在疾病治療中作為胞毒劑,藥物預(yù)致敏劑和化學(xué)致敏劑的透明質(zhì)酸的制作方法

專利名稱：在疾病治療中作為胞毒劑,藥物預(yù)致敏劑和化學(xué)致敏劑的透明質(zhì)酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及增強(qiáng)化療劑的生物利用率以治療疾病。本發(fā)明尤其涉及單獨使用透明質(zhì)酸或與化療劑組合使用以增強(qiáng)化療劑的生物利用率而治療疾病的用途。本發(fā)明還涉及治療抗藥性疾病的方法，其中通過單獨使用透明質(zhì)酸或與化療劑組合使用以克服或減輕抗藥性。
背景技術(shù)：
侵害動物包括人類地許多疾病是用化療劑治療的。例如，化療劑在治療腫瘤性疾病包括結(jié)締組織或自身免疫性疾病，代謝性疾病，和皮膚病中是有利用價值的，而且這些制劑中有許多是高效的及沒有任何生物利用率的問題。
正確使用化療劑需要在選擇化療劑，確定劑量及進(jìn)行治療之前，十分熟悉疾病的自然病史和病理生理學(xué)情況。對每個患者要進(jìn)行仔細(xì)評價，注意可加強(qiáng)毒性的直接相關(guān)因素，如明顯感染或隱性感染，出血惡病質(zhì)，營養(yǎng)不良，及嚴(yán)重代謝紊亂。另外，一些主要器官如肝，腎和骨髓的功能狀態(tài)是非常重要的。因此，要根據(jù)患者的情況，選擇適當(dāng)?shù)幕焺┖驮O(shè)計一種有效的治療方案。這種考慮影響施用藥物的劑量和劑量。
不幸地，不是所有化療劑均是易于使用的。例如，一些化療劑本身是不應(yīng)性的，即動物細(xì)胞對這些制劑不易應(yīng)答，而其它化療劑有獲得性抗性。例如，已熟知對長期化療的一些患者要被迫改變化療劑，因為這些化療劑隨著時間而效力降低。然而另外一些不受固有的或獲得的抗性影響的化療劑在治療一些疾病中是無效的，因為它們具有生物利用率的天生的問題。通常受細(xì)胞抗性和生物利用率問題同時影響的疾病是癌癥。
癌癥是西方社會中4種致死原因之一。盡管1990-1994年美國和加拿大的癌癥新發(fā)率和死亡率降低，但數(shù)據(jù)表明在1990-1994年美國有2604650人死于癌癥，男性(53％)多于女性(47％)。大多數(shù)致死的常見癌癥是肺癌(728641)，結(jié)腸直腸癌(285724)，乳腺癌(218786)，和前列腺癌(169943)。
在女性當(dāng)中，最常見的癌癥是乳腺癌(31％)，肺癌(12％)，結(jié)腸直腸癌(12％)，子宮癌(6％)，和卵巢癌(4％)，而乳腺癌和卵巢癌占女性所有發(fā)現(xiàn)的癌癥的大約35％。經(jīng)診斷患有這種形式癌癥的女性大多數(shù)接受外科手術(shù)，放療或化療等組合治療。
用于治療癌癥的化療劑基本可以分為幾個主要類別，包括(1)烷化劑，如二氯甲基二乙胺，環(huán)磷酰胺，苯丙氨酸氮芥，尿嘧啶芥子，苯丁酸氮芥，二甲磺酸丁酯，卡氮芥，環(huán)己亞硝脲，甲環(huán)亞硝脲，鏈脲霉素(streptozoticin)和decrabazine；(2)抗代謝物如氨甲喋呤，氟尿嘧啶，氟脫氧尿嘧啶，阿糖胞苷，azarabine，5-碘脫氧尿苷，6-巰基嘌呤，硝基咪唑硫嘌呤，硫鳥嘌呤，和腺嘌呤阿拉伯糖苷；(3)天然產(chǎn)物衍生物如長春花堿，長春新堿，更生霉素，道諾霉素，阿霉素，光神霉素，taxanes(例如paclitaxel)，博來霉素，依托泊苷，鬼臼噻吩苷，和絲裂霉素C；和(4)混合制劑如羥基脲，procarbezine，mititane，和順鉑。
已經(jīng)觀測到具有臨床多元抗藥性的重要的癌癥化療劑(常規(guī)有效劑量)包括長春花堿(0.1mg/kg/周)，長春新堿(0.01mg/kg/周)，依托泊苷(35-50mg/m2/天)，更生霉素(0.15mg/kg/天)，阿霉素(500-600mg/m2/周)，道諾霉素(65-75mg/m2/周)，和光神霉素(0.025mg/kg/天)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已充分意識到目前沒有有效的方法克服對化療劑的細(xì)胞抗性。更重要的是沒有提高化療劑的生物利用率而不伴隨毒性或副作用提高的實用方法。因此，需要一種克服或至少減輕與獲得性或固有的細(xì)胞抗性相關(guān)的問題的方法，以及提高化療劑生物利用率的方法。
本申請人先前研究了透明質(zhì)酸(HA)作為化療的藥物輸送載體的功效，發(fā)現(xiàn)HA當(dāng)與這些藥物聯(lián)合施用時是有益的，國際專利申請PCT/AU00/00004覆蓋了這一發(fā)明，在此以其全文并入?yún)⒖?。HA，也稱為透明質(zhì)酸，是一種包含線性鏈聚合物的天然發(fā)生的多糖，發(fā)現(xiàn)其遍布于動物王國中。HA是高度水溶性的，是生物系統(tǒng)的一種理想的藥物輸送載體。
在國際專利申請PCT/AU00/00004申請之后，本申請人驚奇地發(fā)現(xiàn)可單獨施用HA發(fā)揮作用。發(fā)現(xiàn)HA對人乳腺癌細(xì)胞，以及預(yù)致敏細(xì)胞可發(fā)揮胞毒作用，使它們對化療劑更敏感。本發(fā)明因此提供了可有效處理對化療劑有抗性或變得有抗性的細(xì)胞的方法。更重要地，通過使用本發(fā)明揭示的方法，可降低化療劑的劑量而不降低對患者的效力。本發(fā)明的方法包括單獨施用透明質(zhì)酸或與化療劑結(jié)合施用。
本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸，其衍生物，類似物及鹽不僅抑制細(xì)胞，而且還可在標(biāo)準(zhǔn)劑量或據(jù)認(rèn)為效力較低的低劑量安全施用所選擇的化療劑，進(jìn)行治療患者包括病人。在體內(nèi)組合化療劑施用透明質(zhì)酸，還可增強(qiáng)這些制劑對不應(yīng)細(xì)胞的治療作用，因此預(yù)防隨后出現(xiàn)的多元抗藥性。
病變的細(xì)胞如癌細(xì)胞通常具有由于膜電壓改變而更通透的膜，或受體狀態(tài)提高，這可改變其胞內(nèi)分子轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)則，導(dǎo)致細(xì)胞膨脹(Lang等，1993)。盡管本申請人不希望被任何假定的理論所束縛，但其中有一些機(jī)制可解釋HA作為單獨藥劑，及作為預(yù)處理化療劑所發(fā)揮的細(xì)胞作用
1)當(dāng)HA與CD44，RHAMM和結(jié)合的清除劑受體結(jié)合時，HA
的凈負(fù)電荷改變細(xì)胞膜電壓，導(dǎo)致細(xì)胞通透性提高，接著使
藥物更順利地流入病變的細(xì)胞。
2)當(dāng)HA與病變的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞結(jié)合并內(nèi)在化時，可以有高
滲效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞裂解。
3)HA可引起氧化性膜損害作用導(dǎo)致編程性細(xì)胞死亡。
4)HA內(nèi)在化可升高線粒體膜電壓，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或提高藥物
的保持力。
由于HA是在飽和水平施用的，因此糖胺聚糖的內(nèi)在化是恒定的，這意味著在HA的容量結(jié)構(gòu)域中是平衡的任何治療劑被共同內(nèi)在化，導(dǎo)致藥物在細(xì)胞內(nèi)濃縮釋放。發(fā)明概述
本發(fā)明的最寬方面是提供一種治療需要治療的患者的方法，包括給所述患者施用與化療劑結(jié)合的治療有效量的透明質(zhì)酸，由此所述化療劑比單獨施用更有效。
本發(fā)明還提供了一種增強(qiáng)化療劑的生物利用率的方法，包括給需要治療的患者施用治療有效量的透明質(zhì)酸。
透明質(zhì)酸可用于明顯增強(qiáng)任何施用的化療劑的生物利用率。優(yōu)選地，施用的化療劑選自卡氮芥(BCNU)，苯丁酸氮芥(Leukeran)，順鉑(Platinol)，阿糖胞苷，阿霉素(Adriamycin)，氟尿嘧啶(5-FU)，氨甲喋呤(Mexate)，CPT111，依托泊苷，普卡霉素(Mithracin)，和taxanes如紫杉醇。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防多元抗藥性或抗藥性細(xì)胞的方法，包括在施用化療劑之前，同時或之后，施用治療有效量的透明質(zhì)酸。
如以下更詳細(xì)的論述，施用透明質(zhì)酸和化療劑使腫瘤生長抑制至少50％，優(yōu)選60％，更優(yōu)選70％以上。因此，消除腫瘤生長和增殖可消除多元抗藥性細(xì)胞產(chǎn)生，降低癌癥的復(fù)發(fā)及提高化療法的效力。
本發(fā)明還提供了一種用以提高細(xì)胞對化療劑的敏感性的包含透明質(zhì)酸的藥物組合物。透明質(zhì)酸和/或化療劑也可與另外的藥物載體一起施用。
本發(fā)明還提供了一種治療癌細(xì)胞的方法，包括為需要治療的患者施用治療有效量的透明質(zhì)酸。
典型地，所述癌細(xì)胞是對化療藥物有抗性的癌細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供了一種克服細(xì)胞抗性的方法，包括施用治療有效量的HA。
在本申請的闡述和權(quán)利要求中，術(shù)語“包括”意為“包括但非限于”，及不排外其它添加物，組成成分，整數(shù)或步驟。附圖簡述


圖1示出暴露于750000道爾頓的HA 24小時的指數(shù)生長的乳腺癌細(xì)胞，在此階段對細(xì)胞進(jìn)行照相。注意到在10ng/ml，細(xì)胞數(shù)減少，但形態(tài)學(xué)無差異。在100ng/ml和1μg/ml，上部細(xì)胞呈現(xiàn)滲透壓應(yīng)答，表現(xiàn)出細(xì)胞膨脹。在2mg/ml和5mg/ml，細(xì)胞變?yōu)榱?，質(zhì)膜“有凹痕”，可能表示滲透壓應(yīng)答和/或細(xì)胞死亡的開始。
圖2a-2f示出暴露于750000道爾頓的HA 30分鐘，1小時或24小時的指數(shù)生長的乳腺癌細(xì)胞，在此階段細(xì)胞用不同濃度阿霉素處理。這些圖還示出HA/藥物共溫育1或3天的效果。這些圖示出HA可使細(xì)胞對治療藥物“預(yù)致敏”和/或化學(xué)致敏。
圖3a-3d示出暴露于750000道爾頓的HA 1小時，24小時，或3天后，接著用40nM阿霉素處理1小時，24小時或3天的指數(shù)生長的乳腺癌細(xì)胞。這些圖表示出寬范圍濃度的透明質(zhì)酸可作為化學(xué)致敏劑或發(fā)揮胞毒作用。
圖4示出在6周的研究期間沒有治療毒性。與用5-FU處理組相對比，證明接受HA治療的小鼠(HA作為唯一藥劑或作為化學(xué)致敏劑)表現(xiàn)良好，動物不喪失體重而是保持體重。
圖5示出在6周研究末，確定腫瘤質(zhì)量，經(jīng)HA化學(xué)致敏治療組的腫瘤明顯小于鹽水組，HA和5-FU組(p＝0.005)。通過與鹽水對照組相比原發(fā)腫瘤塊縮小，也證明HA作為唯一藥劑的效力。在開始處理的2周內(nèi)，腫瘤應(yīng)答無明顯不同，但之后通過HA及隨后的5-FU處理，腫瘤生長與其它方式處理的對照組相比延遲。在6周的處理期間，在腫瘤倍增周期數(shù)中注意到令人感興趣的差異。接受鹽水處理的小鼠經(jīng)歷平均4次腫瘤倍增，而將HA摻入治療方案中明顯提高腫瘤倍增時間，其中HA/5-FU處理的動物經(jīng)歷平均1次腫瘤倍增循環(huán)，再一次顯著表明HA對5-FU胞毒性的作用。
圖6示出共同施用HA導(dǎo)致非淋巴性轉(zhuǎn)移明顯降低。除了接受HA治療的小鼠之外，在原發(fā)腫瘤鄰近部位的頸部或腋下周圍觀測到新發(fā)腫瘤。發(fā)明詳述
本發(fā)明方法和組合物能用于增加細(xì)胞對化療劑如抗癌劑如紫杉醇、止痛劑、鴉片劑、激素或抗生素等的敏感性。本發(fā)明的方法和組合物特別可用于增加與細(xì)胞增生疾病(如贅生物)相關(guān)的細(xì)胞的敏感性。通過增加效力而無伴隨的對非癌細(xì)胞的毒性，本發(fā)明提供了可用于治療腫瘤和預(yù)防或降低復(fù)發(fā)和由于胞毒性所致的死亡的復(fù)發(fā)和組合物。另外，本發(fā)明通過在誘導(dǎo)多元抗藥性表型的任何突變出現(xiàn)之前消除癌細(xì)胞而消除或降低了多元抗藥性細(xì)胞數(shù)。因此，通過降低多元抗藥性細(xì)胞的出現(xiàn)，本發(fā)明令人滿意地克服了目前的治療形式中存在的問題。
本文所用術(shù)語“患者”是指具有需要用化療劑治療的疾病或病理狀態(tài)的任何動物，其中化療劑的效力相對于所需治療效力降低。優(yōu)選地，患者患有細(xì)胞增生性疾病(例如贅生性疾病)。本發(fā)明的患者包括哺乳動物(例如牛，狗，馬，貓，豬)，優(yōu)選人。
“細(xì)胞增生性疾病”是指細(xì)胞不正常生長，典型地異常生長，產(chǎn)生贅生物，腫瘤或癌癥。
細(xì)胞增生性疾病包括例如乳腺，肺，前列腺，腎，皮膚，神經(jīng)系統(tǒng)，卵巢，子宮，肝，胰腺，上皮細(xì)胞，胃，小腸，外分泌腺，內(nèi)分泌腺，淋巴，造血系統(tǒng)或頭頸部組織的癌癥。
通常地，贅生性疾病是這樣一種病態(tài)，其中細(xì)胞異常增殖產(chǎn)生稱為贅生物或腫瘤的組織塊。贅生物在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)中有不同程度的差異。一些贅生物是良性的，而其它是惡性或癌性的。一種有效治療贅生性疾病的方法被認(rèn)為是對研究癌癥預(yù)防或治療方法有益的。
本發(fā)明的方法包括一個實施方案，(1)在施用化療劑之前，同時或隨后施用透明質(zhì)酸；或(2)組合施用透明質(zhì)酸和化療劑。
本文所用術(shù)語“治療有效量”是指有效產(chǎn)生所需治療效果的本發(fā)明的化合物的數(shù)量。例如在宿主中預(yù)防癌癥或治療癌癥綜合征的數(shù)量或有效治療癌癥的數(shù)量。
具體的“治療有效量”明顯地可由于這樣一些因素而變化，如正在治療的特定病理狀態(tài)，患者的物理狀態(tài)，治療的哺乳動物類型，治療持續(xù)時間，協(xié)同治療的性質(zhì)(如果有)，和應(yīng)用的特異配方，和化合物或其衍生物的結(jié)構(gòu)。
本文所用“藥物載體”是將透明質(zhì)酸和/或化療劑輸送至動物或人體的一種藥物合適的溶劑，懸浮劑或運(yùn)載體。此載體可以是液體或固體，而且是根據(jù)計劃的施用方式選擇的。
本文所用術(shù)語“癌癥”是指在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的所有類型的癌或贅生物或惡性腫瘤。癌包括肉瘤，淋巴瘤和其它癌。例如但非限于以下這些特殊類型的癌癥前列腺癌，結(jié)腸癌，乳腺癌，MX-1和MCF細(xì)胞系癌，胰腺癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，橫紋肌肉瘤，home，肺癌，小鼠，黑素瘤，白血病，胰腺癌，黑素瘤，卵巢癌，腦癌，頭頸部癌，腎癌，間皮瘤，肉瘤，Kaposi’s肉瘤，胃癌和子宮癌。
本文所用術(shù)語“細(xì)胞”包括但非限于哺乳動物細(xì)胞(例如小鼠細(xì)胞，大鼠細(xì)胞或人體細(xì)胞)。
透明質(zhì)酸和/或化療劑可以以含有常規(guī)非毒性藥物合適的載體，佐劑和運(yùn)載體的劑量單位配方，經(jīng)口服，局部或非腸道施用。本文所用術(shù)語非腸道包括皮下注射，氣霧劑，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，鞘內(nèi)，顱內(nèi)，胸骨內(nèi)注射或輸注方法。
本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明的新治療方法中的適當(dāng)?shù)木植浚诜头悄c道藥物配方。本發(fā)明的化合物可以以片劑，水性或油性懸浮液，錠劑，糖錠，粉末，粒劑，乳劑，膠囊，糖漿或酏劑口服施用?？诜慕M合物可含有一或多種選自甜味劑，香味劑，色素和防腐劑的制劑，以產(chǎn)生一流的和口味好的藥物制品。片劑含有活性配料，與適于生產(chǎn)片劑的無毒藥物學(xué)可接受賦形劑混合。
這些賦形劑例如可以是(1)惰性稀釋劑，如碳酸鈣，乳糖，磷酸鈣或磷酸鈉；(2)成粒劑和崩解劑如谷物淀粉或藻酸；(3)粘合劑如淀粉，明膠或阿拉伯樹膠；和(4)潤滑劑如硬脂酸鎂，硬脂酸或滑石。這些片劑可以不包衣或通過已知方法包衣，以在胃腸道中延遲崩解和吸收，從而提供較長期的緩釋作用。例如，可應(yīng)用延時物質(zhì)如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。也可用美國專利No.4256108；4160452；和4265874所述的方法進(jìn)行包衣，形成滲透壓治療片劑以控制釋放。
用于本發(fā)明方法中的透明質(zhì)酸以及化療劑可在體內(nèi)單獨或一起經(jīng)非腸道注射或逐漸灌注而施用?？梢越?jīng)靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，腔內(nèi)或皮內(nèi)注射施用。為進(jìn)行體外研究，可將制劑加入或溶解于適當(dāng)?shù)纳飳W(xué)合適的緩沖液中，及加入細(xì)胞或組織中。
非腸道施用的制品包括無菌水溶液或非水溶液，懸浮液或乳劑。非水溶液溶劑例如是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油，和可注射有機(jī)酯如油酸乙酯。水溶液載體包括水，乙醇水溶液，乳狀液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。非腸道運(yùn)載體包括氯化鈉溶液，Ringer’s葡萄糖溶液，葡萄糖和氯化鈉溶液，乳酸化的Ringer’s靜脈內(nèi)運(yùn)載體包括流質(zhì)和營養(yǎng)補(bǔ)充物，電解質(zhì)補(bǔ)充物(如基于Ringer’s葡萄糖液的那些補(bǔ)充物)等等。也可存在防腐劑和其它添加物，如抗微生物劑，抗氧化劑，螯合劑，生長因子和惰性氣體等等。
可以預(yù)想本發(fā)明可用于治療病理學(xué)相關(guān)的細(xì)胞增生性疾病，包括例如贅生物，癌(例如乳腺，肺，前列腺，腎，皮膚，神經(jīng)系統(tǒng)，卵巢，子宮，肝，胰腺，上皮，胃，小腸，外分泌腺，內(nèi)分泌腺，淋巴，造血系統(tǒng)或頭頸部組織的癌癥)，纖維化疾病等。
本發(fā)明的方法和化合物也可用于治療與化療法相關(guān)的其它疾病，如神經(jīng)變性疾病，激素失調(diào)等。因此，本發(fā)明涵蓋了改善與細(xì)胞增殖，腫瘤，癌等相關(guān)的疾病狀況的方法，包括在患病部位用足以抑制或改善細(xì)胞增殖或相關(guān)疾病的數(shù)量的透明質(zhì)酸和化療劑治療患者。一般地，本文所用術(shù)語“治療”，“療法”等是指作用于對象，組織或細(xì)胞，以獲得所需的藥理和/或生理學(xué)作用。此作用可以預(yù)防性的，完全或部分預(yù)防細(xì)胞增生性疾病或跡象或癥狀，和/或可以是治療性的，部分或完全治療歸因于例如異常細(xì)胞增殖的疾病，和/或副作用。所用術(shù)語“治療”涵蓋了在脊椎動物，哺乳動物尤其人體中對細(xì)胞增生性疾病的任何治療或預(yù)防，包括(a)在有患病傾向但還未診斷的對象中預(yù)防疾病發(fā)生；(b)抑制疾病，即阻止其發(fā)展；或(c)緩解或改善疾病，即使疾病消退。
本發(fā)明包括用于改善細(xì)胞增生性疾病的各種藥物組合物，所述疾病包括腫瘤，癌等。本發(fā)明的藥物組合物是通過將透明質(zhì)酸，其類似物，衍生物或其鹽和一或多種化療劑，或透明質(zhì)酸和一或多種化療劑的組合，用載體，賦形劑和添加劑或輔助劑形成適于施用于患者的形式而制備。通常使用的載體或輔助劑包括碳酸鎂，二氧化鈦，乳糖，甘露醇和其它糖，滑石，乳蛋白，明膠，淀粉，維生素，纖維素及其衍生物，動物和植物油，聚乙二醇和溶劑，如無菌水，乙醇，甘油和多元醇。靜脈內(nèi)載體包括流質(zhì)和營養(yǎng)補(bǔ)充物。防腐劑包括抗微生物劑，抗氧化劑，螯合劑和惰性氣體。其它藥物合適的載體包括水相溶液，無毒賦形劑，包括鹽，防腐劑，緩沖液等，例如Remington’s藥物科學(xué)，第15版，EastonMack出版公司，1405-1412，1461-1487(1975)，和國家處方一覽表XIV，第14版，華盛頓美國藥品協(xié)會(1975)所述，其內(nèi)容在此并入?yún)⒖肌Ｋ幬锝M合物的各種成分的pH和準(zhǔn)確濃度是根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法調(diào)節(jié)的。見Goodman和Gilman，藥物學(xué)治療基礎(chǔ)(第7版)。
藥物組合物優(yōu)選以劑量單位制備和施用。固體劑量單位是片劑，膠囊和栓劑。為進(jìn)行治療，根據(jù)化合物的活性，施用方式，疾病的性質(zhì)和程度，患者的年齡和體重，可使用不同的日劑量。然而在一些情況下，較高或較低的日劑量可以是適當(dāng)?shù)?。日劑量的施用可以通過一次單獨劑量單位形式或若干較少劑量單位單次施用及也可以特異間隔多次施用細(xì)分的劑量。
本發(fā)明的藥物組合物可以治療有效量局部施用或系統(tǒng)施用。所用的有效量當(dāng)然依賴于疾病的程度和患者的體重和一般狀態(tài)。典型地，在體外施用的劑量可為原位施用藥物組合物提供有益的指導(dǎo)，可施用動物模型以確定治療特定疾病的有效劑量。例如Langer，科學(xué)2491527(1990)闡述了各種需要考慮的事項。口服配方可以是硬明膠膠囊形式，其中活性配料與惰性固體稀釋劑混合，例如碳酸鈣，磷酸鈣或高嶺土。也可以是軟明膠膠囊形式，其中活性配料與水或油基混合，如花生油，液體石臘或橄欖油。
水性懸浮液通常含有與適于產(chǎn)生水性懸浮液的賦形劑混合的活性物質(zhì)。這種賦形劑可以是(1)懸浮劑如羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，藻酸鈉，聚乙烯吡咯烷酮，黃蓍膠和阿拉伯膠；(2)分散劑或濕潤劑，其可以是(a)天然存在的磷脂如卵磷脂；(b)烯化氧與脂肪酸的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；(c)環(huán)氧乙烷與長鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物，例如heptadecaethylenoxycetanol；(d)環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯的縮合產(chǎn)物，如聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸酯；或(e)環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和無水己糖醇的部分酯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧化乙烯山梨聚糖一油酸酯。
藥物組合物可以是無菌可注射的水性或油性懸浮液。懸浮液可以是根據(jù)已知方法配制的，使用上述那些適當(dāng)?shù)姆稚┗驖駶檮┖蛻腋o菌可注射的制品也可以是在無毒非腸道合適的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射的溶液或懸浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。在合適的運(yùn)載體和溶劑中可應(yīng)用的是水，Ringer’s溶液，和等滲的氯化鈉溶液。另外，無菌的，不易揮發(fā)的油常規(guī)用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可應(yīng)用任何刺激性小的不易揮發(fā)的油，包括合成的一或二甘油酯。另外，脂肪酸如油酸用于可注射制品中。
本發(fā)明的透明質(zhì)酸與化療劑也可一起以脂質(zhì)輸送系統(tǒng)形式施用.如小單層脂質(zhì)體、大單層脂質(zhì)體和多層脂質(zhì)體。脂質(zhì)體可以從各種磷脂中形成，如膽固醇，硬脂胺，或磷脂酰膽堿。
本發(fā)明的化合物劑量水平是大約0.5-10mg/kg體重，優(yōu)選為大約5-20mg/kg體重/天(大約0.3g-20g/人/天)?？膳c載體物質(zhì)組合產(chǎn)生單一劑量的活性配料的數(shù)量，根據(jù)治療的宿主和施用模式可以改變。例如，口服施用于人體的配方可含有大約5mg-1g的活性化合物，及適當(dāng)?shù)暮统Ｒ?guī)量的載體物質(zhì)，此載體物質(zhì)可占總組合物的大約5-95％。劑量單位形式一般含有大約5mg-500mg的活性配料。
然而應(yīng)意識到對任何特殊患者的特異劑量水平依賴于各種因素，包括應(yīng)用的具體化合物的活性，年齡，體重，一般狀況，性別，飲食，施用時間，施用途徑，排泄速度，藥物組合，及進(jìn)行治療的疾病的程度。
另外，本發(fā)明的一些化合物可與水或常用有機(jī)溶劑形成溶劑化物。這種溶劑化物涵蓋在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明的化合物可另外與其它化合物組合，提供一種實用組合。這包括化療劑的任何化學(xué)相容的組合，只要這種組合不消除本發(fā)明的透明質(zhì)酸的活性。
本發(fā)明通過參考以下非限制性實施例得以進(jìn)一步闡述。然而應(yīng)意識到以下實施例只是例證了本發(fā)明，而無任何限制本發(fā)明之意。特別地，盡管本發(fā)明相對于癌癥進(jìn)行了詳細(xì)闡述，但應(yīng)清楚地明了本發(fā)明并非只限于治療癌癥。例如，HA可用于治療其它癥狀。實施例1制備透明質(zhì)酸和5-氟尿嘧啶溶液
用于所有體外和體內(nèi)研究的HA均得自Kyowa Kogyo(Yamaguchi，日本)。5-FU得自Sigma，St.Louis，美國。阿霉素得自Cytomix，Northcote，澳大利亞墨爾本。使用的HA標(biāo)準(zhǔn)分布圖如表1所示。
表1散裝透明質(zhì)酸干粉的說明單
HA溶液的10mg/ml原液是通過將干粉狀的HA(模式Mr，7.5×105kDa)溶解于無熱原的注射等級水中制備的。為保證溶液均質(zhì)，將HA在4℃溶解過夜隨后渦旋。為保證HA在制備原液期間保持其分子量，將溶液在Sephacryl S-1000大小排阻凝膠上分析，柱規(guī)格為1.6cm×70cm，樣品大小2ml，流速18ml/h，級分大小2ml。通過糖醛酸分析檢測層析柱級分中的透明質(zhì)酸。
糖醛酸分析用于定量檢測收集自凝膠過濾層析步驟的級分中透明質(zhì)酸的存在。然后將每個級分的25μl等份移至96孔平板中，接著在這些級分中加入250μl的咔唑試劑(在H2SO4中的3M咔唑/0.025M硼酸鹽)。將96孔平板在80℃溫育45-60分鐘。用具有550nm濾膜的Dynatech MR7000平板讀出器閱讀此96孔平板。當(dāng)在背景吸光度之上吸光度＞3標(biāo)準(zhǔn)偏差時，認(rèn)為此吸光度是顯著的。背景是通過取等量樣品在Vo和Vt之前和之后計算的，其中平均數(shù)是16(Fraser等，1998)。
5-FU的原液是通過將粉末狀的5-FU溶解于0.1M的NaOH(pH8.9)中，并用無熱原注射等級的0.9％w/v NaCl將濃度調(diào)節(jié)為1mg/ml而制備的。將此原液通過0.22μm濾膜過濾以保證無菌性。通過在上述細(xì)胞系特異性生長培養(yǎng)基中加入所需體積的原液，將5-FU稀釋。
在0.9％ NaCl中的10mg/ml的阿霉素溶液得自Cytomix。實施例2測試透明質(zhì)酸對癌細(xì)胞形態(tài)的作用
基于HA結(jié)合親和性(Culty等，1994)，和HA受體CD44和RHAMM的表達(dá)(Wang等，1996)，選擇人乳腺腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468，MDA-MB-435和MDA-MB-231。這些細(xì)胞系的特性示于表2。
表2人乳腺癌細(xì)胞系的透明質(zhì)酸結(jié)合和受體表達(dá)
aCulty等，1994
bWang等1996
將細(xì)胞系MDA-MB-231，MDA-MB-468和MDA-MB-435常規(guī)培養(yǎng)，并以單層細(xì)胞在175cm2培養(yǎng)瓶中，在補(bǔ)加10％胎牛血清(FCS)和抗生素/抗真菌試劑的Leibovitz L-15培養(yǎng)基中，于37℃具有100％(v/v)空氣的控制濕度的溫育器中傳代培養(yǎng)。
具有谷氨酰胺的Leibovitz-L-15培養(yǎng)基(10×濃縮物)，RPMI(10×濃縮物)，Eageles基本培養(yǎng)基(EBM，10×濃縮物)，20mMHEPES，0.09％ w/v碳酸氫鹽，Hanks’平衡鹽溶液(HBSS，10×濃縮物)和無鈣和鎂的Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，10×濃縮物)，均購自Sigma(St.Louis，Mo.，美國)。將粉末狀濃縮物溶解于所需體積的反滲透去離子的無熱原的蒸餾水中，產(chǎn)生單一濃度的溶液，通過0.22μm高壓過濾器滅菌(Millipore公司，MA，美國)，并貯藏于4℃。FCS購自澳大利亞CSL公司。將FCS貯藏于-20℃。含有10000單位/ml青霉素，10mg/ml鏈霉素和25μg/ml兩性霉素U的抗生素/抗真菌溶液(100×濃縮物)得自Sigma(St Louis，美國)。含有在0.9％w/v NaCl中的5g/L豬胰蛋白酶和2g/L EDTA的胰蛋白酶/EDTA溶液(10×濃縮物)得自Sigma(St Louis，Mo.，美國)。所有乳腺癌細(xì)胞系均得自美國組織培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，美國)。所有塑料一次性培養(yǎng)瓶均得自Greiner(澳大利亞)。8孔的組織培養(yǎng)顯微鏡玻片得自Linbro(Flow實驗室，VA，美國)。
為進(jìn)行測試，將MDA-MB-468，MDA-MB-231和MDA-MB-435細(xì)胞系在補(bǔ)加10％ FCS的90％Leibovitz L-15培養(yǎng)基中生長。當(dāng)鋪滿時，將培養(yǎng)物用HBSS洗1次，并在0.25％胰蛋白酶/0.05％ EDTA中用胰蛋白酶消化。用自動細(xì)胞計數(shù)器(ZM-2 Coulter計數(shù)器)，通過加入15ml鹽水+0.2ml細(xì)胞懸浮液，計數(shù)細(xì)胞懸浮液。
將細(xì)胞以以下數(shù)目再懸浮
MDA-MB-46825000個細(xì)胞/ml培養(yǎng)基
MDA-MB-23112000個細(xì)胞/ml培養(yǎng)基
MDA-MB-43512000個細(xì)胞/ml培養(yǎng)基
將細(xì)胞鋪板于48孔平板中(1cm2表面積)，每孔加入1ml細(xì)胞懸浮液。使細(xì)胞附著24小時，之后除去培養(yǎng)基，洗單層細(xì)胞。實驗培養(yǎng)基是含有0-1μM阿霉素或5-FU的生長培養(yǎng)基，加入或不加入0-1μM的HA(Mw 750000)。將細(xì)胞在不同時間和不同濃度接觸HA和藥物的若干組合(表3)。
表3透明質(zhì)酸和藥物與人乳腺癌細(xì)胞溫育的條件
在溫育和培養(yǎng)之后，將單層細(xì)胞用HBSS洗及在0.25％胰蛋白酶/0.05％ EDTA中經(jīng)胰蛋白酶消化。用自動細(xì)胞計數(shù)器(ZM-2 Coulter計數(shù)器)，加入15ml鹽水+0.2ml細(xì)胞懸浮液，計數(shù)細(xì)胞懸浮液。結(jié)果以％無藥物對照組表示，其如下計算
或根據(jù)試驗以％藥物對照表示，如下計算
將如實施例2所述指數(shù)生長的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，與0-5mg/ml HA(模式Mr 750000D)溫育24小時。在第24小時，計數(shù)細(xì)胞并用得自Eastman Kodak公司，Rochester，美國的CPR，1600膠卷照相。
當(dāng)HA與乳腺癌細(xì)胞溫育30分鐘，1小時，24小時或3天時，觀測到不同應(yīng)答，其中乳腺癌細(xì)胞數(shù)降低0-29％(見表4)。
表4HA對人乳腺癌細(xì)胞系的胞毒性作用*表中結(jié)果是2-3次獨立測定的平均值。
當(dāng)人乳腺癌細(xì)胞與HA溫育時，還觀測到特異性形態(tài)學(xué)改變(見圖1)，如質(zhì)膜膨脹，胞質(zhì)成分的顆粒度較大。
當(dāng)人乳腺癌細(xì)胞接觸HA 30分鐘，1小時，24小時或3天后，隨后接觸阿霉素，顯然地HA增強(qiáng)藥物的胞毒性(圖3&表5)。
表5在乳腺癌細(xì)胞系中HA對阿霉素胞毒性的作用
所有數(shù)字均代表2-3次獨立的試驗的范圍，其中數(shù)值是IC50減少倍數(shù)，這是通過將HA加入藥物中或在加入藥物之前用HA預(yù)致敏癌細(xì)胞而得的。實施例3透明質(zhì)酸在體內(nèi)的效力
基于實施例2中體外藥物敏感性實驗結(jié)果，對透明質(zhì)酸作為單獨藥劑及作為化學(xué)致敏劑，在體內(nèi)治療人乳腺癌的治療效力進(jìn)行評價。
從實施例2的結(jié)果中，選擇癌細(xì)胞系MDA-MB-468作為癌細(xì)胞接種物，以產(chǎn)生所有人腫瘤異種移植的裸鼠。將細(xì)胞常規(guī)生長，并如實施例2所述傳代培養(yǎng)。為注射入小鼠中，將細(xì)胞生長至100％鋪滿，在0.025％胰蛋白酶/0.01％ EDTA溶液中經(jīng)胰蛋白酶消化，洗2次，在Beckman TJ-6臺式離心機(jī)中以400gav離心10分鐘，用ZM型Coulter計數(shù)器計數(shù)，并以1×108個細(xì)胞/ml再懸浮于無血清的Leibovitz L-15培養(yǎng)基中。
將得自澳大利亞墨爾本W(wǎng)alter和Eliza Hall研究所的6-8周齡的無胸腺CBA/WEHI雌性裸鼠，保持在特異的無病原的條件下，無限制地給予無菌食物和水。每個小鼠注射一次含有5×106個細(xì)胞的50μl注射液。用26號針頭將細(xì)胞注射入在第一個乳頭下的乳腺脂肪墊中(Lamszus等，1997)。通過測定三維直徑(d1d2d3)每周對腫瘤進(jìn)行測定。腫瘤體積用以下公式估算
(1/6)π(d1d2d3)
在接種癌細(xì)胞后約4-8周，開始用5-FU±HA處理。用于每項研究的小鼠的平均腫瘤大小示于表6。
表6在每項研究開始時人乳腺癌腫瘤的概況
在誘導(dǎo)腫瘤后大約8周，將攜帶腫瘤的兩個小鼠給予致死劑量的戊巴比妥。在3分鐘內(nèi)殺死小鼠，經(jīng)手術(shù)切除腫瘤，并立即在10％福爾馬林緩沖液中固定12小時。將固定的腫瘤在70-100％系列的乙醇中脫水過夜，隨后用石蠟包埋，制成2-4μm的切片。將切片置于玻片上，脫蠟，并加入水。將玻片用PBS洗3×5分鐘。用10％胎牛血清溫育10分鐘封閉嗜異蛋白，隨后用PBS漂洗。
用于觀測HA和HA合酶抗體的二級抗體得自Dako(Californie，美國)。3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(Sigma，F(xiàn)ast DAB)片劑得自Sigma，St.Louis，美國。
在室溫應(yīng)用檢測抗體60分鐘。檢測抗血清或抗體是抗RHAMM，CD44H和CAE的抗血清或抗體。將玻片用PBS洗3×5分鐘，并通過在甲醇中的0.3％H2O2中浸泡20分鐘阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。再用PBS洗后，在室溫應(yīng)用綴合過氧化物酶的豬抗兔二級抗血清60分鐘，隨后用PBS洗3×5分鐘。Sigma Fast 3，3′-二氨基聯(lián)苯胺片劑(DAB)是根據(jù)生產(chǎn)者的指導(dǎo)制備的，并在室溫應(yīng)用DAB溶液5-10分鐘。將玻片用自來水洗10分鐘，用蘇木精負(fù)染，脫水并封固。
各個5-FU注射液是根據(jù)各個小鼠的質(zhì)量制備的，目的是將30mg/kg的5-FU分液在50μl注射液中輸送(相當(dāng)于平均60kg體重的人用治療劑量10.5mg/kg；Inaba等，1988)。制備包含終HA濃度等于12.5mg/kg小鼠體重的HA注射液，以便可以實現(xiàn)將12.5mg/kgHA在50μl中輸送。就注射至體內(nèi)的HA的數(shù)量而言，在實驗期間可觀測飽和動力學(xué)(Fraser等，1983)。
一種最常用的治療人乳腺癌的方案是在一個28天周期的第1天和第8天施用環(huán)磷酰胺，氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶。在人乳腺癌中，開始治療方案是6個周期，此時再確定患者的情況，因此我們嘗試盡可能地模擬人體治療方案，即在長期效力研究中將小鼠進(jìn)行6個周期(6個月)治療，和6個周期(6周)的短期效力研究?？紤]到小鼠的生活周期是大約2年，我們同時開始短期和長期治療方案(見表7)。
表7治療施用方案
將小鼠隨機(jī)分成7組每組8只動物進(jìn)行短期研究，及5組每組8只動物進(jìn)行長期研究(參考表7的劑量和治療施用時間表)。
治療不要超過6個月，因為已經(jīng)證實超過6個月的化療一般不伴有更大的益處(Harris等，1992)。
在進(jìn)行長期研究應(yīng)用處理的當(dāng)天，對動物稱重并測定腫瘤體積。在6周的研究期間，每天對動物進(jìn)行稱重及測定腫瘤體積。將動物單獨置于注射盒中，并通過尾靜脈施用注射液。實驗證明在患者對化療的反應(yīng)中，應(yīng)激是一個主要因素(Shackney等，1978)，因此我們保證在每個籠中分配相同數(shù)目的小鼠，根據(jù)實驗階段每個籠中小鼠的數(shù)目可以是5-8只。
當(dāng)動物由于疾病進(jìn)展的程度不得不進(jìn)行安死術(shù)時，或當(dāng)6個月(長期)或6周(短期)治療方案結(jié)束時，實驗到達(dá)終點。由于動物保護(hù)規(guī)范，通過獨立的動物保護(hù)人員隔周監(jiān)測一次動物，其確定疾病進(jìn)展程度。以下標(biāo)準(zhǔn)用于確定動物是否已經(jīng)達(dá)到需要致死的實驗終點階段
1)腫瘤已經(jīng)非常大以至于使動物不能行動；
2)動物不吃不喝，而且體重已經(jīng)明顯下降；
3)腫瘤大小超過身體的10％。
在實驗終點，將動物通過腹膜內(nèi)注射0.1ml的戊巴比妥(60mg/ml)進(jìn)行麻醉，收集血液，隨后用頸椎脫位法處死小鼠。
在處死小鼠后，立即切下小鼠的腫瘤，肝，心，脾，膀胱，左右腎，子宮，肺，胃，小腸，腦和淋巴結(jié)，并置于用0.06M磷酸鹽(pH7.5)和1.0％w/v十六烷基氯化吡啶緩沖的4％福爾馬林中。將組織固定16-24小時，之后進(jìn)行組織學(xué)加工。將固定的組織用100％乙醇脫水，并包埋于石蠟中制成2-4μm的切片，將切片置于顯微玻片上。用蘇木精核染色法和伊紅胞質(zhì)染色法對組織切片進(jìn)行染色，示出可表示治療毒性的任何病理學(xué)特征。
從每只動物收集9-11個淋巴結(jié)，確保收集的是自腫瘤區(qū)域輸出的所有淋巴結(jié)。通常有兩種方法用于檢測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移
i)對大體器官結(jié)構(gòu)進(jìn)行常規(guī)蘇木精和伊紅染色；及
ii)用癌癥標(biāo)記如癌胚抗原(CEA)進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。
在本研究中這兩種轉(zhuǎn)移檢測方法均使用。不是所有的可商購的CEA抗體均與人乳腺癌細(xì)胞反應(yīng)，所以我們測試了5種不同的抗體的反應(yīng)性(DAKO，Amershan和KPL)。
P.Allen博士(認(rèn)證的病理學(xué)家)測試了蘇木精和伊紅染色的淋巴結(jié)，其中對每個淋巴結(jié)進(jìn)行顯微鏡檢腫瘤細(xì)胞的存在情況。對CEA免疫染色的淋巴結(jié)進(jìn)行顯微鏡檢，其中計數(shù)任何陽性染色的淋巴結(jié)，并認(rèn)為此陽性是轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)。
用圓規(guī)每天或每周監(jiān)測腫瘤體積，并如前述計算腫瘤體積。在6周研究期末，確定腫瘤質(zhì)量，其中經(jīng)HA化學(xué)致敏處理的腫瘤體積明顯小于鹽水組，HA和5-FU處理組的腫瘤體積(p＝0.005)，如圖6所示。在處理的前兩周，腫瘤應(yīng)答無明顯不同，但之后經(jīng)HA隨后5-FU處理的腫瘤生長與其它組相比明顯延遲。在處理的6周期間，腫瘤倍增周期數(shù)令人感興趣地不同。接受鹽水處理的小鼠經(jīng)歷平均4次腫瘤倍增，而在治療方案中摻入HA明顯延長腫瘤倍增時間，其中HA/5-FU處理的動物經(jīng)歷平均1次腫瘤倍增周期，再一次顯明了HA對5-FU胞毒性的作用。
所有動物均顯示淋巴結(jié)中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤在原發(fā)腫瘤的鄰近。淋巴結(jié)累及百分率(每只動物轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)數(shù)目)在經(jīng)HA隨后5-FU處理，5-FU和HA處理后明顯降低，而鹽水組表明淋巴結(jié)累及數(shù)量提高6倍。其它處理組表明百分率明顯較低，為12.2-14.3％(Dunnett’s多重對比試驗，p＝＜0.001)。
共施用HA導(dǎo)致非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯降低。除了接受HA處理的小鼠之外，在原發(fā)腫瘤鄰近的區(qū)域的頸部或腋下發(fā)現(xiàn)了新腫瘤。胃腸道毒性
5-FU的一個最常見的毒性作用是對胃腸道的毒性作用，其中可發(fā)生出血性腸炎和小腸穿孔(Martindale，1993)。每天監(jiān)測動物的胃腸道紊亂情況如腹瀉，及每周更嚴(yán)重的毒性表現(xiàn)如體重減輕。體重減輕是通過減去腫瘤重計算凈重而監(jiān)測的，腫瘤重是根據(jù)1g×腫瘤體積(cm3)計算的，如Shibamoto等，1996所述。為表明任何體重變化，根據(jù)以下公式將動物體重根據(jù)開始處理時的體重而歸化
在6周研究期間注意到無治療毒性。與經(jīng)5-FU處理組相比，接受HA治療的小鼠(即HA作為唯一藥劑或作為化學(xué)致敏劑)行為更良好而體重不減輕，而是還保持其體重(圖4)。血液骨髓抑制
與5-FU治療相關(guān)的一個主要毒性是骨髓抑制，隨之而來的是白細(xì)胞數(shù)減少，這需要評定任何治療相關(guān)的血液毒性。將動物麻醉，用針頭和注射器從心臟和大血管中收集血液。將血液在小鼠粘性鹽水(M)中1/50稀釋，并在血細(xì)胞計數(shù)器上計數(shù)估算白細(xì)胞數(shù)。通過計數(shù)嗜中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞進(jìn)行血液分類計數(shù)。將全部估算的血細(xì)胞亞群與關(guān)于小鼠血液公布的數(shù)據(jù)相對比。
不管怎樣處理，總白細(xì)胞計數(shù)和亞群計數(shù)無明顯差異。治療對器官質(zhì)量的影響
為保證治療不導(dǎo)致器官萎縮或漲大，在動物死后切除器官并稱重。每個器官的質(zhì)量以總凈體重的％計算，并與只用鹽水治療組(1組)的器官質(zhì)量相對比。
計算所有患病動物的存活時間(天或周)，即在開始治療后動物的存活時間。在每種治療組中的所有動物均度過6周的治療程序。
與器官質(zhì)量相關(guān)，HA治療不導(dǎo)致任何明顯毒性。接受5-FU的小鼠呈現(xiàn)脾擴(kuò)大(質(zhì)量增加61％)，而聯(lián)合施用HA和5-FU將這種擴(kuò)大明顯抵消31％(t檢驗，p＜0.001)。5-FU治療導(dǎo)致子宮萎縮(22％)，而HA/5-FU治療再一次顯示將此毒性作用降低10％(t檢驗，p＝0.04)。還清楚地說明在治療方案中加入HA，當(dāng)聯(lián)合施用或提前一天施用時，與鹽水治療組相比，明顯降低原發(fā)腫瘤的大小(t檢驗，p＝0.006)。在這些治療當(dāng)中注意到器官質(zhì)量方面無其它差異。實施例4透明質(zhì)酸濃度對5-FU體外效力的影響
將MDA-MB-468，MDA-MB-435和MDA-MB-231細(xì)胞如實施例2所述培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到70-80％鋪滿時，將它們用1×HBSS在37℃洗滌，并在10ml的0.25％胰蛋白酶/0.05％ EDTA中經(jīng)胰蛋白酶消化，直至細(xì)胞充分脫附。在加入1ml FCS以中和胰蛋白酶后，計數(shù)細(xì)胞，在1200rpm離心5分鐘，并如下重懸
MDA-MB-23112000個細(xì)胞/ml培養(yǎng)基；
MDA-MB-46825000個細(xì)胞/ml培養(yǎng)基；
MDA-MB-43512000個細(xì)胞/ml培養(yǎng)基。
然后將細(xì)胞鋪板于48孔平板中，并根據(jù)供應(yīng)商的指導(dǎo)溫育。在24小時后，除去培養(yǎng)基并用以下測試培養(yǎng)基置換
MDA-MB-46840nM阿霉素；
MDA-MB-23150nM阿霉素；
MDA-MB-43510nM阿霉素。40nM阿霉素培養(yǎng)基450ml(原液阿霉素是1.7mM，因此1700000/40＝42500；450000/42500＝10.6μl的1.7mM阿霉素+450ml培養(yǎng)基)。原液HA是700000道爾頓的14.3μM HA。結(jié)論
此研究充分證明HA在體外和體內(nèi)均可增強(qiáng)抗癌藥物5-FU和阿霉素的胞毒性。更具體地
1)作為唯一藥劑，HA在體外和體內(nèi)均能發(fā)揮對癌細(xì)胞的胞毒
作用(圖5)；
2)對HA單獨治療或化學(xué)致敏治療的療效進(jìn)行評價表明，其
對正常組織無毒性，及不增強(qiáng)藥物的毒性分布圖。事實上，
接受治療的小鼠顯示在6周的治療期間體重明顯增加，而
且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移降低。聯(lián)合施用HA和5-FU對降低原發(fā)腫瘤
體積具有明顯的作用；
3)在治療方案中摻入HA的小鼠不顯示任何繼發(fā)性腫瘤形成
(圖6)。未來研究
進(jìn)行使用HA在體內(nèi)治療乳腺癌的實驗。這些實驗針對于HA濃度和分子量對阿霉素的胞毒性的作用。借助于這些研究，也可確定藥物和HA的接觸時間和方案，以及HA的作用機(jī)制，即受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)和/或?qū)?xì)胞膜的作用。也收集了關(guān)于HA在化學(xué)致敏抗藥性癌細(xì)胞中的作用的其它數(shù)據(jù)。第1部分
所有研究均是在表達(dá)不同水平的HA受體CD 44和RHAMM的乳腺癌細(xì)胞系上進(jìn)行的。測試細(xì)胞系，如MDA-MB435，MDA-MB-231MDA-MB-468，ZRL-751和一些表達(dá)MDR-1的乳腺癌細(xì)胞系。
評價HA/阿霉素接觸時間和濃度對抗藥性和藥物敏感性乳腺癌細(xì)胞的作用。將4種MDR-1陽性和4種MDR-1陰性細(xì)胞系接觸1，2.5，5，10，20，40，60，80和100nM的阿霉素，測試以下變量
1)接觸藥物±100nM HA 1小時，隨后無藥物培養(yǎng)3天；
2)恒定接觸藥物±100nM HA 3天，接觸100nM HA 30分鐘，隨
后接觸藥物1小時，細(xì)胞無藥物培養(yǎng)3天；
3)接觸100nM HA 24小時，隨后接觸藥物1小時，細(xì)胞無藥物
培養(yǎng)3天。
這些實驗將確定最佳HA接觸時間和方案，當(dāng)與HA組合時阿霉素胞毒性提高的量度，及HA是否能克服乳腺癌細(xì)胞中的流量泵的抗性。
目前阿霉素的IC50已經(jīng)確定為90nM。使用90nM的阿霉素，HA(700kD)的濃度可以是1，3，10，30，100，300nM，1μM，3μM，10μM，30μM，和100μM。待測試的溫育變量是
1)接觸HA 30分鐘，隨后接觸藥物1小時，細(xì)胞無藥物培養(yǎng)3天；
2)接觸HA 24小時，隨后接觸藥物1小時，細(xì)胞無藥物培養(yǎng)3
天；
3)接觸HA±藥物1小時，細(xì)胞無藥物培養(yǎng)3天。
對任何脫附的細(xì)胞測試細(xì)胞存活性，因為已經(jīng)提示HA在癌細(xì)胞脫附和遷移中能起關(guān)鍵作用。如果脫附的細(xì)胞是存活的，用FACS表面表位鑒別方法確定HA受體狀態(tài)。用短的HA寡糖進(jìn)行相似的實驗，即用4糖，6糖，12糖，5600Da，50000Da，100000Da，250000Da的寡糖。
這些實驗將表明體外最佳HA藥物比率，最佳HA接觸時間和方案，HA分子量對阿霉素胞毒性的作用。
在確定最佳HA濃度后，將IC50的阿霉素用于一系列時程實驗中，以觀測HA對阿霉素代謝的作用。
將細(xì)胞接觸〔14C〕阿霉素30分鐘，1小時，2小時，4小時，8小時，16小時和24小時。實驗條件是
1)將細(xì)胞接觸HA 30分鐘，隨后接觸藥物；
2)將細(xì)胞接觸HA 24小時，隨后共同接觸HA/阿霉素。
除去細(xì)胞，低滲裂解并在113000gav離心1小時。計數(shù)膜沉淀和上清，并用HPLC分析代謝物。
另外將細(xì)胞在蓋玻片上生長，它們將接觸阿霉素±HA(如上述接觸方案)，及使用時程聚焦照像追蹤藥物的胞質(zhì)吸收和運(yùn)動。
鑒別在MDR-1陽性和陰性乳腺癌細(xì)胞系上的HA受體，對CD44s，CD44v6，CD44v10和RHAMM受體進(jìn)行FACS定量。另外用FITC/HA和FACS分析確定HA/受體結(jié)合數(shù)量和飽和動力學(xué)。
通過將細(xì)胞接觸
1)HA 30分鐘，隨后接觸藥物；
2)HA 24小時，隨后接觸藥物；
3)HA/阿霉素我們可以確定這些物質(zhì)阻斷CD44s和RHAMM受體。任何存活細(xì)胞的受體狀態(tài)用表面表位FACS分析定量。如果HA受體的阻斷降低正常觀測到的阿霉素和HA之間的協(xié)同作用，則膜結(jié)合的和胞質(zhì)阿霉素定量為±HA受體阻斷。
用〔3H〕HA和凝膠過濾層析±受體阻斷研究細(xì)胞系對HA的降解。
將分子量為4糖，6糖，12糖，5600Da，50000Da，100000Da，250000Da，750000Da和1500000Da的HA與乳腺癌細(xì)胞系在預(yù)定的“觀測效應(yīng)”濃度溫育，以下為研究的參數(shù)胞外和胞內(nèi)Ca2+流量(細(xì)胞探針分析)。另外也進(jìn)行細(xì)胞骨架成分的調(diào)節(jié)(細(xì)胞骨架基因的微陣列)，對細(xì)胞體積的作用(Coulter大小分析)和癌細(xì)胞的遷移率(Boyden Chamber matrigel分析)分析。
通過將乳腺癌細(xì)胞系在預(yù)定的“觀測效應(yīng)”濃度與分子量為4糖，6糖，12糖，5600Da，50000Da，100000Da，250000Da，750000Da和1500000Da的HA溫育，證明HA對細(xì)胞周期的作用。將細(xì)胞用碘化鉀標(biāo)記，進(jìn)行FACS分析。確定在一個細(xì)胞周期的每個階段的細(xì)胞數(shù)。
用最佳HA/阿霉素制品進(jìn)行脂質(zhì)體阿霉素和HA/阿霉素制品的體外效力對比，使用Liposome公司在脂質(zhì)體阿霉素的臨床前試驗中使用的劑量范圍。第2部分
在將HA/阿霉素抗癌治療用于I期人乳腺癌試驗之前，必需進(jìn)行初步的毒性試驗。此試驗集中于
1)在小鼠身體器官和體液中透明質(zhì)酸對阿霉素吸收的作用；
2)確立阿霉素的初步劑量范圍。確定HA是否將阿霉素定向于
在裸鼠體內(nèi)的人乳腺腫瘤異種移植物；
3)對比商購的脂質(zhì)體阿霉素與HA/阿霉素在小鼠體內(nèi)的吸收情
況；
4)對比脂質(zhì)體阿霉素和HA/阿霉素的短期效力。
根據(jù)Inaba等所述(1988)，用于裸鼠的阿霉素劑量為4mg/kg，等于用于人體的60mg/m2劑量。攜帶人體腫瘤的裸鼠用阿霉素±HA注射。使用4mg/kg濃度的阿霉素±12.5mg/kg的HA。實驗方案包括以下治療組
1)4mg/kg阿霉素；
2)4mg/kg阿霉素+12.5mg/kg HA；
3)4mg/kg脂質(zhì)體阿霉素。
所用的阿霉素±HA將定量地注射入小鼠的尾靜脈內(nèi)。
在間隔2，15，30，60分鐘和1.5，2，4，8，24和48小時(每個時間點4只動物)，通過IP注射0.1ml戊巴比妥而處死。取出所有器官，骨骼肌，淋巴結(jié)，骨髓，尿液和血液，并用HPLC和熒光確定阿霉素含量。
在裸鼠中(WEHI CBA品系)產(chǎn)生人乳腺腫瘤。將小鼠如下述注射
1)小鼠LD50為10mg/kg；
2)4mg/kg阿霉素；
3)4mg/kg阿霉素+12.5mg/kg HA；
4)8mg/kg阿霉素；
5)8mg/kg阿霉素+12.5mg/kg HA；
6)4mg/kg脂質(zhì)體阿霉素
7)鹽水
8)12.5mg/kg HA。
上述是在一周周期的第2，4，6天定量注射入小鼠尾靜脈內(nèi)的(8只動物/組)。
每天監(jiān)測小鼠的腫瘤體積，體重，攝食和功能性。
在8周研究期完成后，將小鼠通過IP注射0.1ml戊巴比妥處死。取出所有器官，腫瘤，骨骼肌，淋巴結(jié)，骨髓，尿液和血液，進(jìn)行病理學(xué)分析。第3部分
為回答一些關(guān)于HA對結(jié)腸癌細(xì)胞的抗癌治療作用的基礎(chǔ)問題，應(yīng)進(jìn)行以下實驗。
研究HA/5-FU接觸時間和濃度對抗藥性和藥物敏感性結(jié)腸癌細(xì)胞的作用。
將3個抗性細(xì)胞系和3個敏感性細(xì)胞系接觸1，2.5，5，10，20，40，60，80和100nM的5-FU，測試以下變量
1)接觸藥物±100nM HA 1小時，隨后無藥物培養(yǎng)3天；
2)恒定接觸藥物±100nM HA 3天；
3)接觸100nM HA 30分鐘，隨后接觸藥物1小時，將細(xì)胞無藥
物培養(yǎng)3天；
4)接觸100nM HA 24小時，隨后接觸藥物1小時，細(xì)胞無藥物
培養(yǎng)3天。
使用如上述確定的IC50的5-FU，HA(700kD)濃度可以是1，3，10，30，100，300nM，1μM，3μM，10μM，30μM和100μM。測試以下溫育變量
1)接觸HA 30分鐘，隨后接觸藥物1小時，將細(xì)胞無藥物培養(yǎng)
3天；
2)接觸HA 24小時，隨后接觸藥物1小時，將細(xì)胞無藥物培養(yǎng)
3天
3)接觸藥物±HA1小時，將細(xì)胞無藥物培養(yǎng)3天。
對任何脫附的細(xì)胞測試細(xì)胞存活性，因為已經(jīng)提示HA在癌細(xì)胞脫附和遷移中起關(guān)鍵作用。如果脫附的細(xì)胞是存活的，用FACS表面表位鑒別方法確定HA受體狀態(tài)。
用短的HA寡糖進(jìn)行相似實驗，即用4糖，6糖，12糖，5600Da，50000Da，100000Da，250000Da。
在確定最佳HA濃度后，將IC50的5-FU用于一系列時程實驗中，以觀測HA對阿霉素代謝的作用。
將〔3H〕5-FU接觸細(xì)胞30分鐘，1小時，2小時，4小時，8小時，16小時和24小時。實驗條件是
1)將細(xì)胞接觸HA 30分鐘，隨后接觸藥物；
2)將細(xì)胞接觸HA 24小時，隨后共同接觸HA/5-FU。
除去細(xì)胞，低滲裂解并在113000gav離心1小時。計數(shù)膜沉淀和上清，并用HPLC分析代謝物。
另外將細(xì)胞生長于蓋玻片上，在此將它們接觸5-FU±HA(如上述接觸方案)，及用時程聚焦照像追蹤藥物的胞質(zhì)吸收和運(yùn)動。
使用FITC/HA和FACI分析，鑒別抗性和敏感性結(jié)腸癌細(xì)胞系上的HA受體，F(xiàn)ACS定量CD44s，CD44v6，CD44v10和RHAMM受體，定量HA/受體結(jié)合和飽和動力學(xué)。
用抑制性抗體阻斷CD44s和RHAMM受體，參照以下方案應(yīng)用5-FU±HA
1)將細(xì)胞接觸HA 30分鐘，隨后接觸藥物；
2)將細(xì)胞接觸HA 24小時，隨后共同接觸HA/5-FU。
計數(shù)細(xì)胞。用表面表位FACS分析定量存活的細(xì)胞的受體狀態(tài)。
如果HA受體的阻斷降低在5-FU和HA之間正常觀測到的協(xié)同作用，膜結(jié)合的和胞質(zhì)的5-FU將被定量為±HA受體阻斷。
用〔3H〕HA和凝膠過濾層析±受體阻斷研究細(xì)胞系對HA的降解。
HA對質(zhì)膜的作用
將分子量為4糖，6糖，12糖，5600Da，50000Da，100000Da，250000Da，750000Da，和1500000Da的透明質(zhì)酸，與乳腺癌細(xì)胞系在預(yù)定的“觀測效力”濃度溫育，以下是待研究的參數(shù)
1)胞外和胞內(nèi)Ca2+流量(細(xì)胞探針分析)；
2)細(xì)胞骨架成分的調(diào)節(jié)(細(xì)胞骨架基因的微陣列)；
3)對細(xì)胞體積的作用(Coulter大小分析)；
4)癌細(xì)胞的遷移率(Boyden Chamber matrigel分析)；
5)HA受體的定量(FACS)；
6)膜電壓(已經(jīng)確定的方法)。
進(jìn)行HA新佐劑治療對抑制器官轉(zhuǎn)移的作用的研究。與其它治療組相對比，接受HA治療的小鼠表明
1)與其它治療組相比淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移降低；
2)抑制新腫瘤形成；
3)體重增加；
4)行為更好。
這些結(jié)果充分表明HA抗癌療法作為降低癌擴(kuò)散的一種有效方法的可能性。通過專性選擇臨床前模型，有一限制，從而繼發(fā)性癌擴(kuò)散通常發(fā)生在淋巴結(jié)周圍。使用我們能檢測到癌是否擴(kuò)散到每個器官和骨的模型是有利的。通過使用已知為BAG載體轉(zhuǎn)移模型的模型，我們能監(jiān)測癌是否擴(kuò)散到器官和骨。
簡單來說，BAG載體由新霉素抗性LacZ基因組成，該基因可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入人乳腺癌細(xì)胞中。在將其經(jīng)心內(nèi)注射至裸鼠后，隨后進(jìn)行6周治療程序，可通過PCR檢測在任何轉(zhuǎn)移的細(xì)胞/器官中LacZ基因。檢測骨損害的Faxitron掃描可檢測任何骨轉(zhuǎn)移。
以下治療在一周周期的第1，2天給予，共6周。治療組(5只動物/組)由以下組成
1.鹽水
2.第1，2天30mg/kg 5-FU；
3.第1，2天12.5mg/kg HA；
4.30mg/kg 5-FU+12.5mg/kg HA(在第1，2天共同施用)；
5.在第1天12.5mg/kg HA，第2天30mg/kg 5-FU，第3天
12.5mg/kg HA，第4天30mg/kg 5-FU；
6.在第1，3天12.5mg/kg HA；
7.在第2，4天30mg/kg5-FU；
8.在第1，2天15mg/kg MTX；
9.15mg/kg MTX+12.5mg/kg HA(在第1，2天共同施用)；
10.第1天12.5mg/kg HA，第2天15mg/kg MTX，第3天
12.5mg/kg HA；第4天15mg/kg MTX；
11.在第2，4天15mg/kg MTX；
12.在第1，2天15mg/kg MTX，30mg/kg 5-FU，30mg/kg環(huán)
磷酰胺；
13.在第1，2天15mg/kg MTX，30mg/kg5-FU，30mg/kg環(huán)
磷酰胺+12.5mg/kg HA；
在第1天12.5mg/kg HA，第2天(15mg/kg MTX，30mg/kg 5-
FU，30mg/kg環(huán)磷酰胺)，第3天12.5mg/kg HA，第4天(15mg/kg
MTX，30mg/kg 5-FU，30mg/kg環(huán)磷酰胺)。新佐劑療法
在馬上進(jìn)行心內(nèi)注射之前給予下述物質(zhì)
1)12.5mg/kg HA；
2)15mg/kg MTX；
3)15mg/kg MTX，12.5mg/kg HA；
4)30mg/kg 5-FU；
5)30mg/kg 5-FU，12.5mg/kg HA；
6)15mg/kg MTX，30mg/kg 5-FU，30mg/kg環(huán)磷酰胺；
7)15mg/kg MTX，30mg/kg 5-FU，30mg/kg環(huán)磷酰胺+12.5mg/kg
HA。
在6周治療期間每天監(jiān)測小鼠的體重和健康情況。在一個治療周期完成后，對每個小鼠掃描骨損害情況。在掃描后，取出每個器官和體液。保留器官的充分橫切片以進(jìn)行進(jìn)一步病理學(xué)分析，同時將剩余組織均質(zhì)并進(jìn)行競爭性PCR，以檢測LacZ基因。
對顯示轉(zhuǎn)移的任何器官進(jìn)行組織學(xué)加工，并用半乳糖苷酶染色LacZ基因觀測癌細(xì)胞的建群模式。參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1.一種治療需要治療的患者的抗藥性疾病的方法，包括給所述患者施用與化療劑結(jié)合的治療有效量的透明質(zhì)酸，由此所述化療劑比單獨施用時更有效。
2.一種增強(qiáng)化療劑生物利用率的方法，包括給需要治療的患者施用治療有效量的透明質(zhì)酸。
3.一種治療或預(yù)防多元抗藥性或抗藥性細(xì)胞的方法，包括在施用化療劑之前，同時或之后施用足夠量的透明質(zhì)酸。
4.權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中化療劑選自卡氮芥(BCNU)，苯丁酸氮芥(Leukeran)，順鉑(Platinol)，阿糖胞苷，阿霉素(Adriamycin)，氟尿嘧啶(5-FU)，氨甲喋呤(Mexate)，CPT111，依托泊苷，普卡霉素(Mithracin)，和taxanes。
5.權(quán)利要求1的方法，其中抗藥性疾病是一種細(xì)胞增生性疾病。
6.權(quán)利要求5的方法，其中細(xì)胞增生性疾病選自乳腺癌，肺癌，前列腺癌，腎癌，皮膚癌，中樞神經(jīng)癌，卵巢癌，子宮癌，肝癌，胰腺癌，上皮癌，胃癌，小腸癌，外分泌腺癌，內(nèi)分泌腺癌，淋巴癌，造血系統(tǒng)癌或頭頸部組織癌。
7.權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中患者是哺乳動物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中哺乳動物選自牛，狗，馬，貓，豬和人。
9.權(quán)利要求1-8任一項的方法，其中透明質(zhì)酸是在施用化療劑之前，同時或隨后施用的。
10.權(quán)利要求1-9任一項的方法，其中透明質(zhì)酸和/或化療劑是經(jīng)口服，局部或非腸道施用的。
11.權(quán)利要求10的方法，其中透明質(zhì)酸和/或化療劑是與藥物合適的載體，佐劑或運(yùn)載體一起施用的。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中非腸道施用是通過皮下注射，氣霧劑，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，鞘內(nèi)，顱內(nèi)，胸骨內(nèi)注射或輸注方法施用的。
全文摘要
本發(fā)明涉及增強(qiáng)治療疾病的化療劑的生物利用率的方法。具體地,本發(fā)明涉及增強(qiáng)化療劑的生物利用率的方法,其包括給予需要治療的患者治療有效量的透明質(zhì)酸。
文檔編號A61K45/00GK1388760SQ0180235
公開日2003年1月1日 申請日期2001年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月14日
發(fā)明者特蕾西·布朗, 理查德·?？怂?申請人:美迪泰克研究有限公司