專利名稱：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑及其用途，涉及一種生物制劑、制備方法及其用途，可廣泛用于生物醫(yī)學(xué)和基因治療。
運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)對(duì)這些疾病的研究結(jié)果表明生長(zhǎng)因子合成的失平衡是組織纖維化疾病形成的重要因素。其中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的過度表達(dá)是其中最為重要的原因。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β及其受體的表達(dá)在燒傷后形成的增殖性瘢痕、瘢痕疙瘩組織、硬皮病組織、纖維化肝組織、纖維化腎組織、纖維化肺組織的表達(dá)均高于相對(duì)應(yīng)的正常皮膚組織、肝、腎和肺組織。與此相反，早期胚胎的皮膚組織在傷口愈合過程中不形成瘢痕組織，而是以完全的組織再生來(lái)進(jìn)行修復(fù)。胚胎傷口無(wú)瘢痕愈合的一個(gè)重要原因是其皮膚組織中自身TGF-β含量極低，因而避免了傷口內(nèi)的瘢痕形成。
近來(lái)的研究更進(jìn)一步證實(shí)了，在傷口愈合過程中消除或中和TGF-β的生物學(xué)作用，則可降低瘢痕形成的程度。Shah等以老鼠作為模型，在皮膚的傷口內(nèi)注入抗TGF-β抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于抗體中和了傷口內(nèi)的TGF-β而使瘢痕形成減少。雖然，該項(xiàng)研究為組織纖維化疾病的治療提供了一定的理論依據(jù)，但實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值不高。主要缺點(diǎn)包括1.抗體的制備價(jià)格昂貴；2.抗體在體內(nèi)的半衰期短暫，因此需要反復(fù)注射才能達(dá)到治療效果；3.抗體技術(shù)只在細(xì)胞外中和TGF-β，并末阻斷感應(yīng)細(xì)胞的受體功能；4.用異種動(dòng)物制備的抗體，多次使用后可導(dǎo)致機(jī)體免疫反應(yīng)的形成，增強(qiáng)傷口部位的炎癥反應(yīng)，降低了治療效果?；蛑委熂夹g(shù)的興起則能夠有效克服上述的缺點(diǎn)。采用何種基因來(lái)有效克服TGF-β的生物學(xué)效應(yīng)成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。目前的觀點(diǎn)認(rèn)為，克服轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β病理性作用的有效方法之一是阻斷其受體下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路。
TGF-β信號(hào)傳遞的主要過程為TGF-βII型受體在和TGF-β結(jié)合之后再與I型受體結(jié)合形成四聚體。通過II型受體的絲氨酸/蘇氨酸激酶的轉(zhuǎn)磷酸化作用而激活I(lǐng)型受體，后者繼續(xù)激活信號(hào)傳遞分子(SMAD)而將信號(hào)傳入細(xì)胞核內(nèi)最終產(chǎn)生TGF-β的生物學(xué)效應(yīng)。其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)被打斷均可導(dǎo)致TGF-β生物學(xué)效應(yīng)的廢除。Yamamoto等將TGF-βII型受體細(xì)胞內(nèi)片段的絲氨酸/蘇氨酸激酶位點(diǎn)刪除形成截短型TGF-βII型受體，發(fā)現(xiàn)該受體在細(xì)胞中的表達(dá)能完全阻斷TGF-β細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，使得TGF-β失去對(duì)這些細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。目前，阻斷TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的研究多局限于體外培養(yǎng)細(xì)胞，很少涉及動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)或用于組織纖維化疾病的研究。Nakamura等將截短型TGF-βII型受體重組腺病毒靜脈內(nèi)注射入肝硬化模型的實(shí)驗(yàn)鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過阻斷肝細(xì)胞內(nèi)的TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能顯著延緩肝硬化的病理進(jìn)程，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成，促進(jìn)肝細(xì)胞再生和延長(zhǎng)病鼠的壽命。
所有的這些結(jié)果均表明，阻斷TGF-β的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的確是克服TGF-β病理性作用的非常有效的方法。但是，這一方法除了在治療肝硬化方面進(jìn)行了相關(guān)的研究外，尚未用于其他器官組織纖維化疾病的治療。特別是在外科領(lǐng)域，燒傷、創(chuàng)傷或手術(shù)本身造成的皮膚組織增生性瘢痕形成或術(shù)后內(nèi)臟器官粘連等組織纖維化疾病是否能用相同的方法治療尚無(wú)報(bào)道。
基因治療的興起源于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的開發(fā)和成熟。目前常用的轉(zhuǎn)基因載體主要有病毒類載體和非病毒類載體兩大類。病毒類載體包括腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體和逆轉(zhuǎn)入病毒載體。非病毒載體主要為能在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的質(zhì)粒。
腺病毒是中等大小的無(wú)包膜雙鏈DNA病毒，與人類上呼吸道感染和眼部及胃腸炎有關(guān)。病毒的基因組DNA約36kb(千堿基對(duì))，包含早期基因E1、E2、E3和E4及其他晚期(L)基因?；蚪MDNA被包裹在二十面體的蛋白衣殼內(nèi)。最常用的血清型為第2型和第5型。將E1及E3替換成所需的治療基因便可行成重組DNA病毒。腺病毒的優(yōu)點(diǎn)包括制備病毒滴度高，基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞范圍廣泛，轉(zhuǎn)染效率明顯高于其他類病毒載體，不整合到宿主細(xì)胞的染色體，適合直接而短暫的基因表達(dá)。它的缺點(diǎn)包括可引起一定的宿主抗病毒免疫反應(yīng)，大劑量應(yīng)用可有一定的細(xì)胞毒作用。
腺相關(guān)病毒屬于人類微小病毒，為一4.7kb的單鏈DNA病毒。若將治療基因取代病毒復(fù)制(rep)和殼蛋白(cap)基因，則可形成重組腺相關(guān)病毒。腺相關(guān)病毒的優(yōu)點(diǎn)包括為一非致病的病毒，基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞范圍廣泛，不引起宿主的免疫反應(yīng)，基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)。它的缺點(diǎn)包括會(huì)整合到宿主細(xì)胞的第19號(hào)染色體，不能攜帶較大的治療基因。
逆轉(zhuǎn)入病毒是單鏈的RNA病毒。其主要特征為能通過攜帶的逆轉(zhuǎn)錄酶將自身的RNA基因組反向轉(zhuǎn)錄為DNA模板進(jìn)行大量復(fù)制。將治療基因替換病毒的核心蛋白(gag)，逆轉(zhuǎn)錄酶(pol)和包膜糖蛋白(env)病毒基因可制備成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)點(diǎn)包括能夠在體外條件下把基因高效率地轉(zhuǎn)入分裂期的細(xì)胞，因而可選擇性地感染高分裂狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞。由于病毒能嵌入宿主的染色體，因而能維持長(zhǎng)時(shí)間的基因表達(dá)。逆轉(zhuǎn)入病毒的缺點(diǎn)為隨機(jī)插入宿主的染色體DNA，故可造成基因突變等不良作用；病毒只能感染處于分裂期的細(xì)胞，故基因轉(zhuǎn)染范圍較窄。
最常用的非病毒類載體為能在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)基因的質(zhì)粒載體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明將質(zhì)粒DNA直接注射入肌肉或皮膚等組織能有效表達(dá)注入的基因；并發(fā)揮治療基因的功能效應(yīng)。質(zhì)粒DNA直接注射到皮膚的傷口組織內(nèi)同樣被證明能有效地在傷口組織內(nèi)表達(dá)有活性的生長(zhǎng)因子。近來(lái)的研究也表明可以通過靜脈注射質(zhì)粒DNA來(lái)達(dá)到全身組織表達(dá)治療基因的目的。另外，也可通過物理的方法(如基因槍或微型針穿刺)將質(zhì)粒DNA有效送入皮膚組織，促進(jìn)基因的表達(dá)。
與病毒載體相比，質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低。為了提高轉(zhuǎn)染效率，將脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA混合后注射能促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)染效率。但是進(jìn)年來(lái)的研究表明采用可降解的生物高分子材料(polymer)與質(zhì)粒DNA混合后其轉(zhuǎn)基因效率大大高于脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA的混合物，而且細(xì)胞毒性大大降低。
本發(fā)明的目的可通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑，用轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建成含截短型TGF-βII型受體的DNA分子。
在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，所述轉(zhuǎn)基因載體包括真核細(xì)胞質(zhì)粒表達(dá)載體，腺病毒表達(dá)載體，腺相關(guān)病毒表達(dá)載體，逆轉(zhuǎn)入病毒表達(dá)載體，生物高分子材料復(fù)合的真核細(xì)胞質(zhì)粒表達(dá)載體中的一種。
在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，取正常人體細(xì)胞，制備不含細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)的TGF-βII型受體互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸鏈(cDNA)片段。
其中，可取正常人體細(xì)胞，用Trizol抽提細(xì)胞總RNA，用逆向轉(zhuǎn)錄酶引導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)克隆出人類轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βII型受體的cDNA，并用分子生物學(xué)方法切除II型受體細(xì)胞內(nèi)片段的絲氨酸/蘇氨酸激酶位點(diǎn)形成截短型TGF-βII型受體或取正常人體細(xì)胞，用RT-PCR克隆不含細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)的TGF-βII型受體cDNA片段。
在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，將截短型TGP-βII型受體cDNA克隆至真核細(xì)胞基因表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌并大量擴(kuò)增，抽提和純化質(zhì)粒DNA；將質(zhì)粒DNA與生物高分子材料結(jié)合形成特殊的復(fù)合物。
在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，將截短型TGP-βII型受體cDNA克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌并大量擴(kuò)增，穿梭質(zhì)粒DNA抽提；采用DNA同源重組將截短型TGF-βII型受體基因置換腺病毒E1基因形成含有截短型TGF-βII型受體基因重組腺病毒的DNA分子；將其轉(zhuǎn)入腺病毒包裝細(xì)胞，形成重組腺病毒顆粒并進(jìn)行大量擴(kuò)增和純化。
也可采用非同源重組的方法將腺病毒的E1基因去除，并插入所需基因而形成重組腺病毒。
在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，將截短型TGF-βII型受體cDNA克隆至腺相關(guān)病毒DNA載體，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌并大量擴(kuò)增，載體DNA抽提；將重組腺相關(guān)病毒和輔助病毒(helper virus)cDNA同時(shí)轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞，進(jìn)行大量擴(kuò)增，并用超速離心法或過柱法分離純化病毒。
在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，將截短型TGP-βII型受體cDNA克隆至逆轉(zhuǎn)入病毒DNA載體，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌并大量擴(kuò)增，載體DNA抽提；將重組病毒DNA分子轉(zhuǎn)入逆轉(zhuǎn)入病毒包裝細(xì)胞，挑選高病毒滴度細(xì)胞克隆，體外擴(kuò)增并用于大量生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)入病毒。
本發(fā)明可針對(duì)不同類型器官或組織疾病將不同轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建成的TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑分別采用動(dòng)脈導(dǎo)管介入法、靜脈注射法、病變組織局部注射或涂抹等給藥方式用于人體。用于皮膚組織纖維化疾病的治療，或用于治療內(nèi)臟和其他器官的組織纖維化疾病。
本發(fā)明的優(yōu)越性在于提供了一種可用于纖維性疾病防治的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑，用于治療皮膚增生性瘢痕，瘢痕疙瘩及內(nèi)臟器官組織纖維化疾病如慢性腎、肺纖維化、硬皮病等的治療。構(gòu)建含有治療基因的不同轉(zhuǎn)基因載體用于不同疾病的治療，優(yōu)化了治療基因的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)效率，為獲取有效的治療效果打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。本發(fā)明通過阻斷TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)治療傷口愈合過程中的瘢痕形成和增生，不僅可以解除創(chuàng)傷病人的身心疾苦，也可以為國(guó)家和患者個(gè)人減少不必要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。另外，內(nèi)臟器官組織纖維化是嚴(yán)重危害人民身體健康的疾病，疾病發(fā)展晚期可以導(dǎo)致器官功能衰竭和死亡。本發(fā)明對(duì)內(nèi)臟器官纖維化病變的預(yù)防治療將有積極的意義。
B.逆向轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)第1溶液取1-5μg RNA，加10mM脫氧核糖核苷混合液(dNTP)1μl，加寡聚脫氧胸腺嘧啶(Oligo(dT))(0.5μg/μl)1μl，加焦碳酸二乙酯(DEPC)水，使總?cè)莘e為10μl。65℃培育5分鐘，冰育1-3分鐘。第二溶液10×RT緩沖液2μl，25mM氯化鎂(MgCl2)4μl，0.1M二硫蘇糖醇(DTT)2μl，RNA酶抑制劑1μl。取9μl第1溶液加入第2溶液，42℃培育2分鐘，加1μl逆轉(zhuǎn)錄酶，42℃培育50分鐘，72℃培育15分鐘終止反應(yīng)。加1μl RNA酶H，37℃培育20分鐘。
C.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)10×PCR緩沖液5μl，25mM MgCl21.5μl，10mM dNTP混合液1μl，10mM上游引物1μl，10mM下游引物1μl，Taq酶(DNA合成酶)0.4μl，RT產(chǎn)物2μl，去離子水(diH2O)38.1μl?；靹?，置PCR擴(kuò)增儀，按下列程序擴(kuò)增94℃ 2分鐘，94℃15秒，60℃45秒，70℃1分鐘，共35循環(huán)，70℃ 5分鐘終止反應(yīng)。
D.跑0.8％瓊脂電泳，切膠，用Geneclean試劑盒回收PCR產(chǎn)物，并用T4DNA連接酶將其克隆到TA克隆載體。分別從克隆基因的5’端和3’端做測(cè)序分析，以確定正確的基因序列。
E.選擇特異的酶切位點(diǎn)，將克隆的基因取出，并用T4DNA連接酶將其克隆到真核細(xì)胞基因表達(dá)質(zhì)粒載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌(100μl)，42℃熱休克45秒，加入900μl細(xì)菌培養(yǎng)液(LB液)，在37℃培育1小時(shí)。將菌液撤在瓊脂平板上，37℃培育過夜，挑選菌落，擴(kuò)增，常規(guī)抽提DNA，酶切鑒定。
(2)重組腺病毒載體的構(gòu)建A.獲取人體組織并分離細(xì)胞和體外擴(kuò)增，用TriZol抽提取細(xì)胞總RNA。
B.RT第1溶液取1-5μg RNA，加10mM dNTP混合液1μl，加Oligo(dT)(0.5μg/μl)1μl，加DEPC水，使總?cè)莘e為10μl。65℃培育5分鐘，冰育1-3分鐘。第二溶液10×RT緩沖液2μl，25mM MgCl24μl，0.1M DTT 2μl，RNA酶抑制劑1μl。取9μl第1溶液加入第2溶液，42℃培育2分鐘，加1μl逆轉(zhuǎn)錄酶，42℃培育50分鐘，72℃培育15分鐘終止反應(yīng)。加1μl RNA酶H，37℃培育20分鐘。
C.PCR10×PCR緩沖液5μl，25mM MgCl21.5μl，10mM dNTP混合液1μl，10mM上游引物1μl，10mM下游引物1μl，Taq酶0.4μl，RT產(chǎn)物2μl，diH2O 38.1μl。渾勻，置PCR擴(kuò)增儀，按下列程序擴(kuò)增94℃ 2分鐘，94℃ 15秒，60℃ 45秒，70℃1分鐘，共35循環(huán)，70℃5分鐘終止反應(yīng)。
D.跑0.8％瓊脂電泳，切膠，用Geneclean試劑盒回收PCR產(chǎn)物，并用T4DNA連接酶將其克隆到TA克隆載體。分別從克隆基因的5’端和3’端做測(cè)序分析，以確定正確的基因序列。
E.選擇特異的酶切位點(diǎn)，將克隆的基因取出，并用T4DNA連接酶將其克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌(100μl)，42℃熱休克45秒，加入900μl LB細(xì)菌培養(yǎng)液，37℃培育1小時(shí)。將菌液撤在瓊脂平板上，37℃培育過夜，挑選菌落，擴(kuò)增，常規(guī)抽提DNA，酶切鑒定。
F.非DNA重組法構(gòu)建腺病毒穿棱質(zhì)粒載體克隆基因兩側(cè)各含有一個(gè)人為制造的酶切位點(diǎn)，而腺病毒載體的E1基因已被預(yù)先切除，并在治療基因克隆位點(diǎn)分別加上了與穿棱質(zhì)粒一致的酶切位點(diǎn)。
a.用特異的內(nèi)切酶將治療基因從穿梭質(zhì)粒上切下，采用酒精鹽沉析法純化獲得治療基因DNA片段。
b.將治療基因DNA片段用T4DNA連接酶直接連接到腺病毒載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌(100μl)，42℃熱休克45秒，加入900μl LB細(xì)菌培養(yǎng)液，37℃培育1小時(shí)。將菌液撤在瓊脂平板上，37℃培育過夜，挑選菌落，擴(kuò)增，常規(guī)抽提DNA，酶切鑒定。
c.用內(nèi)切酶將連成環(huán)狀重組腺病毒分解成線狀的完整的重組腺病毒DNA分子，氯仿抽提，酒精鹽沉析法純化。
d.將重組腺病毒DNA分子用脂質(zhì)體或FUGENE等轉(zhuǎn)入腺病毒包裝細(xì)胞(293細(xì)胞)。待細(xì)胞病變破裂后，收集上清液，再次感染293細(xì)胞，培養(yǎng)1-2天，在細(xì)胞變圓，尚未破裂之前，收集細(xì)胞，反復(fù)凍溶裂解細(xì)胞，收集含重組病毒的上清夜，用氯化銫梯度超速離心分離腺病毒。
G.DNA重組法構(gòu)建腺病毒a.擴(kuò)增，抽提和純化穿梭質(zhì)粒DNA。
b.提取野生型腺病毒DNA分子將分離純化的腺病毒溶于2倍的水和3倍的無(wú)水酒精，-70℃冷凍10-30分鐘，離心去上清液，將沉淀物溶于TNE[10mM鹽酸緩沖液(Tris HCl)，10mM氯化鈉(NaCl)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)]，加入10％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.25M EDTA，和鏈霉蛋白酶，37℃培育30分鐘，氯仿抽提，酒精和鹽沉淀獲得病毒DNA。
c.將穿梭質(zhì)粒DNA和野生型病毒DNA同時(shí)轉(zhuǎn)入293包裝細(xì)胞。
d.用空斑實(shí)驗(yàn)提取重組腺病毒將轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞置于6孔培養(yǎng)，使之成約90％融合狀態(tài)。將明膠，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液和酵母提取物和瓊脂混合并冷卻致42℃，鋪在293細(xì)胞上面，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱令其自然成膠。待空斑形成之后，分離每個(gè)空斑內(nèi)的腺病毒，擴(kuò)增，純化并用PCR篩選重組腺病毒。
e.將獲得的重組腺病毒感染293細(xì)胞，并用氯化銫梯度超速離心分離和純化病毒。
(3)腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建A.獲取人體組織并分離細(xì)胞和體外擴(kuò)增，用TriZol抽提取細(xì)胞總RNA。
B.RT第1溶液取1-5μg RNA，加10mM dNTP混合液1μl，加Oligo(dT)(0.5μg/μl)1μl，加DEPC水，使總?cè)莘e為10μl。65℃培育5分鐘，冰育1-3分鐘。第二溶液10×RT緩沖液2μl，25mMMgCl24μl，0.1M DTT 2μl，RNA酶抑制劑1μl。取9μl第1溶液加入第2溶液，42℃培育2分鐘，加1μI逆轉(zhuǎn)錄酶，42℃培育50分鐘，72℃培育15分鐘終止反應(yīng)。加1μl RNA酶H，37℃培育20分鐘。
C.PCR10×PCR緩沖液5μl，25mM MgCl21.5μl，10mM dNTP混合液1μl，10mM上游引物1μl，10mM下游引物1μl，Taq酶0.4μl，RT產(chǎn)物2μl，diH2O 38.1μl?；靹颍肞CR擴(kuò)增儀，按下列程序擴(kuò)增94℃ 2分鐘，94℃ 15秒，60℃ 45秒，70℃ 1分鐘，共35循環(huán)，70℃5分鐘終止反應(yīng)。
D.跑0.8％瓊脂電泳，切膠，用Geneclean試劑盒回收PCR產(chǎn)物，并用T4 DNA連接酶將其克隆到TA克隆載體。分別從克隆基因的5’端和3’端做測(cè)序分析，以確定正確的基因序列。
E.選擇特異的酶切位點(diǎn)，將克隆的基因取出，并用T4 DNA連接酶將其克隆到腺相關(guān)病毒順式-質(zhì)粒載體(含有腺相關(guān)病毒兩端的末端反向重復(fù)序列)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌(100μl)，42℃熱休克45秒，加入900μl LB細(xì)菌培養(yǎng)液，37℃培育1小時(shí)。將菌液撤在瓊脂平板上，37℃培育過夜，挑選菌落，擴(kuò)增，常規(guī)抽提DNA，酶切鑒定。
F.將293病毒包裝細(xì)胞培養(yǎng)在10cm的培養(yǎng)皿上，待細(xì)胞達(dá)到60-80％融合時(shí)，用脂質(zhì)體或FUGENE將腺相關(guān)順式-質(zhì)粒載體，反式-質(zhì)粒載體(含腺相關(guān)病毒rep和cap基因)和協(xié)助病毒質(zhì)粒載體(含腺病毒E類和L類基因)共同轉(zhuǎn)入293細(xì)胞。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后4天，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞。
G.將收集的細(xì)胞溶解于磷酸緩沖液(PBS)，反復(fù)凍溶數(shù)次，并行超聲破碎，離心后將收集上清液。65℃培育1小時(shí)，滅活可能存在的腺病毒。
H.分離純化病毒a.超速離心法將獲取的上清液作氯化銫超速梯度離心法，根據(jù)所獲條帶的大小，分離重組腺相關(guān)病毒。
b.肝素親和沉析柱法取4.6×50mm肝素親和沉析柱，用50倍的3M氯化鈉平衡沉析柱，繼以50倍的PBS沖洗。將含重組腺相關(guān)病毒的上清液經(jīng)過濾后上柱。PBS充分洗柱后，用不同濃度的氯化鈉將病毒從柱子上洗脫，胰酶消化和有機(jī)溶劑純化去除污染的蛋白質(zhì)。最后經(jīng)脫鹽而獲得純化的腺相關(guān)病毒。
(4)逆轉(zhuǎn)入病毒載體的構(gòu)建A.獲取人體組織并分離細(xì)胞和體外擴(kuò)增，用TriZol抽提取細(xì)胞總RNA。
B.RT第1溶液取1-5μg RNA，加10mM dNTP混合液1μl，加Oligo(dT)(0.5μg/μl)1μl，加DEPC水，使總?cè)莘e為10μl。65℃培育5分鐘，冰育1-3分鐘。第二溶液10×RT緩沖液2μl，25mM MgCl24μl，0.1M DTT 2μl，RNA酶抑制劑1μl。取9μl第1溶液加入第2溶液，42℃培育2分鐘，加1μl逆轉(zhuǎn)錄酶，42℃培育50分鐘，72℃培育15分鐘終止反應(yīng)。加1μl RNA酶H，37℃培育20分鐘。
C.PCR10×PCR緩沖液5μl，25mM MgCl21.5μl，10mM dNTP混合液1μl，10mM上游引物1μl，10mM下游引物1μl，Taq酶0.4μl，RT產(chǎn)物2μl，diH2O 38.1μl?；靹?，置PCR擴(kuò)增儀，按下列程序擴(kuò)增94℃ 2分鐘，94℃ 15秒，60℃ 45秒，70℃ 1分鐘，共35循環(huán)，70℃5分鐘終止反應(yīng)。
D.跑0.8％瓊脂電泳，切膠，用Geneclean試劑盒回收PCR產(chǎn)物，并用T4DNA連接酶將其克隆到TA克隆載體。分別從克隆基因的5’端和3’端做測(cè)序分析，以確定正確的基因序列。
E.選擇特異的酶切位點(diǎn)，將克隆的基因取出，并用T4DNA連接酶將其克隆到逆轉(zhuǎn)入病毒載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌(100μl)，42℃熱休克45秒，加入900μl LB細(xì)菌培養(yǎng)液，37℃培育1小時(shí)。將菌液撤在瓊脂平板上，37℃培育過夜，挑選菌落，擴(kuò)增，常規(guī)抽提DNA，酶切鑒定。
F.將逆轉(zhuǎn)入病毒包裝細(xì)胞置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，待細(xì)胞約60-70％融合時(shí)，用脂質(zhì)體或FUGENE將病毒DNA分子轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞內(nèi)，48-72小時(shí)后用特異的抗菌素持續(xù)篩選，直到形成細(xì)胞克隆。
G.對(duì)不同的細(xì)胞克隆進(jìn)行病毒滴度檢測(cè)，以挑選出高滴度的包裝細(xì)胞克隆。
(5)生物高分子材料復(fù)合的真核細(xì)胞質(zhì)粒表達(dá)載體A.獲取人體組織并分離細(xì)胞和體外擴(kuò)增，用TriZol抽提取細(xì)胞總RNA。
B.RT第1溶液取1-5μg RNA，加10mM dNTP混合液1μl，加Oligo(dT)(0.5μg/μl)1μl，加DEPC水，使總?cè)莘e為10μl。65℃培育5分鐘，冰育1-3分鐘。第二溶液10×RT緩沖液2μl，25mMMgCl24μl，0.1M DTT 2μl，RNA酶抑制劑1μl。取9μl第1溶液加入第2溶液，42℃培育2分鐘，加1μl逆轉(zhuǎn)錄酶，42℃培育50分鐘，72℃培育15分鐘終止反應(yīng)。加1μlRNA酶H，37℃培育20分鐘。
C.PCR10×PCR緩沖液5μl，25mM MgCl21.5μl，10mM dNTP混合液1μl，10mM上游引物1μl，10mM下游引物1μl，Taq酶0.4μl，RT產(chǎn)物2μl，diH2O 38.1μl。混勻，置PCR擴(kuò)增儀，按下列程序擴(kuò)增94℃ 2分鐘，94℃ 15秒，60℃ 45秒，70℃ 1分鐘，共35循環(huán)，70℃ 5分鐘終止反應(yīng)。
D.跑0.8％瓊脂電泳，切膠，用Geneclean試劑盒回收PCR產(chǎn)物，并用T4DNA連接酶將其克隆到TA克隆載體。分別從克隆基因的5’端和3’端做測(cè)序分析，以確定正確的基因序列。
E.選擇特異的酶切位點(diǎn)，將克隆的基因取出，并用T4DNA連接酶將其克隆到真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌(100μl)，42℃熱休克45秒，加入900μlLB細(xì)菌培養(yǎng)液，37℃培育1小時(shí)。將菌液撤在瓊脂平板上，37℃培育過夜，挑選菌落，擴(kuò)增，常規(guī)抽提DNA，酶切鑒定。
F.采用聚賴氨酸等材料作為生物可降解高分子材料，并對(duì)這些分子進(jìn)行增加咪唑基團(tuán)等的修飾，以提高基因表達(dá)能力和降低細(xì)胞毒性的作用。
G.取20μg質(zhì)粒DNA溶解于100μl 10mM的N-2-羥乙基哌噱-N-2-乙烷磺酸(Hepes)緩沖液，并與100μl含有經(jīng)修飾的生物材料分子充分混勻，室溫下放置20分鐘，使其形成DNA-生物材料復(fù)合物。
2.組織纖維化疾病的基因治療(1)疾病的治療方式A.介入療法針對(duì)不同的器官，行動(dòng)脈導(dǎo)管插管至該器官的主要供血?jiǎng)用}如肝動(dòng)脈、腎動(dòng)脈等，并通過動(dòng)脈插管將TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑注入，以確保截短型TGF-βII型受體基因在該器官內(nèi)的特異和高效表達(dá)，從而達(dá)到治療效果。
B.全身療法若疾病涉及到全身不同的器官，如進(jìn)展性系統(tǒng)性硬化病的患著，不僅存在皮膚組織的纖維化，也伴有食道或其他器官的纖維化病變，則可采用靜脈注射的方法，達(dá)到同時(shí)治療多種器官疾病的目的。
C.局部療法針對(duì)器官局部病變，如手術(shù)切口瘢痕，瘢痕疙瘩或小面積燒傷等，可以采用局部病變皮膚組織內(nèi)注射或局部創(chuàng)面的涂抹。
(2)不同轉(zhuǎn)基因載體的選擇A.逆轉(zhuǎn)入或腺相關(guān)病毒載體針對(duì)某些慢性組織纖維化疾病的治療如肝硬化、矽肺或慢性腎纖維化，可采用這兩種載體以維持治療基因在相應(yīng)器官內(nèi)的長(zhǎng)期表達(dá)。
B.腺病毒載體用于短暫的病理過程，如創(chuàng)面的愈合和切口瘢痕的治療等。
C.質(zhì)粒及生物高分子復(fù)合的質(zhì)粒載體可用于需要多次反復(fù)治療的疾病。
如圖本發(fā)明流程圖所示，首先，取正常人體細(xì)胞，用Trizol抽提細(xì)胞總RNA，用逆向轉(zhuǎn)錄酶引導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)克隆出人類轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βII(TGF-βII)型受體的cDNA，并用分子生物學(xué)方法切除II型受體細(xì)胞內(nèi)片段的絲氨酸/蘇氨酸激酶位點(diǎn)形成截短型TGF-βII型受體；或用RT-PCR直接克隆不含細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)的TGF-βII型受體的cDNA片段；將截短型TGP-βII型受體cDNA克隆至(1)真核細(xì)胞基因表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌并大量擴(kuò)增，抽提和純化質(zhì)粒DNA。將質(zhì)粒DNA與生物高分子材料結(jié)合形成特殊的復(fù)合物；(2)腺病毒穿梭質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌并大量擴(kuò)增，穿梭質(zhì)粒DNA抽提。采用DNA同源重組將截短型TGF-βII型受體基因置換腺病毒E1基因形成含有截短型TGF-βII型受體基因重組腺病毒的DNA分子。將其轉(zhuǎn)入腺病毒包裝細(xì)胞，形成重組腺病毒顆粒并進(jìn)行大量擴(kuò)增和純化。也可采用非同源重組的方法將腺病毒的E1基因去除，并插入所需基因而形成重組腺病毒；(3)腺相關(guān)病毒DNA載體，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌并大量擴(kuò)增，質(zhì)粒DNA抽提。將重組腺相關(guān)病毒和輔助病毒(helper virus)cDNA同時(shí)轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞，進(jìn)行大量擴(kuò)增，并用超速離心法或過柱法分離純化病毒；(4)逆轉(zhuǎn)入病毒DNA載體，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌并大量擴(kuò)增，質(zhì)粒DNA抽提。將重組病毒DNA分子轉(zhuǎn)入逆轉(zhuǎn)入病毒包裝細(xì)胞，挑選高病毒滴度細(xì)胞克隆，體外擴(kuò)增并用于大量生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)入病毒。
其次，根據(jù)不同類型器官或組織疾病治療的需要，將不同轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建成的TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑分別采用動(dòng)脈導(dǎo)管介入法、靜脈注射法、病變組織局部注射或涂抹等方法來(lái)治療組織纖維化疾病。
本發(fā)明通過阻斷TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)治療傷口愈合過程中的瘢痕形成和增生，不僅可以解除創(chuàng)傷病人的身心疾苦，也可以為國(guó)家和患者個(gè)人減少不必要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。另外，內(nèi)臟器官組織纖維化是嚴(yán)重危害人民身體健康的疾病，疾病發(fā)展晚期可以導(dǎo)致器官功能衰竭和死亡。目前對(duì)這些疾病尚無(wú)非常有效的治療方法。國(guó)外的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了阻斷TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)能有效抑制肝纖維化的進(jìn)程，因此本項(xiàng)發(fā)明對(duì)內(nèi)臟器官纖維化病變的治療將有積極的意義。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括采用基因治療手段開發(fā)出TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑，并用于治療燒傷或創(chuàng)傷導(dǎo)致的皮膚增殖性瘢痕和瘢痕疙瘩等。采用這種信號(hào)阻斷劑能夠有效抑制動(dòng)物傷口愈合過程中的瘢痕形成，而瘢痕疙瘩細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)了TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑能抑制瘢痕疙瘩細(xì)胞的增殖和膠原分泌。這些研究成果為增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的臨床治療提供了有力的依據(jù)。另外，本發(fā)明通過構(gòu)建不同的轉(zhuǎn)基因載體，優(yōu)化了治療基因的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)效率，并針對(duì)不同的疾病設(shè)計(jì)出不同的給藥途徑，為有效治療組織纖維化疾病提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)保障。
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑，特征在于用轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建成含截短型TGF-βII型受體的DNA分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑，特征在于所述轉(zhuǎn)基因載體包括真核細(xì)胞質(zhì)粒表達(dá)載體，腺病毒表達(dá)載體，腺相關(guān)病毒表達(dá)載體，逆轉(zhuǎn)入病毒表達(dá)載體，生物高分子材料復(fù)合的真核細(xì)胞質(zhì)粒表達(dá)載體中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑，特征在于取正常人體細(xì)胞，制備不含細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)的TGF-βII型受體cDNA片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑，特征在于不含細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)的TGF-βII型受體cDNA片段的制備方法是分子取正常人體細(xì)胞，用RNA抽提劑(Trizol)抽提細(xì)胞總RNA，用逆向轉(zhuǎn)錄酶引導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)克隆出人類轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βII型受體的互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸鏈(cDNA)，并用分子生物學(xué)方法切除II型受體細(xì)胞內(nèi)片段的絲氨酸/蘇氨酸激酶位點(diǎn)形成截短型TGF-βII型受體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑，特征在于取正常人體細(xì)胞，用RT-PCR克隆不含細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)的TGF-βII型受體cDNA片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑，特征在于將截短型TGP-βII型受體cDNA克隆至真核細(xì)胞基因表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌并大量擴(kuò)增，抽提和純化質(zhì)粒DNA；將質(zhì)粒DNA與生物高分子材料結(jié)合形成特殊的復(fù)合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑，特征在于將截短型TGF-βII型受體cDNA克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌并大量擴(kuò)增，穿梭質(zhì)粒DNA抽提；采用DNA同源重組將截短型TGF-βII型受體基因置換腺病毒E1基因形成含有截短型TGF-βII型受體基因重組腺病毒的DNA分子；將其轉(zhuǎn)入腺病毒包裝細(xì)胞，形成重組腺病毒顆粒并進(jìn)行大量擴(kuò)增和純化。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑，特征在于可采用非同源重組的方法將腺病毒的E1基因去除，并插入所需基因而形成重組腺病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑，特征在于將截短型TGP-βII型受體cDNA克隆至腺相關(guān)病毒DNA載體，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌并大量擴(kuò)增，載體DNA抽提；將重組腺相關(guān)病毒和輔助病毒(helper virus)cDNA同時(shí)轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞，進(jìn)行大量擴(kuò)增和純化。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑，特征在于將截短型TGF-βII型受體cDNA克隆至逆轉(zhuǎn)入病毒DNA載體，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌并大量擴(kuò)增，載體DNA抽提；將重組病毒DNA分子轉(zhuǎn)入逆轉(zhuǎn)入病毒包裝細(xì)胞，挑選高病毒滴度細(xì)胞克隆，體外擴(kuò)增并用于大量生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)入病毒。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑的應(yīng)用，特征在于可針對(duì)不同類型器官或組織疾病將不同轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建成的TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑分別采用動(dòng)脈導(dǎo)管介入法、靜脈注射法、病變組織局部注射或涂抹等給藥方式。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑的用途，特征在于用于皮膚組織纖維化疾病的治療。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑的用途，特征在于用于治療內(nèi)臟和其他器官的組織纖維化疾病。
全文摘要
本發(fā)明轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑及其用途,涉及一種生物制劑、制備方法及其用途,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑,是用轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建成含截短型TGF－βII型受體的脫氧核糖核苷酸(DNA)分子,其中,轉(zhuǎn)基因載體包括:真核細(xì)胞質(zhì)粒表達(dá)載體,腺病毒表達(dá)載體,腺相關(guān)病毒表達(dá)載體,逆轉(zhuǎn)入病毒表達(dá)載體,生物高分子材料復(fù)合的真核細(xì)胞質(zhì)粒表達(dá)載體中的一種,將不同轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建成的TGF－β信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑分別采用動(dòng)脈導(dǎo)管介入法、靜脈注射法、病變組織局部注射或涂抹等方法來(lái)治療組織纖維化疾病,如內(nèi)臟器官纖維化病變、燒傷或創(chuàng)傷導(dǎo)致的皮膚增殖性瘢痕和瘢痕疙瘩等。本發(fā)明通過構(gòu)建不同的轉(zhuǎn)基因載體,優(yōu)化了治療基因的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)效率。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1375335SQ02111238
公開日2002年10月23日 申請(qǐng)日期2002年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月2日
發(fā)明者劉偉, 曹誼林 申請(qǐng)人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院