積的10mM Tris，1.7M硫酸鈉，pH7.6洗柱，再用經(jīng)過(guò)10個(gè)柱體積漸變至100％10mM Tris，pH7.6的線性梯度洗脫已被結(jié)合的IFNG變體。使流出物以及洗脫的IFNG變體分級(jí)分離。將富含IFNG變體的級(jí)分匯總，通過(guò)在10mM Tris，pH9.0中用Vivaflow200系統(tǒng)(VivaScience)以分子量截流值10,000Da進(jìn)行滲濾而更換緩沖液。
然后將IFNG變體加載至已用10mM Tris，pH9.0平衡的18mlQ-sepharose Fast Flow(Pharmacia)柱中。然后用3個(gè)柱體積的10mM Tris，pH9.0洗柱，再用經(jīng)過(guò)15個(gè)柱體積由0％至100％線性梯度的10mM Tris，0.5MNaCl，pH9.0洗脫已被結(jié)合的IFNG變體。使流出物以及洗脫的IFNG變體分級(jí)分離。將富含IFNG變體的級(jí)分匯總，通過(guò)在10mM磷酸鈉，pH7.0中用VivaSpin20柱(VivaScience)以分子量截流值10,000Da進(jìn)行滲濾而更換緩沖液。
然后將IFNG變體加載至已用10mM磷酸鈉，pH7.0平衡的8ml CHT陶瓷羥基磷灰石柱(Biorad)中。然后用5個(gè)柱體積的10mM磷酸鈉，pH7.0洗柱，再用經(jīng)過(guò)30個(gè)柱體積由0％至60％線性梯度的500mM磷酸鈉，pH7.0洗脫已被結(jié)合的IFNG變體。使流出物以及洗脫的IFNG變體分級(jí)分離。將富含IFNG變體的級(jí)分匯總，用VivaSpin20柱(VivaScience)在5mM琥珀酸鈉，4％甘露醇，pH6.0中更換緩沖液，隨后添加Tween 20至濃度為0.01％。將該IFNG變體過(guò)濾除菌，保存在-80℃。
也可以按照下述純化方案對(duì)IFNG變體進(jìn)行純化過(guò)濾物經(jīng)顯微過(guò)濾(0.22μm)，然后用Millipore TFF系統(tǒng)超濾至約1/15體積。在同一系統(tǒng)中，將該濃縮物用10mM Tris，pH7.6進(jìn)行滲濾，然后將pH調(diào)至9.0，并將沉淀通過(guò)顯微過(guò)濾除去。
將樣品加載至已用10mM Tris，pH9.0平衡的Q-sepharose Fast Flow(Pharmacia)柱中。然后用3個(gè)柱體積的10mM Tris，pH9.0洗柱，再用經(jīng)過(guò)15個(gè)柱體積由0％至100％線性梯度的10mM Tris，0.5M NaCl，pH9.0洗脫已被結(jié)合的IFNG變體。使流出物以及洗脫的IFNG變體分級(jí)分離。將富含IFNG變體的級(jí)分匯總，將pH調(diào)至7.6。加硫酸銨至1.5M，攪拌后，通過(guò)離心除去沉淀。
然后將IFNG變體加載至已用10mM Tris，1.5M硫酸銨，pH7.6平衡的Phenyl Sepharose High Performance(Pharmacia)柱中。然后用3個(gè)柱體積的10mM Tris，1.5M硫酸銨，pH7.6洗柱，再用經(jīng)過(guò)10個(gè)柱體積漸變至100％的10mM Tris，pH7.6線性梯度洗脫已被結(jié)合的IFNG變體。使流出物以及洗脫的IFNG變體分級(jí)分離。將富含IFNG變體的級(jí)分匯總，并將硫酸銨調(diào)整至1.7M。
然后將IFNG變體加載至已用10mM磷酸鈉，1.7M硫酸銨，pH7.6平衡的Butyl Sepharose柱中。然后用10mM磷酸鈉，1.7M硫酸銨，pH7.6洗柱，再用10mM磷酸鈉，pH6.5洗脫已被結(jié)合的IFNG變體。使流出物以及洗脫的IFNG變體分級(jí)分離。
將富含IFNG變體的級(jí)分匯總，加載至已用10mM磷酸鈉，pH6.5平衡的羥基磷灰石柱中。用5個(gè)柱體積的10mM磷酸鈉，pH6.5洗柱，再用經(jīng)過(guò)30個(gè)柱體積由0％至100％的500mM磷酸鈉，pH6.5線性梯度洗脫已被結(jié)合的IFNG變體。使流出物以及洗脫的IFNG變體分級(jí)分離。
將含IFNG變體的級(jí)分匯總，將緩沖液更換為含有5mM琥珀酸鈉，4％甘露醇，pH6.0的緩沖液。隨后添加Tween 20至濃度為0.01％。將該IFNG變體過(guò)濾除菌，保存在-80℃。
實(shí)施例9-變體和PEG化變體的活性用上述“初步實(shí)驗(yàn)”測(cè)出以下活性數(shù)據(jù)(瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后)
活性 相對(duì)于全長(zhǎng)wt活性的％突變(AU/ml)野生型(全長(zhǎng)) 1.4×107-S99T(全長(zhǎng)) 5.1×10636％E38N(全長(zhǎng)) 1.4×107100％E38N+S40T(全長(zhǎng))9.9×10671％E38N+S40T+S99T(全長(zhǎng)) 1.3×10793％E38N+K61T(全長(zhǎng))1.2×10786％E38N+K61T+S99T(全長(zhǎng)) 1.4×10610％N10C+S99T(全長(zhǎng))2.5×10618％N16C+S99T(全長(zhǎng))1.1×10779％E38C+S99T(全長(zhǎng))1.0×10771％S99T+N104C(全長(zhǎng)) 5.0×10636％N10C+E38N+S40T+S99T(全長(zhǎng)) 1.5×10611％N16C+E38N+S40T+S99T(全長(zhǎng)) 3.7×10626％E38N+S40T+N59C+S99T(全長(zhǎng)) 1.1×10779％E38N+S40T+N83C+S99T(全長(zhǎng)) 7.2×1055％E38N+S40T+K94C+S99T(全長(zhǎng)) 9.4×1057％E38N+S40T+S99T+N104C(全長(zhǎng)) 2.3×10616％野生型(截短型) 6.3×10645％S99T(截短型) 3.5×10625％E38N+S40T+S99T(截短型) 4.0×10629％表1全長(zhǎng)型和截短型rhuIFNG多肽變體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的活性用上述“初步實(shí)驗(yàn)”測(cè)出以下活性數(shù)據(jù)(純化后)比活性 全長(zhǎng)wt活性的突變(AU/mg) ％野生型(全長(zhǎng)) 2.1×107-S99T(全長(zhǎng)) 2.2×107105％E38N+S40T+S99T(全長(zhǎng)) 1.4×10767％N10C+S99T(全長(zhǎng))3.8×10618％N16C+S99T(全長(zhǎng))2.3×10611％N16C+S99T(全長(zhǎng)+10kDa mPEG) 1.3×1066％E38C+S99T(全長(zhǎng))3.4×10616％N59C+S99T(全長(zhǎng))6.3×10630％N59C+S99T(全長(zhǎng)+5kDa mPEG) 2.4×10611％S99T+N104C(全長(zhǎng)) 3.5×10617％表2全長(zhǎng)rhuIFNG多肽變體純化后的活性測(cè)定多個(gè)PEG化變體的活性，具體是將PEG化產(chǎn)物與經(jīng)歷相同的PEG化過(guò)程(見實(shí)施例5)、但實(shí)際上未向反應(yīng)介質(zhì)中添加PEG的樣品進(jìn)行比較。結(jié)果匯編在以下表3中相對(duì)于經(jīng)歷“PEG化過(guò)程”的突變未PEG化產(chǎn)物的活性(％)N10C+S99T(全長(zhǎng)+5kDa mPEG) 23N16C+S99T(全長(zhǎng)+5kDa mPEG) 59E38C+S99T(全長(zhǎng)+10kDa mPEG)1) 41S99T+N104C(全長(zhǎng)+5kDa mPEG) 42表3全長(zhǎng)rhuIFNG多肽的PEG化變體的活性1)利用了ODSS偶聯(lián)化學(xué)。所有其它PEG化變體利用了MAL偶聯(lián)化學(xué)。
應(yīng)強(qiáng)調(diào)，表1所示活性數(shù)據(jù)反映了比活性和CHO-K1細(xì)胞中表達(dá)水平的組合。因此可以得出結(jié)論，所有變體與rhuIFNG相比，顯示出相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平/比活性。
如表2所示，所有半胱氨酸變體與rhuIFNG相比，顯示降低的比活性，而含有E38N，S40T和/或S99T突變的變體保留了與rhuIFNG相當(dāng)?shù)谋然钚?。?dāng)半胱氨酸變體與5或10kDa的PEG連接后，發(fā)現(xiàn)比活性進(jìn)一步降低2-3倍(表3)。不受任何具體理論限制，推測(cè)比活性的降低可歸因于偶聯(lián)的PEG基團(tuán)造成的空間阻礙導(dǎo)致受體結(jié)合降低。
實(shí)施例10-評(píng)估對(duì)N-糖基化位點(diǎn)的利用為了定量所利用的糖基化位點(diǎn)的相對(duì)數(shù)量，用收獲的培養(yǎng)基進(jìn)行western印跡(見圖1)。估計(jì)野生型rhuIFNG(全長(zhǎng))約有50％利用了全部?jī)蓚€(gè)糖基化位點(diǎn)(2N)，約有40％利用了其中一個(gè)糖基化位點(diǎn)(1N)，約有10％未被糖基化(0N)。這些數(shù)據(jù)與此前由Hooker et al.，1998，J.Interferon and CytokineRes.18，287-295和Sarenva et al.，1995，Biochem J.，308，9-14公開的一致。
如圖1所示，S99T變體(全長(zhǎng))比相應(yīng)野生型顯著更有效地利用其兩個(gè)糖基化位點(diǎn)。估計(jì)S99T變體約有90％利用了全部?jī)蓚€(gè)糖基化位點(diǎn)(2N)，約有7％利用了其中一個(gè)糖基化位點(diǎn)(1N)，約有3％未被糖基化(0N)。
還可從圖1看出，變體E38N+S40T(全長(zhǎng))對(duì)引入第38位的糖基化位點(diǎn)的利用顯著好于未優(yōu)化的變體E38N(全長(zhǎng))對(duì)它的利用。
這些數(shù)據(jù)清楚表明，不管糖基化位點(diǎn)是天然的還是引入的，對(duì)這些位點(diǎn)的更好利用，都可以通過(guò)在相對(duì)于天冬酰胺殘基而言的位置+2引入蘇氨酸殘基而不是絲氨酸殘基來(lái)實(shí)現(xiàn)。
實(shí)施例11-藥代動(dòng)力學(xué)研究大鼠皮下給藥的AUC(AUCsc)如前文針對(duì)多種IFNG變體所述進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果匯總在表4和圖2，圖3。
AUCsc/劑 AUCsc變體AUCsc變體Tmax，sc變體 (min xg)/ml AUCsc，ActimmuneAUCsc，全長(zhǎng)，wt(min)Actimmune 0.3-0.4- 0.013-0.027 43rhuIFNG(全長(zhǎng)) 15-24 37-80 - 362-446E38N+S40T+S99T1)111-192277-6404.6-13308-374N16C+S99T2)37 92-123 1.5-2.5 247N16C+93)114285-3804.8-7.6 249表4大鼠皮下給藥的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)1)全長(zhǎng)2)全長(zhǎng)，5kDa mPEG與引入的半胱氨酸殘基相連3)全長(zhǎng)，10kDa mPEG與引入的半胱氨酸殘基相連從圖2，圖3和表4可明顯看出，當(dāng)皮下給藥時(shí)，所述變體(包括PEG化變體)與rhuIFNG相比，尤其與市售Actimmune相比，具有顯著更高的AUC。根據(jù)圖3所示，還應(yīng)注意，兩種PEG化變體的給藥劑量比[E38N+S40T+S99T]變體減少2.5倍。
顯然，這開創(chuàng)了一種可能性，即施用更低劑量，從而減小副作用，和/或使實(shí)現(xiàn)活性所需的給藥次數(shù)比目前的更少，從而改善患者的順應(yīng)性。
序列表<110>馬克西根控股公司(Maxygen Holdings)<120>干擾素γ多肽變體<130>231wo410-INFG變體<140>
<141>
<160>49<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>143<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述[S99T]huIFNG<400>1Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln130 135 140<210>2<211>142<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的[S99T]huIFNG<400>2Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser130 135 140<210>3<211>141<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的[S99T]huIFNG<400>3Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala130 135 140<210>4<211>140<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的[S99T]huIFNG<400>4Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg130 135 140<210>5<211>139<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的[S99T]huIFNG<400>5Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Ash Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg130 135<210>6<211>138<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的[S99T]huIFNG<400>6Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly130 135<210>7<211>137<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的[S99T]huIFNG<400>7Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg130 135<210>8<211>136<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的[S99T]huIFNG<400>8Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95
Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe130 135<210>9<211>135<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的[S99T]huIFNG<400>9Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu130 135<210>10<211>134<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的[S99T]huIFNG<400>10Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met130<210>11<211>133<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的[S99T]huIFNG<400>11Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln130<210>12<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的[S99T]huIFNG<400>12Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125
Arg Lys Arg Ser130<210>13<211>131<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的[S99T]huIFNG<400>13Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg130<210>14<211>130<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的[S99T]huIFNG<400>14Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys130
<210>15<211>129<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的[S99T]huIFNG<400>15Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg<210>16<211>128<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的[S99T]huIFNG<400>16Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125<210>17<211>143
<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>17Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln130 135 140<210>18<211>166<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>18Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu1 5 10 15Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu20 25 30Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn35 40 45Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp50 55 60Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe65 70 75 80Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile85 90 95Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg100 105 110Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val115 120 125Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser130 135 140Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg145 150 155 160Gly Arg Arg Ala Ser Gln165<210>19<211>142<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的huIFNG<400>19Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser130 135 140<210>20<211>141<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的huIFNG<400>20Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Ash Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala130 135 140<210>21<211>140<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的huIFNG
<400>21Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg130 135 140<210>22<211>139<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的huIFNG<400>22Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg130 135<210>23<211>138<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的huIFNG<400>23Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly130 135<210>24<211>137<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的huIFNG<400>24Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg130 135<210>25<211>136<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的huIFNG<400>25Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe130 135<210>26<211>135<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的huIFNG<400>26Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu130 135<210>27<211>134<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的huIFNG<400>27Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met130<210>28<211>133<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的huIFNG<400>28Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln130<210>29<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的huIFNG<400>29Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser130<210>30<211>131<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的huIFNG<400>30Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg130<210>31<21l>130<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的huIFNG<400>31Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys130<210>32<211>129<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的huIFNG<400>32Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg<210>33<211>128<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C末端被截短的huIFNG<400>33Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125<210>34<211>140<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Actimmune(r)<400>34Met Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe1 5 10 15Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly20 25 30Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser35 40 45Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp50 55 60Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val65 70 75 80Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu85 90 95Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His100 105 110Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly115 120 125Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg130 135 140<210>35<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述標(biāo)記<400>35His His His His His His1 5<210>36<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述標(biāo)記<400>36Met Lys His His His His His His1 5<210>37<211>10
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述標(biāo)記<400>37Met Lys His His Ala His His Gln His His1 5 10<210>38<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述標(biāo)記<400>38Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln1 5 10<210>39<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述標(biāo)記<400>39Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu1 5 10<210>40<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述標(biāo)記<400>40Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>41<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述標(biāo)記<400>41Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 5
<210>42<211>498<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于使干擾素γ在CHO細(xì)胞中優(yōu)化表達(dá)的表達(dá)盒<400>42atgaagtaca caagctatat cctggccttt cagctgtgca tcgtgctggg ctccctgggc 60tgctattgcc aggaccctta cgtgaaggag gccgagaacc tgaagaagta ctttaacgcc 120ggccacagcg atgtggccga caatggcaca ctgtttctgg gcatcctgaa gaattggaag 180gaggagagcg atcggaagat catgcagtcc cagatcgtgt ccttctattt caagctgttt 240aagaatttca aggacgatca gtccatccag aagtccgtgg agaccatcaa ggaggacatg 300aacgtgaagt ttttcaatag caataagaag aagagagacg atttcgagaa gctgaccaat 360tactccgtga cagacctgaa cgtgcagaga aaggccatcc acgagctgat ccaggtgatg 420gccgagctgt cccccgccgc caagaccggc aagagaaaga gaagccagat gctgttcaga 480ggcagacggg ccagccag 498<210>43<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>43gatggctggc aactagaag 19<210>44<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>44tgtacggtgg gaggtctat 19<210>45<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>45gttcaggtct gtcacgctgt aattggtcag ctt 33<210>46<211>33<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物<400>46aagctgacca attacaccgt gacagacctg aac 33<210>47<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>47catgatcttc cgatcggtct cgttcttcca att 33<210>48<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>48aattggaaga acgagaccga tcggaagatc atg 33<210>49<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>49gagtctagat tacagcatct ggcttctctt 30
權(quán)利要求
1.具有IFNG活性并具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的干擾素γ(IFNG)多肽變體，或其具有IFNG活性的片段。
2.權(quán)利要求1的變體，其中所述變體具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的變體，其中所述變體是SEQ ID NO1所示氨基酸序列的片段，它在C-末端截短了1-15個(gè)氨基酸殘基。
4.權(quán)利要求2的變體，其中所述片段具有選自SEQ ID NO2，SEQ IDNO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15或SEQ ID NO16的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1-4之一的變體，其中所述變體被糖基化。
6.權(quán)利要求1-5之一的變體，其中所述變體包含至少一個(gè)額外的修飾并具有IFNG活性。
7.權(quán)利要求6的變體，其中所述變體與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相比，包含1-10個(gè)修飾。
8.權(quán)利要求6的變體，其中所述變體與選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ BD NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ IDNO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO1 0，SEQ B NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15或SEQ ID NO16的氨基酸序列相比，包含1-10個(gè)修飾。
9.權(quán)利要求7或8的變體，其中所述修飾是取代。
10.權(quán)利要求6-9之一的變體，其中所述變體包含至少一個(gè)引入的和/或至少一個(gè)除去的氨基酸殘基，所述氨基酸殘基包含對(duì)應(yīng)于非多肽組分的連接基團(tuán)。
11.權(quán)利要求10的變體，其中所述變體包含至少一個(gè)引入的糖基化位點(diǎn)。
12.權(quán)利要求11的變體，其中所述糖基化位點(diǎn)為N-糖基化位點(diǎn)。
13.權(quán)利要求12的變體，其中所述N-糖基化位點(diǎn)被引入這樣一個(gè)位置，該位置包含具有至少25％其側(cè)鏈暴露在表面的氨基酸殘基(如本文實(shí)施例1所述)。
14.權(quán)利要求13的變體，其中所述N-糖基化位點(diǎn)被引入這樣一個(gè)位置，該位置包含具有至少50％其側(cè)鏈暴露在表面的氨基酸殘基(如本文實(shí)施例1所述)。
15.權(quán)利要求13或14的變體，其中所述N-糖基化位點(diǎn)通過(guò)取代而引入。
16.權(quán)利要求15的變體，其中所述取代選自K12S，K12T，G18S，G18T，E38N，E38N+S40T，K61S，K61T，N85S，N85T，K94N，Q106S或Q106T。
17.權(quán)利要求16的變體，其中所述取代選自K12T，G18T，E38N+S40T，K61T，N85T，K94N或Q106T。
18.權(quán)利要求17的變體，其中所述取代是E38N+S40T。
19.權(quán)利要求10的變體，其中所述變體包含至少一個(gè)引入的半胱氨酸殘基。
20.權(quán)利要求19的變體，其中所述半胱氨酸殘基被引入這樣一個(gè)位置，該位置包含具有至少25％其側(cè)鏈暴露在表面的氨基酸殘基(如本文實(shí)施例1所述)。
21.權(quán)利要求20的變體，其中所述半胱氨酸殘基被引入這樣一個(gè)位置，該位置包含具有至少50％其側(cè)鏈暴露在表面的氨基酸殘基(如本文實(shí)施例1所述)。
22.權(quán)利要求20或21的變體，其中所述半胱氨酸殘基通過(guò)取代而引入。
23.權(quán)利要求22的變體，其中所述取代選自N10C，N16C，E38C，N59C，N83C，K94C，N104C或A124C。
24.權(quán)利要求19-23之一的變體，其中所述半胱氨酸殘基與非多肽組分共價(jià)相連。
25.權(quán)利要求24的變體，其中所述非多肽組分是聚合物分子。
26.權(quán)利要求25的變體，其中所述聚合物分子是線性或支鏈聚乙二醇。
27.權(quán)利要求10的變體，其中所述變體包含至少一個(gè)引入的N-糖基化位點(diǎn)和至少一個(gè)引入的半胱氨酸殘基。
28.權(quán)利要求27的變體，其中所述N-糖基化位點(diǎn)被引入權(quán)利要求13-18任一項(xiàng)所述的位置，而所述半胱氨酸殘基被引入權(quán)利要求20-23任一項(xiàng)所述的位置。
29.權(quán)利要求28的變體，其中所述變體包含選自下組的取代K12T+N16C，K12I+E38C，K12T+N59C，K12I+N83C，K12T+K94C，K12T+N104C，K12T+A124C，G18T+N10C，G18T+E38C，G18T+N59C，G18T+N83C，G18T+K94C，G18T+N104C，G18T+A124C，G18N+S20T+N10C，G18N+S20T+N16C，G18N+S20T+E38C，G18N+S20T+N59C，G18N+S20T+N83C，G18N+S20T+K94C，G18N+S20T+N104C，G18N+S20T+A124C，E38N+S40T+N10C，E38N+S40T+N16C，E38N+S40T+N59C，E38N+S40T+N83C，E38N+S40T+K94C，E38N+S40T+N104C，E38N+S40T上A124C，K61T+N10C，K61T+N16C，K61T+E38C，K61T+N83C，K61T+K94C，K61T+N104C，K61T+A124C，N85T+N10C，N85T+N16C，N85T+E38C，N85T+N59C，N85T+K94C，N85T+N104C，N85T+A124C，K94N+N10C，K94N+N16C，K94N+E38C，K94N+N59C，K94N+N83C，K94N+N104C，K94N+A124C，Q106T+N10C，Q106T+N16C，Q106T+E38C，Q106T+N59C，Q106T+N83C，Q106T+K94C或Q106T+A124C。
30.權(quán)利要求29的變體，其中所述變體包含選自下組的取代E38N+S40T+N10C，E38N+S40T+N16C，E38N+S40T+N59C，E38N+S40T+N83C，E38N+S40T+K94C，E38N+S40T+N104C或E38N+S40T+A124C。
31.權(quán)利要求27-30之一的變體，其中所述半胱氨酸殘基與非多肽組分共價(jià)相連。
32.權(quán)利要求31的變體，其中所述非多肽組分由權(quán)利要求25-26之一限定。
33.權(quán)利要求6-32之一的變體，其中所述變體包含選自下組的取代G26F，G26N，G26Y，G26Q，G26V，G26A，G26M，G26I，G26K，G26R，G26T，G26H，G26C或G26S。
34.權(quán)利要求33的變體，其中所述變體包含選自下組的取代G26A，G26M，G26I，G26K，G26R，G26T，G26H，G26C或G26S。
35.權(quán)利要求34的變體，其中所述變體包含取代G26A或G26S。
36.權(quán)利要求35的變體，其中所述變體包含取代G26A。
37.權(quán)利要求10的變體，其中所述變體包含至少一個(gè)除去的N-糖基化位點(diǎn)和至少一個(gè)引入的半胱氨酸殘基。
38.權(quán)利要求37的變體，其中所述變體包含至少一個(gè)除去的N-糖基化位點(diǎn)，至少一個(gè)引入的N-糖基化位點(diǎn)，和至少一個(gè)引入的半胱氨酸殘基，其中所述引入的N糖基化位點(diǎn)被引入的位置不同于所述被除去的N-糖基化位點(diǎn)所占據(jù)的位置。
39.權(quán)利要求37或38的變體，其中所述半胱氨酸殘基與非多肽組分共價(jià)相連。
40.權(quán)利要求39的變體，其中所述非多肽組分由權(quán)利要求25-26之一限定。
41.一種核苷酸序列，它編碼權(quán)利要求1-40之一的多肽變體。
42.一種表達(dá)載體，它包含權(quán)利要求41的核苷酸序列。
43.一種糖基化宿主細(xì)胞，它包含權(quán)利要求41的核苷酸序列或權(quán)利要求42的表達(dá)載體。
44.權(quán)利要求43的宿主細(xì)胞，它是CHO細(xì)胞或BHK細(xì)胞。
45.IFNG多肽變體群，或IFNG多肽變體群的組合物，其中所述群體包含至少70％的按照權(quán)利要求1-40之一所述的IFNG多肽變體。
46.一種藥物組合物，它包含權(quán)利要求1-40之一的多肽變體和可藥用的稀釋劑，載體或輔助劑。
47.權(quán)利要求1-40之一的多肽變體或權(quán)利要求46的藥物組合物作為藥物的用途。
48.權(quán)利要求1-40之一的多肽變體或權(quán)利要求46的藥物組合物在制備用于治療間質(zhì)性肺疾病的藥物中的用途。
49.權(quán)利要求48的用途，其中所述間質(zhì)性肺疾病是自發(fā)性肺纖維化。
50.治療或預(yù)防間質(zhì)性肺疾病的方法，所述方法包括對(duì)有需要的哺乳動(dòng)物，尤其人，施用有效量的權(quán)利要求1-40之一所述多肽變體或權(quán)利要求46所述藥物組合物。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述間質(zhì)性肺疾病是自發(fā)性肺疾病。
52.增加親本IFNG多肽的體內(nèi)N-糖基化程度的方法，所述親本IFNG多肽包含至少一個(gè)具有氨基酸序列N-X-S的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)，其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸殘基，所述方法包括將所述N-X-S氨基酸序列中的絲氨酸殘基用蘇氨酸殘基取代，以便獲得一種IFNG變體。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述親本IFNG多肽具有SEQ ID NO17所示氨基酸序列。
54.權(quán)利要求52的方法，其中所述親本IFNG多肽是SEQ ID NO17所示氨基酸序列的片段，它在C-末端截短了1-15個(gè)氨基酸殘基。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述片段具有選自SEQ ID NO19，SEQID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO31，SEQ ID NO32或SEQ ID NO33的氨基酸序列。
56.制備權(quán)利要求1-40之一的IFNG多肽變體的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)糖基化宿主細(xì)胞，該細(xì)胞含有編碼權(quán)利要求1-40之一所述IFNG多肽變體的核苷酸序列，所用培養(yǎng)條件有利于該多肽變體的表達(dá)；(b)任選使所述多肽變體與非多肽組分在有利于發(fā)生偶聯(lián)的條件下進(jìn)行體外反應(yīng)；和(c)回收所述多肽變體。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述方法包括(a)培養(yǎng)糖基化宿主細(xì)胞，該細(xì)胞含有編碼權(quán)利要求1-40之一所述IFNG多肽變體的核苷酸序列，所用培養(yǎng)條件有利于該多肽變體的表達(dá)；(b)使所述多肽變體與非多肽組分在有利于發(fā)生偶聯(lián)的條件下進(jìn)行體外反應(yīng)；和(c)回收所述多肽變體。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述變體由權(quán)利要求19-40之一限定。
59.權(quán)利要求56的方法，其中所述方法包括(a)培養(yǎng)糖基化宿主細(xì)胞，該細(xì)胞含有編碼權(quán)利要求1-40之一所述IFNG多肽變體的核苷酸序列，所用培養(yǎng)條件有利于該多肽變體的表達(dá)；和(b)回收所述多肽變體。
60.權(quán)利要求61的方法，其中所述多肽變體具有選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15或SEQID NO16的氨基酸序列。
61.權(quán)利要求59的方法，其中所述變體包含至少一個(gè)另外的修飾。
62.權(quán)利要求60的方法，其中所述變體由權(quán)利要求11-18之一或33-36之一限定。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有干擾素γ(IFNG)活性的新的干擾素γ多肽變體，其制備方法，含有該多肽變體的藥物組合物及其在疾病治療中的用途，尤其是在治療間質(zhì)性肺疾病，如自發(fā)性肺纖維化中的用途。這些新的多肽變體與huIFNG的氨基酸序列或其片段相比，全都包含S99T取代。該突變導(dǎo)致第97位的天然N－糖基化位點(diǎn)得到顯著更好的利用。優(yōu)選地，所述變體包含其它修飾，例如，當(dāng)皮下給藥時(shí)可增加所述變體的AUC。
文檔編號(hào)A61K47/34GK1537117SQ02807891
公開日2004年10月13日 申請(qǐng)日期2002年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月6日
發(fā)明者安妮·D·詹森, 安妮 D 詹森 申請(qǐng)人:馬克西根控股公司