專利名稱：乳中的osteoprotegerin的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可從乳源，特別是人乳和牛乳中獲得的osteoprotegerin。本發(fā)明還涉及其在制備可以食用的制劑和/或藥物組合物中的用途，特別是所述制劑/組合物在預(yù)防或治療與骨代謝和免疫功能相關(guān)的疾病中的用途。
在哺乳動物中，骨骼提供了對身體的支撐，并且由礦物質(zhì)、膠原蛋白和非膠原蛋白的基質(zhì)、和細胞成分組成。其生長和維持受多種不同因素的控制，包括其組成細胞類型的調(diào)控和相互作用，所述細胞類型即形成軟骨的軟骨細胞，合成并且沉積骨基質(zhì)的成骨細胞，以及負責骨物質(zhì)吸收的破骨細胞。
軟骨細胞源于間充質(zhì)細胞，并且產(chǎn)生軟骨內(nèi)骨形成所需要的起始軟骨模板。促進骨組織形成的成骨細胞源于間充質(zhì)骨祖細胞，并且位于骨表面，在這里它們合成、轉(zhuǎn)運并且排列所述基質(zhì)蛋白，另一方面，負責骨吸收的破骨細胞源于存在于造血骨髓中的粒細胞-單核細胞前體。破骨細胞和成骨細胞的作用是密切聯(lián)系的，例如，在破骨細胞介導的吸收過程中，所述蛋白因子專門起著信號傳導分子的作用，由破骨細胞啟動骨更新。相反，成骨細胞可以通過表達可溶性或膜結(jié)合調(diào)節(jié)劑影響破骨細胞功能。因此，正常骨重建取決于骨形成和骨吸收的相反功能之間的明確平衡，所述功能是由各種相應(yīng)的細胞類型產(chǎn)生的。
諸如成纖維細胞生長因子(FGF)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β的生長因子儲存在骨細胞外基質(zhì)中，并且能在分泌時刺激骨祖細胞的局部釋放。然后，諸如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)和甲狀旁腺素(PTH)的因子能影響所述祖細胞發(fā)育成成骨細胞，骨形成細胞、其最終分化和功能，是通過所述細胞與骨基質(zhì)蛋白的相互作用調(diào)控的。
在衰老期間，個體會經(jīng)歷骨質(zhì)的逐漸損失，這種現(xiàn)象被稱為解偶聯(lián)，它被認為是由于破骨細胞的活性超過了成骨細胞的活性所導致的。當這種解偶聯(lián)持續(xù)較長時間時，會有越來越多的骨物質(zhì)被破壞/吸收，這種狀況被稱為骨質(zhì)疏松結(jié)果。
除了取決于年齡的現(xiàn)象之外，骨損失還可能由鈣或激素缺乏引起，或由會導致多種不同疾病的狀況引起，如骨質(zhì)疏松癥、高鈣血癥、骨佩吉氏病，由于骨關(guān)節(jié)炎或類風濕關(guān)節(jié)炎或骨髓炎所導致的骨損失等。降低了的骨密度，通常會導致機械強度減弱，并且增加了骨折的可能性。
現(xiàn)有用于骨質(zhì)疏松和/或相關(guān)的骨疾病的方法包括給需要的個體服用鈣。最近，業(yè)已設(shè)計出用于治療上述疾病狀況的試劑，包括刺激和/或抑制骨細胞，如激素、降鈣素、胰島素樣生長因子或osteoprotegerin(OPG)。所述制劑通常是通過重組方法制備的，并且業(yè)已配制/制備成galenic形式，以便相應(yīng)的物質(zhì)能夠以活性形式達到靶，即骨骼。
WO 00/24771披露了編碼osteoprotegerin樣蛋白的核酸及其在諸如治療骨質(zhì)疏松方面的用途。這種多肽是通過重組方法合成的，然后進行配制，以便與希望的給藥途徑相容。推薦靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下、口服(例如吸入)、經(jīng)皮(局部)、經(jīng)粘膜和直腸內(nèi)給藥途徑。
一般，對于特定的物質(zhì)來說，要找到合適的galenic形式要花費很長時間并且是很煩瑣的，因為用于這一目的的成分必須與所述活性物質(zhì)相容，并且還必須提供對人體內(nèi)不同條件的足夠的保護作用。不過，由于刺激骨骼生長的試劑是局部合成的-骨組織內(nèi)/骨組織上-給予這種物質(zhì)是困難的。通常，必須設(shè)計出膠囊，它有助于使所述物質(zhì)通過胃腸道，而又不會受到胃腸道中占主導地位的不利環(huán)境條件的破壞。不過，這種給藥途徑還是具有某些缺陷，因為所述物質(zhì)必須通過肝臟，并且在體液中運輸然后才能達到骨骼。另外，它通常會導致較少數(shù)量的活性生物學物質(zhì)達到靶組織。
因此，本發(fā)明的問題是提供一種給予個體活性物質(zhì)的方法，以便所述物質(zhì)能在所述個體的特定靶組織中起作用。
因此，業(yè)已通過提供可通過乳獲得的osteoprotegerin解決了上述問題。
在附圖中，
圖1表示在哺乳期的不同階段，人乳中osteoprotegerin的濃度；圖2表示在還原條件下使用10％SDS-凝膠進行的人乳級份的蛋白印跡分析。用購自R&D Systems的生物素化的抗OPG多克隆抗體BAF805和鏈親和素-堿性磷酸酶(SAPP)顯示OPG帶；圖3表示整合到Y(jié)arrowia轉(zhuǎn)化體中的基因組DNA中的質(zhì)粒的限制圖譜；圖4表示人乳細胞和人乳腺上皮細胞MCF-7的RT-PCR分析；泳道1和2β-肌動蛋白(預(yù)期的帶大小460bp)；泳道3和4OPG(預(yù)期的帶大小603bp)；1.人乳細胞；2.MCF-7；3.人乳細胞；4.MCF-7；圖5表示一種實驗的結(jié)果，其中，本發(fā)明的OPG能抑制TRAIL-誘導的Jurkat細胞的凋亡。
Osteoprotegerin(OPG)又被稱為破骨細胞發(fā)生抑制因子(OCIF)和TNF-受體樣分子1(TR1)最近被報導為受體的腫瘤壞死因子家族(TNFR)的成員。它能在體外和體內(nèi)抑制破骨細胞發(fā)育，并且提高骨密度(骨硬化病)。在正常的小鼠胚胎中，業(yè)已將OPG定位于發(fā)育中骨骼的軟骨原基和小腸內(nèi)。
不過，與TNF受體家族的其他成員不同，OPG不具有跨膜結(jié)構(gòu)域。另外，還可以證實OPG也是細胞毒性配體TRAIL(TNF-相關(guān)的細胞凋亡誘導配體)的受體，并且與濾泡樹突細胞來源的受體-1相同。因此，推測它能調(diào)控細胞死亡，并且在淋巴樣組織的形成和免疫應(yīng)答調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。實際上，業(yè)已證實缺乏OPG的動物具有發(fā)育不足的淋巴組織。
在導致本發(fā)明的研究中，業(yè)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，除了在骨組織中存在osteoprotegerin之外，它還存在于人類乳中。其結(jié)果是，在哺乳期間，母親顯然以能夠在胃腸道中存活的形式給新生兒提供所述物質(zhì)。隨后發(fā)現(xiàn)，由乳腺細胞生產(chǎn)的OPG明顯不同于從其他來源分離的OPG，這些不同表現(xiàn)在其穩(wěn)定性和/或抗降解能力方面。
并不希望受任何理論的約束，目前認為，在乳腺細胞中所產(chǎn)生的對蛋白的特異的糖基化模式，使得所述多肽在遇到酸性胃液和/或在腸道中遇到的堿性環(huán)境中更穩(wěn)定，以便在腸道吸收和運輸?shù)焦墙M織時，所述活性結(jié)構(gòu)域保持完整，并且能夠發(fā)揮其生物學活性。
本發(fā)明的OPG，即可以從乳源中獲得的形式具有SEQ ID.No.1所示的多肽序列，并且分別具有大約80，130和200kDa的大小，其大小不同于通過重組方法獲得的大小(55kDa)。
本發(fā)明的OPG可以包含在可食用的制劑中，所述制劑可以是食品物質(zhì)，如乳、酸乳、凝乳、奶酪、發(fā)酵乳、乳基發(fā)酵食品、冰淇淋、谷基發(fā)酵食品、乳基粉末、嬰兒配方以及寵物食品。同樣，本發(fā)明的OPG還可以摻入腸道或藥物組合物中，例如，選自下列一組溶液、干燥的口服添加劑、液體口服添加劑、干燥的管裝飼料或液體管裝飼料。
實際上，由于本發(fā)明的OPG是穩(wěn)定的，沒有必要將所述活性化合物制成特定的galenic形式，以便避免它受到在胃腸道和體液中占主導地位的不同的和潛在的不利條件的破壞。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了來自乳的osteoprotegerin在制備可以食用的制劑中的用途，如制備食品物質(zhì)或腸道組合物或藥物組合物。
可以將本發(fā)明的osteoprotegerin和上文詳細說明的可食用制劑用于治療和/或預(yù)防骨重建疾病。
最常見的骨骼疾病是骨量減少，這是一種一般與骨量低于正常水平的任何疾病相關(guān)的狀況。這種狀況可能是由骨合成的速度降低或骨分解速度的提高或同時由這兩者所導致的。骨量減少的最常見的形式是原發(fā)性骨質(zhì)疏松，又被稱作絕經(jīng)后和老年骨質(zhì)疏松。這種形式的骨質(zhì)疏松是隨著年齡增加骨普遍損失的后果，并且通常是在具有正常的骨骼形成速度下，骨吸收速度增加的結(jié)果。另一種形式的骨質(zhì)疏松包括內(nèi)分泌骨質(zhì)疏松(甲狀腺機能亢進、甲狀旁腺機能亢進、柯興氏綜合征和肢端肥大癥)，遺傳性和先天性骨質(zhì)疏松(骨發(fā)育不全，高胱氨酸尿、Menkes′綜合征，和Riley-Day綜合征)和由于四肢固定而導致的骨質(zhì)疏松。
最近，業(yè)已認識到人群中的骨質(zhì)疏松同樣與動脈鈣化的高發(fā)病率相關(guān)，它是很多動脈粥樣硬化病變的一種成分。
因此，如上文所述的食品可以被很好地用于預(yù)防分別與骨量減少或骨質(zhì)疏松相關(guān)的癥狀和/或骨結(jié)構(gòu)變化的發(fā)生或減輕這種癥狀。可以理解的是，可以將所述活性物質(zhì)以足以實現(xiàn)所需生物學反應(yīng)的量添加到所述食品物質(zhì)中。由于業(yè)已發(fā)現(xiàn)OPG本身是母乳的一種成分，乳基產(chǎn)品本身就很好地適合將所述物質(zhì)輸送到人體。
在另一方面，為了分別治療嚴重的骨量減少或骨質(zhì)疏松病例，優(yōu)選方案可能是一種藥物組合物，該組合物包括較高含量的本發(fā)明的osteoprotegerin，該含量足以阻止或者甚至是逆轉(zhuǎn)有關(guān)疾病過程。所述組合物可以含有本發(fā)明的OPG作為唯一的活性成分，其優(yōu)點是沒有必要涉及所述物質(zhì)的主要配方。因此，在本發(fā)明范圍內(nèi)，可以簡單地壓制一種由任選補充了載體或香味劑的“OPG-粉末”組成的片劑，不過，當需要將本發(fā)明的OPG與其他活性物質(zhì)一起配制時，應(yīng)當考慮所述額外物質(zhì)的性質(zhì)以及在胃腸道中降解這些物質(zhì)的可靠性。以劑量單位形式配制的本發(fā)明的OPG，使得主治醫(yī)師能更好地控制所述活性化合物的每日或每周的劑量。
還可將本發(fā)明的osteoprotegerin用于預(yù)防骨佩吉氏病，骨髓炎，導致骨損失的骨感染性病變，高鈣血癥，骨壞死，由于骨關(guān)節(jié)炎或類風濕關(guān)節(jié)炎所導致的骨損失，牙周骨損失和/或溶骨性轉(zhuǎn)移的發(fā)生和/或治療所述疾病。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)OPG是腫瘤壞死因子相關(guān)配體(TRAIL)的一種受體，它在與其含有死亡結(jié)構(gòu)域的受體結(jié)合之后能誘導細胞凋亡。據(jù)推測它能調(diào)控細胞死亡，并且在淋巴組織形成和免疫應(yīng)答調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。另外，OPG是RANKL的引誘受體(NF-κB的受體激活物的配體)，業(yè)已報導它是激活的T細胞的產(chǎn)物。RANKL受體在成熟樹突細胞上的連接，能增強樹突細胞的存活，另外，RANKL與其受體的結(jié)合，能增強T-細胞生長和樹突細胞功能。
因此，本發(fā)明提供了可以從人和/或牛乳中獲得的osteoprotegerin在生產(chǎn)可食用制劑，如飲食組合物或腸道組合物，或生產(chǎn)藥物中的用途，所述可食用制劑和藥物分別用于導致免疫組織的正常發(fā)育，用于導致正常的免疫功能，甚至用于預(yù)防和/或治療免疫系統(tǒng)疾病。
本發(fā)明考慮的免疫系統(tǒng)疾病包括過敏、自身免疫、膿毒癥、癌癥、炎性腸病、系統(tǒng)性自身免疫狀況、心血管疾病和皮膚、口腔、胃腸道、泌尿生殖道或呼吸道的免疫病理學狀況。
另外，本發(fā)明的osteoprotegerin同樣可應(yīng)用于調(diào)控細胞增殖和凋亡，用于促進口腔耐受性，調(diào)節(jié)感染過程和新生兒的細菌集群。特別是對于新生兒來說，上述疾病可能在很大程度上與早產(chǎn)和/或低出生體重相關(guān)，因此，在這種情況下，可以通過嬰兒食品的方式給所述嬰兒簡單地服用osteoprotegerin。
可以理解的是，任何年齡的個體都可以成為接受治療的個體，不過，嬰兒和老年人是主要考慮對象，因為他們本身需要外源osteoprotegerin。特別是諸如新生兒的個體，其骨物質(zhì)和/或免疫系統(tǒng)的發(fā)育需要osteoprotegerin，因此，在這種情況下，可以有利地給予本發(fā)明的所述化合物和/或食品物質(zhì)和/或藥物組合物。
不過，應(yīng)當理解的是，本發(fā)明還可應(yīng)用于成年人，以便預(yù)防上述任何疾病的發(fā)生。還應(yīng)當理解的是，除了人之外，要治療的個體還可以是動物，如寵物，其中，將本發(fā)明的OPG摻入寵物食品。
本發(fā)明的OPG可以從乳源中獲得，所述乳源來自哺乳動物，特別是來自人或牛乳或初乳。人乳OPG具有380個氨基酸的氨基酸序列，與用作分子量標準的蛋白標記(BioRad)相比，其分子量大約為80、130和200kDa。它具有4個N-糖基化位點，并且能夠以單體形式存在，并且通過Cys379形成S-S鍵，從而形成二聚體。
本發(fā)明的OPG可以從諸如人或牛乳的乳源中分離。不過，應(yīng)當理解的是，本發(fā)明的OPG可以通過重組方法在合適的細胞中制備，產(chǎn)生存在于“乳-OPG”中的糖基化模式。用于表達的優(yōu)選細胞是乳腺細胞，因為預(yù)計這種細胞能產(chǎn)生相同的或基本上相同的糖基化模式。
適用于表達本發(fā)明OPG的合適的細胞，可以通過用合適的方法永生化而獲得，如SV40載體或端粒酶基因，并且用含有編碼OPG多肽的核苷酸序列的表達載體轉(zhuǎn)化。當感興趣的多肽是分泌的多肽時，可以通過從上清液中分離獲得這種多肽，或者通過收集所述細胞，并且從所述細胞中分離所述多肽。對于連續(xù)生產(chǎn)來說，優(yōu)選從上清液中分離。下面的實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不局限于這些實施例。
實施例人乳和人血清樣品在無菌條件下，通過吸乳泵或偶然通過人工擠壓從健康母親體內(nèi)采集人乳樣品(10-60ml)，直到產(chǎn)后17天。將所述人乳擠入無菌的50ml離心管中，并且在收集之后2小時內(nèi)處理，在離心(200×g，10分鐘)之后，馬上取出細胞沉淀，并且處理，以便提取RNA。其余的乳在-20℃下冷凍。人血清樣品是從健康供體獲得的，并且在-20℃下保存。
人乳的分級分離通過高速離心從全乳中提取乳脂。取出上層乳脂層，用水洗滌，并且將洗滌過的乳脂放在-20℃下保存直到使用。乳清和酪蛋白的分離是通過對脫脂乳進行粗制凝乳酶處理或化學酸化(用鹽酸)誘導酪蛋白凝固而實現(xiàn)的。對處理過的乳進行離心，然后分別從非溶解地的粗制凝乳酶酪蛋白中分離甜乳清，并且從酸性酪蛋白中分離酸性乳清。最后，通過超速離心制備可溶性乳蛋白(超速離心的乳清)和不可溶性膠束酪蛋白。在-20℃下冷凍所有酪蛋白和乳清級份，直到使用。
人乳腺細胞系MCf-7(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA.，HTB-22)是一種源于乳腺癌胸膜滲出液的人乳腺細胞系，它保留了分化的乳腺上皮細胞的若干特征。在添加了lO％胎牛血清(FCS，Amimed Bioconcept)的DMEM(Amimed Bioconcept，Allschwill，SwitZ6rland)中培養(yǎng)所述細胞，并且在37℃下，在含有5％ CO2的潮濕氣體中保持。每周更換2-3次培養(yǎng)基。在達到鋪滿之后，在37℃下，用胰蛋白酶/EDTA(GibcoBRL)分離細胞。然后制備所述細胞進行RNA提取。
蛋白印跡分析用Laemmli還原樣品緩沖液將乳樣品稀釋l/25倍，并且煮沸5分鐘。通過10％SDS-PAGE分離所述蛋白，并且轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(BioRad)上。用生物素化的多克隆抗人OPG(BAF805，O.2μg/ml；R&D systems)和鏈親和素堿性磷酸酶(Pieroe)探測所述印跡。用堿性磷酸酶底物BCIP/NBT(Zymed Laboratofies)觀察免疫反應(yīng)性。將預(yù)先染色的蛋白標記用作分子量標準物(BioRad)。將以25ng/泳道的用量加樣的重組人OPG(R&D systems)用作陽性對照。
通過人乳腺乳細胞和人乳腺上皮細胞表達OPG在逆轉(zhuǎn)錄之后接著進行PCR，在來自產(chǎn)后18天的單身母親的全人乳細胞群中，以及在人乳腺上皮細胞系MCF-7中擴增OPG轉(zhuǎn)錄物。通過Trizol方法(Gibco-BRL)從所述細胞中提取總RNA。簡單地講，將Trizol(5-10×106細胞使用lml)添加到細胞沉淀中，用移液管吸入和排出若干次，并且轉(zhuǎn)移到一個Eppendorf試管中。添加氯仿(每lml Trizol添加O.2m1)，并且將該試管溫育5分鐘，然后在4℃下以12,000×g的速度離心15分鐘。用等體積的異丙醇使RNA沉淀，并且以12,000×g的速度離心10分鐘。用70％的乙醇洗滌沉淀，然后重新懸浮在無菌的去離子水中。在-20℃下保存RNA直到使用。
用不含RNA酶的DNase I處理RNA樣品，以便消除基因組DNA的污染。通過在光譜儀中測定合適稀釋度(100-200倍)在260曲和280nm下的吸收值，對RNA進行定量。按以下方法計算RNA濃度(μg/ml)在A260×稀釋倍數(shù)×40mg/ml下的吸收值?；旧喜缓鞍椎目俁NA樣品的A260/A280的比值應(yīng)當為1.8-2.2。
用莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Perkin Elmer)對RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。將RNA樣品(0.5μg總RNA)，0.5個單位的RNA酶抑制劑，1mM每一種dNTP，0.5nmol/ml特異性3’引物，5mM MgCl2和1.25個單位的逆轉(zhuǎn)錄酶放入含有由生產(chǎn)商提供的酶緩沖液的總體積為10μl反應(yīng)混合物中溫育。在42℃下，將該反應(yīng)混合物溫育30分鐘，然后在95℃下加熱5分鐘。然后在熱循環(huán)儀(Biolabo，Scientific Instruments，ChatelSt Denis，Switzerland)上用Gold DNA聚合酶(Perkin Elmer)擴增所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在50μl的總體積中進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。在PCR緩沖液中使用10μl的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，2mM MgCl2，5μM每一種dNTP，0.2nmol/ml OPG-特異性反義ACTAGTTATAAGCAGCTTATTTTTACTG，和有義GGAGGCATTCTTCAGGTTTGCTG引物，和1.25個單位的DNA聚合酶。在95℃下進行10分鐘的最初變性步驟，然后通過在94℃下變性45秒，在60℃下退火1分鐘，并且在72℃下延伸1分30秒然后在72℃下進行7分鐘的延伸，共進行35輪，以便擴增樣品。用β-肌動蛋白作為陽性對照對所有樣品進行RT-PCR。將RT-PCR產(chǎn)物的樣品加樣到用1×TAE緩沖液配制的1.2％的瓊脂糖凝膠(含有溴化乙錠)上，并且通過在150伏電壓下電泳1小時分離。在UV光下觀察RT-PCR產(chǎn)物。通過與DNA大小標記(Boehringer Mannheim)比較，確定所述帶的正確大小。
人OPG的ELI SA-(夾心酶免疫測定)通過ELISA測定存在于乳和不同乳級份中OPG的濃度。為此，通過在4℃下溫育過夜，將抗OPG的單克隆抗體(MAB805，1μg/ml；R&DSystems，UK)包被到96孔平板(Nunc)上。然后用由PBS配制的0.05％的Tween-20洗滌平板2次。通過在室溫下用由PBS配制的2％的牛血清白蛋白(BSA)將所述平板再溫育2小時抑制非特異性結(jié)合。在室溫下，在PBS-BSA中將樣品或標準濃度的重組OPG(0.119-121.5ng/ml；R&DSystems)溫育3小時。然后用PBS-Tween洗滌平板4次，然后添加生物素標記過的抗人OPG多克隆抗體(BAF805，0.5μg/ml；R&D Systems)，在室溫下再溫育1小時。再經(jīng)過4次洗滌之后，添加鏈親和素-過氧化物酶(SAAP，0.5μg/ml，Kirkegaard ％ Perry KPL)在室溫下溫育1小時。洗滌平板4次，并且添加底物TMB過氧化物酶(KPL)。覆蓋平板，并且遮光溫育5分鐘。通過添加1N HCl終止所述酶促反應(yīng)。在450nm下用ELISA讀數(shù)器(Dynex Technologies)讀出吸光度。檢測限為大約30pg/ml。
人乳OPG的生物學活性O(shè)PG是腫瘤壞死因子相關(guān)配體的受體(TRAIL)，它在與它的含有死亡結(jié)構(gòu)域的受體DR4和DR5結(jié)合之后，能誘導細胞凋亡。開發(fā)了一種生物測定方法，其中，可以測定人乳OPG阻斷TRAIL-誘導的所述細胞的凋亡的能力。
就此而言，將Jurkat細胞、克隆E6-1(ATCC)維持在由供應(yīng)商ATCC改進的含有10％ FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中(37℃，5％ CO2)。以5×104細胞/孔的密度將細胞接種到96孔平板(Nunc)上。在存在2μg/ml增強蛋白的條件下向每一個孔中添加各種濃度的可溶性重組人TRAIL(0-20ng/ml)，所述增強子蛋白是一種抗體，它能與可溶性重組人TRAIL反應(yīng)，并因此增強其活性(Alexis，Laufelfingen，CH)。某些孔還裝有50ng/ml重組人OPG(R&D Systems)，人乳樣品(HM；1/80最終稀釋度；在產(chǎn)后第一天或第九天采集)，和/或20μg/ml抗-OPG單克隆抗體(MAB805，R&DSystems)。在37℃下溫育平板16小時。在培養(yǎng)的最后6小時，通過添加3H-胸苷(1μCi/孔)測定細胞存活力。
在培養(yǎng)基對照中，在超過5ng/ml的濃度下觀察到了TRAIL-誘導的細胞增殖的抑制。不過，HM樣品能阻止這種抑制作用。這種作用顯然是由于OPG的存在所導致的，因為抗OPG單克隆抗體能逆轉(zhuǎn)這種作用。
結(jié)果如圖5所示蛋白印跡分析OPG在細胞中是以55kDa的單體形式合成的，不過，在分泌到細胞外之后，轉(zhuǎn)化成大約110kDa的二硫鍵連接的二聚體。在乳中，檢測到大約80，130和200kDa的帶。
人乳中的OPG濃度通過ELISA檢查了在哺乳的前17天的不同時間，10位哺乳母親的乳樣品中的OPG含量。在哺乳的前1-3天，其濃度提高到最大值，然后降低。OPG在乳中的濃度為大約50ng/ml-大約2μg/ml(圖1)。
乳OPG的細胞來源
RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的OPG可能存在于人乳細胞和乳腺上皮細胞中。在兩種類型的未處理過的細胞中證實了OPG mRNA的組成型表達(圖4)。
將人乳OPG克隆到酵母中通過離心(200×g，10分鐘)從人乳(產(chǎn)后18天)中分離細胞。用TRIzol(Life Technologies，Basel，Switzerland)從所述細胞沉淀中提取總RNA，用DNAseI處理，并且按照生產(chǎn)商推薦的方法在RNeasy旋轉(zhuǎn)柱(Qiagen，Basel)上進一步純化。按照生產(chǎn)商提供的方法(RocheDiagnostics，Rotkreuz)，使用TitanTMOne試管RT-PCR系統(tǒng)，由該總RNA擴增編碼成熟形式的OPG的PCR產(chǎn)物。
使用OPG特異性反義引物CCGGCCTCTTCGGCCGCCAAGCGAGAAACGTTTCCTCCAAAGTACC，和有義引物ACTAGTTATAAGCAGCTTATTTTTACTG，由該cDNA擴增了一個1174bp PCR片段。對該PCR產(chǎn)物進行SfiI-SpeI消化，凝膠純化，并且將所得到的1156bp片段連接到SfiI-XbaI消化過的和SAP-處理過的pINA1267上，形成pNFF270。然后通過轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pNFF270導入酵母Yarrowia lipolytica中。圖3表示整合到Y(jié)arrowia轉(zhuǎn)化體的基因組DNA中的所述質(zhì)粒的限制圖譜，而SEQ ID.No.1表示由該OPG質(zhì)粒編碼的蛋白。
pGEM-T OPG克隆的序列如圖6所示。成熟的OPG用黑體表示，并且翻譯。在公開的OPG/OCIF序列上，成熟OPG的242號氨基酸殘基是Ala-殘基(A)，而分析過的所有pGEM-T OPG克隆編碼位于該位置上的Asp-殘基(D)。將該克隆的SfiI-SpeI OPG片段轉(zhuǎn)移到SfiI-XbaI消化過的pINA1267上。所得到的質(zhì)粒具有圖3所示的限制圖譜。將單拷貝的該質(zhì)粒整合到Y(jié)arrowia轉(zhuǎn)化體的基因組DNA上。在圖4中示出了由該質(zhì)粒編碼的蛋白。成熟的OPG用粗體字母表示。通過轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pNFF270導入Yarrowia lipolytica中。所得到的轉(zhuǎn)化體能將一種與OPG-特異性抗體交叉反應(yīng)的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，而具有空的表達載體的Y.lipolytica轉(zhuǎn)化體不能分泌這種蛋白。
權(quán)利要求
1.可以從人或牛乳或初乳中獲得的osteoprotegerin。
2.如權(quán)利要求1的osteoprotegerin，其中，所述osteoprotegerin具有能產(chǎn)生具有大約80，130和200kDa的分子量的多肽的糖基化模式。
3.一種食品物質(zhì)，含有如權(quán)利要求1或2中任意一項的osteoprotegerin。
4.選自下列一組的食品物質(zhì)乳、酸乳、凝乳、奶酪、發(fā)酵乳、乳基發(fā)酵制品、冰淇淋、谷基發(fā)酵制品、乳基粉末、嬰兒配方和寵物食品。
5.一種腸道組合物或藥物組合物，含有權(quán)利要求1或2中任意一項的osteoprotegerin。
6.如權(quán)利要求5的腸道或藥物組合物，該組合物選自下列一組溶液、干燥的口服添加劑、液體口服添加劑、干燥的管裝飼料或液體管裝飼料。
7.權(quán)利要求1或2的osteoprotegerin在生產(chǎn)可以食用的制劑中的用途。
8.如權(quán)利要求7的用途，其中，所述可以食用的制劑是權(quán)利要求3或4的食品物質(zhì)或權(quán)利要求5或6的組合物。
9.權(quán)利要求1或2的osteoprotegerin在制備用于治療與骨重建相關(guān)的疾病的如權(quán)利要求3-6中任意一項的物質(zhì)或組合物中的用途。
10.如權(quán)利要求9的用途，其中，所述疾病是骨質(zhì)疏松癥、骨佩吉氏病、骨髓炎、導致骨損失的骨感染性病變、高鈣血癥、骨量減少、骨壞死、由骨關(guān)節(jié)炎或類風濕關(guān)節(jié)炎導致的骨損失、牙周骨損失和/或溶骨性轉(zhuǎn)移。
11.權(quán)利要求1或2的osteoprotegerin在制備用于治療和/或預(yù)防免疫疾病的如權(quán)利要求3-6中任意一項的物質(zhì)或組合物中的用途。
12.如權(quán)利要求11的用途，其中，所述疾病是過敏、自身免疫、炎性腸病、系統(tǒng)性自身免疫狀況、細胞增殖和細胞凋亡失調(diào)以及皮膚、口腔、胃腸道、泌尿生殖道或呼吸道的免疫病理學狀況。
13.如權(quán)利要求9-12中任意一項的用途，其中，所述疾病與早產(chǎn)和/或低出生體重相關(guān)。
14.權(quán)利要求1或2的osteoprotegerin在制備用于骨物質(zhì)和/或免疫系統(tǒng)發(fā)育的如權(quán)利要求3-6中任意一項的物質(zhì)或組合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及可從乳源，特別是人乳和牛乳中獲得的osteoprotegerin。本發(fā)明還涉及所述成分在制備可以食用的制劑和/或藥物組合物中的用途，特別是所述制劑/組合物在預(yù)防或治療與骨代謝和免疫功能相關(guān)的疾病中的用途。
文檔編號A61P37/08GK1500096SQ02807864
公開日2004年5月26日 申請日期2002年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月3日
發(fā)明者K·維達爾, K 維達爾, P·范登布羅克, 遣悸蘅, ５驢ㄎ, E·奧福德卡文, A·東內(nèi)特－胡格斯, 諤 胡格斯 申請人:雀巢制品公司