調(diào)節(jié)參與黑色素合成的酶表達(dá)的寡核苷酸的制作方法

專利名稱：調(diào)節(jié)參與黑色素合成的酶表達(dá)的寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型寡核苷酸序列及其衍生物。
這些新型寡核苷酸序列能夠與黑色素合成的途徑中的一種必需酶的編碼基因或其基因產(chǎn)物雜交。
本發(fā)明還涉及這些新型寡核苷酸作為皮膚褪色劑或漂白劑在美容組合物或皮膚護(hù)理組合物中的用途。
對于人類來說，皮膚、毛囊或眼睛中的黑色素的合成和分布導(dǎo)致色素沉著。色素沉著是遺傳決定的，但也受許多內(nèi)部或外部因素的調(diào)節(jié)。黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的黑色素及黑色素細(xì)胞的數(shù)目、他們的酪氨酸酶活性和向角質(zhì)化細(xì)胞運(yùn)輸黑色素的能力以及含有黑色素顆粒的黑色素體的大小均影響人類皮膚的顏色，對于每個人來講，皮膚顏色的差異主要受到或多或少的來自紫外線的輻射作用影響。換句話說，對于每個人，當(dāng)受到最弱的紫外輻射時存在一個基本的膚色，相當(dāng)于他最淡的皮膚顏色，當(dāng)受到稍強(qiáng)一些的紫外輻射時，其皮膚的色素沉著也強(qiáng)一些，當(dāng)受到持久的強(qiáng)紫外輻射時，比如在高山中遇到的那樣，色素沉著達(dá)到最大，相當(dāng)于他最深的皮膚顏色。
另外，眾所周知，關(guān)于皮膚色素沉著在世界人群中存在很大的遺傳多樣性。因此，不同的人群，其如上所述的基本膚色都在非常淡或非常深的范圍內(nèi)表現(xiàn)得淡一些或深一些。不同的人群，其基本色素沉著時和最大色素沉著時的膚色的差別也或多或少的不同。因此，眾所周知，那些具有淡膚色(基本色素沉著)的人群對紫外輻射的反應(yīng)較快和/或較明顯，并且因此比較容易具有深色膚色，甚至這些人并沒有有意在陽光下持續(xù)暴露一定時間也如此。在下文中，這些人被稱作“對紫外輻射非常敏感的人”。特別是亞洲人種或被稱為混合人種的人群。
另外，人們的皮膚上特別是在臉或手上有較深的或者帶顏色的部分或者斑點(diǎn)，使皮膚具有一定的不均勻性。這些斑點(diǎn)是由于表皮的角質(zhì)化細(xì)胞中的黑色素的明顯集中所致。
皮膚色素沉著的形成機(jī)理涉及黑色素的合成，該機(jī)理特別復(fù)雜，簡要概括為下列主要步驟酪氨酸→多巴→多巴醌(Dopaquinone)→多巴色素→黑色素已知該系列反應(yīng)中涉及的酶類主要是酪氨酸酶及酪氨酸酶相關(guān)蛋白(TPR-1)。這些酶特別地催化酪氨酸形成多巴的反應(yīng)(二羥基苯丙氨酸)以及多巴形成多巴醌的反應(yīng)，最后形成黑色素。這些酶在黑色素形成反應(yīng)機(jī)制中不是單獨(dú)起作用的。事實(shí)上，酪氨酸酶和TRP-1形成酶復(fù)合物(Wincler et al.(1994)Cell，Mol.Biol.Res.407-8；orlowet al.(1994)，J.of Investigative Dermatology 103196-211)。因此，這兩種酶協(xié)同作用，并且，似乎一種酶不存在時另一種酶也不起作用。眾所周知，當(dāng)細(xì)胞中TRP-1缺乏時，也觀察到酪氨酶的活性的降低(Orlow et al.(1994))；這意味著，酪氨酸酶必須在TRP-1的存在下才有活性(Zhao.et al.(1996)J.of Investigative Dermatology106744-752)。
在本文的下文中，這些黑色素合成途徑中涉及的必需酶被稱為“色素沉著必需酶”。
如果一個分子通過抑制表皮黑色素細(xì)胞的活性而直接作用于這些細(xì)胞和/或阻斷黑色素生物合成途徑中的一個步驟，則該分子被認(rèn)為是有褪色作用的分子。特別是指該分子能夠抑制一種參與黑色素形成的酶或者它能與黑色素合成鏈中的化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)。
已知的有褪色作用物質(zhì)特別是氫醌及其衍生物，抗壞血酸及其衍生物，胎盤提取物，曲酸，阿魏酸，熊果苷，二羥苯衍生物(WO 00/47045)，鄰甲氧基苯酚衍生物(WO 00/47179)，4-(2，3-二羥苯基)環(huán)己醇(WO00/56279)，間苯二酚衍生物(WO 00/56702)和苯酚酰胺類(WO99/32077)。這些物質(zhì)都有一定的不足。它們可能不穩(wěn)定，需要很高的應(yīng)用濃度，對于它們的作用方式缺乏特異性或者具有細(xì)胞毒性或刺激性。
在美容品或護(hù)膚品局部應(yīng)用中特別希望高效、無害的褪黑物質(zhì)。這些物質(zhì)特別地應(yīng)用在治療黑色素細(xì)胞過度活化引起的局部的過度色素沉著，如特發(fā)性黑斑病，由于良性的黑色素細(xì)胞的過度活化和增殖引起的局部過度色素沉著，如已知的老年斑(senile lentigo老年斑)，意外的過度色素沉著，如光致敏或瘢痕性的過度色素沉著，以及某些白斑病，比如白斑。在后一病例中，使皮膚重新色變化是不可能的，因此為了使皮膚呈現(xiàn)比較均一的顏色，而將褪色的區(qū)域邊界周圍的色素沉著弱化。
褪色物質(zhì)也被某些人用作皮膚漂白劑，特別是上文提到的那些人，他們對紫外輻射非常敏感，為了淡化膚色，特別是他們的臉部和手部的膚色，以致于盡可能保持白皙或均一的膚色，或者至少降低紫外線的色素沉著效果。
因此，專業(yè)人員面臨的問題是設(shè)計、制造或分離用于人類皮膚、體毛、頭發(fā)的新型褪色物質(zhì)或者新型漂白劑，它們沒有已知物質(zhì)的缺點(diǎn)，即它們對皮膚無刺激、無毒和/或無致敏，并且在組合物中穩(wěn)定。
WO 99/25819中公開了一種反義寡核苷酸在治療由黑色素細(xì)胞機(jī)能障礙引起的疾病，特別是白斑病和其它褪色疾病中的應(yīng)用。在這些病理的皮膚狀態(tài)下，由于異常高的替拿素(tenascin)含量導(dǎo)致色素沉著不足。該文件中描述的寡核苷酸通過調(diào)節(jié)替拿素的表達(dá)來抵抗色素沉著不足。
另一方面，本發(fā)明的目的包括提供作用于黑色素生成過程的一種褪色劑，其意圖首先是在基本均一的色素沉著情況下漂白皮膚、體毛或頭發(fā)，也就是降低它們的色素沉著，其次是在皮膚顯示非均一色素沉著時治療皮膚的過度色素沉著。
本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)寡核苷酸能夠與編碼色素沉著必需酶的基因或其產(chǎn)物(比如RNAs)雜交。
因此，本發(fā)明所述的用于調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞中色素沉著必需酶的表達(dá)的寡核苷酸參與上文所述的黑色素生成上游反應(yīng)。甚至在非常低的濃度這種活性就體現(xiàn)出來，這增加了這些寡核苷酸的優(yōu)點(diǎn)。另外，本文所述的寡核苷酸無細(xì)胞毒性。
本發(fā)明所述的寡核苷酸為通常應(yīng)用的物質(zhì)所面對的問題提供了理想的解決方法。已知的抑制酪氨酸酶或TRP-1活性的物質(zhì)(特別是氫醌及其衍生物，抗壞血酸及其衍生物，胎盤提取物，曲酸和熊果苷)，由于它們較差的特異性而引起許多不能接受的副作用。因此，本發(fā)明通過調(diào)節(jié)色素沉著必需酶的生成而不是直接抑制該酶以達(dá)到褪色的效果，從而解決了以往研究者所遇到的問題。
因?yàn)?，該必需酶是以?fù)合物的形式協(xié)同起作用。因此，為了解決存在的問題，發(fā)明者描述了抑制酶復(fù)合物中一種或另一種酶的新型寡核苷酸。
本發(fā)明所述的寡核苷酸本身是新的，作為醫(yī)用產(chǎn)品也是新的。
本發(fā)明涉及一種寡核苷酸，其包含7-25個核苷酸，優(yōu)選地9-25個，12-25個，15-25個或18-25個，并更優(yōu)選地包含20個核苷酸，該寡核苷酸能與編碼色素沉著必需酶之一的基因或其產(chǎn)物雜交。特別是，所述的寡核苷酸能與編碼酪氨酸酶或TRP-1的基因或其產(chǎn)物雜交。
本發(fā)明更具體地涉及一種如上所述的寡核苷酸，并且該寡核苷酸能夠特異性地與編碼酪氨酸酶或TRP-1的基因或其產(chǎn)物雜交。
特別是，它是一種序列選自如下所示的序列SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.11的寡核苷酸-SEQ ID NO.15’-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3’-SEQ ID NO.25’-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3’-SEQ ID NO.35’-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3’-SEQ ID NO.45’-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3’-SEQ ID NO.55’-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3’-SEQ ID NO.65’-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3’-SEQ ID NO.75’-CAAGGTCTGCAGGAACTGGC-3’-SEQ ID NO.85’-CCTCACAAGGTCTGCAGGAA-3’-SEQ ID NO.95’-CTACAGACAATCTGCCAAGA-3’-SEQ ID NO.10 5’-GCATTCTTCCTCTAGTCCTC-3’-SEQ ID NO.11 5’-TTCCAGTACCTCACAATCCT-3’
本發(fā)明的主題還包括一種寡核苷酸用作一種新產(chǎn)品，該寡核苷酸的序列是如上所述的序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.11中的一種。
在本發(fā)明的上下文中，“編碼酪氨酸酶的基因”是指酪氨酸酶基因的基因組序列。類似的，“編碼TRP-1的基因”是指TRP-1基因的基因組序列。
酪氨酸酶和TRP-1在黑色素形成中的關(guān)鍵作用是已知的。針對編碼一種酶或蛋白的信使RNA的寡核苷酸在調(diào)節(jié)該酶或蛋白質(zhì)表達(dá)中的用途也是已知的。但是，本發(fā)明的發(fā)明者所開發(fā)的技術(shù)從未作為一種褪色手段被應(yīng)用過。
本發(fā)明所述的寡核苷酸設(shè)計成能夠與信使RNA或基因直接雜交。因此，他們便對由所述基因產(chǎn)生的酪氨酸酶或TRP-1的含量實(shí)施最終的調(diào)節(jié)成為可能。
在本申請文件中，術(shù)語“雜交”是指在通常位于兩條核酸鏈上的互補(bǔ)堿基之間形成氫鏈，也被認(rèn)為Watson-crick配對，從而形成雙螺旋形式的雙鏈體。
相同長度的兩條核酸序列之間的互補(bǔ)程度由比對之后將第一條序列與第二條序列的互補(bǔ)序列進(jìn)行比較而確定。通過確定比較的兩條序列間核苷酸相同的相同位點(diǎn)數(shù)目，除以總的位點(diǎn)數(shù)，乘以100就得到兩條序列間的互補(bǔ)程度。
術(shù)語“特異雜交”特別是指存在一定程度的互補(bǔ)性，從而在希望發(fā)生特異性結(jié)合的條件下足以避免寡核苷酸與非靶序列的非特異性結(jié)合?？梢岳斫鉃檫_(dá)到特異性雜交，寡核苷酸無需與靶核酸序列具有100％互補(bǔ)性。特別是，具有至少大約80％的互補(bǔ)程度的寡核苷酸能夠與選定的靶核酸序列特異性雜交。
本發(fā)明所述的寡核苷酸優(yōu)選地與編碼色素沉著必需酶的基因或其產(chǎn)物特異性雜交。特別地，本發(fā)明的寡核苷酸能夠或者與編碼酪氨酸酶或TRP-1的基因DNA雜交，或者是可以與一種或另一種這些基因衍生的mRNA雜交。本發(fā)明所述的寡核苷酸包含一定數(shù)目的核苷酸，其在同一性及數(shù)目上足以進(jìn)行特異雜交。這種性質(zhì)通常被稱為“反義”。
因此本發(fā)明的一個主題是能夠與相關(guān)基因的上游，或編碼區(qū)，或與該基因的翻譯起始密碼區(qū)特異雜交的寡核苷酸。
本發(fā)明的主題還是能與一種色素沉著必需酶，特別是酪氨酸酶或TRP-1的編碼DNA或信使RNA特異雜交的寡核苷酸。
本發(fā)明的主題還是能夠與一種色素沉著必需酶，特別是酪氨酸酶或TRP-1編碼基因或mRNA的5′非編碼區(qū)、起始密碼區(qū)、編碼區(qū)或者3′非編碼區(qū)特異雜交的寡核苷酸。
在本發(fā)明的上下文中，“編碼酪氨酸酶的DNA”或“編碼TRP-1的DNA”是指外顯子和內(nèi)含子，特別是指外顯子。
具體說明如下▲本發(fā)明中具有序列SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，和SEQ ID NO.4的寡核苷酸與編碼TRP-1的基因或mRNA的5′非編碼區(qū)特異雜交。
▲本發(fā)明中具有序列SEQ ID NO.5的寡核苷酸與編碼TRP-1的基因或mRNA的起始密碼子區(qū)特異雜交。
▲本發(fā)明中具有序列SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的寡核苷酸與編碼酪氨酸酶的基因或mRNA的5′非編碼區(qū)特異雜交。
▲本發(fā)明中具有序列SEQ ID NO.9的寡核苷酸與編碼酪氨酸酶的基因或mRNA的編碼區(qū)特異地雜交。
▲本發(fā)明中具有序列SEQ ID NO.10的寡核苷酸與編碼酪氨酸酶的基因或mRNA的起始密碼子區(qū)特異地雜交。
▲本發(fā)明中具有序列SEQ ID NO.11的寡核苷酸與編碼TRP-1的基因或mRNA的5′非編碼區(qū)特異地雜交。
本發(fā)明的一個主題還是在糖組分、核堿基組分或核苷酸間主鏈上含有一個或多個化學(xué)修飾的寡核苷酸。這些修飾使本發(fā)明的寡核苷酸具有所需的物化特性，如增加的生物可利用性，與靶序列的親和性的提高，細(xì)胞內(nèi)在化的提高，或者更好的生物穩(wěn)定性，或者在細(xì)胞內(nèi)核酸酶的存在下的穩(wěn)定性的提高。
舉例來說，可賦予這些特性的修飾為核苷糖組分上的2′-O-烷基和2′-O-氟代衍生物，以及核苷酸間主鏈內(nèi)的硫代磷酸酯衍生物或甲基膦酸酯衍生物。
本申請文件中，術(shù)語“寡核苷酸”是指由天然核堿基和呋喃五碳糖基團(tuán)制成的多核苷酸，它們構(gòu)成核苷，核苷通過磷酸二酯鍵彼此相連。因此，術(shù)語“寡核苷酸”是指由天然亞基或它的密切同源物質(zhì)構(gòu)成的天然物質(zhì)或合成物質(zhì)。
術(shù)語“寡核苷酸”也可指與天然寡核苷酸具有相似的功能但可能含有非天然部分的組分。該寡核苷酸可能含有修飾的糖組分，修飾的核堿基組分或修飾的核苷酸間連鍵。在可能的修飾中，優(yōu)選的修飾為糖組分上的2′-O-烷基衍生物，特別是2′-O-乙氧基-甲基或2′-O-甲基衍生物，或者核苷酸間主鏈上是硫代磷酸酯或甲基膦酸酯。
在本發(fā)明優(yōu)選的修飾中包括嵌合的寡核苷酸。該寡核苷酸包含至少兩個化學(xué)上不同的區(qū)域，每一個區(qū)域至少包含一個核苷酸。特別是包括一個或多個含有修飾的核苷酸的區(qū)域，該修飾核苷酸使其具有一個或多個有益的特性，比如更好的生物學(xué)穩(wěn)定性、增加了的生物可利用性、細(xì)胞內(nèi)在化提高、或者與靶RNA的親和性間主鏈提高。
優(yōu)選地，核苷酸間主鏈可以全部或部分地由磷酸二酯、硫代磷酸酯或甲基膦酸酯，或者磷酸二酯和/或硫代磷酸酯和/或甲基膦酸酯鍵的組合所組成。
因此，本發(fā)明的寡核苷酸的特征在于它的核苷酸間主鏈的一些磷酸二酯基團(tuán)被硫代磷酸酯基團(tuán)和/或甲基膦酸酯基團(tuán)取代。
或者，本發(fā)明的寡核苷酸的特征在于所有的磷酸二酯基團(tuán)被硫代磷酸酯基團(tuán)或甲基膦酸酯基團(tuán)取代。
或者，磷酸二酯基團(tuán)全部或部分被硫代磷酸酯基團(tuán)和/或甲基膦酸酯基取代。
術(shù)語“寡核苷酸”還可以指其上連接有環(huán)狀質(zhì)粒類載體或線性核酸類或肽類載體的寡核苷酸。
本發(fā)明的寡核苷酸作為醫(yī)用產(chǎn)品是新的。
本發(fā)明的一個主題還是一種美容品或護(hù)膚品組合物，其含有至少一種如上所述的寡核苷酸和美容上或護(hù)膚上可接受的介質(zhì)。這種組合物可能含有一種或多種活性劑以加強(qiáng)所希望的效果。
本發(fā)明的一個主題還是至少一種針對色素沉著必需酶之一、特別是酪氨酸酶或TRP-1的編碼基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的寡核苷酸序列在制備美容或護(hù)膚組合物中的用途，該組合物可以褪色或漂白人類皮膚、體毛或頭發(fā)，或去除或弱化人類皮膚的色斑。
本發(fā)明還涉及能夠與色素沉著必需酶之一、特別是酪氨酸酶或TRP-1的編碼基因或其產(chǎn)物特異地雜交的一種寡核苷酸序列，作為美容劑，特別是用于褪色或漂白人類皮膚、體毛、或頭發(fā)和弱化人類皮膚色斑中的用途。
本發(fā)明的主題還是至少一種針對色素沉著必需酶之一、特別是酪氨酸酶或TRP-1的編碼基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的寡核苷酸序列作為黑色素合成的抑制劑用以制造美容或護(hù)膚組合物中的用途。
本發(fā)明還涉及至少一種上述寡核苷酸制造用于經(jīng)局部途徑治療或預(yù)防由酪氨酸酶和/或TRP-1過量表達(dá)導(dǎo)致的疾病的醫(yī)用產(chǎn)品中的用途。該醫(yī)用產(chǎn)品可能用于抑制黑色素的合成，特別是皮膚的褪色或漂白，但還可用于療病或預(yù)防黑色素細(xì)胞過度活化引起的局部過度色素沉著，如特發(fā)性黑斑病，由良性的黑色素細(xì)胞過度活化和增殖引起的局部過度色素沉著，如老年斑(著色斑)，和意外的過度色素沉著，如光致敏或損傷后疤痕，以及治療某些白斑病，如白斑。
本發(fā)明的主題還是至少一種能針對色素沉著必需酶之一、特別是酪氨酸酶或TRP-1的編碼基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的寡核苷酸在用于人類皮膚的褪色或漂白美容組合物中的用途。
本發(fā)明還涉及上述的寡核苷酸在調(diào)節(jié)色素沉著必需酶之一、特別是酪氨酸酶或TRP-1的表達(dá)中的用途。
本發(fā)明的主題還是至少一種針對色素沉著必需酶之一、特別是酪氨酸酶或TRP-1的編碼基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的寡核苷酸序列在制備用于人類皮膚的褪色或漂白皮膚組合物中的用途。
本發(fā)明還涉及一種褪色或漂白人類皮膚的美容或皮膚護(hù)理治療方法，包括將包含至少一種針對色素沉著必需酶之一、特別是酪氨酸酶或TRP-1的編碼基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的寡核苷酸的美容組合物應(yīng)用于色素沉著的皮膚。
本發(fā)明的主題還是一種褪色組合物，其特征在于，它在美容或皮膚護(hù)理可接受的介質(zhì)中包含至少一種針對色素沉著必需酶之一，特別是酪氨酸酶或TRP-1的編碼基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的寡核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明如上所述的組合物、用途和治療方法優(yōu)選的實(shí)施方案，寡核苷酸的序列為如下所示的序列中的一種-SEQ ID NO.15’-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3’-SEQ ID NO.25’-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3’-SEQ ID NO.35’-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3’-SEQ ID NO.45’-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3’-SEQ ID NO.55’-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3’-SEQ ID NO.65’-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3’本發(fā)明所述的美容或皮膚護(hù)理組合物適于局部應(yīng)用，因此其含有美容上或皮膚護(hù)理上可接受的介質(zhì)，也就是可與皮膚相容的介質(zhì)。本發(fā)明中的寡核苷酸序列可占組合物總重量的0.00001％到10％，優(yōu)選地占0.0003％到3％。
本發(fā)明的組合物可以是適于局部應(yīng)用的習(xí)慣上常用的藥物形式，特別是含水、水-醇或油的溶液，水包油、油包水或多相乳狀液形式，水或油性凝膠形式，液體的、糊狀的或固體無水的產(chǎn)品，聚合顆粒的分散溶液，如在水相或油相中的小球或小膠囊，或者如美國專利4,508,703中描述的離子型或非離子型的脂囊泡分散體。
該組合物可以是或多或少流動性的，并且可以是白色或彩色霜狀、軟膏狀、奶狀、凝膠狀、洗液狀、液狀、糊狀或摩絲狀外觀。它可以任選把以氣溶膠的形式應(yīng)用于皮膚上。它也可以是固體形式，可是或不是粉狀的，例如唇膏或粉餅狀，也可以貼片狀、筆狀、刷狀以及涂敷器具狀，以便于面部或手部斑點(diǎn)的局部應(yīng)用。它可以被用做護(hù)理用品或用作化妝用品。
習(xí)慣上，本發(fā)明的組合物也可以包含在美容上和皮膚護(hù)理中常見的佐劑，如親水的或親油的膠凝劑、親水的或親油的活性劑、防腐劑、抗氧化劑、溶劑、香料、填料、防曬劑、色素、香味吸收劑和著色劑。各種佐劑的含量為該領(lǐng)域的常規(guī)用量。根據(jù)這些佐劑的性質(zhì)，它們分別被加到脂相、水相、脂囊泡或小顆粒中。
當(dāng)該美容或皮膚護(hù)理用組合物為乳劑時，脂相的比例通?？梢詾榻M合物總重量的5-80％重量百分比，優(yōu)選地為5-50％重量百分比。在乳劑形式的組合物中所用的油，乳化劑和共乳化劑選自該領(lǐng)域常用的物質(zhì)。組合物中乳化劑和共乳化劑的比例通常為組合物總重量的0.3％-30％重量百分比，優(yōu)選地為0.5％到20％重量百分比。
可以與本發(fā)明中的寡核苷酸聯(lián)合使用的油有礦物油(液體凡士林)、植物來源的油(鱷梨油、大豆油)、來源于動物的油(羊毛脂)、合成油(全氫化角鯊烯)、硅油(環(huán)(二)甲基硅酮)以及氟化油(全氟聚醚)。脂肪醇(十六(烷)醇)、脂肪酸以及蠟(巴西棕櫚蠟，地蠟)也可用作脂肪物質(zhì)。
可與本發(fā)明的寡核苷酸聯(lián)合使用的乳化劑和共乳化劑有，例如聚乙二醇的脂肪酸酯，如PEG-20硬脂酸酯，以及甘油的脂肪酸酯，如硬脂酸甘油酯。
可與本發(fā)明的寡核苷酸聯(lián)合使用的親水性膠凝劑有，特別是羧基乙烯基聚合物(丙烯酸聚合物)，丙烯類共聚物，如丙烯酸酯/丙烯酸烷基酯共聚物、聚丙烯酰胺、多糖、天然樹膠和粘土。作為親脂性膠凝劑，可提及的有修飾的粘土如皂土，脂肪酸的金屬鹽，疏水硅石以及聚乙烯。
本發(fā)明的一個主題是含有至少一種如上所述的寡核苷酸及一種或多種其它活性劑的美容或皮膚護(hù)理組合物。
本發(fā)明還涉及至少一種如上所述的寡核苷酸在制備醫(yī)用產(chǎn)品中的用途，該醫(yī)用產(chǎn)品旨在同時或分別或以隨時間擴(kuò)散的方式與一種或多種活性劑聯(lián)合使用。
所述的可與本發(fā)明的寡核苷酸聯(lián)合使用的并以純物質(zhì)使用或來源于含有這些分子的提取物的活性劑，特別是以下化合物鞣花酸及其衍生物；對苯二酚；熊果苷；間苯二酚及其衍生物；維生素C及其衍生物；泛酸磺酸酯及其衍生物；曲酸；胎盤提取物；可直接或間接干擾α-促黑素(α-MSH)或其受體或促腎上脈皮質(zhì)激素(ACTH)的分子；多羥基化合物，如甘油、乙二醇或丙二醇；維生素；溶角蛋白劑或脫皮劑，如水楊酸及其衍生物；α-醇酸，如乳酸或蘋果酸，可以是單獨(dú)的或接枝的；抗壞血酸及其衍生物；視黃酸；視黃醛；視黃醇及其衍生物，如棕櫚酸酯、丙酸酯或乙酸酯，其可以或不以脂質(zhì)體制劑形式存在；antiglycation劑或抗氧化劑，其單獨(dú)或聯(lián)合使用，如維生素E(生育酚)及其衍生物，硫代?；撬?、亞?；撬?、氨基胍、硫胺素焦磷酸、吡哆胺、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、維生素B6(吡哆醇)、三磷酸腺苷；抗炎劑，如甘草亭酸十八烷基酯；潤膚劑及其混合物，化學(xué)的或物理的防曬劑，如微粉化氧化鋅，氧化鈦，丁基甲氧基二苯甲?；淄楹图籽趸夤鹚嵝刘?；以及脫氧核糖核酸和核酸。如果不相容時，這些其它的活性劑和/或本發(fā)明的寡核苷酸可能摻入小球，特別是美國專利4,508,703所述的由離子或非離子型兩親脂質(zhì)構(gòu)成的小泡，或小顆粒。
下面的實(shí)施例用于說明本發(fā)明而不是限制。
考慮到在體外培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性及與普通實(shí)踐的一致性，實(shí)施例2到4利用硫代磷酸酯衍生物，實(shí)施例5到12同樣利用硫代磷酸酯或膦酸二酯衍生物制備。
下面的實(shí)施例中，除另有說明外，所有的百分比均為重量百分比。實(shí)施例1寡核苷酸的合成舉例來說，寡核苷酸按照操作手冊，采用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺衍生化學(xué)法利用自動合成儀(Perseptive Biosystems Expedite Model 8909)合成。β-氰乙基二異丙基亞磷酰胺由Perseptive Biosystems公司提供。對于磷酸二酯寡核苷酸，亞磷酸的氧化步驟在碘溶液中完成。對于硫代磷酸酯寡核苷酸，亞磷酸的氧化步驟在含有0.05M的3H-1，2-苯并二硫-3-酮1，1-二氧化物的無水乙腈溶液中完成。從柱子(Controlled PoreGlass，Perspective Biosystems)上裂解下后，用33％的氨水溶液55℃處理18小時進(jìn)行序列的脫保護(hù)。寡核苷酸在乙酸鈉存在下經(jīng)乙醇沉淀法純化。利用氯化鈉梯度洗脫的離子交換層析和乙酸三乙銨存在下的乙腈梯度洗脫的C18反相層析進(jìn)行高壓液相層析檢驗(yàn)。
合成的寡核苷酸如表1所述的前11個序列，序號為SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.11。下面實(shí)施例研究的主題是它們的脫色活性。
在表1中，每個序列末尾處的數(shù)字是指該寡核苷酸在原始序列中的位置。
這些序列分別來源于稱為“HUMTYRA”的人酪氨酸酶cDNA序列，(Shibahara等人發(fā)表于/Tohoku J.Exp.Med.1988，156403(Genbank進(jìn)入號為M27160))，稱為“HSTYRRP”的人TRP-1 cDNA序列(Cohen等人發(fā)表于Nucl.Acides Res.1990，182807(Genbank進(jìn)入號為X51420))以及來源于稱為“AF 001295”的另一個TRP-1序列(Box等人發(fā)表于Mamm.Genome 1998，950(Genbank進(jìn)入號為AF 001295))。
另外，為了進(jìn)行比較以證實(shí)本發(fā)明的寡核苷酸相對于編碼酪氨酸酶或TRP-1的基因或其產(chǎn)物的特異性，在本發(fā)明的序列SEQ ID NO.2的基礎(chǔ)上合成兩條寡核苷酸，命名為*“正義對照”(sense control)序列，如表1中SEQ ID NO.12所示，與序列SEQ ID NO.2的堿基序列相反。
*“混淆對照”(scrambled control)序列，如表1中SEQ ID NO.13所示，與序列SEQ ID NO.2具有相同種類和數(shù)目的堿基，但順序隨意放置。
表1
實(shí)施例2本發(fā)明的寡核苷酸對正常人黑色素細(xì)胞(NHMs)的褪色效果。
就實(shí)施例1表1中的本發(fā)明的寡核苷酸(SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.11)對黑色素生成的作用，以及對黑色素細(xì)胞生成黑色素的調(diào)節(jié)能力進(jìn)行了研究。作為對照，同時對“正義對照”(SEQ ID NO.12)和“混淆對照”(SEQ IN NO.13)寡核苷酸的這種作用進(jìn)行了研究。
回憶一下，在黑色素生成反應(yīng)機(jī)制中，酪氨酸酶和TRP-1形成酶促復(fù)合物，催化L-多巴形成多巴醌，再形成多巴色素。這兩個酶協(xié)同作用，并且似乎一個酶需要另一個酶存在下起作用。事實(shí)上，當(dāng)用針對TRP-1的反義寡核苷酸使細(xì)胞中TRP-1缺乏時，觀察到酪氨酸酶(也稱作“多巴氧化酶”)的活性也降低。酪氨酸酶因其多功能性質(zhì)也被稱為“多巴氧化酶”；事實(shí)上，它在酪氨酸形成多巴的氧化過程中發(fā)揮多巴氧化酶的功能。
本檢測方法的原理是測量多巴氧化酶將反應(yīng)底物L(fēng)-多巴轉(zhuǎn)化成多巴色素的反應(yīng)速率。通過在一定時間間隔測量光密度來定量生成的多巴色素，從而有可能針對檢測中作用的每種寡核苷酸及對照實(shí)驗(yàn)計算多巴氧化酶的反應(yīng)速率。進(jìn)而根據(jù)獲得的結(jié)果有可能評價檢測的寡核苷酸對黑色素生成的作用。與對照實(shí)驗(yàn)相比反應(yīng)速率的下降對應(yīng)于酶活性的下降，因而對應(yīng)于黑色素的形成減少及褪色效果。黑色素細(xì)胞培養(yǎng)物的制備及用寡核苷酸的處理黑色素細(xì)胞從白種人的兒童包皮中獲得。將皮膚碎片用PBS(Gibco，Paisley，GB)沖洗，然后用70％乙醇沖洗。最后用PBS沖洗后，將皮膚切成含有最少真皮的1mm的細(xì)條。將皮膚細(xì)條在0.25％的胰蛋白酶溶液(Gibco，Paisley，GB)中4℃溫育過夜，分離真皮和表皮。溫育后，用手術(shù)刀刮下表皮的細(xì)胞以回收表皮細(xì)胞。將細(xì)胞置于含有10％(V/V)胎牛血清(Gibco，Paisley，GB)的E-199培養(yǎng)基(Gibco，Paisley，GB)中終止胰蛋白酶的反應(yīng)。勻漿并去除表面漂浮的角質(zhì)細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液過濾并離心，將沉淀置于貼壁培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基1)，培養(yǎng)基的組成如下表所示，其中EGF指表皮生長因子。
細(xì)胞計數(shù)后，以200000/cm2的比例接種于培養(yǎng)瓶中，于37℃、飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后，將貼壁培養(yǎng)基換成KSFM培養(yǎng)基(Gibco，Paisley，GB)，每48小時換液一次。
這樣培養(yǎng)的表皮細(xì)胞可以獲得角質(zhì)細(xì)胞-黑色素細(xì)胞的共培養(yǎng)物，當(dāng)其培養(yǎng)物達(dá)到大約70％的鋪滿率時，用選擇培養(yǎng)基(培養(yǎng)基2)替換KSFM培養(yǎng)基，該選擇培養(yǎng)基可以刺激黑色素細(xì)胞的生長，其組成如下表所示，其中IBMX代表3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，PMA代表12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波醇。
48至72小時后，用0.1％胰蛋白酶和0.05％EDTA混合溶液(Gibco，Paisley，GB)室溫處理細(xì)胞1-2分鐘，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上消化下來。將細(xì)胞懸液離心后重懸于選擇培養(yǎng)基中。24-48小時后，重新用胰蛋白酶-EDTA混合液(0.1％-0.05％)室溫處理細(xì)胞1-2分鐘，然后重新接種于特異適于黑色素細(xì)胞的增殖培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基3)。
培養(yǎng)基3由10％的培養(yǎng)基2和90％的培養(yǎng)基A組成，培養(yǎng)基A是角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基SFM(Gibco，17005-034)。
此時，獲得了純的、專門由正常人黑色素細(xì)胞(NHMs)組成的細(xì)胞群。
在研究前，將NHMs細(xì)胞置于不含有強(qiáng)代謝刺激物的培養(yǎng)基中一周，如佛波醇酯或IBMX(培養(yǎng)基4)。
培養(yǎng)基4由10％的培養(yǎng)基B和90％的上述培養(yǎng)基A組成。培養(yǎng)基B的組成如下表所示。
將NHMs接種于96-孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(Falcon，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，USA)，每孔含200μl培養(yǎng)基4,10,000個細(xì)胞。
在研究的培養(yǎng)基中臨時配制要檢測的寡核苷酸，濃度分別為10nM、100nM、250nM、500nM和1μM。各種寡核苷酸的處理每天做一次，持續(xù)7天，每個濃度做3個實(shí)驗(yàn)。代表多巴氧化酶活性的反應(yīng)速率的測量在7天處理的結(jié)束時，測量酪氨酸酶或“多巴氧化酶”的活性。
用PBS沖洗細(xì)胞，然后每孔加入50μl裂解緩沖液(含0.5％TritonX100(Sigma，T-9284)的PBS(Gibco，14190-0947))，并且在4℃振蕩平板1小時。在每孔中加入50μl底物(10mM L-多巴，Sigma)啟動反應(yīng)。每隔2分鐘在450nM檢測產(chǎn)生的多巴色素，在常規(guī)振蕩下，用340 ATTC(SLT-Labinstrument，Grdig/Salzburg，Austria)型平板光密度讀數(shù)儀37℃下檢測1小時。計算反應(yīng)速率，表述為10-4OD單位/分鐘(10-4OD units/min)。
經(jīng)過寡核苷酸處理的培養(yǎng)物和對照培養(yǎng)物(未經(jīng)處理)的檢測結(jié)果如表2所示(δ標(biāo)準(zhǔn)偏差)。
表2
從表2結(jié)果很明顯地看出，用本發(fā)明的寡核苷酸(SEQ ID NO.1-SEQID NO.11)處理黑色素細(xì)胞引起代表多巴氧化酶活性的反應(yīng)速率下降。經(jīng)寡核苷酸SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6處理的下降尤為明顯。
另一方面，發(fā)現(xiàn)用與寡核苷酸SEQ ID NO.2對比的，命名為“正義對照”SEQ ID NO.12和“混淆對照”SEQ ID NO.13的寡核苷酸在每一濃度處理后，代表多巴氧化酶活性的反應(yīng)速率有所提高。例如，100nM濃度下，“正義對照”和“混淆對照”的反應(yīng)速率分別增加2.2％和11.7％，而應(yīng)用本發(fā)明的反義寡核苷酸SEQ ID NO2時，下降28.8％。
從后一結(jié)果可以推斷，本發(fā)明的寡核苷酸降低代表多巴氧化酶活性的反應(yīng)速率的活性是由于該寡核苷酸與編碼酪氨酸酶或TRP-1的靶信使RNA的特異性雜交的結(jié)果。
因此，這種寡核苷酸/mRNA相互作用可阻止靶信使RNA攜帶的信息的翻譯，因此導(dǎo)致酪氨酸酶或TRP-1的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的下降(這取決于所應(yīng)用的反義序列)。換句話說，這種相互作用將降低酪氨酸酶或TRP-1的新合成。由于這些酶的天然再生，導(dǎo)致了細(xì)胞中酪氨酸酶和TRP-1的量的下降，從而引起這些酶在維持黑色素合成的活性上的下降。實(shí)際上，本發(fā)明的寡核苷酸通過降低酪氨酸酶和TRP-1的再生起作用，而不是作用于黑色素細(xì)胞中已經(jīng)存在的酪氨酸酶。
對黑色素細(xì)胞的這種作用的結(jié)果是這些細(xì)胞合成黑色素的能力降低，因此，根據(jù)具體情況以及涉及的個體，將產(chǎn)生漂白或褪色效果。實(shí)施例3本發(fā)明的寡核苷酸對來源于黑白混血成年供體的正常黑色素細(xì)胞的褪色效果。
這里所用的黑色素細(xì)胞取自黑白混血成年供體的大腿皮膚。皮膚碎片用PBS(Gibco，Paisley，GB)沖洗，然后用在PBS中稀釋成50％的70％(V/V)乙醇沖洗。PBS沖洗后，用角膜刮刀刮皮膚碎片。刮下來的碎片用0.05％的胰蛋白酶(Difco Laboratories，West Molesy，GB)37℃處理1小時以便其離散。表皮細(xì)胞然后用含10％胎牛血清(FCS，Gibco，Paisley，GB)的E-199培養(yǎng)基回收。勻漿及去除漂在表面的角質(zhì)層部分后，將細(xì)胞懸液過濾并離心。將獲得的細(xì)胞沉淀置于實(shí)施例2所述的培養(yǎng)基1中。細(xì)胞計數(shù)，并在Thoma小室上用苔酚蘭排出實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力。最后將表皮細(xì)胞以80000個/cm2的比例接種于培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基1中，在37℃飽和濕度、5％CO2條件下培養(yǎng)。
用培養(yǎng)基6代替培養(yǎng)基1，培養(yǎng)基6的組成如下表所示，其中B-FGF代表一種堿性成纖維細(xì)胞生長因子，PdBu代表12，13-二丁酸佛波醇酯。
該培養(yǎng)基每48小時更換一次，持續(xù)1-2周。
黑色素細(xì)胞經(jīng)過篩選之后，用培養(yǎng)基7代替培養(yǎng)基6刺激NHM的增殖。
培養(yǎng)基7由10％的培養(yǎng)基C和90％的上述的培養(yǎng)基A組成。補(bǔ)加的PdBu(Sigma，P-1269)在培養(yǎng)基的最終濃度為0.25ug/ml。
此時，獲得的細(xì)胞是只含有NHMs的純細(xì)胞群。
將NHMs細(xì)胞接種于96-孔細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)基6中(Falcon，F(xiàn)ranklin Lakes，NT，USA)。24小時后，用培養(yǎng)基8代替培養(yǎng)基6，在該研究的以后全部過程中都將應(yīng)用培養(yǎng)基8。培養(yǎng)基8的組成如下所示。
寡核苷酸SEQ ID NO.2臨時加到研究的培養(yǎng)基中，濃度為50nM，100nM，250nM，500nM和1μM。這種處理每天進(jìn)行一次，持續(xù)7天。每個濃度做6次實(shí)驗(yàn)。代表多巴氧化酶活性的反應(yīng)速率的測量在每次7天處理結(jié)束，測量多巴氧化酶的活性。測量方法同實(shí)施例2中的相同，計算反應(yīng)速率，表示為10-4OD units/min。
經(jīng)過寡核苷酸SEQ ID NO2處理的培養(yǎng)物和未經(jīng)處理的對照培養(yǎng)物的結(jié)果如表3所示(δ標(biāo)準(zhǔn)偏差)。
表3
從以上結(jié)果可以看出，從較低濃度的寡核苷酸(100nM)到高于這個濃度，代表多巴氧化酶活性的反應(yīng)速率明顯降低。
因此，就象在實(shí)施例2的結(jié)論中陳述的那樣，本發(fā)明的所述寡核苷酸可以降低黑色素細(xì)胞合成黑色素的能力。本實(shí)驗(yàn)證明這種降低與所涉及的人的遺傳特性無關(guān)。
在本實(shí)施例中，由于涉及的黑白混血供者具有與深色膚色相應(yīng)的基礎(chǔ)色素沉著，因此本發(fā)明的寡核苷酸的使用會引起漂白效應(yīng)，也就是使膚色變淡。實(shí)施例4本發(fā)明所述寡核苷酸對于紫外線誘導(dǎo)的正常人黑色素細(xì)胞中的黑色素形成的抑制作用的研究。
繼以上實(shí)施例的結(jié)果之后，本實(shí)驗(yàn)的目的是證實(shí)本發(fā)明的寡核苷酸對由刺激而活化的黑色素細(xì)胞是否也有作用，本實(shí)驗(yàn)中的刺激為UVB紫外線輻射(280-320nM)。換句話說，是為證實(shí)寡核苷酸對受到黑色素生成刺激的黑色素細(xì)胞中的多巴氧化酶活性的獨(dú)立的降低能力。
為此，本實(shí)驗(yàn)涉及的黑色素細(xì)胞來源白種成年人供體。此處所用的黑色素細(xì)胞取自乳房整形術(shù)的皮膚。獲得這些黑色素細(xì)胞的技術(shù)方法與實(shí)施例3中應(yīng)用和描述的相同。
在35mm的平皿中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在每個35mm平皿(Falcon，F(xiàn)ranklinLakes，NJ，USA)中接種250000個黑色素細(xì)胞和2ml培養(yǎng)基8。培養(yǎng)基8的組成如實(shí)施例3所述。細(xì)胞接種24小時后用寡核苷酸SEQ ID NO.2處理和8mJ/cm2UVB輻射(Bio-Energie，Vilbert-Lourmect，marne-la-Vallée，F(xiàn)rance)。
在每次UVB輻射前，將NHMs放入PBS(2ml/平皿)中。照射后，細(xì)胞重新置于2ml的培養(yǎng)基8中，培養(yǎng)基8中可含有或不含有寡核苷酸SEQID NO.2。
將寡核苷酸SEQ ID NO.2臨時加入研究培養(yǎng)基(實(shí)施例3中的培養(yǎng)7)中，濃度為100nM、250nM和500nM。
每天用寡核苷酸處理，持續(xù)9天。照射每天一次，除了第5天和第6天。每個濃度做3次實(shí)驗(yàn)。代表多巴氧化酶活性的反應(yīng)速率的測量處理結(jié)束，也就是9天的寡核苷酸處理和7輪的照射后，測量多巴氧化酶的活性。
為此，用500μl 0.1％胰蛋白酶-0.5％EDTA將NHMs從平皿上消化下來，置于1.5ml不含酚紅的E-199培養(yǎng)基(Gibco)中，并且補(bǔ)加10％的胎牛血清。一等份細(xì)胞懸液用以細(xì)胞計數(shù)，另一等份離心，將獲得的黑色素細(xì)胞沉淀置于50μl裂解緩沖液中，按實(shí)施例2所述方法測量代表多巴氧化酶活性的反應(yīng)速率。
計算代表多巴氧化酶活性的反應(yīng)速率，表示為10-4OD units/min/106NHMs，結(jié)果如表4所示(δ標(biāo)準(zhǔn)偏差)。
表4
以上結(jié)果清楚表明，本發(fā)明的寡核苷酸可以明顯降低代表受到UVB輻射作用刺激的黑色素細(xì)胞中多巴氧化酶活性的反應(yīng)速率。
因此，本發(fā)明的寡核苷酸不但可以降低基礎(chǔ)活性狀態(tài)下的黑色素細(xì)胞的合成黑色素的能力，如以前實(shí)施例所證明，也可以降低活化狀態(tài)下的黑色素細(xì)胞的能力。因此，這些寡核苷酸可以用來特別是預(yù)防或弱化因暴露陽光中受到紫外線照射刺激引起的色素沉著。實(shí)施例5淡化面部膚色的粉劑微纖維素20.00％月桂基磺基乙酸鈉15.00％寡核苷酸(SEQ ID NO.5)(磷酸二酯) 1.00％香料、著色劑、防腐劑適量滑石補(bǔ)足為100％這種粉劑有雙重功能。它可以清潔皮膚，另外，經(jīng)常使用一段時間后，它可以使膚色變淡。每天可在面部使用1-2次。實(shí)施例6H用面部褪色乳劑-凝膠甘油 5.00％辛酸/癸酸/琥珀酸甘油三酯 5.00％甲氧基肉桂酸辛酯 1.00％聚二甲基硅氧烷共聚醇 0.50％丙烯酸酯/C10-30丙烯酸烷基酯交聯(lián)共聚物0.50％寡核苷酸SEQ ID NO.3(磷酸二酯)0.01％中和劑 適量防腐劑、香料、著色劑 適量水 補(bǔ)足為100％某些遇到強(qiáng)度或多或少的日光照射或者陽光直接照射的人，希望保持淡一些的膚色并避免出現(xiàn)色斑，上述的乳劑-凝膠可以達(dá)到此目的。該組合物通常在早晨用到面部，具有預(yù)防和治療色素沉著的雙重作用，這種色素沉著可以是面部的，甚至不是面部的。實(shí)施例7SPF30的預(yù)防色斑的防護(hù)液揮發(fā)性的五環(huán)甲基硅酮(pentacyclomethicone)49.00％二氧化鈦 15.00％甲氧基肉桂酸辛酯 7.50％甘油 5.00％苯基三甲基硅酮(phenyltrimethicone)5.00％聚二甲基硅氧烷共聚醇 3.00％聚甲基丙烯酸甲酯 2.50％丁基甲氧基二苯甲酰甲烷1.00％寡核苷酸SEQ ID NO.2(磷酸二酯) 0.1％中和劑、香料、防腐劑、抗氧化劑 適量水補(bǔ)足為100％該組合物用于在受到陽光強(qiáng)輻射前預(yù)防色斑的出現(xiàn)。應(yīng)注意的是高濃度的防曬成分可以補(bǔ)償因黑色素水平下降導(dǎo)致的天然防護(hù)功能的下降。實(shí)施例8褪色潤膚霜甘油硬脂酸酯+PEG-100硬脂酸酯 5.00％氫化聚異丁烯 4.00％抗壞血酸磷酸鎂 3.30％甘油三辛酸酯/癸酸酯3.00％角鯊?fù)?3.00％甘油 2.00％蜂蠟 1.50％十六芳基辛酸酯(Cetearyl octanoate) 1.50％鯨蠟醇 1.00％
十八烷醇 1.00％聚二甲基硅氧烷1.00％黃原酸膠 0.30％乙二胺四乙酸 0.20％檸檬酸0.10％檸檬酸鈉 0.10％寡核苷酸SEQ ID NO.6(磷酸二酯) 0.10％中和劑、香料、防腐劑 適量水補(bǔ)足為100％這種霜可以通過弱化或清除老年斑或光照引起的色斑治療皮膚不規(guī)則色素沉著，使膚色均一或淡化。實(shí)施例9淡化膚色用潤面露乙醇 30.00％PEG-3肉豆蔻醚 5.00％甘油 2.00％丙烯酸聚合物(carbomer) 0.20％聚山梨酸酯20 0.20％寡核苷酸SEQ ID NO.4(硫代磷酸酯)0.01％中和劑、香料、防腐劑 適量水 補(bǔ)足為100％這種淡化膚色用潤面露在卸妝及皮膚清潔后使用。實(shí)施例10淡化膚色用潤膚液水 補(bǔ)足為100％甘油2％乙二胺四乙酸四鈉)檸檬酸) 適量使pH＝6
檸檬酸三鈉)黃原酸膠 0.25％聚丙烯酰胺、C13/C14異鏈烷烴、laureth-7 0.5％聚二甲基硅氧烷共聚醇 0.25％寡核苷酸SEQ ID NO.2(磷酸二酯) 0.1％香料、著色劑、防腐劑 適量通常在使用潤膚霜前在臉上使用一滴該濃縮液。通常使用該潤膚液處理1至2周以達(dá)到或維持皮膚的淡化。實(shí)施例11淡化頭發(fā)用的發(fā)露水 補(bǔ)足為100％酒精 50％泛?；一? 0.5％乙酸DL-α-生育酚酯 0.2％聚山梨酸酯60 1％寡核苷酸SEQ ID NO.1(硫代磷酸酯)0.01％香料 0.2％甘油 0.5％著色劑 適量這種發(fā)露早晨和晚上用于頭發(fā)上，持續(xù)足夠長時間以使頭發(fā)逐步淡化。這段時間通常為幾周。實(shí)施例12潤手霜(抗斑凝膠-霜)辛酸/癸酸二甘油琥珀酸酯6％辛酸辛酯 2.5％甲氧基肉桂酸辛酯 6％寡核苷酸SEQ ID NO.5(磷酸二酯) 0.001％苯基三甲基硅酮 2.5％苯酮- 30.5％透明質(zhì)酸鈉0.05％漢生膠0.2％丙烯酸酯/C10-C30丙烯酸烷基酯共聚物 0.5％甘油 2％PEG 150 3％中和劑、著色劑、香料、防腐劑 適量純化水補(bǔ)足為100％這種霜應(yīng)直接用于手部的老年斑上使其著色弱化。
序列表序列表<110>LVMH研究所<120>寡核苷酸作為褪色劑在調(diào)節(jié)酪氨酸酶和酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1的表達(dá)中的用途<130>343 810<150>FR 00/01730<151>2000-02-11<150>PCT/FR01/00398<151>2001-02-09<160>13<170>PatentIn Ver.2.2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>與編碼人酪氨酸酶相關(guān)蛋白基因的cDNA 111-92位的核苷酸序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸(TRP-Genbank位置號HSTYRRP)<400>1gcaaaacaaa gacctggttt 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>與編碼人酪氨酸酶相關(guān)蛋白基因的cDNA 102-83位的核苷酸序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸(TRP-Genbank位置號HSTYRRP)<400>2agacctggtt tgcagctctt20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>與編碼人酪氨酸酶相關(guān)蛋白基因的cDNA 127-108位的核苷酸序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸(TRP-Genbank位置號HSTYRRP)<400>3tgcttgaaat aagagtgcaa20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>與編碼人酪氨酸酶相關(guān)蛋白基因的cDNA 53-54位的核苷酸序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸(TRP-Genbank位置號HSTYRRP)<400>4aaaatccagc tcacaatcct 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>與編碼人酪氨酸酶相關(guān)蛋白基因的cDNA 141-122位的核苷酸序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸(TRP-Genbank位置號HSTYRRP)<400>5aggagcactc attctgcttg 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>與編碼人酪氨酸酶基因的cDNA 475-457位的核苷酸序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸(Genbank位置號HUMTYRA)<400>6aggaactggc taattggagt 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>與編碼人酪氨酸酶基因的cDNA 485-466位的核苷酸序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸(Genbank位置號HUMTYRA)<400>7caaggtctgc aggaactggc 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>與編碼人酪氨酸酶基因的cDNA 490-471位的核苷酸序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸(Genbank位置號HUMTYRA)<400>8cctcacaagg tctgcaggaa 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>與編碼人酪氨酸酶基因的cDNA 1332-1313位的核苷酸序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸(Genbank位置號HUMTYRA)<400>9ctacagacaa tctgccaaga 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>與編碼人酪氨酸酶基因的cDNA 506-487位的核苷酸序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸(Genbank位置號HUMTYRA)<400>10gcattcttcc tctagtcctc 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>與編碼人酪氨酸酶相關(guān)蛋白的DNA 5875-5856位的核苷酸序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸(TRP1-Genbank位置號AF001295)<400>11ttccagtacc tcacaatcct 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列ID No.2的反義對照<400>12ttctcgacgtttggtccaga 20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列ID No.2的隨機(jī)組合<400>13acgtttctcg cctagtgatg 20
權(quán)利要求
1.一種寡核苷酸，其包括7至25個核苷酸，優(yōu)選地包括20個核苷酸，能與黑色素合成途徑中的一種必需酶的編碼基因或其產(chǎn)物雜交，其特征在于所述酶選自酪氨酸酶和酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TRP-1)。
2.權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，特征在于它能與酪氨酸酶的編碼基因或其產(chǎn)物特異地雜交。
3.權(quán)利要求1或2所述的寡核苷酸，其能與編碼酪氨酸酶的DNA或mRNA特異地雜交。
4.權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，特征在于它能與TRP-1的編碼基因或其產(chǎn)物特異地雜交。
5.權(quán)利要求1或3所述的寡核苷酸，其能與編碼TRP-1的DNA或mRNA特異地雜交。
6.權(quán)利要求1到3之一所述的寡核苷酸，其能與編碼酪氨酸酶的基因或mRNA的起始密碼子區(qū)特異地雜交。
7.權(quán)利要求1到3之一所述的寡核苷酸，其能與編碼酪氨酸酶的基因或mRNA的編碼區(qū)特異地雜交。
8.權(quán)利要求1到3之一所述的寡核苷酸，基能與編碼酪氨酸酶的基因或mRNA的3′非編碼區(qū)特異地雜交。
9.權(quán)利要求1、4或5之一所述的寡核苷酸，其能與編碼TRP-1的基因或mRNA的5′非編碼區(qū)特異地雜交。
10.權(quán)利要求1、4或5之一所述的寡核苷酸，其能與編碼TRP-1的基因或mRNA的起始密碼子區(qū)特異地雜交。
11.權(quán)利要求1，4或5之一所述的寡核苷酸，其能與編碼TRP-1的基因或mRNA的編碼區(qū)特異地雜交。
12.權(quán)利要求1、4或5之一所述的寡核苷酸，其能與編碼TRP-1的基因或mRNA的3′非編碼區(qū)特異地雜交。
13.權(quán)利要求6所述的寡核苷酸，其序列為下面序列SEQ ID NO.6至SE QID NO.8中所示的一種-SEQ ID NO.65’-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3’-SEQ ID NO.75’-CAAGGTCTGCAGGAACTGGC-3’-SEQ ID NO.85’-CCTCACAAGGTCTGCAGGAA-3’
14.權(quán)利要求7所述的寡核苷酸，其序列為下列序列SEQ ID NO.10所示-SEQ ID NO.105’-GCATTCTTCCTCTAGTCCTC-3’
15.權(quán)利要求8所述的寡核苷酸，其序列為下列序列5SEQ ID NO.9所示-SEQ ID NO.95’-CTACAGACAATCTGCCAAGA-3’
16.權(quán)利要求10所述的寡核苷酸，其序列為下列序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.11中所示的一種-SEQ ID NO.15’-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3’-SEQ ID NO.25’-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3’-SEQ ID NO.35’-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3’-SEQ ID NO.45’-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3’-SEQ ID NO.11 5’-TTCCAGTACCTCACAATCCT-3’
17.權(quán)利要求11所述的寡核苷酸，其序列為下列序列SEQ ID NO.5所示-SEQ ID NO.55’-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3’
18.作為一種新產(chǎn)品的寡核苷酸，其序列為下列序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.11中所示的一種-SEQ ID NO.1 5’-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3’-SEQ ID NO.2 5’-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3′-SEQ ID NO.3 5’-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3’-SEQ ID NO.4 5’-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3’-SEQ ID NO.5 5’-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3’-SEQ ID NO.6 5’-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3’-SEQ ID NO.7 5’-CAAGGTCTGCAGGAACTGGC-3’-SEQ ID NO.8 5’-CCTCACAAGGTCTGCAGGAA-3’-SEQ ID NO.9 5’-CTACAGACAATCTGCCAAGA-3’-SEQ ID NO.10 5’-GCATTCTICCTCTAGTCCTC-3’-SEQ ID NO.11 5’-TTCCAGTACCTCACAATCCT-3’
19.上述權(quán)利要求之一所述的寡核苷酸，在它的糖組分、核苷組分或核苷酸間主鏈上包括一個或多個化學(xué)修飾，所述的化學(xué)修飾賦予了所希望的物化特性，如增加的生物可利用性、對靶序列的親和力的增加、細(xì)胞內(nèi)在化的增加、或者更好的生物學(xué)穩(wěn)定性或在細(xì)胞內(nèi)核酸酶存在下穩(wěn)定性的增加。
20.權(quán)利要求20所述的寡核苷酸，特征在于它的糖組分包含2′-O-氟代或2′-O-烷基的取代基，優(yōu)選2′-O-乙氧基甲基或2′-O-甲基取代基。
21.權(quán)利要求20或21所述的寡核苷酸，特征在于其核苷酸間主鏈上的一些磷酸二酯基被硫代磷酸酯基取代。
22.權(quán)利要求20或21所述的寡核苷酸，特征在于其核苷酸間主鏈上的一些磷酸二酯基被甲基膦酸酯基取代。
23.權(quán)利要求22所述的寡核苷酸，特征在于所有的磷酸二酯基被硫代磷酸酯基取代。
24.權(quán)利要求23所述的寡核苷酸，特征在于所有的磷酸二酯基被甲基膦酸酯基取代。
25.權(quán)利要求22和23所述的寡核苷酸，特征在于磷酸二酯基全部或部分地被硫代磷酸酯基和/或甲基膦酸酯基取代。
26.權(quán)利要求1至26之一所述的寡核苷酸，其上接枝了線性的核酸類或肽類載體或者環(huán)狀質(zhì)粒類載體。
27.以上權(quán)利要求之一所述的寡核苷酸，作為一種醫(yī)用產(chǎn)品。
28.美容或皮膚護(hù)理組合物，其包含至少一種權(quán)利要求1至27之一所述的寡核苷酸和美容或皮膚護(hù)理上可接受的介質(zhì)。
29.權(quán)利要求29所述的美容或皮膚護(hù)理組合物，其包含一種或多種選自下列物質(zhì)的活性劑鞣花酸及其衍生物；間苯二酚及其衍生物；維生素C及其衍生物；泛酸磺酸酯及其衍生物；可直接或間接干擾α-促黑素(α-MSH)或其受體或促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的分子；多羥基化合物，如甘油、乙二醇或丙二醇；維生素；溶角蛋白劑或脫皮劑，如水楊酸及其衍生物；α-醇酸，如乳酸或蘋果酸，可以是單獨(dú)的或接枝的；抗壞血酸及其衍生物；視黃酸；視黃醛；視黃醇及其衍生物，如棕櫚酸酯、丙酸酯或乙酸酯，它們是或不是脂質(zhì)體制劑形式；antiglycation劑或抗氧化劑，其單獨(dú)或聯(lián)合使用，如生育酚及其衍生物、硫代?；撬?、亞?；撬帷被?、硫胺素焦磷酸、吡哆胺、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、吡哆醇、三磷酸腺苷；抗炎劑，如甘草亭酸十八烷基酯；潤膚劑及其混合物，化學(xué)的或物理的防曬劑，如微粉化氧化鋅，氧化鈦，丁基甲氧二苯甲?；淄楹图籽趸夤鹚嵝刘?；以及脫氧核糖核酸或核酸。
30.權(quán)利要求29或30所述的組合物，特征在于寡核苷酸占組合物總重量的0.00001％到10％，優(yōu)選地0.0003％到3％。
31.權(quán)利要求29到31之一所述的美容或皮膚護(hù)理組合物，特征在于它以適于局部應(yīng)用的通常形式提供，并且特別是含水的、水-醇的或油的溶液，水包油、油包水或多相乳液形式，水或油性凝膠形式，液體的、糊狀的或固體無水的產(chǎn)品形式，聚合顆粒的分散物，如在水相或油相中的小球和小膠囊，或者是離子或非離子型脂囊泡的分散體形式。
32.一種寡核苷酸作為美容劑的用途，該寡核苷酸包含7到25個核苷酸，優(yōu)選地為20個核苷酸，其能與參與黑色素合成途徑的一種必需酶的編碼基因或其產(chǎn)物雜交，所述必需酶選自酪氨酸酶和TRP-1。
33.權(quán)利要求33所述的寡核苷酸在褪色或漂白人類皮膚、體毛或頭發(fā)中的用途。
34.權(quán)利要求1至27之一所述的一種寡核苷酸在制備醫(yī)用產(chǎn)品上的用途，該醫(yī)用產(chǎn)品用來通過局部途徑治療或預(yù)防酪氨酸酶和/或TRP-1過度表達(dá)引起的疾病。
35.權(quán)利要求1至27之一所述的一種寡核苷酸在制備抑制黑色素合成的醫(yī)用產(chǎn)品中的用途。
36.權(quán)利要求36所述的一種寡核苷酸在治療或預(yù)防黑色素細(xì)胞過度活化引起的局部過度色素沉著，如特發(fā)性黑斑病，由于良性的黑色素細(xì)胞的過度活化和增殖引起的局部過度色素沉著，如老年斑，以及意外的過度色素沉著，如光致敏或瘢痕性過度色素沉著中的用途，以及在治療某些白斑病，如白斑中的用途。
37.權(quán)利要求35或36所述的寡核苷酸在制備用于褪色或漂白皮膚的醫(yī)用產(chǎn)品中的用途。
38.權(quán)利要求1至27之一所述的一種寡核苷酸在調(diào)節(jié)酪氨酸酶或TRP-1的表達(dá)中的用途。
39.權(quán)利要求35至38之一所述的一種寡核苷酸在制備一種醫(yī)用產(chǎn)品中的用途，該醫(yī)用產(chǎn)品可以同時或分別或以隨時間擴(kuò)散的方式與以下一種或多種活性劑組合使用鞣花酸及其衍生物；氫醌；熊果苷；間苯二酚及其衍生物；維生素C及其衍生物；泛酸磺酸酯及其衍生物；曲酸；胎盤提取物；可直接或間接干擾α-促黑素(α-MSH)或其受體或促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的分子；多羥基化合物，如甘油、乙二醇或丙二醇；維生素；溶角蛋白劑或脫皮劑，如水楊酸及其衍生物；α-醇酸，如乳酸或蘋果酸，可以是單獨(dú)的或接枝的；抗壞血酸及其衍生物；視黃酸；視黃醛；視黃醇及其衍生物，如棕櫚酸酯、丙酸酯或乙酸酯，其是或不是脂質(zhì)體制劑形式；antiglycation劑或抗氧化劑，可以單獨(dú)或聯(lián)合使用，如維生素E(生育酚)及其衍生物、硫代牛磺酸、亞牛磺酸、氨基胍、硫胺素焦磷酸、吡哆胺、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、吡哆醇、三磷酸腺苷；抗炎劑，如甘草亭酸十八烷基酯；潤膚劑及其混合物，化學(xué)的或物理的防曬劑，如微粉化氧化鋅，氧化鈦，丁基甲氧基二苯甲?；淄楹图籽趸夤鹚嵝刘ィ灰约懊撗鹾颂呛怂峄蚝怂?。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型寡核苷酸序列及其衍生物。這些寡核苷酸序列能與編碼酪氨酸酶的基因或其產(chǎn)物特異地雜交，或者與編碼酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TRP－1)的基因或其產(chǎn)物特異地雜交。本發(fā)明還涉及這些新型寡核苷酸作為褪色或漂白劑在美容組合物或皮膚護(hù)理組合物中的用途。
文檔編號A61K8/33GK1411508SQ0180602
公開日2003年4月16日 申請日期2001年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月11日
發(fā)明者R·庫弗斯特, R·喬里 申請人:Lvmh研究公司