人參皂甙Re作為制備治療記憶障礙的藥物中的應(yīng)用的制作方法

專利名稱：人參皂甙Re作為制備治療記憶障礙的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人參皂甙Re作為制備治療記憶障礙的藥物中的應(yīng)用，具體地，本發(fā)明所述的人參皂甙Re不但能改善化學(xué)藥物(東莨菪堿等)所致記憶障礙，而且具有改善自然衰老，Aβ等所致記憶障礙以及增強(qiáng)基礎(chǔ)突觸傳遞、促進(jìn)LTP形成的作用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)公開(kāi)了部分類型的人參皂苷的藥物用途，例如CN99122651公開(kāi)了“擬人參皂苷F11的醫(yī)藥用途，該文獻(xiàn)指出，擬人參皂苷F11能顯著地抑制嗎啡引起的記憶障礙并具有較強(qiáng)的改善正常動(dòng)物和藥物所致的動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶障礙作用。
CN98102890公開(kāi)了“人參皂甙Re的提取工藝及其新的藥物用途，該文獻(xiàn)指出，人參皂甙Re在制備治療心率不齊、心肌缺血和再灌損傷藥物中有著廣泛的應(yīng)用。
CN98103433公開(kāi)了“20(S)-人參皂甙Rg3的半合成方法及其藥物用途”，該文獻(xiàn)指出，20(S)-人參皂甙Rg3特別適合在制備治療肺癌、黑色素瘤、S180肉瘤、結(jié)腸癌及抗病毒的藥物中應(yīng)用。
CN99814933公開(kāi)了“含有人參皂甙Rb1的腦細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑”，該文獻(xiàn)指出，施用人參皂甙Rb1或其鹽作為細(xì)胞保護(hù)劑的制劑特別適用于治療、預(yù)防或處理腦和神經(jīng)疾病。
CN01102117公開(kāi)了“人參皂甙Rg2在制備治療心、腦血管疾病藥物中的應(yīng)用”，該文獻(xiàn)指出，從人參莖葉中提取分離的人參皂甙Rg2對(duì)多種休克、心衰、心肌缺血及腦缺血有明顯的治療作用，其作用優(yōu)于已知的參麥注射液；用于治療休克、心衰、冠心病、腦梗塞及老年性癡呆等疾病。
但是，以上這些公開(kāi)文獻(xiàn)都沒(méi)有具體涉及到本發(fā)明所述的適應(yīng)癥或僅僅提出概念而沒(méi)有具體的實(shí)驗(yàn)參數(shù)和效果參數(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于實(shí)現(xiàn)人參皂甙Re在藥物上的應(yīng)用，具體地講，本發(fā)明的目的在于實(shí)現(xiàn)人參皂甙Re在制備改善自然衰老、Aβ等所致記憶障礙以及增強(qiáng)基礎(chǔ)突觸傳遞、促進(jìn)LTP形成的藥物上的應(yīng)用。
由于人參皂甙Re的提取工藝和其他的一些藥物用途在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)公開(kāi)，而本發(fā)明的主要技術(shù)內(nèi)容是驗(yàn)證人參皂甙Re在本發(fā)明所述的適應(yīng)癥上的效果，因此，本發(fā)明的人參皂甙Re的提取工藝可參見(jiàn)CN98102890所公開(kāi)的內(nèi)容。本發(fā)明采用國(guó)際上常用的多種行為學(xué)方法和電生理方法，分別在成年、老年大鼠及多種記憶障礙模型上觀察了人參皂甙Re的改善記憶作用，同時(shí)采用電生理學(xué)方法觀察了Re對(duì)突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的作用，具體可見(jiàn)以下的實(shí)施例，通過(guò)實(shí)施例，可以進(jìn)一步的理解本發(fā)明。


附圖1是本發(fā)明中使用的小鼠水迷宮裝置的示意圖。
通過(guò)說(shuō)明書(shū)附圖并結(jié)合本發(fā)明的具體內(nèi)容，可以清楚地理解本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本實(shí)施例涉及的是人參皂甙Re促進(jìn)自然衰老的小鼠和大鼠學(xué)習(xí)記憶作用的研究。
(1)人參皂甙Re在小鼠水迷宮中對(duì)抗自然衰老引起的記憶獲得障礙的作用取SPF昆明種老年雄性小鼠64只，體重50±2g，隨機(jī)分5組，正常老年對(duì)照組，人參皂甙Re組(12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg)，腦復(fù)康組(500mg/kg)，并加一SPF昆明種小鼠正常年青對(duì)照組。正常老年和年青對(duì)照組灌服水。其余經(jīng)口灌服給藥，給藥第11天到第15天進(jìn)行小鼠水迷宮訓(xùn)練，迷宮的示意圖參見(jiàn)附圖1。
由附圖1可見(jiàn)，水迷宮由一黑色有機(jī)玻璃長(zhǎng)方體水槽(73×42×20cm)組成，其中有若干隔板組成迷宮；其中1、2、3、4為盲端，迷宮的一角有一組臺(tái)階為終點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，迷宮中要灌水，水深10cm，水溫24±1℃。
在訓(xùn)練第一天用隔板將A點(diǎn)與B點(diǎn)的通道阻斷，小鼠首先被置于臺(tái)階上10秒，使其了解此安全區(qū)域的存在，然后將小鼠放于起點(diǎn)A，讓其自由游泳，記錄其進(jìn)入盲端1的次數(shù)(即錯(cuò)誤次數(shù))以及爬上安全臺(tái)階的時(shí)間(即潛伏期)，如果在訓(xùn)練時(shí)間2min內(nèi)尚未找到臺(tái)階者，將會(huì)被引導(dǎo)到安全臺(tái)階處，其潛伏期被記為2min。第一次訓(xùn)練后休息片刻按同樣方法訓(xùn)練第二次。依次訓(xùn)練其它小鼠。
在訓(xùn)練的第二天，將隔板置于B點(diǎn)，小鼠的游泳起點(diǎn)為B點(diǎn)，分別記錄2min內(nèi)小鼠進(jìn)入盲端1、2、3的錯(cuò)誤次數(shù)，爬上安全臺(tái)階的潛伏期，每只小鼠連續(xù)訓(xùn)練2次。如果在2min內(nèi)找不到臺(tái)階者，將被引導(dǎo)到終點(diǎn)，其潛伏期被記為2min。
訓(xùn)練第三到四天小鼠的游泳起點(diǎn)為C點(diǎn)，記錄2min內(nèi)小鼠進(jìn)入盲端1、2、3、4的錯(cuò)誤次數(shù)和找到安全臺(tái)階的潛伏期每只小鼠連續(xù)訓(xùn)練二次。
表1人參皂甙Re在小鼠水迷宮中對(duì)抗自然衰老引起的記憶獲得障礙的作用

(2)人參皂甙Re在小鼠避暗實(shí)驗(yàn)中對(duì)抗自然衰老引起的記憶獲得障礙的作用取SPF昆明種老年小鼠64只，體重50±2g，雄性，隨機(jī)分5組，正常老年對(duì)照組，人參皂甙Re組(12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg)，腦復(fù)康組(500mg/kg)，并加一正常年青對(duì)照組。正常老年和年青對(duì)照組灌服水。其余經(jīng)口灌服給藥，給藥第16和第17天進(jìn)行小鼠避暗訓(xùn)練。
實(shí)驗(yàn)裝置為一條件反射箱，分為明暗兩部分，兩室中有一小孔洞使小鼠可自由通行，箱底有銅柵，其中暗室底部的銅柵通以36V電壓。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠放入明室并背向暗室，因小鼠有喜暗及鉆洞的習(xí)性，所以在實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練期間會(huì)多次鉆入暗室，當(dāng)小鼠一走入暗室四足接觸銅柵時(shí)就會(huì)受到電擊，此行為即為錯(cuò)誤，其正常反應(yīng)為馬上設(shè)法退出暗室。第一天訓(xùn)練時(shí)，記錄小鼠在3分鐘內(nèi)進(jìn)入暗室的次數(shù)及第一次進(jìn)入暗箱的時(shí)間。24小時(shí)后再做實(shí)驗(yàn)，觀察5分鐘內(nèi)小鼠首次進(jìn)入暗箱的時(shí)間即潛伏期，小鼠進(jìn)入暗箱的次數(shù)即錯(cuò)誤次數(shù)。
從表2可見(jiàn)，低中高劑量的人參皂甙Re在潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)方面均有顯著性差異，以高劑量的人參皂甙Re更為顯著。
表2人參皂甙Re在小鼠避暗實(shí)驗(yàn)中對(duì)抗自然衰老引起的記憶獲得障礙的作用

(3)人參皂甙Re在大鼠Morris水迷宮測(cè)試中對(duì)抗自然衰老引起的記憶獲得障礙的作用取SD老年大鼠雄性56只，左右隨機(jī)分5組，正常老年對(duì)照組，人參皂甙Re組(6.25mg/kg、12.5mg/kg和25mg/kg)，腦復(fù)康組(250mg/kg)，并加一正常年青對(duì)照組。正常老年和年青對(duì)照組灌服水。其余經(jīng)口灌服給藥，給藥第15天到第19天進(jìn)行大鼠水迷宮訓(xùn)練。
Morris水迷宮主要由一不銹鋼制成的園柱形水池和一可移動(dòng)位置的平臺(tái)組成。水池上空通過(guò)一攝像機(jī)與監(jiān)視器和計(jì)算機(jī)相連接。當(dāng)設(shè)定的訓(xùn)練時(shí)間已到或動(dòng)物已爬上平臺(tái)，計(jì)算機(jī)停止跟蹤或停止記錄，并記錄下游泳軌跡和自動(dòng)計(jì)算出動(dòng)物在水池中所游過(guò)的路程，找到平臺(tái)所需的時(shí)間(即潛伏期)及初始角度(入水瞬間大鼠身體長(zhǎng)軸與入水點(diǎn)平臺(tái)連線之間的夾角)。
預(yù)先在水池里注入清水，然后加入溶有1kg新鮮奶粉的水溶液，使池水成為不透明的乳白色，再注入清水使水面高出平臺(tái)1cm，水濕控制在24±0.5℃，平臺(tái)置于某一象限的中間，在其它三個(gè)象限中任選一入水點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)每天訓(xùn)練二次，每次采用不同的入水點(diǎn)，每次訓(xùn)練1min的方案。若動(dòng)物在1min之內(nèi)尚未找到平臺(tái)，則將動(dòng)物拿到平臺(tái)上并使它在上面停留15s，若大鼠在1min之內(nèi)找到平臺(tái)，也讓其在平臺(tái)停留15s，方結(jié)束一次訓(xùn)練。如此訓(xùn)練五天，分別記錄每只動(dòng)物的潛伏期，游過(guò)的路程。在訓(xùn)練的最后一天，將平臺(tái)移走，每只大鼠只游1min，分別用秒表記錄每只大鼠第一次經(jīng)過(guò)平臺(tái)的時(shí)間一也即潛伏期，并可記錄每只大鼠在1min內(nèi)經(jīng)過(guò)平臺(tái)的次數(shù)以及在平臺(tái)所在象限(第一象限)內(nèi)逗留的時(shí)間，如果某只大鼠的潛伏期越短而后兩個(gè)指標(biāo)越大，則說(shuō)明這只大鼠越聰明。
表3人參皂甙Re在大鼠Morris水迷宮測(cè)試前五天中對(duì)抗自然衰老引起的記憶獲得障礙的作用

表4人參皂甙Re在大鼠Morris水迷宮測(cè)試第八天對(duì)抗自然衰老引起的記憶獲得障礙的作用

潛伏期#這里實(shí)際記錄的是撤平臺(tái)后大鼠在1min內(nèi)第一次游過(guò)平臺(tái)位置的時(shí)間，也就相當(dāng)于訓(xùn)練前五天的潛伏期。
第一象限時(shí)間##是指大鼠游泳時(shí)在第一象限中停留的時(shí)間總和，也就是在第一象限停留時(shí)問(wèn)占總時(shí)間的比率。
在以上的大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)中，老年大鼠與青年大鼠相比在訓(xùn)練的第二天至最后一天在潛伏期方面，第二和第三天的游泳路程方面，在訓(xùn)練的第三天與最后一天在初始角度方面以及在訓(xùn)練的最后一天的過(guò)臺(tái)次數(shù)方面均有顯著性差異，說(shuō)明此老年大鼠模型成立。腦復(fù)康組在訓(xùn)練的第三天與最后一天，高劑量的Re在訓(xùn)練的第四和第五天在潛伏期方面，腦復(fù)康組和高劑量的Re組在訓(xùn)練的第三天在游泳路程方面以及在初始角度方面，高劑量的Re在訓(xùn)練的最后一天在第一象限停留時(shí)間方面，中劑量的Re在訓(xùn)練的最后一天在潛伏期和過(guò)臺(tái)次數(shù)方面與老年大鼠相比均有顯著性差異。
實(shí)施例2本實(shí)施例涉及的是人參皂甙Re對(duì)Aβ25-35引起大鼠空間辨別障礙的改善作用。
老年癡呆以老年斑的沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成和神經(jīng)元丟失為主要病理學(xué)特征并以記憶、認(rèn)知功能障礙為主要的臨床表現(xiàn)。β-淀粉樣肽(β-amyloid peptide，Aβ)(由1-40個(gè)氨基酸組成)是老年斑的一個(gè)重要的組成成分，具有直接的神經(jīng)毒性作用。由Aβ中的第25到35這11個(gè)氨基酸組成的肽鏈Aβ25-35也具有凝聚能力和神經(jīng)毒性，我們利用側(cè)腦室注射凝聚態(tài)的Aβ25-35造成空間學(xué)習(xí)記憶障礙并觀察人參皂甙Re的改善作用。
雄性Wistar大鼠體重200g±，Aβ25-35購(gòu)自Sigma公司，凝聚態(tài)的Aβ25-35的制備是將1mg的Aβ25-35溶于3.14ml滅菌的蒸餾水中，終濃度3mmol.L-1(15mmol/5μl)密封后置37℃培養(yǎng)箱中120h。
將48只大鼠分成四組，即手術(shù)對(duì)照組，模型組，25mg/kg Re組，12.5mg/kg Re組，動(dòng)物以水合氯醛(150mg/kg)或?yàn)趵?750mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于立體定位儀上，剃毛并以75％灑精消毒皮膚后沿前后方向正中剪開(kāi)顱頂皮膚約2cm，小心剝離皮下組織及骨膜，充分暴露顱骨，以電鉆在定位坐標(biāo)為A0.8，L1.8的位置，在右側(cè)顱骨鉆一直徑1.5mm的小孔，清除骨屑后以尖頭鑷子小心挑破硬腦膜，隨后在立體定位儀引導(dǎo)下，將外徑0.8mm的小鋼管插入腦室，將5μl Aβ25-35或等量無(wú)菌蒸餾水(對(duì)照)緩慢(3min)注入側(cè)腦室2min后抽出小鋼管并在小孔周圍顱骨上酒少量青霉素粉，迅速縫合皮膚，術(shù)后次日開(kāi)始每天灌胃一次，連續(xù)給藥14天后進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練，共訓(xùn)練5天，其中第5天撤去平臺(tái)記錄動(dòng)物找到平臺(tái)所需時(shí)間即潛伏期及撤去平臺(tái)后動(dòng)物在原放置平臺(tái)的象限內(nèi)停留的時(shí)間以及到達(dá)平臺(tái)所采取的策略(直線式、趨向式、邊緣式、隨機(jī)式)。
Morris水迷宮裝置及測(cè)試參見(jiàn)實(shí)施例1。
表5人參皂甙Re在Morris水迷宮試驗(yàn)中對(duì)Aβ25-35所致空間辨別障礙的改善作用

第5天測(cè)定結(jié)果表示撤去平臺(tái)后動(dòng)物在原放置平臺(tái)象限內(nèi)停留時(shí)間。
實(shí)施例3本實(shí)施例涉及人參皂甙Re在小鼠避暗實(shí)驗(yàn)、小鼠水迷宮、Morris水迷宮測(cè)試中對(duì)抗東莨菪堿引起的記憶獲得障礙的作用。
人參皂甙Re在小鼠避暗實(shí)驗(yàn)中對(duì)抗東莨菪堿引起的記憶獲得障礙的作用如下，取SPF昆明種小鼠72只，體重20±2g，雄性，隨機(jī)分6組，正常對(duì)照組，東莨菪堿模型組，腦復(fù)康組，人參皂甙Re組(12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg)，經(jīng)口灌服給藥9天，正常對(duì)照組和東莨菪堿模型組灌服水，給藥第9和第10天進(jìn)行小鼠避暗訓(xùn)練。所采用的測(cè)試方法同前。
參見(jiàn)表6，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，腦復(fù)康和人參皂甙Re在小鼠避暗實(shí)驗(yàn)中都具有對(duì)抗東莨菪堿引起的記憶獲得障礙的作用，其中以中劑量組的作用更為顯著。
表6人參皂甙Re在小鼠避暗實(shí)驗(yàn)中對(duì)抗東莨菪堿引起的記憶獲得障礙的作用(n＝12)


與東莨菪堿模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01人參皂甙Re在小鼠水迷宮中對(duì)抗東莨菪堿引起的記憶獲得障礙的作用具體如下取SPF昆明種小鼠72只，體重20±2g，雄性，隨機(jī)分6組，正常對(duì)照組，東莨菪堿模型組，腦復(fù)康組，人參皂甙Re組(25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg)，經(jīng)口灌服給藥17天，正常對(duì)照組和東莨菪堿模型組灌服水。給藥第14天到第18天進(jìn)行小鼠水迷宮訓(xùn)練。除了正常對(duì)照組外的其余五組在訓(xùn)練的前四天中每天在訓(xùn)練前20min腹腔注射東莨菪堿(5mg/kg)，在訓(xùn)練的五天前所有動(dòng)物均不注射東莨菪堿。測(cè)試方法同前。
訓(xùn)練第三到五天小鼠的游泳起點(diǎn)為C點(diǎn)，記錄2min內(nèi)小鼠進(jìn)入盲端1、2、3、4的錯(cuò)誤次數(shù)和找到安全臺(tái)階的潛伏期每只小鼠訓(xùn)練2次。
從表7中可以看出，在訓(xùn)練的第四天只有正常對(duì)照組與東莨菪堿模型組在潛伏期及錯(cuò)誤次數(shù)方面有顯著差異，腦復(fù)康組與模型組相比只在潛伏期方面有差異。在訓(xùn)練的第五天正常對(duì)照組和腦復(fù)康組與東莨菪堿模型組在潛伏期及錯(cuò)誤次數(shù)方面有顯著差異，而與東莨菪堿模型組相比人參皂甙低劑量組在潛伏期及錯(cuò)誤次數(shù)方面，中劑量組在潛伏期方面都有差異，可見(jiàn)正常對(duì)照組、腦復(fù)康組和人參皂甙低、中兩個(gè)劑量組(25，50mg/kg)在小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)中有對(duì)抗東莨菪堿所造成的記憶障礙的作用。
表7人參皂甙Re在小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)中對(duì)抗東莨菪堿引起的記憶獲得障礙的作用(n＝12)


與東莨菪堿模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01Morris水迷宮測(cè)試，具體如下取SPF昆明種小鼠72只，體重20±2g，雄性，隨機(jī)分6組，正常對(duì)照組，東莨菪堿模型組，腦復(fù)康組，人參皂甙Re組(25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg)，經(jīng)口灌服給藥17天，正常對(duì)照組和東莨菪堿模型組灌服水，給藥第14天到第18天進(jìn)行小鼠水迷宮訓(xùn)練。除了正常對(duì)照組外的其余五組在訓(xùn)練的前四天中每天在訓(xùn)練前20min腹腔注射東莨菪堿(5mg/kg)，在訓(xùn)練的前五天所有動(dòng)物均不注射東莨菪堿。測(cè)試方法同前。
從表8中可以看出，在訓(xùn)練的第四天只有正常對(duì)照組與東莨菪堿模型組在潛伏期及找臺(tái)路程方面有顯著差異，人參皂甙Re低劑量組與模型組相比只在潛伏期方面有差異的趨勢(shì)。在訓(xùn)練的第五天正常對(duì)照組與東莨菪堿模型組相比在潛伏期及找臺(tái)路程方面有差異，而人參皂甙Re高劑量組在潛伏期方面與東莨菪堿模型組相比有差異，可見(jiàn)正常對(duì)照組和人參皂甙高劑量組在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中有一定的對(duì)抗東莨菪堿所造成的記憶障礙的作用。
表8人參皂甙Re在小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中對(duì)抗東莨菪堿引起的記憶獲得障礙的作用(n＝12)

與東莨菪堿模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01從本實(shí)施例3可以得出如下結(jié)論小鼠經(jīng)口灌服人參皂甙Re低劑量(12.5mg/kg)，中劑量(25mg/kg)和高劑量(50mg/kg)，在小鼠避暗實(shí)驗(yàn)中能明顯對(duì)抗東莨菪堿引起的記憶獲得障礙；在小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)中25，50mg/kg劑量的人參皂甙Re有對(duì)抗東莨菪堿引起的記憶獲得障礙的作用，在小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)中，50mg/kg劑量的人參皂甙Re可能有對(duì)抗東莨菪堿引起的記憶獲得障礙的作用。
實(shí)施例4本實(shí)施例涉及的是人參皂甙Re對(duì)小鼠暫時(shí)性腦缺血引起記憶障礙的作用，具體如下取昆明種小鼠雄性，體重18-22克，動(dòng)物稱重后，戊巴比妥納60mg/kg腹腔注射麻醉，進(jìn)行手術(shù)。術(shù)后24小時(shí)將動(dòng)物隨機(jī)分成5組，分別灌胃給予Re，劑量6.25，12.5，25mg/kg體重。對(duì)照組和模型組給予溶劑。此后，每日給藥一次至行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)束。術(shù)后48小時(shí)后完全阻斷兩側(cè)頸總動(dòng)脈，于動(dòng)物出現(xiàn)翻正反射消失后恢復(fù)血供。24小時(shí)后進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。
暫時(shí)性腦缺血模型制備動(dòng)物麻醉后取仰臥位。頸部正中剪開(kāi)皮膚約7mm，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈，于左側(cè)動(dòng)脈下置0號(hào)白絲線，右側(cè)動(dòng)脈下置0號(hào)黑絲線，供阻斷血流用。各線兩端燕齊，將四終端通過(guò)一段長(zhǎng)約5mm PE50塑料管。由頸背部正中穿出皮膚，塑料管埋于皮膚內(nèi)。用另一黑色絲線穿過(guò)黑白兩線套住血管的環(huán)部，該線的兩端由頸下部切口處引出皮膚，縫合切口。缺血時(shí)用一鑷子輕按頸背部皮膚，拉緊黑白四根線終端，并以動(dòng)脈夾將四線與皮膚固定，造成大腦缺血狀態(tài)。缺血結(jié)束，松開(kāi)動(dòng)脈夾，輕拉頸下引線，即可使頸動(dòng)脈完全恢復(fù)血液再灌注。
避暗實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前將小鼠置于避暗箱內(nèi)適應(yīng)3min。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠面部背向洞口放入明室，動(dòng)物穿過(guò)洞口進(jìn)入暗室受到電擊，1分鐘后取出小鼠。24小時(shí)后重作測(cè)驗(yàn)，記錄進(jìn)入暗室動(dòng)物的潛伏期和5min內(nèi)的電擊次數(shù)。
水迷宮實(shí)驗(yàn) 記錄動(dòng)物從起步區(qū)到達(dá)目標(biāo)區(qū)所須時(shí)間以及在這段時(shí)間內(nèi)動(dòng)物進(jìn)入盲端的錯(cuò)誤次數(shù)，以這兩項(xiàng)指標(biāo)作為學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)。動(dòng)物每天訓(xùn)練一次，每次2min，連續(xù)訓(xùn)練4天。
數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以mean±s表示，進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。
表9人參皂甙Re在避暗實(shí)驗(yàn)中對(duì)腦缺血再灌注引起的學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響


表10人參皂甙Re在水迷宮實(shí)驗(yàn)中對(duì)腦缺血再灌注引起的學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響

*P＜0.05**P＜0.01在避暗試驗(yàn)中，假手術(shù)組與模型組相比，在潛伏期與錯(cuò)誤次數(shù)等行為學(xué)指標(biāo)上均有顯著性差異，模型成立。Re12.5mg/kg、25mg/kg可減少錯(cuò)誤次數(shù)。
在水迷宮試驗(yàn)中，第四天游泳潛伏期假手術(shù)組與模型組相比，顯著縮短。25mg/kg組與模型組相比有極顯著差異，6.25mg/kg，12.5mg/kg組潛伏期短于模型組，但未有顯著性差異。
實(shí)施例5本實(shí)施例涉及的是人參皂甙Re對(duì)麻醉大鼠海馬齒狀回基礎(chǔ)突觸傳遞活動(dòng)的影響，目前對(duì)促智藥的研究，不但要提供行為學(xué)研究證據(jù)，也要采用電生理學(xué)技術(shù)來(lái)證明它對(duì)神經(jīng)突觸可塑性的影響，主要觀察對(duì)突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的作用，它被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)記憶的細(xì)胞模型。
具體實(shí)驗(yàn)是，Wistar大鼠用20％烏拉坦1.0g/kg腹腔注射麻醉后，固定于立體定位儀上。在定位坐標(biāo)為AP0.8，L1.8，H3.5處植一簍管于側(cè)腦室內(nèi)，在AO3.8，L2.5，H3.5處植一記錄電極于海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層，在AP7.5，L4.2，H3.5-4.0處植一刺激電極于內(nèi)嗅區(qū)穿質(zhì)通路(perforant path，PP)。調(diào)整刺激電極的位置，找到固定刺激強(qiáng)度下可記錄到最大群峰電位振幅(population spike amplitude，PSA)時(shí)的位置，固定不動(dòng)。測(cè)試刺激是波寬0.2ms的方波，頻率為1/30Hz，刺激強(qiáng)度為引起最大PSA所需刺激強(qiáng)度的1/3-1/2。Re用0.01％的DMSO溶解并稀釋至不同濃度，通過(guò)植入側(cè)腦室的簍管給予，對(duì)照組給0.01％DMSO。記錄給約前30min的PSA，然后在5min內(nèi)將5μl的待測(cè)物緩慢注射入側(cè)腦室，記錄給藥后60min內(nèi)的PSA，取15min、30min、60min三點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。取給藥前PSA的平均值代表給藥前的基礎(chǔ)突觸傳遞水平，再用此均值去除給藥后15min、30min、60min各點(diǎn)的PSA，得出各點(diǎn)PSA相對(duì)值(％)。組內(nèi)求均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，組間作t檢驗(yàn)。
從表11可以看出，側(cè)腦室注射Re可使海馬齒狀回基礎(chǔ)突觸傳遞反應(yīng)增強(qiáng)。Re濃度為10-5M時(shí)增加不很明顯，在60min時(shí)才達(dá)到了135±20.6％；隨著Re濃度的降低，PSA的增幅逐漸加大，10-6M在30min就達(dá)到了138.9±10.6％；以10- 7M濃度增幅最大，給藥后15min達(dá)到了138.4±18.0％，并持續(xù)增加，到60min時(shí)達(dá)189.6±63.0％?？梢暈樽钸m劑量；10-8M的PSA增幅較10-7M又有所下降，但也在30min達(dá)到152.2±32.4％。10-6M、10-7M、10-8M三個(gè)劑量組PSA增幅均超過(guò)了30。
表11 人參皂甙Re對(duì)大鼠海馬LTP形成的影響

P＜0.05，*P＜0.01，***P＜0.01 vs control突觸傳遞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)記憶的細(xì)胞學(xué)模型，成為學(xué)習(xí)記憶的細(xì)胞學(xué)模型，成為學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中神經(jīng)元生理活動(dòng)的客觀指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人參皂甙Re在10-6M、10-7M、10-8M劑量下側(cè)腦室給藥對(duì)麻醉大鼠海馬齒狀回基礎(chǔ)突觸傳遞有增強(qiáng)作用，且能形成LTP形象，此結(jié)果為人參的促智作用研究豐富了新的內(nèi)容。
人參皂甙Re是人參中的一個(gè)重要化學(xué)成分，它能改善化學(xué)藥物(東莨菪堿等)所致記憶障礙，以及改善自然衰老，Aβ等所致記憶障礙以及增強(qiáng)基礎(chǔ)突觸傳遞、促進(jìn)LTP形成的作用屬首次發(fā)現(xiàn)，為把人參皂甙Re開(kāi)發(fā)成一個(gè)促智藥提供了較充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種人參皂甙Re作為制備治療老年性癡呆、記憶障礙的藥物中的應(yīng)用。
2.一種人參皂甙Re作為制備改善β-淀粉樣肽引起的空間辨別障礙的藥物中的應(yīng)用。
3.一種人參皂甙Re作為制備改善自然衰老引起的記憶障礙的藥物中的應(yīng)用。
4.一種人參皂甙Re作為制備治療東莨菪堿所致記憶障礙的藥物中的應(yīng)用。
5.一種人參皂甙Re作為制備增強(qiáng)基礎(chǔ)突觸傳遞、促進(jìn)LTP形成的藥物中的應(yīng)用。
6.一種人參皂甙Re作為制備治療腦缺血引起的記憶障礙的藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于所述的人參皂甙Re的用量為12.5-50mg/kg。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的人參皂甙Re的用量?jī)?yōu)選為25-50mg/kg。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種人參皂甙Re的藥物應(yīng)用，具體地，本發(fā)明涉及的是人參皂甙Re作為制備治療記憶障礙的藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明的研究人員采用多種行為學(xué)方法，分別在成年、老年大鼠及多種記憶障礙模型上觀察了人參皂甙Re的改善記憶作用，同時(shí)采用電生理學(xué)方法觀察了Re對(duì)突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的作用，得出的結(jié)論是人參皂甙Re不但能改善化學(xué)藥物(東莨菪堿等)所致記憶障礙，而且具有改善自然衰老，Aβ等所致記憶障礙以及增強(qiáng)基礎(chǔ)突觸傳遞、促進(jìn)LTP形成的作用。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1498621SQ02149320
公開(kāi)日2004年5月26日 申請(qǐng)日期2002年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月7日
發(fā)明者張均田, 李平亞, 趙文杰 申請(qǐng)人:北京鑫利恒醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司