專利名稱：治療性蛋白b淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型免疫調(diào)節(jié)藥物的基因工程表達(dá)載體的構(gòu)建、基因表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的制備。更具體地，本發(fā)明涉及B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段及其生產(chǎn)方法、以及用于該方法的表達(dá)載體、宿主菌。
背景技術(shù)：
淋巴細(xì)胞是一種具有特異性免疫功能的白細(xì)胞。20世紀(jì)60年代初在研究胸腺的功能時(shí)發(fā)現(xiàn)存在著兩類淋巴細(xì)胞，即T細(xì)胞和B細(xì)胞。它們?cè)诳乖碳は驴稍龃蟆⒎至逊敝?，并分別執(zhí)行細(xì)胞免疫和體液免疫的功能。從而改變了淋巴細(xì)胞是終末細(xì)胞的概念，確定了淋巴細(xì)胞的特異性免疫功能。
淋巴細(xì)胞按其發(fā)生過(guò)程和功能至少可以分為兩大類一類有賴于胸腺的存在，稱為胸腺依賴淋巴細(xì)胞，簡(jiǎn)稱T細(xì)胞；另一類在鳥類依賴于腔上囊的存在，稱為囊依賴淋巴細(xì)胞，簡(jiǎn)稱B細(xì)胞。人類的B細(xì)胞，是在骨髓中分化的。T細(xì)胞接受抗原刺激變成致敏細(xì)胞后就分化繁殖成具有免疫活性的細(xì)胞。T細(xì)胞隨血液或淋巴液流動(dòng)到達(dá)抗原所在地，通過(guò)與抗原的直接接觸，才分泌出免疫活性物質(zhì)，發(fā)揮其免疫作用，如排斥移植來(lái)的異體組織、破壞腫瘤細(xì)胞、抑制病毒與細(xì)胞繁殖等，故稱之為細(xì)胞免疫。B細(xì)胞被抗原激活后，可轉(zhuǎn)化為漿母細(xì)胞，并分裂、分化為漿細(xì)胞。漿細(xì)胞產(chǎn)生各種特異性免疫球蛋白，總稱為抗體?？贵w通過(guò)體液運(yùn)輸至抗原所在地，執(zhí)行不同的免疫機(jī)能，故稱為體液免疫。
淋巴細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生障礙即可形成免疫缺陷。免疫缺陷基本上可分為三類，即細(xì)胞免疫缺陷、體液免疫缺陷和聯(lián)合免疫缺陷。細(xì)胞免疫缺陷是由胸腺來(lái)糾正。某些較輕型的細(xì)胞免疫缺陷，可用胸腺素來(lái)治療。嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷可采用組織相容性相近的骨髓進(jìn)行接種而重建免疫。在生活過(guò)程中，人體也會(huì)感染侵害淋巴細(xì)胞的病毒，而造成免疫缺陷。當(dāng)今世界出現(xiàn)的艾滋病的病原體就是一種專門侵害T細(xì)胞的病毒，被稱為人類T細(xì)胞白血病病毒。它是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，可導(dǎo)致人體免疫機(jī)能障礙。
B細(xì)胞在成熟、分化過(guò)程中需要一系列調(diào)控因子的參與，B細(xì)胞在轉(zhuǎn)化漿細(xì)胞中發(fā)生障礙，人體就不能產(chǎn)生抗體，從而導(dǎo)致各種免疫缺陷疾病的發(fā)生。
人B淋巴細(xì)胞刺激因子(B lymphocyte stimulator，BlyS)是人體單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，其主要生物學(xué)功能是與B細(xì)胞上的受體結(jié)合，促進(jìn)B細(xì)胞成熟。并與抗原共同刺激B細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并分裂、分化為漿細(xì)胞產(chǎn)生各種特異性抗體。B淋巴細(xì)胞刺激因子屬于TNF超家族中與人體免疫有密切關(guān)系的細(xì)胞因子(P.A.Moore et al.Sciences，(1999)，260；S.D.Khare et al.PNAS，(2000)，3370；M.Yan et al.Nature Immunology，(2000)，37；B.Nardelliet al.Blood，(2001)，198.)。
根據(jù)BlyS的生物學(xué)性質(zhì)，BlyS可以作為一種治療性蛋白質(zhì)用于治療老年性免疫損傷，器官移植后的免疫低下，淋巴系統(tǒng)腫瘤等疾病。但結(jié)構(gòu)分析表明，人B淋巴細(xì)胞刺激因子為一個(gè)跨膜蛋白，用基因工程技術(shù)表達(dá)其完整分子往往結(jié)果不理想。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)基于B淋巴細(xì)胞刺激因子的新型藥物。
大腸桿菌外源基因表達(dá)系統(tǒng)是基因工程疫苗、藥物、動(dòng)植物生長(zhǎng)因子和工具酶等生物技術(shù)產(chǎn)品研究開發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)之一。由于其遺傳背景清楚，大部分基因元件的結(jié)構(gòu)功能明確，對(duì)培養(yǎng)操作的外部條件寬容度大，因此該系統(tǒng)往往成為基因工程項(xiàng)目研究和生產(chǎn)的首選系統(tǒng)。目前已有不同調(diào)控模式的大腸桿菌外源基因表達(dá)系統(tǒng)問(wèn)世，可歸納為以下幾類[1]采用Lac，Tac啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)，其基因表達(dá)受乳糖及其類似物誘導(dǎo)。
采用噬菌體的PL、PR啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)，其基因表達(dá)受cI蛋白抑制，在溫度敏感突變體cI857存在的條件下，其基因表達(dá)受溫度調(diào)控。
采用Trp啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)，其基因表達(dá)受環(huán)境中低色氨酸濃度誘導(dǎo)。
采用SP6、T7噬菌體的SP6、T7啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)，由Lac啟動(dòng)子控制SP6或T7 RNA聚合酶的表達(dá)，其基因表達(dá)受乳糖及其類似物誘導(dǎo)。
這些大腸桿菌外源基因表達(dá)系統(tǒng)一般適用于小規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)，當(dāng)應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)時(shí)。化學(xué)信號(hào)誘導(dǎo)調(diào)控模式的缺陷是生產(chǎn)成本高，溫度調(diào)控模式的缺陷是傳熱速度不能達(dá)到工藝要求。因此，本領(lǐng)域還迫切需要開發(fā)適合大規(guī)模制備重組蛋白的新表達(dá)系統(tǒng)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的基于B淋巴細(xì)胞刺激因子的免疫調(diào)節(jié)劑-B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段，以及相應(yīng)的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用于生產(chǎn)B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段的表達(dá)載體和工程菌。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種免疫調(diào)節(jié)藥物，它含有藥學(xué)上可接受的載體和安全有效量的人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段，所述的B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段具有促B細(xì)胞成熟的生物活性。
較佳地，所述的人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段具有SEQ ID NO2所示的B淋巴細(xì)胞刺激因子的羧基端的至少120-215個(gè)連續(xù)氨基酸。更佳地，所述的人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種表達(dá)載體，它含有表達(dá)人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段的DNA編碼序列，用于啟動(dòng)所述編碼序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子；用于終止所述編碼序列轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止子；和控制表達(dá)載體復(fù)制的復(fù)制子。
在一優(yōu)選例中，所述的啟動(dòng)子包括T7啟動(dòng)子，所述的復(fù)制子包括pUC復(fù)制子。在另一優(yōu)選例，在所述的表達(dá)載體中，所述的DNA編碼序列編碼具有SEQ IDNO4所示氨基酸序列的人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段，更佳地，所述DNA編碼序列具有SEQ ID NO3所述的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種宿主細(xì)胞，它含有本發(fā)明上述的表達(dá)載體。較佳地，所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞還含有使T7 RNA聚合酶受溶氧濃度調(diào)控表達(dá)的質(zhì)粒，所述的質(zhì)粒含有vgb基因的啟動(dòng)子、T7 RNA聚合酶基因、轉(zhuǎn)錄終止子、和復(fù)制子。更佳地，所述的復(fù)制子是與pUC復(fù)制子相容的復(fù)制子，例如p15A、pSC101、pWSK復(fù)制子等。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段的方法，它包括步驟(1)在適合表達(dá)B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明上述的宿主細(xì)胞，以表達(dá)B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段；(2)分離出所表達(dá)的B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段；(3)對(duì)分離的B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段進(jìn)行復(fù)性處理，從而獲得有活性的B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段。
在一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)是在2-20％培養(yǎng)基溶氧飽和度下進(jìn)行的。
附圖1是本發(fā)明表達(dá)載體pT7450-BlyS2構(gòu)建示意圖。
附圖2是本發(fā)明B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段BlyS-C的PAGE電泳檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，用BlyS的C端膜外區(qū)段(BlyS-C)進(jìn)行基因工程表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BlyS-C實(shí)現(xiàn)BlyS的促B細(xì)胞成熟的效應(yīng)。此外，為了優(yōu)化B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段的表達(dá)，將BlyS-C基因在受溶氧濃度調(diào)控的大腸桿菌外源基因表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物BlyS-C進(jìn)行復(fù)性和純化，使BlyS-C保持促B細(xì)胞成熟的生物活性(缺少跨膜區(qū)，但保留結(jié)合其受體的能力)，從而把BlyS-C發(fā)展成一種新型的治療性蛋白質(zhì)用于臨床。
BlyS的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID NO1所示，其中編碼區(qū)是從137位到994位，共857個(gè)核苷酸，編碼一個(gè)具有285個(gè)氨基酸的B淋巴細(xì)胞刺激因子(BlyS)的氨基酸序列
MDDSTEREQS RLTSCLKKRE EMKLKECVSI LPRKESPSVR SSKDGKLLAA 50TLLLALLSCC LTVVSFYQVA ALQGDLASLR AELQGHHAEK LPAGAGAPKA 100GLEEAPAVTA GLKIFEPPAP GEGNSSQNSR NKRAVQGPEE TVTQDCLQLI 150ADSETPTIQK GSYTFVPWLL SFKRGSALEE KENKILVKET GYFFIYGQVL 200YTDKTYAMGH LIQRKKVHVF GDELSLVTLF RCIQNMPETL PNNSCYSAGI 250AKLEEGDELQ LAIPRENAQI SLDGDVTFFG ALKLL 285(SEQ ID NO2)軟件TMpred分析結(jié)果暗示N端的第47-67個(gè)氨基酸為跨膜區(qū)，軟件TMHMM分析結(jié)果暗示N端的第48-70個(gè)氨基酸為跨膜區(qū)。可認(rèn)為75-285位氨基酸是C端膜外區(qū)段。因此，B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段可具有SEQ ID NO2所示的B淋巴細(xì)胞刺激因子的羧基端的至少120-215個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地140-200個(gè)連續(xù)氨基酸。一種特別優(yōu)選的B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段具有SEQ ID NO2中第134位至第285位氨基酸，即具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，該膜外區(qū)段具有BlyS的促B細(xì)胞成熟的效應(yīng)。
本發(fā)明還包括人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段的衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
本發(fā)明還包括人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段保守性變異多肽。術(shù)語(yǔ)“人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段保守性變異多肽”，指與B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段的氨基酸序列中，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽仍具有促B細(xì)胞成熟的生物活性。
本發(fā)明B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段的編碼序列可以根據(jù)已公開的B淋巴細(xì)胞刺激因子核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR獲得。然后，將其連入合適的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞。最后，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，通過(guò)分離純化得到本發(fā)明的新的突變蛋白。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明新突變蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，更佳地是大腸桿菌。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，提供了一科BlyS-C基因的表達(dá)質(zhì)粒pT7450-BlyS2，這種表達(dá)質(zhì)粒含T7啟動(dòng)子控制BlyS-C基因的表達(dá)的元件。其BlyS-C基因的表達(dá)依賴于T7 RNA聚合酶的存在。
在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明還提供了一種可使T7 RNA聚合酶受溶氧濃度調(diào)控表達(dá)的質(zhì)粒pTQ107，這種表達(dá)質(zhì)粒含vgb基因的啟動(dòng)子控制T7 RNA聚合酶基因表達(dá)的元件。
當(dāng)本發(fā)明的工程菌含有B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段表達(dá)載體和相應(yīng)的調(diào)控質(zhì)粒時(shí)，就可利用受環(huán)境溶氧濃度調(diào)控外源基因表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)BlyS-C基因。根據(jù)透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)轉(zhuǎn)錄過(guò)程受高氧濃度抑制，在貧氧條件下被誘導(dǎo)的性質(zhì)，用vgb基因的啟動(dòng)子控制T7 RNA聚合酶基因表達(dá)，再由T7啟動(dòng)子控制表達(dá)外源基因的表達(dá)，這一表達(dá)系統(tǒng)在外源基因的表達(dá)水平上與現(xiàn)有表達(dá)系統(tǒng)的最高水平相當(dāng)，而且調(diào)控操作簡(jiǎn)單，無(wú)外界誘導(dǎo)物加入表達(dá)系統(tǒng)，因此有很大的應(yīng)用前景。
在利用環(huán)境溶氧濃度來(lái)調(diào)控外源基因表達(dá)時(shí)，可在較低的溶氧飽和度下進(jìn)行表達(dá)。在一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)是在1-40％，較佳地2-20％培養(yǎng)基溶氧飽和度(以常壓和常溫下氧氣的飽和溶解度為100％)下進(jìn)行的。
對(duì)于表達(dá)出的B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段可以用常規(guī)方法進(jìn)行分離和復(fù)性，從而獲得具有活性的、可作為治療性蛋白的B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段。
本發(fā)明的B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段可作為治療性蛋白質(zhì)直接用于疾病治療，例如，用于老年性免疫損傷、器官移植后的免疫低下、淋巴系統(tǒng)腫瘤等疾病的治療。在使用本發(fā)明人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造。活性成分的給藥量是安全有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約5毫克/千克體重，較佳地該劑量是約2微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)發(fā)現(xiàn)了BlyS編碼區(qū)中具有BlyS的促B細(xì)胞成熟的效應(yīng)膜外區(qū)段BlyS-C，并在大腸桿菌外源基因表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，解決了完整的BlyS編碼區(qū)在大腸桿菌外源基因表達(dá)系統(tǒng)中不能表達(dá)的技術(shù)障礙。而且，BlyS-C去除了BlyS分子中的跨膜區(qū)，更適宜于作為一種治療性蛋白質(zhì)。
(2)建立的BlyS-C制備方法與其它重組蛋白質(zhì)制備方法相比，在發(fā)酵工藝上克服了添加誘導(dǎo)劑或傳熱速度不能達(dá)到工藝要求的缺點(diǎn)，且產(chǎn)物表達(dá)量高，有利于大規(guī)模，高密度進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化制備。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例實(shí)施例1BlyS編碼區(qū)(ORF)和BlyS膜外區(qū)段BlyS-C序列的克隆為得到BlyS的ORF序列，根據(jù)BlyS核苷酸序列設(shè)計(jì)以下一對(duì)引物BlyS-F35′-ATCGGAATCCTCACGCCTTACTTCTTGCC-3′(SEQ ID NO5)BlyS-R35′-ATCGAAGCTTCATGGTGTAAGTAGGTCACAGC-3′(SEQ ID NO6)上述引物分別引入了EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)，其擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋了BlyS從第10位至第288位氨基酸的相應(yīng)DNA序列。以BlyS-F3及BlyS-R3為引物，從人胎腦文庫(kù)(Clontech公司)中擴(kuò)增出約850bp的片段。PCR擴(kuò)增條件為94℃50sec，53℃1min，72℃2min，最后一個(gè)循環(huán)延伸9min。將PCR產(chǎn)物純化，分別以Pst I和Dra I酶切鑒定，初步證實(shí)其為BlyS的ORF序列。以EcoRI和Hind III雙酶切該850bp的片段，與經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切的pUC19質(zhì)粒載體連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α，經(jīng)酶切篩選，得到重組質(zhì)粒pUC19-BlyS1。經(jīng)測(cè)序證明克隆在pUC19質(zhì)粒載體上的PCR產(chǎn)物為BlyS的ORF序列。
為得到BlyS膜外區(qū)段BlyS-C的DNA序列，針對(duì)該部分肽段對(duì)應(yīng)的DNA序列設(shè)計(jì)以下一對(duì)引物BlyS-F45′-CATATGGCCGTTCAGGGTCCAGAA-3′(SEQ ID NO7)BlyS-R45′-ATCGAAGCTTCAGCAGTTTCAATGCACCAA-3′(SEQ ID NO8)上述引物分別引入了Nde I和Hind III酶切位點(diǎn)，其擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋了BlyS編碼區(qū)從第134位至第288位氨基酸的相應(yīng)DNA序列。以BlyS-F4及BlyS-R4為引物，質(zhì)粒pUC19-BlyS1為模板，擴(kuò)增出BlyS-C的序列。PCR擴(kuò)增條件為94℃50sec，56℃1min，72℃2min，最后一個(gè)循環(huán)延伸9min。將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳純化，與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α。經(jīng)酶切篩選，得到重組質(zhì)粒pGEM-BlyS2。
實(shí)施例2表達(dá)載體pT7450-BlyS2的構(gòu)建用EcoRI和NcoI雙酶切質(zhì)粒pT7-ZZa(Novagen Inc.)，加入由寡聚核苷酸片段5′-CATGGCATATGG-3′(SEQ ID NO9)和3′-CGTATACCTTAA-5′(SEQ ID NO10)構(gòu)成的接頭，用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α。經(jīng)酶切篩選，得到重組質(zhì)粒pT7450。用Nde I和Hind III雙酶切質(zhì)粒pGEM-BlyS2，用瓊脂糖凝膠電泳純化回收BlyS2片段，與經(jīng)Nde I和Hind III雙酶切的pT7450載體連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α。經(jīng)酶切篩選，得到重組質(zhì)粒pT7450-BlyS2(圖1)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM105。經(jīng)測(cè)序，證明重組質(zhì)粒pT7450-BlyS2序列拼接正確。
實(shí)施例3BlyS-C基因的表達(dá)用實(shí)施例2獲得的質(zhì)粒pT7450-BlyS2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，轉(zhuǎn)化子接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)至A600＝0.5。加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)4小時(shí)。IPTG誘導(dǎo)前后分別取菌樣用SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果表明加入IPTG誘導(dǎo)后有約18KD的BlyS-C蛋白表達(dá)。
實(shí)施例4BlyS-C基因工程菌RD17的發(fā)酵培養(yǎng)及BlyS-C的檢測(cè)從實(shí)施例2中的轉(zhuǎn)化子中抽提質(zhì)粒pT7450-BlyS2。將所抽提的質(zhì)粒pT7450-BlyS2和pTQ107(童芹等，生物工程學(xué)報(bào)，(1999)，232)共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-CodonPlus-RIL。轉(zhuǎn)化子經(jīng)抗生素平板篩選后得到表達(dá)BlyS-C的基因工程菌RD17。
將工程菌RD17接種于含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)接于5L發(fā)酵罐至菌體密度A600＝0.8開始控氧，在2％-20％培養(yǎng)基溶氧飽和度條件下，37℃繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)4小時(shí)。在控氧前后分別取樣用PAGE電泳檢測(cè)BlyS-C的表達(dá)。SDS-PAGE檢測(cè)，表明控氧誘導(dǎo)后有約18KD的蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步了解該蛋白表達(dá)的細(xì)節(jié)，將誘導(dǎo)后的菌液離心，收集菌體，TE緩沖液(含1％TritonX-100)重懸菌體并以超聲波破碎，12,000g離心15min，分別取上清和沉淀作SDS-PAGE分析，證明該蛋白以包涵體形式表達(dá)。
實(shí)施例4B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段的純化和復(fù)性將培養(yǎng)好的菌體發(fā)酵液于4℃，4000rpm，30min離心，收集菌體。用Tris-EDTA緩沖液充分懸浮菌體，于400公斤壓力下勻漿破菌，循環(huán)勻漿兩次至菌液不再粘稠，在此過(guò)程中保持低溫冰浴。再次于4℃，8000rpm，20min離心，收集沉淀部分，洗滌數(shù)次，就得到了包涵體粗品。用超聲波儀繼續(xù)洗滌，包涵體的產(chǎn)物蛋白純度可達(dá)50％-60％。
用8M的尿素溶液將包涵體充分溶解，進(jìn)行透析復(fù)性，復(fù)性需要在4℃條件下進(jìn)行48小時(shí)，其間10小時(shí)左右更換一次復(fù)性液。經(jīng)離心去除不溶物，上清液為復(fù)性好的蛋白溶液，純度可達(dá)60％以上。復(fù)性好的蛋白溶液用DEAE-Sepherose柱層析純化，收集相應(yīng)的蛋白峰，純度可達(dá)80％以上；用G-25 Sepharose脫鹽，再經(jīng)C8柱HPLC反相層析，收集相應(yīng)的蛋白峰，產(chǎn)品純度達(dá)90％以上(圖2)。經(jīng)活性檢測(cè)，有促B細(xì)胞成熟的生物活性。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海新世界基因技術(shù)開發(fā)有限公司<120>治療性蛋白B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段的制備<130>015359<160>10<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1090<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(137)..(994)<400>1taactctcct gaggggtgag ccaagccctg ccatgtagtg cacgcaggac atcaacaaac60acagataaca ggaaatgatc cattccctgt ggtcacttat tctaaaggcc ccaaccttca 120aagttcaagt agtgat atg gat gac tcc aca gaa agg gag cag tca cgc ctt 172Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu1 5 10act tct tgc ctt aag aaa aga gaa gaa atg aaa ctg aag gag tgt gtt 220Thr Ser Cys Leu Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val15 20 25tcc atc ctc cca cgg aag gaa agc ccc tct gtc cga tcc tcc aaa gac 268Ser Ile Leu Pro Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp30 35 40gga aag ctg ctg gct gca acc ttg ctg ctg gca ctg ctg tct tgc tgc 316Gly Lys Leu Leu Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys45 50 55 60ctc acg gtg gtg tct ttc tac cag gtg gcc gcc ctg caa ggg gac ctg 364Leu Thr Val Val Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu65 70 75gcc agc ctc cgg gca gag ctg cag ggc cac cac gcg gag aag ctg cca 412Ala Ser Leu Arg Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro80 85 90gca gga gca gga gcc ccc aag gcc ggc ctg gag gaa gct cca gct gtc460Ala Gly Ala Gly Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val95 100 105acc gcg gga ctg aaa atc ttt gaa cca cca gct cca gga gaa ggc aac508Thr Ala Gly Leu Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn110 115 120tcc agt cag aac agc aga aat aag cgt gcc gtt cag ggt cca gaa gaa556Ser Ser Gln Asn Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu125 130 135 140aca gtc act caa gac tgc ttg caa ctg att gca gac agt gaa aca cca604Thr Val Thr Gln Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro145 150 155act ata caa aaa gga tct tac aca ttt gtt cca tgg ctt ctc agc ttt652Thr Ile Gln Lys Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe160 165 170aaa agg gga agt gcc cta gaa gaa aaa gag aat aaa ata ttg gtc aaa700Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys175 180 185gaa act ggt tac 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1.一種免疫調(diào)節(jié)藥物，其特征在于，它含有藥學(xué)上可接受的載體和安全有效量的人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段，所述的B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段具有促B細(xì)胞成熟的生物活性。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于，所述的人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段具有SEQ ID NO2所示的B淋巴細(xì)胞刺激因子的羧基端的至少120-215個(gè)連續(xù)氨基酸。
3.如權(quán)利要求2所示的藥物，其特征在于，所述的人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列。
4.一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有表達(dá)人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段的DNA編碼序列，用于啟動(dòng)所述編碼序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子；用于終止所述編碼序列轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止子；和控制表達(dá)載體復(fù)制的復(fù)制子。
5.如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述的啟動(dòng)子包括T7啟動(dòng)子，所述的復(fù)制子包括pUC復(fù)制子。
6.如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述的DNA編碼序列編碼具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段。
7.如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體是質(zhì)粒pT7450-BlyS2。
8.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求4所述表達(dá)載體。
9.如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，它還含有使T7 RNA聚合酶受溶氧濃度調(diào)控表達(dá)的質(zhì)粒，所述的質(zhì)粒含有vgb基因的啟動(dòng)子、T7 RNA聚合酶基因、轉(zhuǎn)錄終止子、和復(fù)制子。
10.一種生產(chǎn)B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段的方法，其特征在于，它包括步驟(1)在適合表達(dá)B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，以表達(dá)B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段；(2)分離出所表達(dá)的B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段；(3)對(duì)分離的B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段進(jìn)行復(fù)性處理，從而獲得有活性的B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型免疫調(diào)節(jié)藥物，它含有藥學(xué)上可接受的載體和安全有效量的人B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段，所述的B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段具有促B細(xì)胞成熟的生物活性。本發(fā)明還提供了制備B淋巴細(xì)胞刺激因子膜外區(qū)段的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和生產(chǎn)方法。本發(fā)明不僅提供了可作為新的治療性蛋白，而且在制備工藝上克服了添加誘導(dǎo)劑等工藝缺點(diǎn)，且具有蛋白產(chǎn)物表達(dá)量高，利于大規(guī)模和高密度進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化制備等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1408429SQ0112682
公開日2003年4月9日 申請(qǐng)日期2001年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月21日
發(fā)明者龔毅, 楊勝利, 田瑞陽(yáng) 申請(qǐng)人:上海新世界基因技術(shù)開發(fā)有限公司