專(zhuān)利名稱(chēng)：作為抗生素的多環(huán)氧雜蒽酮的制作方法
背景技術(shù)：
Cervinomycins(EP00246091；EP0054801；J.Antibiot.1982，35，645652；J.Am.Chem.Soc.1986，108，6088-6089，J.Antibiot.1987，40，301-308；J.Antibiot 1994，47，342-348；syntheticderivatives J.Antibiot.1986，39，1636-1639和EP0259496)和citreamicins(J.Antibiot.1989，42，846-851；J.Antibiot.1990，43，504-512；EP0405151)都為天然存在的抗生素家族的一員，都具有嵌入較大的多環(huán)骨架的氧雜蒽酮基單元。
已經(jīng)證明這些化合物具有抗需氧菌和厭氧菌以及支原體的活性，但是只有cervinomycins被認(rèn)為具有抗腫瘤活性(EP0246091)。 R＝Me，Cervinomycin A2R=H,18-O-二甲基cervinomycin A2我們最近也在PCT/GB01/02148公開(kāi)了citreamicins的抗腫瘤活性。 R1R2Citreamicinα COCH2CH(CH3)2CH3Citreamicinβ COCH(CH3)2CH3Citreamicinγ COCH3CH3Citreamicinξ COCH2CH(CH3)2HCitreamicinη H CH3為了治療許多人類(lèi)腫瘤，仍然需要新的抗癌藥物。因此，本發(fā)明的目的是提供新的具有多環(huán)氧雜蒽酮(polycyclic xanthone)結(jié)構(gòu)的抗腫瘤藥劑。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供用于將活性化合物施用給需要治療的患者的藥物組合物。
另一個(gè)目的是要在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中使用有機(jī)體的生物學(xué)純培養(yǎng)物控制需氧發(fā)酵生產(chǎn)多環(huán)氧雜蒽酮，并且提供從發(fā)酵液回收以及濃縮它的方法，以及該活性化合物的最后純化。
發(fā)明概要本發(fā)明提供新一類(lèi)基于從細(xì)菌分離的新化合物IB-00208的發(fā)現(xiàn)的，可用作抗腫瘤藥物的下式活性氧雜蒽酮化合物 因此，本發(fā)明提供具有如下通式的化合物 或 其中各R1相同或不同，可以為氫，?；榛?，烯基，芳基，芐基，堿金屬，和/或糖，以及R2和R3可以為氫，烷基，或一起形成不飽和的鍵。
本發(fā)明也提供制備上述的化合物的方法，包括得到IB-00208的方法。
發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明IB-00208以及相關(guān)的化合物對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤，如人類(lèi)的肺癌，人類(lèi)的結(jié)腸癌，人類(lèi)的黑素瘤等等顯示抗腫瘤活性。因此，本發(fā)明包括治療受對(duì)它們敏感的惡性腫瘤侵襲的哺乳動(dòng)物的方法，其中包括對(duì)其使用治療有效量的所述化合物或其藥物組合物。
本本發(fā)明也涉及包含作為活性成分的化合物IB-00208或其任何衍生物，或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物制劑，以及其制備方法。使用藥學(xué)上可接受的載體。
藥物組合物典型地由活性化合物配制并且包含任何固體(片劑，丸劑，膠囊，顆粒，等)或液體(溶液，懸浮液或乳劑)與任何載體或其他藥理活性化合物。
IB-00208或其衍生物的藥物組合物的正確劑量將根據(jù)具體的化合物，劑型，施用方式，以及宿主的部位和被治療的腫瘤變化。
應(yīng)該考慮的其它因素如年齡，體重，性別，飲食，給藥時(shí)間，排出速率，宿主的狀況，聯(lián)合用藥，反應(yīng)靈敏度和疾病的嚴(yán)重程度?？梢栽跇O限耐藥量?jī)?nèi)連續(xù)地或間歇地給藥。
?；梢詾橹艴；?，芳族?；蛑?芳族混合酰基。因此，例如，它們可以為RCO-基團(tuán)，其中R為烷基，烯基，芳基，芳烷基，或烷基芳香基。例子包括苯甲酰基。
烷基典型地具有1到18個(gè)碳原子。烷基優(yōu)選具有1到約12個(gè)碳原子，更優(yōu)選1到約8個(gè)碳原子，尤其優(yōu)選1到約6個(gè)碳原子，最優(yōu)選1，2，3或4個(gè)碳原子。甲基，乙基和包括異丙基的丙基為本發(fā)明化合物中特別優(yōu)選的烷基。除非另外修飾，本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)烷基指環(huán)狀的和非環(huán)狀的基團(tuán)，不過(guò)環(huán)基包含至少三個(gè)環(huán)碳原子。烷基可以是直鏈或支鏈的。
烯基典型地具有1到18個(gè)碳原子。本發(fā)明化合物中優(yōu)選的鏈烯基具有一個(gè)或多個(gè)不飽和鍵以及2到約12個(gè)碳原子，更優(yōu)選2到約8個(gè)碳原子，尤其優(yōu)選2到約6個(gè)碳原子，更優(yōu)選2，3或4個(gè)碳原子。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)烯基指環(huán)狀的和非環(huán)狀的，不過(guò)通常更優(yōu)選直鏈或支鏈非環(huán)狀的基團(tuán)。
芳基可以碳環(huán)的或雜環(huán)的，以及可以具有一個(gè)或多個(gè)稠環(huán)。碳環(huán)的芳基典型地具有6或10個(gè)碳原子，如苯基或萘基。雜環(huán)的芳基典型地具有5到12個(gè)原子，通常具有4，5，6，10，11或12個(gè)原子，其中有1，2，3或更多個(gè)通常選自氧，硫或氮的雜原子。本發(fā)明化合物中合適的雜環(huán)芳基包括香豆基，包括8-香豆基，喹啉基，包括8-喹啉基，吡啶基，吡嗪基，嘧啶基，呋喃基，吡咯基，噻吩基，噻唑基，噁唑基，咪唑基，吲哚基，苯并呋喃基和苯并噻唑基。
重要的堿金屬包括鈉或鉀。
使用的糖取代基典型地為單，二或三糖或糖衍生物，優(yōu)選單或二糖。優(yōu)選戊糖或己糖化合物。衍生物包括糖苷，N-葡基胺，O-酰基衍生物，O-甲基衍生物，糖醇，糖酸，脫氧糖，和相關(guān)的化合物。例子包括IB-00208三甲基脫氧吡喃己糖苷。
本發(fā)明公開(kāi)了新的多環(huán)氧雜蒽酮IB-00208，分離自微生物發(fā)酵液，微生物優(yōu)選Actinomadura sp.PO 13-046，其培養(yǎng)物已經(jīng)保藏在西班牙巴倫西亞大學(xué)的the Coleccion Espanolade Cultivos Tipo，登錄號(hào)為CECT 5318。該保藏符合布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，當(dāng)本申請(qǐng)被授予專(zhuān)利權(quán)時(shí)，公眾對(duì)其可獲得性將受到限制。
微生物菌株從在比斯開(kāi)灣(Bay of Biscay)收集的未鑒定的marine polychaete中分離。
雖然保藏的有機(jī)體顯然為優(yōu)選的，但是本發(fā)明不限于任何特定的菌株或有機(jī)體。本發(fā)明的目的包括其它本發(fā)明范圍內(nèi)的產(chǎn)生IB-00208的有機(jī)體，菌株或突變體。
在合適的培養(yǎng)基中，在控制條件下培養(yǎng)的Actinomadura sp.PO 13-046產(chǎn)生抗生素IB-00208。在有氧和嗜溫的條件下，該菌株優(yōu)選地生長(zhǎng)在含水培養(yǎng)基中。
通過(guò)用合適的溶劑混合物如CHCl3∶CH3OH∶H2O萃取可以從菌絲體的濾餅分離抗生素IB-00208?；钚晕镔|(zhì)在下層中濃縮。將兩次重復(fù)萃取的萃取液合并并且真空蒸干。
通過(guò)利用適當(dāng)組合的常規(guī)色譜技術(shù)可以從該粗制活性萃取物中分離并且純化IB-00208。
附圖的簡(jiǎn)要描述
圖1為純化的IB-00208的質(zhì)子NMR(1H)光譜；圖2為純化的IB-00208的碳-13NMR(13C)光譜；圖3為純化的IB-00208的DEPT實(shí)驗(yàn)；圖4，5，和6分別為純化的IB-00208的COSY45，HMQC和HMBC光譜；圖7為純化的IB-00208的IR光譜；圖8為IB-00208的HPLC/MS色譜和ESI-MS光譜；以及圖9為純化的IB-00208的HPLC/UV色譜和UV光譜分級(jí)分離可以由流分的抗腫瘤活性，或用濃硫酸香草醛顯色的TLC，或具有光電二極管陣列和MS檢測(cè)器的分析HPLC來(lái)指導(dǎo)。HPLC分析在室溫下使用分析柱Symmetry C18(5μm，流動(dòng)相為99∶1∶1的甲醇∶H2O∶乙酸，流速0.3ml/min.)進(jìn)行并且在325nm繪制，如圖9所示，在該條件中IB-00208保留時(shí)間為4.5min。
根據(jù)它們的各種光譜特性詳細(xì)分析，純化合物可以被確定為IB-00208(參見(jiàn)圖1到9復(fù)制的數(shù)據(jù))。推斷的結(jié)構(gòu)如上所示。
IB-00208數(shù)據(jù)概括于表1。
表1如圖9報(bào)告，UV光譜最大吸收225，255nm和325nm。
1H，13C和DEPT NMR光譜分別如圖1，圖2和圖3報(bào)告。
2D NMR實(shí)驗(yàn)COSY，HMQC和HMBC分別如圖4，圖5和圖6報(bào)告。
紅外吸收光譜顯示于圖7。
如圖8報(bào)告，ES-MS光譜在691顯示(M+H)峰，在713顯示(M+Na)峰。
各種IB-00208衍生物可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備。例如，使用化學(xué)的或生物學(xué)的方法可以做出這些改變。這些變化可以包括制備糖苷配基部分；向糖苷配基加入不同已知的和新的糖；修飾糖苷配基。
具有氫醌環(huán)的化合物可以在合適的溶劑中通過(guò)用還原劑[例如NaBH4(T.Ross Kelly等人，J.Am.Chem.Soc.1989，111，4522-4524)，Na2S2O4(A.V.Rama Rao等人，Tetrahedron Lett.1991，32，5199-5202)]還原醌，接著(當(dāng)R1≠H時(shí))通過(guò)在合適的溶劑中使氫醌與?；瘎┗蛲榛瘎┗蚝线m的試劑反應(yīng)，由具有醌環(huán)的化合物制備。
下列實(shí)施例將進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明優(yōu)選方案，它們將幫助理解本發(fā)明，它們僅僅是為了說(shuō)明本發(fā)明，不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是本發(fā)明的限制。
發(fā)明實(shí)施例除非具體說(shuō)明，本申請(qǐng)報(bào)道的所有的百分?jǐn)?shù)均以重量表示。所有的溫度用攝氏溫度表示。除非另有說(shuō)明，所有的培養(yǎng)在28°進(jìn)行，燒瓶在定軌振蕩器中以250rpm搖動(dòng)。所有的培養(yǎng)基和容器均為無(wú)菌的，所有的培養(yǎng)過(guò)程為無(wú)菌的。
實(shí)施例1到3涉及結(jié)構(gòu)式如上顯示的化合物IB-00208的制備，實(shí)施例4涉及它的生物活性。
實(shí)施例1制備有機(jī)體本申請(qǐng)使用的分類(lèi)學(xué)方法為通常使用的傳統(tǒng)放線菌分類(lèi)學(xué)，文獻(xiàn)中有報(bào)道。
21天內(nèi)每周研究和記錄培養(yǎng)后的所有培養(yǎng)物。必要時(shí)加入NaCl。
有機(jī)體描述如下
21天后在有ASW的ISP2，ISP6，Bennet和172ATCC中觀察到良好的生長(zhǎng)。菌落淺棕色。在使用ASW的ISP3，ISP5，Czapek和ISP7中得到更少的生長(zhǎng)并沒(méi)有觀察到溶解的色素。無(wú)氣生菌絲體形成。基質(zhì)菌絲體為分支的。基質(zhì)菌絲體上可以發(fā)現(xiàn)分離的孢子。孢子是細(xì)長(zhǎng)的并且稀少。沒(méi)有觀察到形成其他東西。
在ISP1以及其他固體培養(yǎng)基中形成褐色可擴(kuò)散的色素。NaCl抗性超過(guò)5％。最適生長(zhǎng)溫度范圍在25°到35℃之間。有機(jī)體可以在作為唯一碳源的葡萄糖，半乳糖，鼠李糖，和木糖上生長(zhǎng)，然而，在果糖，棉子糖，m-肌醇，蔗糖，和α-蜜二糖上的生長(zhǎng)為陰性的，并且在甘露糖醇和松三糖中是難料的。
有機(jī)體的化學(xué)成分研究顯示meso-2，6-二氨基庚二酸存在于菌株P(guān)O13-046細(xì)胞水解產(chǎn)物整體中。
PO13-046與其他相似的菌株的脂肪酸甲酯的比較公開(kāi)于表2。
表2
i-150(9.2％)，a-150(19.6％)，i-170(1.7％)，和a-170(3.25％)對(duì)于鏈霉菌屬(Streptomyces)是重要的脂肪酸，但是在Actinomadura中為次要成分。
1Actinomadura formosensis在先于Thermonospora formosensis。
基于前面的特征，培養(yǎng)物被確定為Actinomadura屬的物種，與A.Vinacea類(lèi)型菌株具有94％相似性。
實(shí)施例2IB-00208的發(fā)酵由優(yōu)選的有機(jī)體生產(chǎn)IB-00208需要的步驟為原種培養(yǎng)物Actinomadura sp.菌株P(guān)O 13-046的純培養(yǎng)物的全部發(fā)酵液冷凍于20％甘油中。
接種物在250cc搖瓶中，冷凍培養(yǎng)物或生長(zhǎng)良好的斜面培養(yǎng)物用來(lái)接種100ml在先前描述的培養(yǎng)基。將該燒瓶培養(yǎng)48h，用作第一階段接種物。用10％第一階段接種物接種2L Erlenmeyer燒瓶中的500ml同樣培養(yǎng)基。將該燒瓶培養(yǎng)48h。
發(fā)酵用2.5L第二階段接種物接種75L發(fā)酵罐中的50L已經(jīng)描述的生產(chǎn)培養(yǎng)基。隨著400rpm的攪動(dòng)和0.5V/V.M的氣流發(fā)酵96小時(shí)。
表3
通過(guò)針對(duì)鼠類(lèi)白血病P-388測(cè)定全部發(fā)酵液或通過(guò)HPLC可以監(jiān)控IB-00208的產(chǎn)率。
實(shí)施例3IB-00208的分離將4.5升全部收獲的發(fā)酵液過(guò)濾分離生物質(zhì)及其他固體。用CHCl3∶CH3OH∶H2O(2∶1∶1)混合溶劑(1.5L)萃取菌絲體濾餅兩次，濃縮下層活性物。將有機(jī)溶劑真空濃縮并且蒸干得到1.2g粗提物。
將萃取物在硅膠上層析，使用正己烷/乙酸乙酯和乙酸乙酯/甲醇混合物作為洗脫溶劑。用乙酸乙酯/醇1∶1洗脫110mg包含抗腫瘤活性的IB-00208的流分。
通過(guò)硅膠柱層析進(jìn)一步純化包含IB-00208的流分，用氯仿/甲醇95∶5洗脫得到18mg IB-0208純化合物。
實(shí)施例4生物活性IB-00208抗腫瘤活性已經(jīng)在小鼠白血病P-388，人類(lèi)的肺癌A-549，人類(lèi)的結(jié)腸癌HT-29和人類(lèi)的黑素瘤MEL-28細(xì)胞培養(yǎng)物中體外測(cè)定。按Bergeron等公開(kāi)的方法進(jìn)行測(cè)定。所有4個(gè)細(xì)胞系的IC50值為0.001，0.001，0.001，和0.001μg/ml。
參考文獻(xiàn)本申請(qǐng)引用下列參考文獻(xiàn)ATCC Catalog 1996；Bergeron等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.121848，1984；Guerrant和Moss，Anal.Chem.56633，1984；Hasegawa等人，J.Gen.Appl.Microbiol.29319，1983；Shirling和Gotlieb.Int.J.Syst.Bacteriol.16313，1966；Van der Auwera等人，J.Microbiol.Methods，4265，1986；Waksman，TheActinomycetes vol.II331，1961.
本發(fā)明，包括優(yōu)選方案，已經(jīng)被詳細(xì)描寫(xiě)。但是，顯然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)上述公開(kāi)修飾和/或改進(jìn)本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.通式如下的化合物 或 其中各R1相同或不同，可以為氫，?；?，烷基，烯基，芳基，芐基，堿金屬，和/或糖，以及R2和R3可以為氫，烷基，或一起形成不飽和鍵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的下式化合物
3.生產(chǎn)化合物IB-00208的方法，其中包括在含水營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠產(chǎn)生它的微生物菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中進(jìn)一步包括從培養(yǎng)肉湯中分離和純化化合物IB-00208。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中生產(chǎn)IB-00208的有機(jī)體為基本上純的培養(yǎng)菌株P(guān)O 13-046，從西班牙巴倫西亞大學(xué)Colección de Cultivos Tipo得到，登錄號(hào)為CECT 5318。
6.一種基本上純的菌株P(guān)O 13-046培養(yǎng)物，從Thermomonosporaceae科的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中分離，分類(lèi)學(xué)分類(lèi)為Actinomadura sp。
7.抗腫瘤藥物組合物，其中包含權(quán)利要求1化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
8.抗腫瘤藥物組合物，其中包含權(quán)利要求2的化合物IB-00208和藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
從屬于<i>Actinomaduru sp.<i>屬的新的海洋微生物菌株P(guān)O13－046分離出一類(lèi)新的抗腫瘤化合物IB－00208。式(I)或(II)中R
文檔編號(hào)A61P35/00GK1449399SQ01814899
公開(kāi)日2003年10月15日 申請(qǐng)日期2001年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月29日
發(fā)明者J·佩雷滋－巴滋, L·M·卡內(nèi)多, D·加西亞格拉瓦洛斯, F·羅梅羅, F·埃斯普里戈 申請(qǐng)人:拜奧馬研究所有限公司