肉毒桿菌毒素藥物組合物的制作方法

專利名稱：肉毒桿菌毒素藥物組合物的制作方法
背景本發(fā)明涉及藥物組合物。尤其是，本發(fā)明涉及含有肉毒桿菌毒素的藥物組合物和制備該藥物組合物的方法。
藥物組合物是含有一種或多種活性成分以及一種或多種賦形劑、載體、穩(wěn)定劑或膨脹劑的制劑，適合給予患者以期望的診斷結果或治療效果。
為了貯存穩(wěn)定性和便于操作，藥物組合物可以配制成凍干(即冷凍干燥)或真空干燥粉劑，在給予患者前用鹽水或水重新組成。可供選擇地，藥物組合物可以配制成水溶液。藥物組合物可以含有蛋白質活性成分。不幸的是，蛋白可能很難穩(wěn)定，使含蛋白的藥物組合物使用前在配制、重新組成(如果需要)過程中和貯存期間，導致蛋白損失和/或蛋白活性損失。由于蛋白變性、降解、二聚和/或聚合可能產(chǎn)生穩(wěn)定性問題。各種賦形劑，如白蛋白和明膠已經(jīng)被不同程度地成功用于嘗試和穩(wěn)定藥物組合物中的蛋白活性成分。此外，冷凍保護劑如乙醇已被用于在凍干的冷凍條件下降低蛋白變性。
白蛋白白蛋白是小的血漿中富含的蛋白。人血清白蛋白具有大約69千道爾頓(kD)的分子量，已被用作藥物組合物中的非活性成分，其中它可用作藥物組合物中大塊的載體和某些蛋白活性成分的穩(wěn)定劑。
在藥物組合物的多步配制過程中以及配成的藥物組合物后期重新組成期間，均可呈現(xiàn)白蛋白在藥物組合物中的穩(wěn)定功能。因此，白蛋白可賦予藥物組合物中蛋白質活性成分以穩(wěn)定性，通過例如，(1)減少蛋白活性成分與表面的粘附(通常稱作“粘性”)，如實驗室玻璃器皿、容器的表面，重新組成藥物組合物的小瓶和用于注射藥物組合物的注射器的內表面。蛋白活性成分與表面的粘附能導致活性成分損失和剩余的存留蛋白活性成分變性，二者均降低藥物組合物中存在的活性成分的總活性，和；(2)減少活性成分低稀釋度溶液制備過程中可發(fā)生的活性成分變性。
除了能夠穩(wěn)定藥物組合物中的蛋白活性成分，白蛋白還具有注射給患者時，通?？珊雎缘拿庖咴缘膬?yōu)點。具有可知的免疫原性的化合物可使對抗它的抗體產(chǎn)生，能導致過敏反應和/或發(fā)展為耐藥性，因此含免疫原成分的藥物組合物使待治療的疾病或紊亂變得潛在難于治療。
不幸的是，盡管已知其穩(wěn)定作用，白蛋白用于藥物組合物中存在著明顯的缺點。例如，白蛋白昂貴且越來越難以獲得。而且，血液制品如白蛋白，給予患者時可給患者帶來接受來自血液的病原體或傳染物的潛在危險。因此，已知存在藥物組合物中白蛋白的存在可使傳染性物質無意摻入到藥物組合物中的可能性。例如，有報道使用白蛋白可將朊病毒傳輸?shù)剿幬锝M合物中。朊病毒是一種蛋白質傳染性顆粒，猜測它是產(chǎn)生正常蛋白的相同核酸序列的構象異常同型。進一步猜測傳染性存在于對翻譯后水平朊病毒蛋白同型的正常同型蛋白的“募集反應”中。正常內源性細胞蛋白明顯被誘導錯誤折疊為致病性朊病毒構象。幾種人血清白蛋白已從確定向白蛋白制備庫中捐獻血液的供體是克羅伊茨費爾特-雅各布(Creutzfeldt-Jacob)病患者的分配中撤回。
克羅伊茨費爾特-雅各布病(有時以快速向前阿爾茨海默氏病為特征)是一種罕見的傳導海綿狀腦病的神經(jīng)變性紊亂，其中傳導物質明顯是朊病毒蛋白的異常同型。一個克羅伊茨費爾特-雅各布病患者在六個月內從明顯非常健康惡化為肌肉不能運動癥。
已經(jīng)報道白蛋白輸液可能導致克羅伊茨費爾特-雅各布病的醫(yī)源性傳播。推測常規(guī)白蛋白的制備方法不能對克羅伊茨費爾特-雅各布病的傳播提供足夠的保護，該方法包括血細胞成分的處理和加熱到60℃10分鐘。因此給予含有人血漿蛋白濃縮物如血清白蛋白的藥物組合物，可能存在罹患朊病毒介導疾病，如克羅伊茨費爾特-雅各布病的潛在危險。
明膠已經(jīng)在一些蛋白活性成分藥物組合物中用作白蛋白取代物。值得注意的是，明膠是來源于動物的蛋白，因此伴隨著白蛋白可能具有的相同潛在風險。因此，期望找到一種白蛋白的取代物，它不是血液成分，并且特別是，白蛋白取代物不是明膠且不來源于任何動物。
肉毒桿菌毒素厭氧革蘭氏陽性細菌肉毒梭狀芽孢桿菌可產(chǎn)生有力的多肽神經(jīng)毒素、肉毒桿菌毒素，引起人和動物神經(jīng)麻痹病變，稱作肉毒桿菌中毒。通常在土壤中可發(fā)現(xiàn)肉毒梭狀芽孢桿菌及其芽孢，該細菌能在家庭罐頭廠未完全消毒和密封的食品容器中生長，其是多種肉毒桿菌中毒事件的原因。典型的肉毒桿菌中毒作用出現(xiàn)在食用肉毒梭狀芽孢桿菌培養(yǎng)或芽孢感染的食品后18至36小時。肉毒桿菌毒素可明顯不被減毒通過腸內層并攻擊外周運動神經(jīng)元。肉毒桿菌毒素中毒癥狀可由步行困難、呼吸肌麻痹造成的吞因和發(fā)音困難發(fā)展到死亡。
肉毒桿菌毒素A型是人們所知的最致命的天然生物學物質。小鼠的LD50是大約50pg的肉毒桿菌毒素(純化的神經(jīng)毒素復合體)A型。有趣的是，在摩爾基礎上，肉毒桿菌毒素A型比白喉致命18億倍，比氰化鈉致命6億倍，比眼鏡蛇毒素致命3千萬倍，比霍亂致命1.2千萬倍。Singh，Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins，63-84頁(第4章)，Natural Toxins II，B.R.Singh等主編，PlenumPress，紐約(1976)(其中所述肉毒桿菌毒素A型的LD50是0.3ng等于1U糾正為大約0.05ng BOTOX等于1U)。一個單位(U)肉毒桿菌毒素定義是給每只體重18-20克的雌性Swiss Webster小鼠腹膜內注射后的LD50。已鑒定七種免疫學不同的肉毒桿菌毒素的特性，它們分別是肉毒桿菌毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G，每種以與特殊類型的抗體中和而區(qū)分。不同的肉毒桿菌毒素血清型隨它們影響的動物物種而不同，它們引起麻痹的嚴重性和持續(xù)時間也不同。例如，測定對小鼠產(chǎn)生麻痹的比例已經(jīng)確定肉毒桿菌毒素A型比肉毒桿菌毒素B型強500倍。而且，已確定480U/kg劑量的肉毒桿菌毒素B型對靈長目無毒，該劑量是肉毒桿菌毒素A型對靈長目LD50的12倍。肉毒桿菌毒素與膽堿能運動神經(jīng)元結合的親和力明顯高，移位到神經(jīng)元并阻斷突觸前乙酰膽堿的釋放。
肉毒桿菌毒素已被用于治療以骨骼肌運動過度為特征的神經(jīng)肌肉紊亂的臨床處置中。肉毒桿菌毒素A型1989年被美國食品和藥物管理局批準用于12歲以上essential瞼痙攣、斜視和半穹隆痙攣患者的治療。外周肌肉內注射肉毒桿菌毒素A型的臨床效果常常在注射后一周內見到。單獨肌肉內注射肉毒桿菌毒素A型后癥狀減輕(即弛緩型肌麻痹)典型的持續(xù)時間可為大約三個月。
盡管所有肉毒桿菌毒素血清型明顯抑制神經(jīng)肌肉接合處的神經(jīng)遞質乙酰膽堿的釋放，這是它們通過影響不同的神經(jīng)分泌蛋白和/或在不同位點切割這些蛋白來進行的。肉毒桿菌毒素A是能特異性水解細胞內小泡相關蛋白SNAP-25的肽鍵的鋅內肽酶。肉毒桿菌E型也切割25千道爾頓(kD)的突觸小體相關蛋白(SNAP-25)，但與肉毒桿菌毒素A型相比，指向這個蛋白內的不同氨基酸序列。肉毒桿菌毒素B、D、F和G型作用于小泡相關蛋白(VAMP，也稱作小突觸小泡蛋白)，每個血清型在不同的位點切割該蛋白。最后，已表明肉毒桿菌毒素C1型切割syntaxin和SNAP-25。這些作用機制的差異可影響各種肉毒桿菌毒素血清型作用的相對效能和/或持續(xù)時間。
對于七個已知的肉毒桿菌毒素血清型，肉毒桿菌毒素蛋白分子的分子量是大約150kD。有趣的是，肉毒桿菌毒素是由肉毒梭狀芽孢桿菌以包含150kD肉毒桿菌毒素蛋白分子和關聯(lián)的無毒蛋白的復合體形式釋放的。因此，肉毒梭狀芽孢桿菌能產(chǎn)生900kD、500kD和300kD肉毒桿菌毒素A型復合體。肉毒桿菌毒素B和C1型看來產(chǎn)生僅僅500kD復合體形式。肉毒桿菌毒素D型以300kD和500kD復合體形式產(chǎn)生。最后，肉毒桿菌毒素E和F型以僅近300kD復合體形式產(chǎn)生。認為復合體(即分子量超過大約150kD)含有無毒血凝素蛋白和無毒和無毒非血凝素蛋白。這兩個無毒蛋白(與肉毒桿菌毒素分子一起可包含相關神經(jīng)毒素復合體)可在接納毒素時，提供對抗肉毒桿菌毒素變性的穩(wěn)定性并保護對抗消化酸。而且，可能較大的(分子量大于大約150kD)肉毒桿菌毒素復合體可使肉毒桿菌毒素從肌肉內注射肉毒桿菌毒素復合體的部位擴散的速率減慢。用紅血細胞在pH7.3時處理復合體可使毒素復合體分為毒素蛋白和血凝素蛋白。血凝素蛋白去除后毒素蛋白具有明顯的不穩(wěn)定性。
肉毒梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生的所有肉毒桿菌毒素血清型是無活性的單鏈蛋白，被蛋白酶切割或切口而變得具有神經(jīng)活性。產(chǎn)生血清型A和G的菌株具有內源性蛋白酶，因此可從細菌培養(yǎng)物中回收大部分是活性形式的血清型A和G。相比之下，肉毒桿菌毒素血清型C1、D和E由無水解蛋白株合成，因此當從培養(yǎng)物中回收時是典型失活的失活狀態(tài)。血清型B和F由水解蛋白和無水解蛋白株產(chǎn)生，因此可以活性或非活性形式回收。然而，即使是水解蛋白株產(chǎn)生的，例如肉毒桿菌毒素B型血清型僅切割產(chǎn)生的毒素的一部分。有切口和無切口分子的確切比例依賴于孵育時間和培養(yǎng)溫度。因此，任何制劑的某些部分，如肉毒桿菌毒素B型可能是非活性的，這可能是由于已知與肉毒桿菌毒素A型相比，肉毒桿菌毒素B型的效能明顯低的原因。臨床制劑中存在非活性肉毒桿菌毒素分子將助于制劑的全部蛋白負載，與抗原性增加關聯(lián)，無助于其臨床功效。而且，已知肌肉內注射肉毒桿菌毒素B型，活性持續(xù)時間變短，且比相同劑量水平下肉毒桿菌毒素A型的效能低。
高質量結晶狀肉毒桿菌毒素A型可由肉毒梭狀芽孢桿菌Hall A株產(chǎn)生，特性是≥3×107U/mg，A260/A278小于0.60和凝膠電泳上不同模式的模式帶。已知的Shantz方法可用于獲得結晶狀肉毒桿菌毒素A型，如Shantz，E.J.等，Properties and use of Botulinum toxinand Other Microbial Neurotoxins in Medicine，Microbiol Rev.5680-99(1992)中闡述。一般來說，通過在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)肉毒梭狀芽孢桿菌A型，厭氧發(fā)酵可分離和制備肉毒桿菌毒素A型復合體。用硫酸沉淀可收獲粗毒素，通過超微過濾濃縮。將酸沉淀溶于氯化鈣進行純化。然后用冷乙醇沉淀毒素。沉淀可溶于磷酸鈉緩沖液并離心。干燥后可獲得具有3×107LD50U/mg或更高特定潛能的近900kD結晶狀肉毒桿菌毒素A型復合體。也可使用已知的方法，將無毒蛋白分離出去，得到純的肉毒桿菌毒素，例如分子量近150kD，1-2×108LD50U/mg或更高特定潛能的純化肉毒桿菌毒素A型；分子量近156kD，1-2×108LD50U/mg或更高特定潛能的純化肉毒桿菌毒素B型，和；分子量近155kD，1-2×107LD50U/mg或更高特定潛能的純化肉毒桿菌毒素F型。
從List Biological Laboratories，Inc.，Campbell，加利福尼亞；the Centre for Applied Microbiology and Research，PortonDown，U.K.；Wako(大阪，日本)和Sigma Chemicals of St Louis，密蘇里州可獲得已經(jīng)制備且純化的適合制備藥物制劑的肉毒桿菌毒素和毒素復合體。
純肉毒桿菌毒素如此不穩(wěn)定以致在制備藥物組合物中的工業(yè)實用性很有限。而且，肉毒桿菌毒素復合體，如毒素A型復合體，也由于表面變性、加熱和堿性環(huán)境而極其容易變性。非活性毒素形式的類毒素蛋白可能具有免疫原性。所得抗體能使毒素注射患者難以治療。
一般對于所帶的酶來講，肉毒桿菌毒素的生物活性(細胞內肽酶)依賴于，或至少部分依賴于它們的三維構象。因此，加熱、各種化學表面延伸和表面干燥可使肉毒桿菌毒素A型解毒。而且，已知的培養(yǎng)、發(fā)酵和純化至濃度非常非常低的毒素得到的毒素復合體稀釋物用于藥物組合物制劑，可使毒素快速解毒，除非存在合適的穩(wěn)定劑。毒素從毫克量稀釋到每毫升含納克的溶液明顯困難，因為這種大大稀釋使特殊毒性快速損失。由于配制成含毒素的藥物組合物后，毒素可能使用數(shù)月或數(shù)年，因此應該使用穩(wěn)定劑穩(wěn)定毒素。用于此目的的唯一成功的穩(wěn)定劑是來源于動物的蛋白白蛋白和明膠。正如指出的，最終的制劑中存在來源于動物的蛋白存在潛在的問題，即從供體攜帶的某些穩(wěn)定的病毒、朊病毒或其它傳染性或致病性化合物可能污染毒素。
而且，凍干(冷凍干燥)或真空干燥含肉毒桿菌毒素的藥物組合物制成毒素運輸和貯存規(guī)格(內科醫(yī)生易于使用或重新組成)所需的任一苛刻的pH、溫度和濃度范圍條件可使毒素解毒。因此，來源于動物或供體庫的蛋白如明膠和血清白蛋白已經(jīng)些許成功地用于穩(wěn)定肉毒桿菌毒素。
以商標BOTOX(可從Allergan，Inc.，Irvine，加利福尼亞得到)可購買得到含肉毒桿菌毒素的藥物組合物。BOTOX由純化肉毒桿菌毒素A型復合體、白蛋白和氯化鈉組成，為無菌包裝，真空干燥的形式。肉毒桿菌毒素A型是由含N-Z胺和酵母提取物的培養(yǎng)基中生長的肉毒梭狀芽孢桿菌Hall株培養(yǎng)物制備的。通過一系列酸沉淀達到由活性高分子量毒素蛋白和相關血凝素蛋白組成的結晶狀復合體，從培養(yǎng)溶液中純化肉毒桿菌毒素A型復合體。結晶狀復合體再次溶解于含鹽水和白蛋白和真空干燥前無菌過濾(0.2微米)的溶液中。BOTOX可在注射前與無菌無防腐劑的鹽水重新組合。每小瓶BOTOX在無菌真空干燥無防腐劑的溶液中含大約100單位(U)肉毒梭狀芽孢桿菌毒素A型復合體、0.5毫克人血清白蛋白和0.9毫克氯化鈉。
為了重新組成真空干燥的BOTOX無菌無防腐劑的正常鹽水，在適當大小的注射器中擬定適當量的0.9％氯化鈉注射液。由于起泡或類似的劇烈振蕩可使BOTOX變性，因此要輕輕將稀釋物注射到小瓶中。應當在重新組成后四小時內給藥BOTOX。在此期間，重新組成的BOTOX貯存在冰箱中(2℃至8℃)。重新組成的BOTOX澄清、無色且不含微粒物質。真空干燥產(chǎn)物貯存在冰箱中或5℃下。在從冰箱中取出小瓶并重新組成后四小時內給藥BOTOX。在這四個小時期間，重新組成的BOTOX可貯存在冰箱中(2℃至8℃)。
有報道合適的替代白蛋白作為肉毒桿菌毒素穩(wěn)定劑的可以是另外的蛋白或可替換的低分子量(非蛋白)化合物。Carpender等，Interactions of Stabilizing Additives with Proteins DuringFreeze-Thawing and Freeze-Drying，International Symposium onBiological Product freeze-Drying and Formulation，24-26，1990年10月；Karger(1992)，225-239。
已證明通常在藥物組合物中用作載體和膨脹劑的許多物質不適合作為含神經(jīng)毒素的藥物組合物中的白蛋白取代物。例如，發(fā)現(xiàn)二糖纖維二糖不適合作為毒素穩(wěn)定劑。因此，已知纖維二糖用作與白蛋白和氯化鈉聯(lián)合的賦形劑，使得與僅有白蛋白凍干后的毒性相比(恢復率＞75％至＞95％)，有這些賦形劑的結晶狀肉毒桿菌毒素A型凍干后的毒性水平很低(恢復率10％)。Goodnough等，Stabilization ofBotulinum Toxin Type A During Lyophilization，App & Envir.Micro.58(10) 3426-3428 (1992)。
此外，糖類，包括多糖一般是用作蛋白穩(wěn)定劑的低劣候選者。因此，已知如果蛋白制劑中包含糖類(如葡萄糖或葡萄糖聚合物)或碳水化合物，含蛋白活性成分的藥物組合物固有不穩(wěn)定，因為已知蛋白和葡萄糖在一起相互作用并產(chǎn)生詳細描述的美拉德反應，即由于葡萄糖和葡萄糖聚合物的還原性質。許多工作致力于通過例如降低濕度或使用非還原糖來防止蛋白-糖類反應，大多數(shù)嘗試不成功。值得注意的是，美拉德反應的降解途徑可導致蛋白活性成分的治療不充分。因此，包含蛋白和還原性糖類、碳水化合物或糖，如葡萄糖聚合物的藥物制劑固有不穩(wěn)定，不能長期貯存而不發(fā)生活性成分蛋白期望的生物活性的明顯損失。
值得注意的是，人血清白蛋白可有效作為藥物組合物中蛋白活性成分的穩(wěn)定劑的一個原因是因為白蛋白作為一種蛋白，不與藥物組合物中的蛋白活性成分發(fā)生美拉德反應。因此，人們將期望在其它蛋白中發(fā)現(xiàn)和尋找白蛋白的取代物。
發(fā)現(xiàn)作為藥物組合物中肉毒桿菌毒素穩(wěn)定劑的白蛋白的合適取代物困難且存在著問題，因為認為白蛋白在藥物組合物中不僅僅起膨脹劑的作用。因此，白蛋白明顯能與肉毒桿菌毒素相互作用以增加神經(jīng)毒素的效力。例如，已知牛血清白蛋白可不僅僅作為肉毒桿菌毒素A型的穩(wěn)定賦形劑，因為牛血清白蛋白也明顯加速合成肽底物的催化速度，該底物與肉毒桿菌毒素A型SNAP-25神經(jīng)元內底物類似。Schmidt等，Endoproteinase Activity of Type A Botulinum NeurotoxinSubstrate Requirements and Activation by Serum Albumin，J.ofProtein Chemistry，16(1)，19-26(1997)。因此，白蛋白可能具有加強作用，明顯是通過影響肉毒桿菌毒素對肉毒桿菌毒素底物的細胞內水解蛋白作用的動力學速度。這種加強作用可能是由于肉毒桿菌毒素將毒素胞吞到靶神經(jīng)元中伴隨著的白蛋白，或者加強作用可能由于肉毒桿菌毒素胞吞前在神經(jīng)元蛋白內預先存在的胞質白蛋白。
牛血清白蛋白對肉毒桿菌毒素A型的水解蛋白活性引起動力學速度刺激作用的存在，這一發(fā)現(xiàn)使尋求含肉毒桿菌毒素的藥物制劑中白蛋白的合適取代物尤其成為問題。因此，具有期望的毒素穩(wěn)定特性的白蛋白取代物可能對毒素催化底物的速度有未知和可能的有害作用，因為至少對于牛血清白蛋白，兩個特性(穩(wěn)定毒素和加強毒素底物催化)是相同白蛋白賦形劑明顯固有的。這種白蛋白的加強作用表明白蛋白在制劑中不僅僅起賦形劑的作用，因此使尋求合適的白蛋白取代物更加困難。
此外，肉毒桿菌毒素及其配制到合適的藥物組合物中具有許多限制和阻礙的獨特特性，使得尋求用于當前含肉毒桿菌毒素的藥物制劑中的白蛋白取代物更加成為問題。四個這種獨特特性的例子如下。第一，肉毒桿菌毒素對于摻入到藥物制劑中來說是相對大的蛋白(肉毒桿菌毒素A型復合體的分子量是900kD)，因此其固有易碎和不穩(wěn)定。毒素復合體的大小使得它比更小的不太復雜的蛋白更加易碎和不穩(wěn)定，因此如果維持毒素穩(wěn)定性，組合該制劑和處理都困難。因此，白蛋白取代物應該能夠與毒素以一種模式相互作用，該模式不變性、片段化或否則解毒毒素分子或不與毒素復合體中存在的無毒蛋白分離。第二，作為已知的最致命生物學產(chǎn)物，配制含肉毒桿菌毒素的藥物組合物的所有步驟都要求特別安全、精確和準確。因此，優(yōu)選的有效白蛋白取代物本身不應該有毒或難于處理，以使其不使含肉毒桿菌毒素藥物組合物配制所需的已經(jīng)非常嚴格的條件惡化。
第三，由于肉毒桿菌毒素是第一個批準注射治療人類疾病的微生物毒素，不得不開發(fā)具體方案和允許培養(yǎng)、大規(guī)模生產(chǎn)和配制到藥物中和肉毒桿菌毒素使用的具體方案。重要的考慮因素是毒素純度和注射劑量。培養(yǎng)和純化的制造應使毒素不接觸可能在甚至微量下污染最終產(chǎn)物和引起患者不適當反應的任何物質。這些限制需要在簡單化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不使用動物肉類產(chǎn)物，和采用無合成溶劑或樹脂參與的步驟純化。使用酶、各種交換器，如存在于層析柱中的和合成溶劑制備毒素可引入污染，因此從優(yōu)選的配制步驟中排除。而且，肉毒桿菌毒素A型在40℃以上的溫度下容易變性，在氣/液交界面上形成氣泡損失毒性，在氮或碳二氧化物存在下變性。
第四，穩(wěn)定肉毒桿菌毒素A型特別困難，因為A型由大約150kD的毒素分子和非共價結合的大約750kD無毒蛋白組成。認為無毒蛋白保護或有助于穩(wěn)定毒性依賴的二級和三級結構。適用于穩(wěn)定非蛋白或相對小的蛋白的步驟或方案不適用于穩(wěn)定肉毒桿菌毒素復合體如900kD的肉毒桿菌毒素A型復合體固有的問題。因此從pH3.5至6.8，A型毒素和無毒蛋白非共價結合在一起，在輕度堿性條件下(pH＞7.1)，非常不穩(wěn)定的毒素從毒素復合體中脫離。由于其不穩(wěn)定性，純毒素不具有或具有有限的醫(yī)療給藥實用性。
根據(jù)肉毒桿菌毒素的獨特性質和上面闡明的需要，現(xiàn)實地看到發(fā)現(xiàn)用于當前含肉毒桿菌毒素的藥物組合物的合適的白蛋白取代物的可能性接近于零。在本發(fā)明之前，已知只有來源于動物的蛋白白蛋白和明膠可用作藥物組合物中存在的肉毒桿菌毒素的合適穩(wěn)定劑。因此，已知白蛋白，本身或與一種或另外的物質如磷酸鈉，或檸檬酸鈉允許在凍干后肉毒桿菌毒素A型的毒性高恢復率。不幸的是，如已經(jīng)闡明的，白蛋白作為混合的血液產(chǎn)品，當存在于藥物組合物中時，可能至少潛在攜帶傳染性或致病元素。事實上，任何動物產(chǎn)品或蛋白如明膠也可潛在攜帶熱原或其它可對注射的患者引起不利反應的物質。
中國專利申請CN 1215084A討論了無白蛋白的肉毒桿菌毒素A型與來源于動物的蛋白明膠共同配制。因此這種制劑不能消除傳播來源于動物的蛋白或伴隨的傳染性元素的風險。
羥乙基淀粉多糖可以由成百或甚至上千個單糖單元通過糖苷(醚)鍵連接在一起而組成。兩個重要的多糖是纖維素和淀粉。纖維素是植物中主要的結構物質，給植物提供硬度和形狀。淀粉組成儲備植物食品供應，主要在各種種子和塊莖中發(fā)現(xiàn)。
淀粉以顆粒存在，該顆粒的大小和形狀是得到該淀粉的植物的特征。一般大約80％的淀粉是稱為支鏈淀粉的不溶于水片段。支鏈淀粉由D-葡萄糖(如吡喃葡萄糖)鏈單元組成，每個單元通過α糖苷鍵與下個單元的C-4連接起來。如淀粉一樣，纖維素也由D-葡萄糖單元鏈組成，其中每個單元通過糖苷鍵與下個單元的C-4連接。然而與淀粉不同，纖維素中的糖苷鍵是β鍵。用硫酸和醋酸酐處理纖維素得到二糖纖維二糖。如前闡述，使用纖維二糖穩(wěn)定肉毒桿菌毒素的嘗試不成功。
一種用吡啶和乙烯氯醇處理淀粉可得到的特殊淀粉衍生物是2-羥乙基淀粉，也稱作淀粉代血漿。美國專利4,457,916公開了非離子表面活性劑和羥乙基淀粉聯(lián)合來穩(wěn)定腫瘤壞死因子(TNF)水溶液。另外，2-羥乙基淀粉(淀粉代血漿)(Du Pont Pharma，Wilmington，特拉華，商標HESPAN，0.9％氯化鈉注射液中含6％淀粉代血漿)的6％水溶液是已知的。已知白蛋白靜脈內給藥患者起血漿擴容劑的作用。HESPAN已給藥患者達到血漿擴容作用，在這種意義上，認為靜脈內HESPAN是靜脈內白蛋白的取代物。
淀粉代血漿是來源于蠟狀淀粉的人工膠體，幾乎完全由支鏈淀粉組成。將羥乙基醚基團引入淀粉的葡萄糖單元上可得到淀粉代血漿，然后所得物質可水解產(chǎn)生分子量適合用作血漿擴容劑的產(chǎn)物。淀粉代血漿以其摩爾取代及其分子量為特征。摩爾取代可以是大約0.75，意思是淀粉代血漿醚化至淀粉代血漿的每100個葡萄糖單元上具有平均大約75個羥乙基取代基團的程度。淀粉代血漿的重均分子量大約670kD，范圍從450kD至800kD，至少80％的聚合物單元落在20kD至2500kD的范圍內。醚鍵連接的羥乙基基團主要在葡萄糖單元的C-2，較少部分在C-3和C-6。聚合物與糖原類似，聚合的D-葡萄糖單元主要通過α-1，4鍵連接，偶爾通過α-1，6支鍵連接。支化的程度大約1∶20，意思是每20個葡萄糖單體單元平均大約一個α-1，6支鍵。淀粉代血漿90％以上由支鏈淀粉組成。
HESPAN產(chǎn)生的血漿擴容作用可與白蛋白得到的近似。分子量50kD以下的淀粉代血漿分子被腎臟排泄快速清除，大約500ml單一劑量的HESPAN(大約30g)在約24小時內從尿中排出大約33％給予的HESPAN。羥乙基淀粉的羥乙基基團在體內不被切割，而在分泌時保持完整并與葡萄糖單元相連。大量葡萄糖不以羥乙基化形式產(chǎn)生，可防止較小的羥乙基淀粉聚合物的完全代謝。
纖維素可同樣轉換為羥乙基纖維素。2-羥乙基纖維素(纖維素的2-羥乙基醚)的平均分子量是大約90kD。不幸的是，羥乙基纖維素不象羥乙基淀粉，它反應性高，因此不適合用作藥物制劑中蛋白活性成分的穩(wěn)定劑。
因此所需要的是用于含神經(jīng)毒素的藥物組合物的來源于動物的蛋白或供體庫白蛋白穩(wěn)定劑的合適取代物。
概述本發(fā)明滿足了這種需要并提供了用可穩(wěn)定藥物組合物中存在的肉毒桿菌毒素的化合物作為藥物組合物中存在的白蛋白的取代物。白蛋白取代化合物注射給人患者時具有低的，且優(yōu)選可忽略的免疫原性。另外，優(yōu)選的白蛋白取代物在注射藥物組合物后從體內清除的速度快。
定義這里使用的，下面闡明的詞或術語具有下列定義。
詞“大約”是指能夠包含所述的項目、參數(shù)或術語向上和向下加或減百分之十的范圍的項目、參數(shù)或術語。
短語“氨基酸”包括聚氨基酸。
詞“多糖”是指兩個以上糖類分子單體的聚合體，其中單體可以等同或不同。
短語“藥物組合物”是指活性成分是神經(jīng)毒素如肉毒梭狀芽孢桿菌的制劑。詞“制劑”是指在藥物組合物中至少存在一個除神經(jīng)毒素活性成分之外的另外成分。因此，藥物組合物是一種適合診斷或治療給予(即通過肌肉內或皮下注射)人患者的制劑。藥物組合物可以是在凍干或真空干燥條件下；凍干或真空干燥的藥物組合物用鹽水或水重新組成后形成的溶液，或；作為不需要重新組成的溶液。神經(jīng)毒素活性成分可以是肉毒桿菌毒素血清型A、B、C1、D、E、F或G或破傷風毒素中的一種，所有的都由肉毒梭狀芽孢桿菌制備。
短語“治療制劑”是指可用于治療和因此可減輕紊亂或疾病，如以外周肌肉機能亢進(即痙攣)為特征的紊亂或疾病的制劑。
詞“穩(wěn)定”、“穩(wěn)定化”是指用鹽水或水對已在約-2℃以下貯存六個月到四年之間的凍干或真空干燥的含肉毒桿菌毒素的藥物組合物重新組成后，或對于已在約2℃和約8℃之間貯存六個月到四年的含肉毒桿菌毒素藥物組合物的水溶液，重新組成的和藥物組合物水溶液中存在的肉毒桿菌毒素具有超過大約20％和直到大約100％的毒性，基于先前已經(jīng)摻入到藥物組合物中的生物活性肉毒桿菌毒素。
本發(fā)明范圍內的藥物組合物可包括神經(jīng)毒素和多糖。多糖穩(wěn)定神經(jīng)毒素。這里公開的藥物組合物重新組成或注射時，pH可在約5和7.3之間。優(yōu)選多糖的二糖單元的平均分子量在大約345D和大約2,000D之間。在一個更優(yōu)選方案中，多糖的二糖單元的平均分子量在大約350kD和大約1,000kD之間，最優(yōu)選方案在大約375D和大約700D之間。另外，多糖可包括至少大約70％支鏈淀粉。而且，多糖本身的重均分子量在大約20kD和大約2,500kD之間。
優(yōu)選，基本上所有多糖的二糖單元都包括醚連接的吡喃葡萄糖分子。多糖中每10個吡喃葡萄糖中有平均大約4至大約10的羥基通過醚鍵被分子式為(CH2)n-OH的化合物取代，其中n可以是從1到10的整數(shù)。更優(yōu)選，n是1和3之間的整數(shù)。
在特別優(yōu)選的方案中，多糖中每10個吡喃葡萄糖中有平均大約6至大約9的羥基通過醚鍵被分子式為(CH2)n-OH的化合物取代，其中n可以是從1到10的整數(shù)。以及在最優(yōu)選的方案中，多糖中每10個吡喃葡萄糖中有平均大約7至大約8的羥基通過醚鍵被分子式為(CH2)n-OH的化合物取代，其中n可以是從1到10的整數(shù)。
本發(fā)明的詳細方案可以是適合注射給人患者的包括肉毒桿菌毒素和多糖的藥物組合物。多糖可包括大量連接起來的吡喃葡萄糖單元，每個吡喃葡萄糖單元具有大量羥基，其中多糖中每10個吡喃葡萄糖中有平均大約6至大約9的羥基通過醚鍵被分子式為(CH2)n-OH的化合物取代，其中n可以是從1到4的整數(shù)。多糖可以是乙基醚取代的多糖。
該藥物組合物適合給予人患者達到治療效果，神經(jīng)毒素可以是肉毒桿菌毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G中的一個。在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，該藥物組合物包含肉毒桿菌毒素和羥乙基淀粉。
本發(fā)明的另一個方案可包括含肉毒桿菌毒素、多糖和氨基酸或聚氨基酸的藥物組合物。
無論該藥物組合物除神經(jīng)毒素活性成分外，只包含多糖穩(wěn)定劑，只包含氨基酸穩(wěn)定劑或多糖和氨基酸穩(wěn)定劑都包括，該藥物組合物在大約-1℃和大約-15℃之間的溫度下貯存，在六個月、一年、兩年、三年和/或四年期間基本保持不發(fā)生變化的能力。另外，指出的藥物組合物重新組成時可具有大約20％和大約100％之間的效能或恢復百分比?？晒┻x擇地或另外地，該藥物組合物重新組成時可具有大約10U/mg和大約30U/mg之間的效能，如重新組成時大約20U/mg的效能。值得注意的是，該藥物組合物不含任何白蛋白。因此，該藥物組合物可以基本上不含任何無毒復合體蛋白。值得注意的是，氨基酸可以以每100單位肉毒桿菌毒素中大約0.5mg和大約1.5mg之間的氨基酸量存在。
多糖可以是淀粉如羥乙基淀粉，當該藥物組合物包含大約100單位肉毒桿菌毒素時，可存在大約500μg和大約700μg之間的羥乙基淀粉。優(yōu)選，肉毒桿菌毒素是肉毒桿菌毒素A型，和當存在氨基酸時，氨基酸選自賴氨酸、甘氨酸、組氨酸和精氨酸。
本發(fā)明進一步詳細的方案可以是穩(wěn)定、高效能、無致熱源、真空干燥的肉毒桿菌毒素A型藥物組合物，包含肉毒桿菌毒素A型復合體、多糖，和氨基酸或聚氨基酸。該藥物組合物可以不含白蛋白，在-5℃下具有1年保存期，用鹽水或水重新組成的當時具有大約90％的效能和重新組成，貯存在2℃下，72小時后具有大約80％效能。另外，重新組成時，該藥物組合物可以具有至少大約18U/mg的專一毒性。
本發(fā)明也包括主要由高分子量多糖和肉毒桿菌毒素組成的凍干或真空干燥的藥物組合物，其中高分子量多糖穩(wěn)定肉毒桿菌毒素。高分子量多糖可選自羥甲基淀粉、羥乙基淀粉、羥丙基淀粉、羥丁基淀粉和羥戊基淀粉，肉毒桿菌毒素可選自肉毒桿菌毒素A、B、C1、D、E、F和G型。
藥物組合物中多糖可以以每單位肉毒桿菌毒素大約1×10-9摩爾多糖和每單位肉毒桿菌毒素大約2×10-12摩爾多糖之間的量存在。
本發(fā)明也包括(a)制備藥物組合物的方法，包括制備肉毒桿菌毒素和由共價連接的重復單體組成的多糖的混合物的步驟，其中單體平均分子量在大約350D和大約1,000D之間，和(b)穩(wěn)定梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素對抗變性或聚集的方法，該方法包括梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素接觸包含多糖的穩(wěn)定性組合物的步驟。后一種方法中的接觸步驟可包括向含梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素的水溶液或凍干或真空干燥粉劑中添加有效量多糖的步驟。
本發(fā)明進一步的方面是一種藥物組合物，包含肉毒桿菌毒素和重組制備的白蛋白。優(yōu)選該組合物也包括乙酰色氨酸酯和鹽和其衍生物。
本發(fā)明另外的方案是注射藥物組合物的裝置，包括雙腔預灌注注射器，注射器的一個腔含有肉毒桿菌毒素，注射器第二個腔含有稀釋劑或緩沖液。
本發(fā)明進一步的方案是使用藥物組合物的方法，該方法包括將該藥物組合物局部給予患者達到治療效果的步驟，其中該藥物組合物包括肉毒桿菌毒素、多糖和氨基酸。
值得注意的是，我的發(fā)明也包括一種藥物組合物，它包含肉毒桿菌毒素和氨基酸。我的發(fā)明也包括穩(wěn)定的藥物組合物，主要由肉毒桿菌毒素和氨基酸組成。這些藥物組合物可以不含白蛋白，不含多糖，在-5℃下具有1年的保存期，用鹽水或水重新組成時具有至少大約90％的效能，和重新組成貯存在2℃時，72小時后具有大約80％的效能。
詳述本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了通過將多糖和/或氨基酸摻入藥物組合物中，可以配制成不含任何來源于動物的蛋白和/或供體庫白蛋白的穩(wěn)定的含神經(jīng)毒素藥物組合物。特別是，本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了用來源于淀粉的高分子量多糖和/或某些反應性氨基酸取代存在于已知含肉毒桿菌毒素的藥物組合物中的供體庫白蛋白，可制備適合給予人患者達到治療效果的穩(wěn)定的含肉毒桿菌毒素的藥物組合物。
令人驚奇的是，我發(fā)現(xiàn)合適的白蛋白取代物是一種既不是另一種蛋白，也不是低分子量非蛋白的化合物。因此，我發(fā)現(xiàn)特定的高分子量多糖在藥物組合物中可起神經(jīng)毒素穩(wěn)定劑的作用。如下闡明，氨基酸也可，或可供選擇地，加入到藥物組合物中以增加藥物組合物的穩(wěn)定性和有效的保存期。
本發(fā)明中使用的多糖可賦予藥物組合物中存在的神經(jīng)毒素活性成分以穩(wěn)定性，如肉毒桿菌毒素，這是通過(1)減少肉毒桿菌毒素與表面的粘附(通常稱作“粘性”)，如實驗室玻璃器皿、容器的表面，重新組成藥物組合物的小瓶和用于注射藥物組合物的注射器的內表面。肉毒桿菌毒素與表面的粘附能導致肉毒桿菌毒素損失和剩余肉毒桿菌毒素變性，二者均降低藥物組合物中存在的肉毒桿菌毒素的毒性。(2)減少肉毒桿菌毒素變性和/或肉毒桿菌毒素與肉毒桿菌毒素復合體中存在的其它無毒蛋白分離，由于藥物組合物中肉毒桿菌毒素的稀釋度低(即在凍干或真空干燥前)和在重新組成的藥物組合物中可發(fā)生變性和/或分離活動。(3)減少在藥物組合物的制備、加工和重新組成過程中發(fā)生的重要pH和濃度下肉毒桿菌毒素的損失(即由于變性或與復合體中無毒蛋白分離)。
多糖糖劑提供三種類型的肉毒桿菌毒素穩(wěn)定化，在藥物組合物注射前，保持肉毒桿菌毒素的天然毒性。
用于本發(fā)明的優(yōu)選多糖包括在大部分葡萄糖單體上有一個或多個取代基的大量葡萄糖單體(摩爾分子量180)，使優(yōu)選多糖分子量在大約20kD和大約800kD之間的范圍。令人驚奇的是，這種多糖可穩(wěn)定藥物組合物中存在的神經(jīng)毒素成分。本發(fā)明排除平均分子量小于大約20kD的二糖寡糖的范圍。本發(fā)明也排除環(huán)狀聚合物如環(huán)糊精的范圍。后兩類化合物排除在本發(fā)明的范圍外，因為需要相對高分子量化合物(即分子量超過20kD)的優(yōu)選多糖期望的穩(wěn)定化特性不需要環(huán)糊精的小親脂性腔特性，而且事實上環(huán)糊精的小親脂性腔特性沒有意義，因為環(huán)糊精親脂性腔的大小比本發(fā)明優(yōu)選多糖穩(wěn)定的神經(jīng)毒素的大小小得多。另外，環(huán)糊精是僅包含大約6至8個葡萄糖單體的低分子量化合物。
本發(fā)明也包括用多糖穩(wěn)定含有梭狀芽孢桿菌毒素的藥物組合物的方法。該穩(wěn)定方法是通過使梭狀芽孢桿菌毒素接觸多糖而達到的。我的發(fā)明范圍內的合適多糖的例子包括某些淀粉和淀粉衍生物。如指出的，多糖對梭狀芽孢桿菌毒素顯示出穩(wěn)定作用。而且，加入氨基酸可增強多糖穩(wěn)定梭狀芽孢桿菌毒素的作用。
出乎意料的是，我發(fā)現(xiàn)2-羥乙基淀粉顯示出獨特的穩(wěn)定存在于含肉毒桿菌毒素的藥物組合物中的肉毒桿菌毒素的作用，因此提供了一種藥物組合物，它不存在攜帶來自人血液或血液部分供體庫或來源于動物的蛋白如明膠的可傳播疾病的可能性。
因此，我發(fā)現(xiàn)特別高分子量的多糖、羥乙基淀粉可在配制、干燥、貯存和重新組成期間穩(wěn)定毒素。優(yōu)選，為了進一步穩(wěn)定蛋白活性成分，含多糖的制劑中也包括氨基酸。
優(yōu)選藥物組合物中的多糖以每單位肉毒桿菌毒素大約1μg多糖至每單位肉毒桿菌毒素大約10μg多糖的量與梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素混合。更優(yōu)選藥物組合物中的多糖以每單位肉毒桿菌毒素大約4μg多糖至每單位肉毒桿菌毒素大約8μg多糖的量與梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素混合。最有選的方案中，其中多糖是羥乙基淀粉，藥物組合物中羥乙基淀粉以每單位肉毒桿菌毒素大約5μg羥乙基淀粉至每單位肉毒桿菌毒素大約7μg羥乙基淀粉的量與肉毒桿菌毒素A型復合體混合。最優(yōu)選，藥物組合物中羥乙基淀粉以每單位肉毒桿菌毒素大約6μg羥乙基淀粉的量與肉毒桿菌毒素A型復合體混合。由于BOTOX每小瓶含有大約100單位肉毒桿菌毒素A型復合體，一般認為羥乙基淀粉的平均分子量在大約20kD和大約2,500kD之間，最優(yōu)選羥乙基淀粉的濃度在每單位肉毒桿菌毒素(M/U)大約1×10-9摩爾至每單位肉毒桿菌毒素大約2×10-12摩爾之間。在另一個優(yōu)選方案中，對于100U的肉毒桿菌毒素A型復合體藥物組合物，制劑中包括大約600μg羥乙基淀粉和大約1mg氨基酸，如賴氨酸、甘氨酸、組氨酸或精氨酸。因此，我的發(fā)明包括使用多糖和氨基酸或聚氨基酸穩(wěn)定藥物組合物中神經(jīng)毒素活性成分。
另外，我的發(fā)明也包括制劑中存在或排除任何多糖的情況下，使用足夠量的合適氨基酸穩(wěn)定藥物組合物中的蛋白活性成分。因此，我驚奇地發(fā)現(xiàn)含神經(jīng)毒素的藥物組合物制劑中包含某些氨基酸可延長這種藥物組合物的有效保存期。因此，我的發(fā)明包括含神經(jīng)毒素的藥物組合物，它包括氨基酸和這種藥物組合物的使用。不受理論的限制，我可假定由于神經(jīng)毒素，如肉毒桿菌毒素由于在毒素復合體中存在二硫鍵，因而易于氧化，所以包含可氧化氨基酸可降低氧化劑，如過氧化物和自由基與神經(jīng)毒素反應的可能性。因此，包含可減弱氧化的作為氧化化合物凈化劑的可氧化氨基酸可降低可氧化神經(jīng)毒素二硫鍵被氧化劑如過氧化物和自由基氧化的可能性。合適的氨基酸是發(fā)生氧化的氨基酸。優(yōu)選的氨基酸例子是甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸。特別優(yōu)選的氨基酸是甲硫氨酸。
我的發(fā)明優(yōu)選的方案也可包括兩種或多種氨基酸單獨或與多糖聯(lián)合使用來穩(wěn)定藥物組合物中蛋白活性成分。因此，對于含100U的肉毒桿菌毒素A型的藥物組合物，可使用大約0.5mg賴氨酸和大約0.5mg甘氨酸，含有或不含有大約500μg和大約700μg之間的淀粉代血漿。
因此，如上闡明，我的發(fā)明包括含蛋白的藥物組合物，它包括多糖。該多糖起穩(wěn)定藥物組合物中蛋白活性成分的作用。另外，我的發(fā)明也包括含蛋白的藥物組合物，它包括多糖和氨基酸。令人驚奇的是，我發(fā)現(xiàn)包括碳水化合物的含神經(jīng)毒素藥物組合物制劑中包含某些氨基酸，可延長這種藥物組合物的有效保存期。因此，我的發(fā)明包括含神經(jīng)毒素藥物組合物，它包括多糖和氨基酸和這種藥物組合物的使用。而且，我的發(fā)明也包括在不含任何多糖的蛋白活性成分藥物組合物中使用氨基酸。
已知也含有糖、多糖和/和碳水化合物(此后稱作“反應性化合物”)的含蛋白藥物組合物固有不穩(wěn)定性，這是由于蛋白和三個指出的反應性化合物可發(fā)生詳細描述的美拉德反應的事實。已進行了多方面的大多無結果的研究，通過降低濕度或通過在制劑中使用非還原性糖來嘗試和降低這種(例如)蛋白-多糖美拉德反應的發(fā)生或成為主流。我的發(fā)現(xiàn)基于觀察到含有高濃度的高反應性氨基酸助長穩(wěn)定性多糖和加入的氨基酸之間發(fā)生美拉德反應。通過為碳水化合物提供豐富的胺來源進行反應，降低蛋白藥物參與美拉德反應的可能性，因此減少了該蛋白活性成分的降解途徑，并且因此以這種方式穩(wěn)定藥物組合物中的蛋白活性成分。
優(yōu)選，使用含有伯和仲胺的任何化合物用于此目的。最優(yōu)選的是氨基酸，如賴氨酸、甘氨酸、精氨酸。聚氨基酸，如聚賴氨酸也可合適。陽離子氨基酸如賴氨酸可以進行離子吸引，結合酸性蛋白(如肉毒桿菌毒素)，保護活性蛋白不接觸糖。聚賴氨酸，除了較大和因此更可能作為屏障外，還提供了作為抗菌劑的另外優(yōu)點。
我的發(fā)明的另一個方面是在活性蛋白成分(肉毒桿菌毒素)加入到糖和氨基酸制劑成分前，使糖和氨基酸成分預先反應，從而耗盡美拉德反應的潛能，因此基本上限制活性蛋白發(fā)生美拉德反應。
因此，我的發(fā)明包括藥物組合物，其中含有和使用氨基酸和聚氨基酸作為含淀粉、糖和/或多糖的蛋白(即肉毒桿菌毒素)藥物制劑中的美拉德反應抑制劑。
本發(fā)明具體表現(xiàn)了活性蛋白(如肉毒桿菌毒素)與穩(wěn)定性淀粉、糖或多糖，或這些和氨基酸如賴氨酸聯(lián)合的制劑。
值得注意的是，我發(fā)現(xiàn)羥乙基淀粉與其它多糖或碳水化合物相比，羥乙基淀粉與蛋白，如肉毒桿菌毒素不發(fā)生或發(fā)生美拉德反應的速度或水平大大減少。另外，我發(fā)現(xiàn)包含氨基酸可增強羥乙基淀粉的保護作用，可能是通過作為競爭性抑制劑，那是通過與毒素競爭美拉德反應的反應性糖。為了這個目的，氨基酸如賴氨酸、甘氨酸、精氨酸和組氨酸是優(yōu)選的氨基酸。也可使用顯示出期望的競爭性抑制行為的聚氨基酸，如聚賴氨酸。值得注意的是，具體的氨基酸和聚氨基酸也可顯示出抗菌特性，因此提供了降低藥物組合物中細菌污染的額外益處。
還原性糖，如葡萄糖和葡萄糖聚合物，與蛋白發(fā)生美拉德反應。即使糖醇如甘露醇也可反應，盡管有時通過污染物或降解產(chǎn)物。因此多糖可使毒素穩(wěn)定一段時間，僅僅推遲化學反應，因此使貯存穩(wěn)定性降低。很明顯，多糖的選擇是關鍵的。我發(fā)現(xiàn)羥乙基淀粉在美拉德反應中的沉淀速度很低。另外，我發(fā)現(xiàn)盡管羥乙基纖維素結構與羥乙基淀粉非常相似，它不適合用作穩(wěn)定劑，因為我發(fā)現(xiàn)羥乙基纖維素可與賴氨酸以模式系統(tǒng)發(fā)生快速反應。這不僅僅意味著羥乙基淀粉比其它糖(即多糖)穩(wěn)定劑具有明顯的優(yōu)點，而且甚至與羥乙基淀粉類似的賦形劑，如羥乙基纖維素也不適合用作藥物組合物中蛋白活性成分的穩(wěn)定劑。
如指出的，羥乙基淀粉可在至少部分程度上參與美拉德反應。因此，如上闡述，單獨多糖可能不足以提供最佳的毒素穩(wěn)定作用。因此，我發(fā)現(xiàn)包含氨基酸作為競爭性抑制劑的優(yōu)點。不受理論的限制，假設通過提供另一種胺來源，其濃度與毒素相比較高，與毒素發(fā)生美拉德反應的可能性降低了，從而穩(wěn)定毒素?？梢允褂萌魏伟被幔欢?，賴氨酸具有高度反應性，是優(yōu)選的氨基酸。
我的發(fā)明也包括向含肉毒桿菌毒素的藥物制劑中添加鋅離子來源。有報道，金屬特別是二價陽離子，大大影響冷凍干燥制劑的成功，這是由于各種冰-性能包括所形成的冰的點陣結構。外來金屬如銅和鐵引導它們自身發(fā)生基團氧化，通常要避免。更特別的是肉毒桿菌A型毒素的活性依賴于與鋅結合。許多建議的賦形劑或賦形劑的反應產(chǎn)物會螯合金屬。這可導致不穩(wěn)定的冰和/或非活化毒素形成。通過向制劑中提供豐富的鋅確保期望的二價陽離子的存在，毒素造成鋅損失的可能性降低，穩(wěn)定性增強。這可通過向肉毒桿菌毒素藥物組合物中添加ZnSO4來完成。
已知使用甲醇酵母表達株Pichia pastoris可高生產(chǎn)率地制備重組人血清白蛋白(rHSA)產(chǎn)品?？芍苽浒€(wěn)定性rHSA的含肉毒桿菌毒素的藥物組合物。遺傳學改變的酵母宿主細胞表達的rHSA，盡管具有相同的主氨基酸序列，與血漿來源的HSA在其它方面不同。因此，真核，酵母，缺乏許多在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的細胞內加工。另外，pHSA(來源于血漿的人血清白蛋白)以非糖基化形式制備且添加了細胞外，非酶學添加的葡萄糖。因此，pHSA和rHSA的碳水化合物部分不同。而且，已知rHSA中存在的棕櫚酸和硬脂酸的量大大低于pHSA中的量?？善谕@些差異引起rHSA和pHSA的尤其配體結合、構象穩(wěn)定性和分子電荷的不同。因此驚奇地發(fā)現(xiàn)rHSA可用于穩(wěn)定肉毒桿菌毒素，特別是根據(jù)已知的pHSA對肉毒桿菌毒素的動力學速度作用。rHSA的優(yōu)點是不含來源于血液的病原體。因此，我的發(fā)明的另一個方面包括用rHSA取代藥物組合物中來源于血液的人血清白蛋白。優(yōu)選，rHSA以乙酰色氨酸鹽的形式存在于含肉毒桿菌毒素的藥物制劑中，如下闡述。
可購買得到的人血清白蛋白在60℃加熱十小時作為清除來源于人血庫的潛在傳染性物質的需要。為了防止這個處理過程中嚴重的變性，加入兩種穩(wěn)定劑乙酰色氨酸鈉和辛酸鈉。有rHA時，不需要添加這些成分，因為不存在疾病風險，不需要加熱步驟。我發(fā)現(xiàn)向rHA中添加乙酰色氨酸鈉可增強超過單獨使用辛酸鈉所顯示的熱穩(wěn)定性，甚至當辛酸鈉濃度加倍時亦然。不受理論的限制，我認為可能是由于辛酸鹽可能只結合一個位點，而乙酰色氨酸鹽結合兩個位點。結合第二個位點看來可增強對熱攪拌的抵抗力。我可進一步假設添加乙酰色氨酸鈉可以某些方式增強肉毒桿菌毒素制劑的穩(wěn)定性，可能是通過保持分子熱動力學有利的構象，結合毒素，或通過防止人血清白蛋白本身變性。
我的發(fā)明也包括添加防腐劑，或在稀釋劑中或制劑本身，允許延長保存。優(yōu)選的防腐劑是含芐醇的保存鹽水。
液體制劑有優(yōu)勢。單步給藥(如預灌注注射器)或用戶構思作為單步給藥的產(chǎn)品結構(如雙腔注射器)將提供消除重新組成步驟的方便。冷凍干燥是復雜、昂貴和困難的方法。液體制劑常常易于生產(chǎn)且生產(chǎn)廉價。另一方面，液體制劑是動態(tài)系統(tǒng)，因此比冷凍干燥制劑更容易與賦形劑相互作用，快速作用，細菌生長和氧化?？赡苄枰嗳菪员Ｗo劑。抗氧化劑如甲硫氨酸也可有效作為凈化劑，特別是當用表面活性劑降低吸附，因為這些化合物中許多都含有或產(chǎn)生過氧化物?？烧{整可用于冷凍干燥制劑的任何穩(wěn)定性賦形劑(如羥乙基淀粉或類似氨基酸，賴氨酸)，用于液體制劑促進降低吸附和穩(wěn)定毒素。合適的選擇還有類似于為胰島素開發(fā)的那些的懸浮劑。另外，穩(wěn)定液體載體中的肉毒桿菌毒素可能需要低pH載體，因為報道在pH7以上毒素不穩(wěn)定。酸性可對注射產(chǎn)生灼熱和刺痛?？墒褂枚糠值淖⑸淦?。包含足夠使pH增加到生理條件的協(xié)助分散緩沖液可減輕低pH注射的不適，同時保護在低pH貯存的毒素。另一個雙腔注射器選擇可包括分離腔中分隔開的稀釋劑和凍干材料，僅在使用時混合。這個選擇提供了不需額外來源和時間的液體制劑的優(yōu)點。
因此，可在低pH制備肉毒桿菌毒素，在注射時用緩沖液協(xié)助分散，緩沖液增加pH達到或接近生理pH。雙腔或兩部分的注射器在第一個腔(鄰近活塞)可含有肉毒桿菌毒素液體制劑，pH在3至6之間(即在pH4.0)。第二個腔(鄰近針尖)可含有合適的緩沖液，如較高pH(即pH7.0)的磷酸緩沖鹽水?？晒┻x擇地，第一個腔可含有鹽水稀釋劑和第二個腔可含有冷凍干燥或凍干的神經(jīng)毒素制劑。這兩個腔可以這種方式連接，緩沖成分以這種方式選擇，即溶液在針頭處或接近針頭處混合，因此輸送生理pH的最終溶液。為了這里闡述的目的的適合用作預灌注注射器的雙腔注射器可從Vetter Pharma-Fertigung，Yardley，Pennsylvania得到。
在低pH配制肉毒桿菌毒素具有明顯的優(yōu)點。毒素等電點(p1)低，在接近其p1配制蛋白是已知的穩(wěn)定蛋白的方法。另外，使用很低濃度的毒素使得表面吸附成為問題。使用低pH溶液可抑制毒素可能與表面相互作用的位點離子化。注射器和活塞材料是降低毒素引起的表面吸附的材料。合適的這種材料是聚丙烯。
實施例實施例1肉毒桿菌毒素藥物組合物如前闡述，肉毒桿菌毒素A型復合體可從在含N-Z胺和酵母提取物的培養(yǎng)基生長的肉毒梭狀芽孢桿菌Hall株培養(yǎng)物中得到。通過一系列酸沉淀產(chǎn)生由活性高分子量毒素蛋白和相關血凝素蛋白組成的結晶狀復合體，而從培養(yǎng)溶液中純化肉毒桿菌毒素A型復合體。然后結晶狀復合體再次溶于含鹽水和白蛋白的溶液中，真空干燥前無菌過濾(0.2微米)。接著，肌肉內注射前用無菌無防腐劑鹽水重新組成BOTOX。每個BOTOX小瓶含有大約100單位(U)肉毒梭狀芽孢桿菌毒素A型復合體，0.5毫克人血清白蛋白和0.9毫克氯化鈉，其為無菌真空干燥形式且不含防腐劑。可供選擇地，人血清白蛋白可用重組制備的白蛋白代替。
實施例2含2-羥乙基淀粉的肉毒桿菌毒素藥物組合物用與上面實施例1中闡述的相同方式制備肉毒桿菌毒素A型純化神經(jīng)毒素復合體藥物制劑，除了用500μg或600μg淀粉代血漿代替0.5毫克白蛋白。確定在制備含淀粉代血漿的制劑過程中，保持全部效能。因此，在重新組成凍干的100U(±20U)肉毒桿菌毒素A型復合體的同時測定，含淀粉代血漿制劑和無白蛋白的含淀粉代血漿的組合物的效能都是96至128單位。在重新組成的同時測定，三個獨立的淀粉代血漿、肉毒桿菌毒素A型復合藥物組合物具有的效能分別是105、111和128單位。使用標準給藥小鼠毒素效能實驗測定效能。
實施例3含甘氨酸的肉毒桿菌毒素藥物組合物用與上面實施例1中闡述的相同方式制備肉毒桿菌毒素A型純化神經(jīng)毒素復合體藥物制劑，除了用500μg或600μg淀粉代血漿代替0.5毫克白蛋白。此外，向制劑中添加1mg甘氨酸。凍干，淀粉代血漿加甘氨酸，無白蛋白的100U肉毒桿菌毒素A型復合體藥物組合物在-5℃貯存七個月。這七個月期限末，使用小鼠給藥實驗測定淀粉代血漿加甘氨酸毒素制劑的效能，其基本無改變(即與最初效能的差異少于5％)。
實施例4會賴氨酸的肉毒桿菌毒素藥物組合物用與上面實施例1中闡述的相同方式制備100U肉毒桿菌毒素A型純化神經(jīng)毒素復合體藥物制劑，除了用600μg淀粉代血漿代替0.5毫克白蛋白。此外，向制劑中添加1mg賴氨酸。凍干，淀粉代血漿加賴氨酸，無白蛋白的100U肉毒桿菌毒素A型復合體藥物組合物在-5℃貯存一年。這一年期限末，使用小鼠給藥實驗測定淀粉代血漿加賴氨酸毒素制劑的效能，其基本無改變(即與最初效能的差異少于5％)。
實施例5含組氨酶的肉毒桿菌毒素藥物組合物用與上面實施例1中闡述的相同方式制備100U肉毒桿菌毒素A型純化神經(jīng)毒素復合體藥物制劑，除了用600μg淀粉代血漿代替0.5毫克白蛋白。此外，向制劑中添加1mg組氨酸。凍干，淀粉代血漿加組氨酸，無白蛋白的100U肉毒桿菌毒素A型復合體藥物組合物在-5℃貯存一年。這一年期限末，使用小鼠給藥實驗測定淀粉代血漿加組氨酸毒素制劑的效能，其基本無改變(即與最初效能的差異少于5％)。
實施例6含精氨酸的肉毒桿菌毒素藥物組合物用與上面實施例1中闡述的相同方式制備100U肉毒桿菌毒素A型純化神經(jīng)毒素復合體藥物制劑，除了用600μg淀粉代血漿代替0.5毫克白蛋白。此外，向制劑中添加1mg精氨酸。凍干，淀粉代血漿加精氨酸，無白蛋白的100U肉毒桿菌毒素A型復合體藥物組合物在-5℃貯存一年。這一年期限末，使用小鼠給藥實驗測定淀粉代血漿加精氨酸毒素制劑的效能，其基本無改變(即與最初效能的差異少于5％)。
實施例7含氨基酸的肉毒桿菌毒素藥物組合物用與上面實施例1中闡述的相同方式制備肉毒桿菌毒素A型純化神經(jīng)毒素復合體藥物制劑，除了可用大約1mg氨基酸如賴氨酸、甘氨酸、組氨酸或精氨酸代替0.5毫克白蛋白。凍干，無多糖，無白蛋白加甘氨酸、無白蛋白的100U肉毒桿菌毒素A型復合體藥物組合物可在-5℃貯存至少一年。這一年期限末的效能基本無改變(即與最初效能的差異少于5％)。
實施例8肉毒桿菌毒素藥物組合物的使用一名48歲男性被診斷為肌痙攣病，如頸張力障礙。給患者肌肉內注射大約10-3U/kg和大約35U/kg之間的含600μg淀粉代血漿和1mg氨基酸，如賴氨酸的肉毒桿菌毒素A型藥物組合物。1-7天內，肌痙攣病的癥狀減輕，癥狀減輕持續(xù)至少大約2個月至大約6個月。
這里公開的根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物具有許多優(yōu)點，包括下列1.可制備不含任何血液產(chǎn)物，如白蛋白的藥物組合物，因此不含任何血液產(chǎn)物傳染性元素如朊病毒。
2.該藥物組合物具有與當前可得到藥物組合物可比的或優(yōu)于之的穩(wěn)定性和高毒素潛能恢復百分比。
盡管本發(fā)明已經(jīng)詳細描述了關于某些優(yōu)選的方法，仍可能在本發(fā)明范圍內進行其它方案，變型和修改。例如，廣泛的穩(wěn)定性多糖和氨基酸也在本發(fā)明的范圍內。
因此，下列權利要求的精神和范圍不應該限于上面闡述的優(yōu)選方案的描述。
權利要求
1.一種藥物組合物，包含(a)神經(jīng)毒素，和；(b)多糖，其中多糖穩(wěn)定神經(jīng)毒素。
2.權利要求1的組合物，其中多糖的二糖單元的平均分子量在大約350D和大約2,000D之間。
3.權利要求1的組合物，其中多糖的二糖單元的平均分子量在大約375D和大約700D之間。
4.權利要求1的組合物，其中多糖包括至少大約70％支鏈淀粉。
5.權利要求1的組合物，其中多糖的重均分子量在大約20kD和大約2,500kD之間。
6.權利要求2的藥物組合物，其中基本上所有多糖的二糖單元都包括醚連接的吡喃葡萄糖分子。
7.權利要求1的藥物組合物，其中多糖中每10個吡喃葡萄糖中有平均大約4至大約10的羥基通過醚鍵被分子式為(CH2)n-OH的化合物取代，其中n可以是從1到10的整數(shù)。
8.權利要求7的藥物組合物，其中n是1和3之間的整數(shù)。
9.權利要求7的藥物組合物，其中多糖中每10個吡喃葡萄糖中有平均大約6至大約9的羥基通過醚鍵被分子式為(CH2)n-OH的化合物取代，其中n可以是從1到10的整數(shù)。
10.權利要求7的藥物組合物，其中多糖中每10個吡喃葡萄糖中有平均大約7至大約8的羥基通過醚鍵被分子式為(CH2)n-OH的化合物取代，其中n可以是從1到10的整數(shù)。
11.一種適合注射給人患者的藥物組合物，包含(a)肉毒桿菌毒素，和；(b)多糖，包括大量連接起來的吡喃葡萄糖單元，每個吡喃葡萄糖單元具有大量羥基，其中多糖中每10個吡喃葡萄糖中有平均大約6至大約9的羥基通過醚鍵被分子式為(CH2)n-OH的化合物取代，其中n可以是從1到4的整數(shù)。
12.權利要求1的藥物組合物，其中多糖的二糖單元的平均分子量在大約345D和大約1,000D之間。
13.權利要求11的藥物組合物，其中多糖是乙基醚取代的多糖。
14.權利要求11的藥物組合物，其中藥物組合物適合給藥人患者達到治療效果。
15.權利要求11的藥物組合物，其中肉毒桿菌毒素選自肉毒桿菌毒素型A、B、C1、D、E、F和G。
16.一種藥物組合物，包含(a)肉毒桿菌毒素，和；(b)羥乙基淀粉，其中該藥物組合物適合給藥人患者達到治療效果。
17.一種藥物組合物，包含(a)肉毒桿菌毒素；(b)多糖，和；(c)氨基酸或聚氨基酸。
18.權利要求17的藥物組合物，其中該藥物組合物在大約-1℃和大約-15℃之間的溫度下貯存一年，其效能基本保持不變。
19.權利要求17的藥物組合物，其中該藥物組合物在大約-1℃和大約-15℃之間的溫度下貯存兩年，其效能基本保持不變。
20.權利要求17的藥物組合物，其中該藥物組合物在大約-1℃和大約-15℃之間的溫度下貯存三年，其效能基本保持不變。
21.權利要求17的藥物組合物，其中該藥物組合物在大約-1℃和大約-15℃之間的溫度下貯存四年，其效能基本保持不變。
22.權利要求17的藥物組合物，其中該藥物組合物重新組成后，具有大約20％和大約100％之間的效能或恢復百分比。
23.權利要求17的藥物組合物，其中該藥物組合物重新組成后，具有大約10U/mg和大約30U/mg之間的效能。
24.權利要求17的藥物組合物，其中該藥物組合物重新組成后，具有大約20U/mg的效能。
25.權利要求17的藥物組合物，其中該藥物組合物不含任何白蛋白。
26.權利要求17的藥物組合物，其中該藥物組合物基本不含任何無毒復合體蛋白。
27.權利要求17的藥物組合物，其中多糖是淀粉。
28.權利要求17的藥物組合物，其中淀粉是羥乙基淀粉。
29.權利要求28的藥物組合物，其中該藥物組合物包含大約100單位肉毒桿菌毒素，和大約500μg和大約700μg之間的羥乙基淀粉。
30.權利要求29的藥物組合物，進一步包含大約0.5mg和大約1.5mg之間的氨基酸。
31.權利要求17的藥物組合物，其中肉毒桿菌毒素是肉毒桿菌毒素A型。
32.權利要求17的藥物組合物，其中氨基酸選自賴氨酸、甘氨酸、組氨酸和精氨酸。
33.一種穩(wěn)定、高效能、無致熱原、真空干燥的肉毒桿菌毒素A型藥物組合物，包含(a)肉毒桿菌毒素A型復合體；(b)多糖，和；(c)氨基酸或聚氨基酸，其中該制劑無白蛋白，在-5℃下具有1年保存期，用鹽水或水重新組成的當時具有大約90％的效能，和重新組成后和貯存在2℃下72小時后，具有大約80％效能。
34.權利要求33的制劑，其中該制劑重新組成時具有至少大約18U/mg的專一毒性。
35.一種主要由高分子量多糖和肉毒桿菌毒素組成的凍干或真空干燥的藥物組合物，其中高分子量多糖穩(wěn)定肉毒桿菌毒素。
36.權利要求35的組合物，其中高分子量多糖選自羥甲基淀粉、羥乙基淀粉、羥丙基淀粉、羥丁基淀粉和羥戊基淀粉。
37.權利要求35的藥物組合物，其中肉毒桿菌毒素選自肉毒桿菌毒素A、B、C1、D、E、F和G型。
38.一種包含與肉毒桿菌毒素混合的多糖和氨基酸的藥物組合物，其中多糖的量對于每單位肉毒桿菌毒素在大約1×10-9摩爾多糖和每單位肉毒桿菌毒素大約2×10-12摩爾多糖之間。
39.一種制備藥物組合物的方法，包括制備肉毒桿菌毒素和由共價連接的重復單體組成的多糖的混合物的步驟，其中單體平均分子量在大約350D和大約1,000D之間。
40.一種穩(wěn)定梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素對抗變性或聚集的方法，該方法包括梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素接觸包含多糖的穩(wěn)定性組合物的步驟。
41.權利要求40的方法，其中接觸步驟包括向含梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素的水溶液或凍干或真空干燥粉劑中添加有效量多糖的步驟。
42.權利要求1的藥物組合物，其中該藥物組合物在重新組成或注射時，pH在大約5和7.3之間。
43.一種藥物組合物，包含(a)肉毒桿菌毒素，和；(b)重組制備的白蛋白。
44.權利要求43的藥物組合物，進一步包含乙酰色氨酸酯和鹽和其衍生物。
45.一種注射藥物組合物的裝置，包括雙腔預灌注注射器，注射器的一個腔含有肉毒桿菌毒素，和注射器第二個腔含有稀釋劑或緩沖液。
46.一種使用藥物組合物的方法，該方法包括將該藥物組合物局部給藥患者獲得治療效果的步驟，其中該藥物組合物包括肉毒桿菌毒素、多糖和氨基酸。
47.一種藥物組合物，包含(a)肉毒桿菌毒素，和；(c)氨基酸。
48.一種穩(wěn)定的藥物組合物，主要由以下組成(a)肉毒桿菌毒素，和；(c)氨基酸。
49.權利要求48的藥物組合物，其中該組合物不含白蛋白，不含多糖，在-5℃下具有1年的保存期，用鹽水或水重新組成時具有至少大約90％的效能，和重新組成后貯存在2℃72小時，具有大約80％的效能。
全文摘要
一種肉毒桿菌毒素藥物組合物，其不含來自血液的白蛋白，包含肉毒桿菌毒素、氯化鈉或水和多糖例如羥乙基淀粉和/或氨基酸，該藥物組合物適于治療給藥至人類患者。可選擇地，多糖和氨基酸可被重組白蛋白替代。
文檔編號A61P21/00GK1398188SQ01804659
公開日2003年2月19日 申請日期2001年2月5日 優(yōu)先權日2000年2月8日
發(fā)明者T·J·亨特 申請人:阿勒根公司