專利名稱：蚯蚓血纖蛋白溶酶的修飾酶制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修飾酶的制備，尤其是蚯蚓纖溶酶(EFE)的修飾酶。
近年來，血栓病、心血管疾病已經(jīng)成為人類健康的頭號殺手。目前市售的降纖酶、蝮蛇抗栓酶、尿激酶等藥物雖然已經(jīng)應(yīng)用于臨床，但穩(wěn)定性差，易失活，體內(nèi)停留時間短，價格昂貴及易導(dǎo)致出血等臨床缺陷，未及普遍推廣應(yīng)用。理想的溶栓藥物要求可迅速溶解血栓、無毒、無出血等副作用，給藥方便，價格便宜。尋找有效的治療藥物是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界重點攻關(guān)的熱點之一。鑒于蚯蚓纖溶酶能溶解血栓，無毒副作用，可口服給藥，生產(chǎn)成本低廉，人們期望能將蚯蚓纖溶酶開發(fā)成一種新型的溶栓藥劑。
當(dāng)前，市售溶栓膠囊、地龍膠囊、“9.12”膠囊等只是蚯蚓凍干粉，在體內(nèi)易受酶、抑制劑等分解破壞，也不易進入病灶細胞和組織，并且免疫原性強，體內(nèi)半衰期短，這些問題顯然有待進一步解決。
本發(fā)明的目的在于針對目前蚯蚓纖溶酶藥物在體內(nèi)易受酶、抑制劑等分解破壞，也不易進入病灶細胞和組織，并且免疫原性強，體內(nèi)半衰期短問題，采用化學(xué)修飾，延長蚯蚓纖酶的體內(nèi)半衰期，降低或消除免疫原性，制備一種高效、易進入病原組織的修飾酶。
在眾多修飾劑中，PEG用得最多。PEG修飾法具有反應(yīng)條件溫和，酶活性回收率高。PEG蛋白質(zhì)加合物水溶性好、無毒、無免疫原性，生物相溶性好。在PEG對EFE的修飾時，首先對PEG進行活化，用活化后的PEG對EFE進行修飾。EFE是蚯蚓血纖蛋白質(zhì)溶酶的英文簡寫。
活化方法有多種，本發(fā)明采用以三聚氰氯為活化劑，其活化反應(yīng)為 用活化的PEG對EFE進行修飾，得到EFE修飾酶，其反應(yīng)為 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的PEG的活化三聚氰氯使用前用無水苯重結(jié)晶兩次。
將三聚氰氯、無水碳酸鈉及PEG加入無水苯中，常溫下攪拌12小時后，過濾，濾液用乙醚沉淀，沉淀物再用苯溶解，如此沉淀、溶解反復(fù)多次，直至溶解后的溶液在258nm波長下檢測無光吸收。將溶液真空干燥，干燥物為活化的PEG。三聚氰氯∶無水碳酸鈉∶PEG為1.1∶2∶8(重量比)，而無水苯的量為三聚氰氯、無水碳酸鈉、PEG總量的7倍以上(重量體積比，g∶ml)。
蚯蚓血纖蛋白溶酶的修飾酶制備于蚯蚓血纖蛋白溶酶中加入活化的PEG，蚯蚓血纖蛋白溶酶與活化的PEG比為1∶3-9(重量比)。在堿性緩沖液中，12～35℃條件下，攪拌反應(yīng)30-180分鐘，在0.1mol/L pH7.3的磷酸緩沖液中透析12小時后，所得的透析溶液為蚯蚓血纖蛋白溶酶的修飾酶。
影響PEG修飾效果主要因素有下列幾個方面(1)PEG的相對分子質(zhì)量，PEG相對分子質(zhì)量太大或太小，均不利于修飾效果。PEG分子質(zhì)量太小，產(chǎn)生的空間阻礙和靜電斥力太小，不能有效地阻礙抑制劑和蛋白酶對酶的進攻，不能有效地遮蓋酶的活性部位，使抑制劑和被修飾酶敏感鍵結(jié)合，從而破壞酶活性部位。PEG分子量太大，不利于PEG與酶結(jié)合，而且太大的PEG，會阻礙修飾酶到達病灶組織和阻礙酶與底物的結(jié)合，本發(fā)明通過對PEG1000、2000、4000、6000R的比較，得到PEG4000修飾率和酶活性均較高。而且PEG4000的相對分子質(zhì)量有利于消除或降低免疫原性，因此本發(fā)明選擇修飾劑PEG的相對分子質(zhì)量為4000最為理想。
(2)PEG和酶的配比。PEG和酶的比例決定了氨基酸修飾率的大小。PEG和酶的相對比例太小，則使殘留氨基較多，不利于消除或降低免疫原性。而PEG量太大，則酶的溶解度相應(yīng)會降低，并造成了不必要的浪費。本發(fā)明通過在10mgEFE(蛋白質(zhì)含量為1mg/ml，酶比活為12000U/ml)中，分別加入活化PEG40000.35、0.50、0.65、0.80、0.95g，在0.1mol/L pH9.2的四硼酸鈉緩沖液中反應(yīng)1小時，產(chǎn)物對pH 7.3的0.01mol/L磷酸緩沖液透析，分別測定酶活和殘留氨基量。結(jié)果表明，隨PEG量的增加，相對酶活力有降低趨勢。當(dāng)PEG用量大于0.65g時，修飾氨基幾乎沒有變化。因此確定的最低PEG修飾用量為每10mg酶蛋白，PEG4000用量為0.65g。
(3)修飾的pH值。在以三聚氰氯活化的PEG與酶蛋白反應(yīng)的產(chǎn)物中，除了修飾酶外，還有HCl。根據(jù)化學(xué)平衡，要使反應(yīng)向右進行，最好是盡快減少HCl的積累量。因此，此修飾反應(yīng)在堿性(pH9.2)條件下進行，以便中和HCl。當(dāng)然，堿性太強，會使酶蛋白變性而失去活性。綜合氨基修飾率和酶活力，本發(fā)明確定的最佳反應(yīng)pH值為9.2。
(4)修飾時間。一般來說，反應(yīng)時間越長，反應(yīng)越徹底。但實踐證明，反應(yīng)超過一定時間后，氨基修飾率并無變化。而且反應(yīng)時間太長會使酶蛋白變性，也浪費時間。所以本發(fā)明得優(yōu)化的修飾時間為1h最佳。
本發(fā)明所獲得的修飾酶(與原酶比較)對其部分酶學(xué)性質(zhì)和體內(nèi)半衰期進行測定。結(jié)果是原酶和修飾酶的酶學(xué)性質(zhì)修飾酶的Kmapp為原酶1/4(以BAEE為底物)，為0.3×10-3mol/L；原酶與修飾酶的pH穩(wěn)定性分別為pH5.8-10.0、pH5.8-10.6；原酶與修飾酶的熱穩(wěn)定性分別為20-55℃、20-55℃；原酶與修飾酶的反應(yīng)最適溫度均為55℃；原酶與修飾酶的反應(yīng)最適pH分別為pH7.8和pH10.0；修飾酶對蛋白酶的抵抗能力較原酶有所提高；貯藏穩(wěn)定性修飾酶和原酶的溶液于常溫下5個月活力基本不變；
修飾酶的活力是原酶的85％，氨基修飾率為70％；酶活性抑制劑PMSF(苯甲磺酰氟)、Hg2+；兩種酶在200～800nm波長下吸收光譜未發(fā)生變化，說明PEG對EFE的修飾可能未引起EFE的結(jié)構(gòu)的變化。
本發(fā)明的優(yōu)點(1)以蚯蚓為原料，原料來源容易，價廉，并且會帶動蚯蚓的綜合利用；(2)本發(fā)明的工藝生產(chǎn)設(shè)備投資少；(3)修飾酶熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性均強于原酶，其體內(nèi)半衰期是原酶的1.4倍，且很有可能無免疫原性或免疫原性很低；(4)修飾過程較為簡單；(5)修飾酶活力高達8000U/ml·酶液(底物為BAEE)。
實例取10mg分離純化的蚯蚓纖溶酶蛋白，蛋白質(zhì)含量為1.5mg/ml，酶比活為8200U/ml，在12～30℃條件下，加入0.65g活化的分子量為4000的PEG，在pH9.2的四硼酸鈉緩沖液中攪拌反應(yīng)1小時，產(chǎn)物對0.1mol/L、pH7.3的磷酸緩沖液透析12小時后，透析后的溶液即為修飾酶溶液。氨基修飾率為70％，活力回收達85％。
權(quán)利要求
1.蚯蚓血纖蛋白溶酶的修飾酶(EFE)制備方法，其特征在于在蛋白質(zhì)含量為1.5mg/L，酶比活為8200U/ml的蚯蚓血纖蛋白溶酶中加入活化的PEG10000-60000、0.35-0.95g，在pH7.0-9.5堿性緩沖液中攪拌反應(yīng)30-180分鐘，用磷酸緩沖液透析12小時后，所得的透析溶液為蚯蚓血纖蛋白溶酶的修飾酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的修飾酶(EFE)制備方法，其特征在于其加入PEG的分子量為4000較理想，加入量為0.65g較適宜，較理想的堿性緩沖液為pH9.2磷酸緩沖液。較理想的攪拌反應(yīng)時間為60分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所說的蚯蚓血纖蛋白溶酶(EFE)修飾酶的制備方法，其特征在于所說PEG的活化，將PEG與三聚氰氯和無水碳酸鈉混合后，加入無水苯中，常溫下攪拌12h，過濾，用乙醚沉淀，沉淀物用無水苯溶解，再用乙醚沉淀，如此沉淀、溶解反復(fù)多次，直至溶解的溶液在258nm波長下檢測無光吸收。將此溶液真空干燥，干燥物為活化的PEG。三聚氰氯∶無水碳酸鈉∶PEG為1.1∶2∶8(重量比)的體系中加入至少7倍體積的無水苯(重量體積比，g∶ml)。
全文摘要
本發(fā)明是涉及蚯蚓纖溶酶的修飾酶的制備，用活化的三聚氰氯對蚯蚓血纖蛋白溶酶進行修飾，經(jīng)堿性緩沖液透析后得修飾酶。修飾酶在熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性均強于原酶，其體內(nèi)半衷期是原酶的1.4倍，且具有原料來源易、價廉、投資少等優(yōu)點。
文檔編號A61P7/02GK1398969SQ01127638
公開日2003年2月26日 申請日期2001年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月19日
發(fā)明者徐鳳彩, 高向陽, 伍曉斌, 詹福建 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)