抑制多核苷酸序列的功能的方法和組合物的制作方法

專利名稱：抑制多核苷酸序列的功能的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在的一些靶多核苷酸序列的功能有抑制或其它調(diào)節(jié)作用的多核苷酸組合物，涉及在治療，預(yù)防，診斷和研究方法中利用這些組合物的方法。
背景技術(shù)：
關(guān)于多核苷酸組合物在藥物中的用途，主要是在治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的疾病中的抑制應(yīng)用以及在這些領(lǐng)域的研究中的應(yīng)用已經(jīng)有過(guò)論述。具體地說(shuō)，圍繞多核苷酸組合物在治療病原體細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)感染，如病毒，細(xì)菌，真菌感染等等中的用途的問(wèn)題目前已做過(guò)大量的工作。一個(gè)例子是，已有敘述，DNA疫苗在體內(nèi)遞送給哺乳動(dòng)物細(xì)胞一種試劑，這種試劑通過(guò)控制哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)抑制病原體。所以，這樣的疫苗被設(shè)計(jì)成例如表達(dá)病毒蛋白質(zhì)或多核苷酸，并且在受感染試劑攻擊時(shí)引發(fā)全身的或細(xì)胞的免疫應(yīng)答。在其它方面，基因治療載體是通常設(shè)計(jì)成能夠遞送給哺乳動(dòng)物細(xì)胞一種在哺乳動(dòng)物中不表達(dá)，表達(dá)不恰當(dāng)或表達(dá)不足的蛋白質(zhì)。這樣的載體通常必然會(huì)產(chǎn)生針對(duì)這些多核苷酸序列的種特異性免疫應(yīng)答，它們被識(shí)別為抗原或引發(fā)多余的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
多核苷酸組合物的其它治療用途是對(duì)有疾病的哺乳動(dòng)物遞送消失的或表達(dá)不足的蛋白質(zhì)。另外多核苷酸本身可用作診斷/成象方案中的體內(nèi)試劑，用作基因治療，反義方案和疫苗應(yīng)用方法中的試劑，或用作治療或預(yù)防各種失調(diào)癥如遺傳缺陷，感染疾病，癌癥和自身免疫疾病的藥物。多核苷酸也可以用作各種實(shí)驗(yàn)中的試劑，如生物學(xué)研究實(shí)驗(yàn)，醫(yī)藥，診斷和篩選實(shí)驗(yàn)和污染檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
本領(lǐng)域已知的宿主問(wèn)題已經(jīng)防止了大量的多核苷酸組合物變成可廣泛采用的有用藥物。所以，只有少數(shù)這樣的DNA疫苗或治療劑仍然在醫(yī)藥領(lǐng)域采用來(lái)治療哺乳動(dòng)物的疾病。
在植物和線蟲中已經(jīng)觀察到多核苷酸組合物介導(dǎo)的癥狀，稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默和轉(zhuǎn)錄沉默。這一現(xiàn)象證明用表達(dá)與調(diào)節(jié)元件如啟動(dòng)子或天然基因或在細(xì)胞中已經(jīng)表達(dá)的部分具有一些同源性的多核苷酸序列的病毒，類病毒，質(zhì)?；騌NA轉(zhuǎn)染或感染植物，線蟲或果蠅可以導(dǎo)致永久性地抑制內(nèi)源調(diào)節(jié)元件或基因和外源序列的表達(dá)。這一沉默效果表現(xiàn)出基因特異性。參見(jiàn)例如，L.Timmons和A.Fire，《自然》，395卷354頁(yè)(1998年10月29日)；A.Fire等人，《自然》，391卷806-810頁(yè)(1998年二月19日)；和R.Jorgensen等人，《科學(xué)》，279卷1486-1487頁(yè)(1998年，3月6日)。將編碼全長(zhǎng)原-αI膠原基因的DNA質(zhì)粒瞬時(shí)地轉(zhuǎn)染進(jìn)嚙齒類動(dòng)物的成纖維組織細(xì)胞系中，即觀察到了對(duì)天然膠原基因和瞬時(shí)表達(dá)基因的“沉默”效果[Bahramian和Zarbl，《分子細(xì)胞生物學(xué)》，19卷(1)274-283(199年1月)]。
同樣，可參見(jiàn)1998年2月12日公開(kāi)的國(guó)際專利公開(kāi)號(hào)，WO98/05770，該專利涉及利用具有二級(jí)結(jié)構(gòu)，和/或結(jié)合雙鏈RNA酶的反義RNA抑制基因。1999年10月21日公開(kāi)的國(guó)際專利公開(kāi)號(hào)WO99/53050涉及通過(guò)導(dǎo)入編碼有義和反義RNA分子的嵌合基因，降低核酸，特別是在植物細(xì)胞中的表型表達(dá)。
本領(lǐng)域存在對(duì)哺乳動(dòng)物中引起疾病的多核苷酸的功能有抑制作用而不會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物的必需基因有不利影響的多核苷酸或利用它的方法的需要，這些多核苷酸如對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的病毒和其它細(xì)胞內(nèi)病原體的復(fù)制所必需的多核苷酸序列，細(xì)胞外哺乳動(dòng)物病原體的序列，在哺乳動(dòng)物中介導(dǎo)癌癥的擴(kuò)散的腫瘤抗原的序列。
發(fā)明概要在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制靶多核苷酸序列的功能的組合物。該組合物含有給哺乳動(dòng)物細(xì)胞至少提供部分雙鏈的RNA分子的試劑，該RNA分子含有至少約200個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的多核苷酸序列。該多核苷酸序列與靶多核苷酸序列基本上同源，靶多核苷酸序列可以是例如病毒或其它細(xì)胞內(nèi)病原體的多核苷酸序列，癌癥抗原或必需的致瘤調(diào)節(jié)序列的多核苷酸序列，哺乳動(dòng)物中存在的細(xì)胞外致病原的多核苷酸序列，或在細(xì)胞中需要被“關(guān)掉”的任何其它多核苷酸序列。這一RNA分子優(yōu)選地不生成功能性蛋白質(zhì)。這一RNA分子優(yōu)選地與天然存在的，必需的哺乳動(dòng)物多核苷酸序列基本上非同源。在一個(gè)實(shí)施方案中，本組合物的試劑是酶學(xué)合成方法或體外化學(xué)合成方法生成的RNA分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在重組培養(yǎng)物中，例如細(xì)菌細(xì)胞可以生成，從中分離和在下面討論的方法中利用該RNA分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本組合物的試劑在遞送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中后，在體內(nèi)生成這樣的RNA分子。
在另一方面，本發(fā)明提供了含有上面剛剛敘述的和下文中特定的敘述的一種或幾種組合物的藥物組合物，和可選地提供在藥理可接受載體中的有助于細(xì)胞吸收多核苷酸的第二種試劑。這樣的組合物可用于治療細(xì)胞內(nèi)病原體的感染，如病毒的感染。其它這樣的組合物可用于治療一些癌癥。其它這樣的組合物還可以治療一些細(xì)胞外病原體。仍然是其它這樣的組合物可用于治療其中對(duì)于其治療或疫苗的利用需要抑制哺乳動(dòng)物中多核苷酸序列的功能的疾病或紊亂。
仍然是另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物給藥一種或幾種上面敘述的組合物，其中靶多核苷酸是感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的病毒的復(fù)制和/或致病所必需的病毒多核苷酸序列，同時(shí)給藥在藥理可接受載體中的有助于細(xì)胞吸收多核苷酸的可選的第二種試劑來(lái)治療哺乳動(dòng)物中的病毒感染的方法。這一組合物是以能夠有效地降低或抑制哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中的病毒序列的功能的量給藥的。
仍然是另一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物給藥在藥理可接受載體中的上面所述的一種或幾種組合物，其中靶多核苷酸是感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的病毒的復(fù)制和/或致病必需的病毒多核苷酸序列，和可選的第二種幫助細(xì)胞吸收多核苷酸的試劑來(lái)防止病毒感染的方法。這一組合物是以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入病毒后能夠有效地降低或抑制病毒序列的功能的量給藥的。
仍然是另一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物給藥一種或幾種上面所述的組合物治療或預(yù)防病毒誘導(dǎo)的癌癥的方法，其中靶多核苷酸是編碼腫瘤抗原或其功能片段或調(diào)節(jié)序列的序列，該序列的功能是哺乳動(dòng)物中維持腫瘤所需要的。組合物還可以含有有助于細(xì)胞吸收多核苷酸的可選的第二種試劑，和藥理可接受的載體。該組合物是以能夠有效地降低或抑制哺乳動(dòng)物中維持腫瘤的序列的功能的量給藥的。
在另一方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中細(xì)胞內(nèi)病原體感染的方法。對(duì)哺乳動(dòng)物給藥本文所述的一種或幾種本文所述的組合物，其中靶多核苷酸是感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的病原體的復(fù)制和/或致病所必需的細(xì)胞內(nèi)病原體的多核苷酸序列。組合物是和藥理可接受的載體中的可選的第二種促進(jìn)細(xì)胞吸收多核苷酸的試劑一起給藥的，給藥的量是能夠有效地降低或抑制哺乳動(dòng)物中該序列的功能的量。
還是在另一方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的細(xì)胞外病原體感染的方法，對(duì)哺乳動(dòng)物給藥本文所述的一種或幾種組合物，其中靶多核苷酸是感染的哺乳動(dòng)物中的病原體的復(fù)制和/或致病必需的細(xì)胞外病原體的多核苷酸序列。該組合物是在藥理可接受載體中一起給藥的，給藥的量是能夠有效地降低或抑制哺乳動(dòng)物中的序列的功能的量。它也可以與可選的有助于病原體細(xì)胞吸收多核苷酸的第二種試劑一起給藥。
仍然是另一方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的癌癥的方法。對(duì)哺乳動(dòng)物給藥一種或幾種上面所述的組合物，其中靶多核苷酸是哺乳動(dòng)物中引起不正常的癌癥的基因或非表達(dá)調(diào)節(jié)序列的多核苷酸，哺乳動(dòng)物同時(shí)還具有基因或調(diào)節(jié)序列的正?？截?。根據(jù)這一方面，不正常序列和正常序列之間的不同是多核苷酸的不同。該組合物是和可選地第二種幫助細(xì)胞吸收多核苷酸的試劑，在藥理可接受載體中一起給藥的，給藥的量是能夠有效地降低或抑制哺乳動(dòng)物中不正常序列的功能的量。
仍然是另一個(gè)方面，本發(fā)明包括治療哺乳動(dòng)物中的疾病或紊亂的方法，方法包括對(duì)有疾病或紊亂的哺乳動(dòng)物給藥一種或幾種上面所述的組合物，疾病或紊亂的特征是表達(dá)了健康的哺乳動(dòng)物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的多核苷酸產(chǎn)物，其中靶多核苷酸序列是表達(dá)該多核苷酸產(chǎn)物或該產(chǎn)物的表達(dá)所必需的非表達(dá)調(diào)節(jié)序列的多核苷酸序列。組合物是在有或沒(méi)有第二種有助于細(xì)胞吸收多核苷酸的試劑，并在藥理可接受載體中給藥的，給藥的量是能夠有效地降低或抑制哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中靶多核苷酸產(chǎn)物或調(diào)節(jié)序列的功能的量。
仍然是本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了可在研究方法中利用的這樣的組合物，如能夠在體外降低或抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中不需要的基因表達(dá)的試劑，用于診斷或其它研究實(shí)驗(yàn)，或來(lái)自體內(nèi)又回到哺乳動(dòng)物中用于治療或用于其它醫(yī)藥用途。
本發(fā)明還有的其它方面進(jìn)一步在下面的優(yōu)選的實(shí)施方案的詳細(xì)敘述中敘述。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A是利用細(xì)菌噬菌體T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子正向gag引物(T7F)和反向gag(R)引物生成PCR產(chǎn)物的圖解。利用T7 RNA聚合酶，從這一PCR模板轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了RNA序列的gag的有義鏈。
圖1B是利用正向gag引物(F)和T7啟動(dòng)子反向gag(T7R)引物生成PCR產(chǎn)物的圖解。利用T7RNA聚合酶，從這一模板轉(zhuǎn)錄生成了RNA序列g(shù)ag的反義鏈。利用圖1A的模板和圖1B的模板產(chǎn)生了雙鏈gag RNA序列。
發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明提供了治療，預(yù)防，研究和診斷哺乳動(dòng)物物種患有的疾病和紊亂的新多核苷酸組合物和方法，其中的目的是降低或抑制選定的靶多核苷酸序列的功能。這些組合物和方法在體內(nèi)和體外都有用途。這些組合物和方法還能夠影響細(xì)胞的分子機(jī)制來(lái)達(dá)到治療的目的，而不需要對(duì)參與的哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)作任何刺激。
正如本文所用，術(shù)語(yǔ)“靶”或“靶多核苷酸序列”指哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物生物體中存在的任何序列，可以是天然存在的并且可能有缺陷的哺乳動(dòng)物多核苷酸序列或由于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的病原體感染或疾病而存在的異源序列，該多核苷酸序列的功能是需要降低或抑制的。這一靶序列可能是編碼序列，即它能翻譯表達(dá)蛋白質(zhì)或其功能片段?；蛘?，靶序列也可以是非編碼的，但具有調(diào)節(jié)功能。一個(gè)靶多核苷酸序列是感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的病毒的復(fù)制和/或致病所必需的病毒多核苷酸序列。靶多核苷酸序列的另一個(gè)例示是腫瘤抗原或其功能片段或病毒誘導(dǎo)的癌癥的非表達(dá)調(diào)節(jié)序列，該序列是哺乳動(dòng)物維持腫瘤所需要的。仍然是靶多核苷酸的另一例示是感染的哺乳動(dòng)物中的病原體的復(fù)制和/或致病所必需的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的病原體的多核苷酸序列。仍然是靶多核苷酸序列的另一例示是同時(shí)具有基因或序列的正常拷貝的哺乳動(dòng)物中的不正常的引起癌癥的基因(非表達(dá)調(diào)節(jié)序列)的多核苷酸序列。在異常序列和正常序列之間的差異是多核苷酸序列水平上的差異。這樣的不正常序列可以是例如兩個(gè)正?；虻娜诤象w，靶序列可以是跨越這一融合體的序列，例如以一些白血病為特征的BCR-abl基因序列。術(shù)語(yǔ)“基因”包括待“沉默”的任何靶序列，可以是或不是轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的，包括調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子。
術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”或“哺乳動(dòng)物的”包含的意義是它們通常的意義。盡管本發(fā)明能夠最令人滿意地對(duì)人有效力，它同時(shí)可以用于家養(yǎng)的哺乳動(dòng)物如犬，貓和馬，以及特定目標(biāo)的哺乳動(dòng)物如，動(dòng)物園的動(dòng)物，農(nóng)場(chǎng)養(yǎng)動(dòng)物等等。
A.本發(fā)明的組合物根據(jù)本發(fā)明，抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的靶多核苷酸序列的功能的組合物包括給哺乳動(dòng)物細(xì)胞提供至少部分雙鏈的RNA分子的試劑。通常，除了另有特定的說(shuō)明，例如核糖的2’-OH基團(tuán)是特別的鍵所需要的情況，術(shù)語(yǔ)“RNA”也可以包括RNA-DNA雜合體。RNA分子包括至少約200個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的多核苷酸序列。重要的是，這一RNA分子的多核苷酸序列是與靶多核苷酸序列基本同源的。這一多核苷酸序列同時(shí)優(yōu)選地含有外顯子序列或其部分序列。令人滿意的是，該多核苷酸序列不含有內(nèi)含子序列。優(yōu)選地，RNA分子不產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)，更優(yōu)選地，它是不能翻譯的。RNA分子的多核苷酸序列優(yōu)選地與任何天然存在的，正常發(fā)揮功能的必需哺乳動(dòng)物多核苷酸序列是非同源的。本文所述的多核苷酸序列可以利用多靶或多表位途徑，例如編碼單個(gè)靶病原體的一個(gè)以上基因的序列或針對(duì)一個(gè)以上靶病原體或其他類需要靜默的靶。
“至少部分雙鏈的RNA分子”包括長(zhǎng)度在約100到10,000個(gè)多核苷酸之間的RNA多核苷酸序列。目前，最需要的是至少200個(gè)多核苷酸長(zhǎng)度的序列，但在一個(gè)實(shí)施方案中，它的長(zhǎng)度范圍可以在200到8000個(gè)多核苷酸之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA分子的長(zhǎng)度低于7500個(gè)多核苷酸。仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA分子可以具有少于5000個(gè)多核苷酸的長(zhǎng)度。還是在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA分子可以具有約少于2000個(gè)多核苷酸的長(zhǎng)度的序列。還是在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA分子可以具有約少于1000個(gè)多核苷酸的序列。還是在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA分子可以具有約少于750個(gè)多核苷酸的序列。
根據(jù)多核苷酸序列的組合物和ΔG約-9.2千卡/摩爾，最少地，為了維持RNA分子的穩(wěn)定性，它至少在雙鏈序列中具有11到30個(gè)核苷酸的基本長(zhǎng)度。正如本領(lǐng)域已知，ΔG的定義是維持分子構(gòu)型穩(wěn)定所需要的最少的外部能量的狀態(tài)[參見(jiàn)，例如，Jaeger等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，20卷7706-7710頁(yè)(1989)；和Soler和Jankowski，《數(shù)學(xué)生物科學(xué)》，2卷167-190(1991)]。根據(jù)這一最小值，優(yōu)選地，至少10％的部分雙鏈的RNA分子序列是雙鏈的?；蛘撸@些RNA分子的雙鏈部分可以至少是該序列的30％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些分子的雙鏈部分至少是該序列的50％。仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些分子的雙鏈部分至少是該序列的70％。仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些分子的雙鏈部分至少是該序列的90％。仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，整個(gè)序列都是雙鏈。或者，這些分子的雙鏈部分可以存在于一個(gè)或兩個(gè)末端，如果分子是線性的，可以存在于序列的稍微中間的部分。同樣，如果分子是環(huán)狀，雙鏈部分可以在任何位置。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，RNA分子的雙鏈部分只有當(dāng)分子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)才變成雙鏈。還是在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，部分雙鏈的分子是RNA/DNA雜合體，例如體外制備的含有RNA和DNA的單鏈，或兩個(gè)這樣的單鏈或它們的部分單鏈組成雙鏈體。還是在另一個(gè)實(shí)施方案中，體內(nèi)或體外制備的RNA分子是RNA單鏈和DNA單鏈組成的雙鏈體。
為了能夠有效地降低或抑制功能，部分雙鏈的RNA分子的多核苷酸序列必須是與靶多核苷酸序列基本同源的。正如本領(lǐng)域已知，“同源性”或“同一性”指如兩個(gè)長(zhǎng)度的序列之間的匹配的同一性確定的兩個(gè)肽或兩個(gè)多核苷酸序列之間的序列相關(guān)的程度。通過(guò)過(guò)去本領(lǐng)域的方法可以容易地計(jì)算出同一性和同源性[參見(jiàn)，例如，《計(jì)算分子生物學(xué)》，Lesk，A.M.，編輯，牛津大學(xué)出版社，紐約(1988)；BIOCOMPUTINGINFORMATICS AND GENOME PROJECTS，Smith，D.W，編輯，研究院出版社，紐約(1993)；《序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析》，第I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.編輯，Humana出版社，新澤西，(1994)；《分子生物學(xué)序列分析》von Heinje，G.，學(xué)術(shù)出版社(1987)；和《序列分析入門》，Gribskov，M.和Devereux，J.編輯，M Stockton出版社，紐約(1991)]。由于存在大量的檢測(cè)兩個(gè)多核苷酸序列之間的同一性和同源性的方法，術(shù)語(yǔ)“同一性”，“相似性”和同源性是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的[H.Carillo和D.Lipton，《SIAM J.Applied Math.》48卷1073(1988)]。通常用于確定兩個(gè)序列之間的同一性或同源性的方法包括，但不限于《Guide to Huge Computer》，Martin J.Bishop，編輯，學(xué)術(shù)出版社，圣迭戈，1994，和H.Carillo和D.Lipton，《SIAM J.Applied Math.》48卷1073頁(yè)(1988)中公開(kāi)的那些。優(yōu)選的確定同一性或同源性的方法是設(shè)計(jì)給出兩個(gè)測(cè)試序列之間匹配最大的方法。確定同一性和相似性的方法是在計(jì)算機(jī)程序中編碼好的。優(yōu)選的確定兩個(gè)序列之間的同一性或同源性的計(jì)算機(jī)程序包括，但不限于來(lái)自GCG程序包的BESTFIT算法[J.Devereux等人，《核酸研究》12卷(1)387頁(yè)(1984)]，相關(guān)的MACVECTOR程序(牛津)，和FASTA(Pearson)程序。例如，對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中天然存在的哺乳動(dòng)物的多核苷酸序列和靶多核苷酸序列之間的的序列相似性的檢索就能夠設(shè)計(jì)需要的適當(dāng)RNA分子用于本發(fā)明。根據(jù)靶與任何天然存在的哺乳動(dòng)物序列之間的同一性和/或靶序列與天然存在的哺乳動(dòng)物的序列之間的同一性的靠近程度，本領(lǐng)域的一個(gè)技術(shù)人員可以選擇任何特定的RNA分子所必需的同源性的算法和程度，而天然存在的哺乳動(dòng)物的序列是在用了本發(fā)明的方法后需要正常發(fā)揮功能的。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用MACVECTOR程序，缺省的退火溫度37℃，RNA多核苷酸序列與靶序列之間令人滿意的整體同源性至少是10％，并且RNA多核苷酸序列至少含有一個(gè)30個(gè)連續(xù)的核苷酸，與靶序列中的一個(gè)相似的30個(gè)核苷酸的區(qū)域至少具有50％的同源性的一個(gè)片段(窗口)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA多核苷酸序列與靶序列令人滿意地至少具有30％的整體同源性，并且至少含有一個(gè)與靶序列的一個(gè)相似的30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的窗中有50％的同源性的具有30個(gè)相連的核苷酸的一個(gè)窗。還是在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA多核苷酸序列與靶序列之間令人滿意地至少具有50％的同源性，并且至少含有一個(gè)與靶序列的相似的30個(gè)核苷酸區(qū)域有50％的同源性的窗的30個(gè)相連的核苷酸的一個(gè)窗。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA多核苷酸序列與靶序列之間整體上令人滿意地至少具有70％的同源性，并且至少含有一個(gè)與靶序列的一個(gè)相似的30個(gè)核苷酸的窗之間有50％的同源性的有30個(gè)相連核苷酸的一個(gè)窗。還是另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA多核苷酸序列與靶序列之間至少具有90％的整體同源性，并且至少含有一個(gè)與靶序列的一個(gè)相似的30個(gè)核苷酸區(qū)中有50％的同源性的窗有30個(gè)相連核苷酸的一個(gè)窗。
仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA多核苷酸序列在整體上與靶序列令人滿意地至少具有10％的同源性，并且至少含有一個(gè)與靶序列的一個(gè)相似的30個(gè)核苷酸的窗的同源性至少70％的一個(gè)30相連的核苷酸的一個(gè)窗，還是在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA多核苷酸序列與靶序列在整體上至少具有10％的同源性，并且至少含有一個(gè)與靶序列相似的30個(gè)核苷酸的區(qū)域，同源性至少90％的一個(gè)30相連的核苷酸的片段(窗)。
仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA多核苷酸序列與靶序列之間在整體上至少具有10％的同源性，并且至少含有兩個(gè)與靶序列的一個(gè)相似的30個(gè)核苷酸的區(qū)域具有同源性至少50％的30個(gè)相連的核苷酸的窗。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠開(kāi)發(fā)這一形式的其它實(shí)施方案。
在第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，RNA多核苷酸與靶序列之間在整體上至少具有10％的同源性，并且至少含有一個(gè)與靶序列的5個(gè)核苷酸的區(qū)段(窗)的30個(gè)相連的核苷酸的窗具有絕對(duì)同源性的5個(gè)相連的核苷酸的一個(gè)片段(窗口)，其中利用的是MACVECTOR程序，缺省的退火溫度是37℃。在這一實(shí)施方案的另一個(gè)變異方案中，RNA多核苷酸序列與靶序列之間在整體上至少具有30％的同源性，并且至少含有一個(gè)與靶序列的一個(gè)5個(gè)核苷酸的區(qū)域有絕對(duì)同源的5個(gè)連續(xù)的核苷酸的窗。還是在另一實(shí)施方案中，RNA多核苷酸與靶序列之間在整體上至少具有50％的同源性，并且含有上面所述的絕對(duì)同源的5個(gè)核苷酸的窗。本實(shí)施方案的其它病原體也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員開(kāi)發(fā)。
上面的方案中提到的窗的存在允許序列的其余部分的整體同源性降低；但是可以預(yù)料，低的整體同源性似乎對(duì)下面所述的治療性組合物的給藥劑量有不利的影響。在RNA多核苷酸序列中增加這樣的窗的數(shù)目似乎能夠允許序列的其它部分的整體同源性降低，而不影響劑量。
我們應(yīng)該理解，選擇需要的同源性，選擇缺省的程序，選擇利用的程序計(jì)算同源性是本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍，前提是在本說(shuō)明書的教導(dǎo)和科學(xué)文獻(xiàn)的知識(shí)范圍基礎(chǔ)上。
RNA分子的多核苷酸序列最好也與任何天然存在的，正常發(fā)揮功能的必需的哺乳動(dòng)物多核苷酸序列基本非同源，從而，當(dāng)用于本發(fā)明的方法中時(shí)，該RNA分子多核苷酸序列沒(méi)有不利地影響任何天然存在的哺乳動(dòng)物多核苷酸序列的功能。這樣的天然存在的功能性哺乳動(dòng)物多核苷酸序列包括編碼需要的蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物序列，以及非編碼的但在健康的哺乳動(dòng)物中提供必需的調(diào)節(jié)序列的哺乳動(dòng)物序列。從基本上說(shuō)，為了其功能在本發(fā)明的任何方法實(shí)施后不打亂，用于本發(fā)明的RNA分子必需和任何哺乳動(dòng)物多核苷酸序列有足夠區(qū)別。正如對(duì)確定上面的靶序列的同源性所述，本領(lǐng)域的一個(gè)技術(shù)人員可以使用上面的計(jì)算機(jī)算法程序確定RNA分子的多核苷酸序列和正常的哺乳動(dòng)物序列之間基本缺乏同源性。所以，在一個(gè)例示的實(shí)施方案中，RNA多核苷酸和選擇的正常序列之間的同源性低于上面所述的方案中的同源性。更優(yōu)選地，在RNA多核苷酸和任何正常的哺乳動(dòng)物序列之間差不多完全沒(méi)有同源性。應(yīng)該理解的是，選擇需要的同源性是本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍，也是本說(shuō)明書的教導(dǎo)和科學(xué)文獻(xiàn)中的現(xiàn)存的知識(shí)所給出的。
最后，本發(fā)明的組合物的RNA分子的另一個(gè)令人滿意的特征是不產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)，或者是不翻譯。該RNA分子或遞送試劑可以各種已知的方法工程化，因此可選地不表達(dá)功能性蛋白質(zhì)，或可選地與參與翻譯的細(xì)胞因子不反應(yīng)。所以，例如，不管是合成的RNA分子的試劑還是在體內(nèi)變成RNA分子的試劑都缺乏多聚腺苷酸化序列。同樣，試劑可能缺乏蛋白質(zhì)翻譯必需的岡崎片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA分子還可能缺乏天然的起始甲硫氨酸密碼子。還是另一個(gè)實(shí)施方案，RNA分子多核苷酸序列缺乏帽子結(jié)構(gòu)。還是另一個(gè)實(shí)施方案，RNA分子沒(méi)有蛋白質(zhì)合成的信號(hào)。另一個(gè)實(shí)施方案，RNA分子沒(méi)有編碼序列或功能性非操作性編碼序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA序列被內(nèi)含子序列間斷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)夾序列位于天然起始密碼子前，或不存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA分子可以是如上所述的RNA/DNA雜合體。所有這些實(shí)施方案可以通過(guò)已知的如下面引證的那些文章的教導(dǎo)進(jìn)行設(shè)計(jì)。
下面是可以用于達(dá)到本文所述的多核苷酸抑制的各種特定的實(shí)施方案。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，下面所述的各利RNA(和RNA/DNA雜合體)結(jié)構(gòu)可以單獨(dú)使用，或結(jié)合兩個(gè)或幾個(gè)，例如套索(有義或反義)和/或互補(bǔ)環(huán)狀和/或線性分子使用。反義套索或環(huán)狀結(jié)構(gòu)也可以單獨(dú)使用。另外，這些結(jié)構(gòu)可以包括本身互補(bǔ)的區(qū)域(例如，串聯(lián)的有義和反義序列)以及與需要的靶相關(guān)的其它反義序列。在本文中，術(shù)語(yǔ)“反義”用來(lái)指與任可mRNA互補(bǔ)并且能夠雜交。
在一個(gè)實(shí)施方案中，“套索”形式的多核苷酸可以使用。套索含有如與通常的3’-5’鍵相對(duì)的2’-5，-磷酸二酯鍵。這樣的結(jié)構(gòu)是在剪接體和自身裂解的核酶催化的剪接反應(yīng)中形成的。這些結(jié)構(gòu)是剪接反應(yīng)的中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物。它們可以在體內(nèi)通過(guò)在細(xì)胞中表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)制備，或在體外制備。當(dāng)核糖或脫氧核糖中的游離的5’磷酸基團(tuán)變成與環(huán)回方式中的核糖的2’-OH連接時(shí)，形成了套索。套索在環(huán)中可能含有10個(gè)或更多的核苷酸，或者可以是完整的環(huán)，在每個(gè)2’-5’-鍵中具有環(huán)回鍵。連接末端核苷酸的套索產(chǎn)生環(huán)狀結(jié)構(gòu)。環(huán)和/或干可以含有以單個(gè)分子串聯(lián)的有義和反義序列，或者每個(gè)單獨(dú)的套索含有有義或反義序列。在各個(gè)分子中含有有義和反義的套索可以作為雙鏈形式一起給藥，或者可以單獨(dú)利用反義套索與mRNA在細(xì)胞中形成雙鏈。套索可以是RNA或DNA雜合體，通過(guò)雜合體的RNA部分的2’-OH實(shí)現(xiàn)2’-5’鍵[Rees C和Song Q.《核酸研究》，27卷2672-2681頁(yè)(1999年)；Dame E等人，《生物化學(xué)》38卷，3157-3167頁(yè)，1999年；Clement J.Q.等人《RNA》，5卷206-220頁(yè)，1999年；Block T和Hill J.《神經(jīng)病毒學(xué)》，3卷313-321頁(yè)，1997年；Schindewolf CA和Domdey H.《核酸研究》23卷，1133-1139頁(yè)(1995)]。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)末端的2’-5’或3’-5’鍵可以產(chǎn)生環(huán)狀RNA(或環(huán)狀RNA-DNA雜合體)。這些可以利用裂片通過(guò)RNA連接酶反應(yīng)在體外，在近端產(chǎn)生末端，或通過(guò)利用自身剪接的核酶(在體內(nèi)和在體外)酶促產(chǎn)生。提供體外生成或體內(nèi)表達(dá)的一個(gè)或幾個(gè)RNA環(huán)，包括有或沒(méi)有自身互補(bǔ)的單個(gè)環(huán)，以及雙鏈環(huán)狀RNA(與靶多核苷酸相關(guān)的有義和反義鏈)，或兩個(gè)相互有互補(bǔ)區(qū)域的，一個(gè)與靶互補(bǔ)的兩個(gè)單鏈RNA環(huán)可以達(dá)到需要的抑制。
另一個(gè)實(shí)施方案利用了單個(gè)的RNA(或RNA-DNA雜合體)反義環(huán)(沒(méi)有自身互補(bǔ)的環(huán)狀RNA，與靶mRNA互補(bǔ))。還有另一個(gè)實(shí)施方案利用了與靶mRNA分子互補(bǔ)的RNA-DNA環(huán)或環(huán)狀DNA分子。具有與靶信息互補(bǔ)的串聯(lián)的有義和反義序列(順序任意)的單環(huán)可以用作抑制靶序列的功能的組合物。優(yōu)選地，我們利用具有這樣的可以形成桿狀的自身互補(bǔ)序列以及與靶互補(bǔ)的其它反義序列的環(huán)狀分子[Schindewolf CA和Domdey H《核酸研究》23卷1133-1139(1995)；Rees C和Song Q.《核酸研究》，27卷2672-2681頁(yè)(1999)；Block T和Hill J.，《神經(jīng)病毒學(xué)雜志》3卷313-321(1997)]。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，抑制靶序列的組合物是帶帽的線性RNA。不管dsRNA是在體外或體內(nèi)形成的，一條或兩個(gè)鏈都可以帶帽。在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)一般不使RNA分子帶帽的情況中，加帽子可以通過(guò)各種方法，包括利用加帽酶如痘苗加帽酶或α病毒加帽酶來(lái)完成。加帽的反義分子可以用于實(shí)現(xiàn)靶基因的需要的轉(zhuǎn)錄后沉默。加帽RNA可以在體外或在體內(nèi)制備。通過(guò)RNApol II，在核中生成的RNA通常是帶帽的。細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的RNA可能或可能不帶帽。表達(dá)細(xì)胞質(zhì)病毒加帽酶可以進(jìn)行加帽。兩個(gè)都加帽或一個(gè)不加帽一個(gè)加帽或兩個(gè)都不加帽的RNA或RNA-DNA雜合體序列可以用于這些組合物中。加帽或不加帽的反義分子可以單獨(dú)使用或與本文所述的多核苷酸結(jié)構(gòu)任意結(jié)合使用。
可以將組合物中的本發(fā)明的RNA分子遞送到哺乳動(dòng)物的或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的胞外的病原體中，如RNA分子，或部分雙鏈的RNA序列，或RNA/DNA雜合體，可以通過(guò)常規(guī)酶合成方法，例如，利用噬菌體T7，T3或SP6 RNA聚合酶，根據(jù)如Pormega方法和Applications Guide(第3版，1996)，Doyle，ISBN No.1-882274-57-1等文章中所述的常規(guī)酶合成方法在體外生成。
或者，這些分子可以在體外通過(guò)化學(xué)合成方法生成[參見(jiàn)例如，Q.Xu等人，《核酸研究》，24(18)3643-4(1996年9月)；N.Naryshkin等人，《Bioorg.Khim》，22卷(9)691-8(1996年9月)；J.A.Grasby等人《核酸研究》21卷(19)4444-50(1993年9月)；C.Chaix等人，《核酸研究》17卷(18)7381-93(1989)；S.H.Chou等人《生物化學(xué)》，28卷(6)2422-35(1989年3月)；O.Odai等人《Nucl.Acids Symp.Ser.》21卷105-6(1989)；N.A.Naryshkin等人《Bioorg.Khim》22卷(9)691-8頁(yè)(1996年9月)；S.Sun等人《RNA》，3卷(11)1352-1363(1997年11月)；X.Zhang等人《核酶研究》25卷(20)3980-3(1997年10月)；S.M.Grvaznov等人，《核酸研究》，26卷(18)4160-7頁(yè)(1998年9月)；M.Kadokura等人《Nucl.Acids Symp.Ser.》37卷77-8(1997)；A.Davison等人《Biomed.Pept.Proteins.Nucl.Acids》，2(1)1-6頁(yè)(1996)；和A.V.Mudrakovskaia等人《Bioorg.Khim.》，17卷(6)819-22(1991年6月)]。
或者，本發(fā)明的RNA分子可以在重組微生物，例如細(xì)菌和酵母，或在重組宿主細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生成，并通過(guò)常規(guī)技術(shù)從它們的培養(yǎng)物中分離，參見(jiàn)例如Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第二版；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989年，所述的技術(shù)，這是詳細(xì)敘述這樣的技術(shù)的典型的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，也可參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,824,538；5,877,159和65,643,771所述的技術(shù)，這幾個(gè)專利號(hào)引入本文作為參考。
這樣體外制備或合成的RNA分子可以直接遞送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中，因?yàn)樗鼈兪窃隗w外生成的。結(jié)合本文提供的教導(dǎo)，上面所述的參考文獻(xiàn)提供給本領(lǐng)域技術(shù)人員設(shè)計(jì)任何下面特定的實(shí)施方案所必需的技術(shù)。所以，在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物“試劑”是雙鏈體(即，它是由兩條鏈組成的)，可以是完全雙鏈的或部分雙鏈的RNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑是單鏈RNA有義鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物試劑是單鏈RNA反義鏈。優(yōu)選地，單鏈RNA有義或反義鏈在一個(gè)或兩個(gè)末端形成發(fā)夾。令人滿意的是，單鏈RNA有義或反義鏈在兩個(gè)末端之間的一些中間部分形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這樣的單鏈RNA有義或反義鏈也可以設(shè)計(jì)成本身回折，在體外或體內(nèi)變成部分雙鏈。用于組合物中的作為有效試劑的現(xiàn)存的RNA分子的另一個(gè)例示是含有有義多核苷酸序列和反義多核苷酸序列的單鏈RNA序列，可選地被非堿基配對(duì)多核苷酸序列分開(kāi)。優(yōu)選地，該單鏈RNA序列一旦在細(xì)胞內(nèi)，或在體外合成過(guò)程中，具有變成雙鏈的能力。本發(fā)明的另一個(gè)例示是如上所述的RNA/DNA雜合體。合成的RNA分子的另一個(gè)例示是可選地可形成桿結(jié)構(gòu)的環(huán)狀RNA分子[參見(jiàn)例如，K-S.Wang等人，《自然》，323508-514頁(yè)(1986)]或者是部分雙鏈的，并且可以根據(jù)下面文獻(xiàn)所述的技術(shù)制備。S.Wang等人，《核酸研究》22卷(12)2326-33頁(yè)(1994年6月)；Y.Matsumoto等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，87(19)7628-32(1990年10月)；《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，91(8)3117-21(1994年4月)；M.Tsagris等人《核酸研究》，19(7)1605-12(1991年3月)；S.Braun等人，《核酸研究》，24(21)4152-7(1996年11月)；Z.Pasman等人《RNA》，2(6)603-10(1996年6月)；P.G.Zaphiropoulos，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，93(13)6536-41(1996年6月)；D.Beaudry等人《核酸研究》，23(15)3064-6(1995年8月)，上述文獻(xiàn)全部引入作為參考。另一種試劑是在分開(kāi)的鏈上存在的，或散布在同一鏈上的RNA和DNA組成的雙鏈分子。
或者，RNA分子可以在體內(nèi)形成，再通過(guò)“遞送試劑”遞送，這樣，在遞送試劑到哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中后，在體內(nèi)生成部分雙鏈的RNA分子。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，形成本發(fā)明的組合物的試劑是“編碼”一個(gè)上面所述的RNA分子的雙鏈DNA分子。DNA試劑提供在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，變成雙鏈RNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，DNA序列提供在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成上面所述的單鏈RNA的有義或反義鏈，或者在一個(gè)或兩個(gè)末端形成發(fā)夾或本身回折變成部分雙鏈的脫氧核苷酸序列。組合物的遞送試劑DNA分子可以提供含有有義多核苷酸序列和反義多核苷酸序列的單鏈RNA序列，它或者被非堿基配對(duì)的多核苷酸序列隔開(kāi)，其中單鏈RNA序列具有變成雙鏈的能力?；蛘撸f送試劑DNA分子能夠轉(zhuǎn)錄成上面所述的環(huán)狀RNA分子，該RNA分子可選地可以在體內(nèi)形成桿狀結(jié)構(gòu)或部分雙鏈結(jié)構(gòu)。該DNA分子也可以如上所述在體內(nèi)生成RNA/DNA雜合體，或含有一個(gè)RNA鏈和一個(gè)DNA鏈的雙鏈體。各種DNA分子可以利用常規(guī)技術(shù)如上面引證的Sambrook的文獻(xiàn)，或在引入作為參考的Promega參考文獻(xiàn)中所述的技術(shù)來(lái)設(shè)計(jì)。
本發(fā)明后面的一個(gè)遞送試劑能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中形成任何上述RNA分子，可以是單鏈或雙鏈質(zhì)?；蜉d體。設(shè)計(jì)成在體外或體內(nèi)生成如上所述的RNA的表達(dá)載體可以含有處于任何RNA聚合酶，包括線粒體RNA聚合酶，RNApolI，RNApolII和RNApolIII的控制下的序列。這些載體可以根據(jù)本發(fā)明用于在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成需要的RNA分子。載體可以如人所愿地設(shè)計(jì)為利用內(nèi)源線粒體RNA聚合酶(例如，人線粒體RNA聚合酶，其中，這樣的載體可以利用相應(yīng)的人線粒體啟動(dòng)子)。線粒體聚合酶可以在體內(nèi)生成加帽的(通過(guò)加帽的酶的表達(dá))或未帶帽的信息。RNApol I，RNA polII，和RNApol III轉(zhuǎn)錄物也可以在體內(nèi)生成。這樣的RNA可以是帶帽的或不帶帽的，并且如果需要，通過(guò)各種方法，包括利用加帽酶如痘苗加帽酶或α病毒加帽酶等來(lái)完成細(xì)胞質(zhì)的加帽過(guò)程。這樣的DNA載體設(shè)計(jì)成含有一個(gè)啟動(dòng)子或結(jié)合在一起的幾個(gè)啟動(dòng)子(線粒體的，RNApolI，II或pol III，或病毒的，細(xì)菌的或噬菌體啟動(dòng)子，和同源聚合酶一起)。優(yōu)選地，當(dāng)啟動(dòng)子是RNA pol II時(shí)，編碼RNA分子的序列具有約大于300個(gè)核苷酸的開(kāi)放讀碼框架，避免了在核內(nèi)降解。這樣的質(zhì)?；蜉d體包括來(lái)自細(xì)菌，病毒或噬菌體的質(zhì)粒序列。這樣的載體包括染色體，附加體和病毒起源的載體，例如，從細(xì)菌質(zhì)粒，噬菌體，酵母附加體，酵母染色體元素和病毒起源的載體，從它們結(jié)合體起源的載體，如起源于質(zhì)粒和細(xì)菌遺傳元件，粘粒和噬菌粒的載體。所以，載體的一個(gè)例子是單鏈或雙鏈的噬菌體載體。另一個(gè)載體的例子是單鏈或雙鏈RNA或DNA病毒載體。通過(guò)已知的技術(shù)，將DNA和RNA導(dǎo)入細(xì)胞，這樣的載體可以作為多核苷酸，優(yōu)選地作為DNA導(dǎo)入細(xì)胞。在噬菌體和病毒載體的情況中載體也可以，并且優(yōu)選地作為包裝好的或帶殼的病毒，通過(guò)已知的感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。病毒載體可以是復(fù)制感受態(tài)或復(fù)制缺陷的。在后一種情況中，病毒繁殖通常僅發(fā)生在互補(bǔ)的宿主細(xì)胞中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，遞送試劑含有不止一種單鏈DNA或RNA質(zhì)粒或載體。作為一個(gè)例子，第一個(gè)DNA質(zhì)粒可以提供如上所述的單鏈RNA有義多核苷酸序列，第二個(gè)DNA質(zhì)?？梢蕴峁┤缟纤龅膯捂淩NA反義多核苷酸序列，其中有義和反義RNA序列具有堿基配對(duì)和變成雙鏈的能力。這樣的質(zhì)?？梢院衅渌Ｒ?guī)質(zhì)粒序列，如細(xì)菌序列，如用于構(gòu)建質(zhì)粒和載體來(lái)重組表達(dá)蛋白質(zhì)的已知序列。但是，可以滿意的是能夠表達(dá)蛋白質(zhì)的序列如Kozak區(qū)等等不包括在這些質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中。
令人滿意的是，生產(chǎn)本發(fā)明的dsRNA的載體可以設(shè)計(jì)成生產(chǎn)兩個(gè)或多個(gè)包括大量與靶序列同源和互補(bǔ)的不同dsRNA。這一途徑令人滿意的是，單個(gè)載體可以生產(chǎn)許多獨(dú)立操作的ds RNA而不是單個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的單個(gè)dsRNA分子，并且通過(guò)生產(chǎn)多個(gè)不同的ds RNA，自身選擇最佳的效果也是可能的。為此可以利用各種方法，包括自我催化序列以及用于裂解的序列，以便產(chǎn)生任意的和/或預(yù)定的剪接位點(diǎn)。
提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞中形成上述的需要的RNA分子必需的信息的其它遞送試劑包括，活的，減毒的或殺死的，失活的重組細(xì)菌，該細(xì)菌是設(shè)計(jì)成含有本發(fā)明需要的RNA分子必需的序列。利用常規(guī)技術(shù)，如美國(guó)專利號(hào)5,824,538；5,877,159；和65,643,771中所述的技術(shù)可以制備這樣的重組細(xì)菌細(xì)胞，真菌細(xì)胞等等，上述專利引入作為參考。用于制備這些遞送試劑的微生物包括上面引證參考文獻(xiàn)中列出的，包括，不限于，大腸桿菌，枯草芽胞桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，和假單胞菌，鏈霉菌和葡萄球菌的各種種類。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，提供形成需要的上述RNA分子的必需信息的其它遞送試劑包括，活的，減毒的或殺死的，失活病毒，和攜帶如上討論的需要的RNA多核苷酸序列的特定的重組病毒。這樣的病毒可以相似地設(shè)計(jì)成目前用于將基因遞送給細(xì)胞用于基因治療等等的重組病毒，但優(yōu)選地不具有表達(dá)蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的功能片段的能力。可以操作，在體內(nèi)提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞需要的RNA分子的有用的病毒或病毒序列是，不限于，α病毒，腺病毒，腺伴隨病毒，桿狀病毒，δ病毒，痘病毒，肝炎病毒，皰疹病毒，乳多空病毒(如SV40)，脊髓灰質(zhì)炎病毒，假狂犬病毒，逆病毒，痘苗病毒，正和負(fù)鏈RNA病毒，類病毒，和擬病毒或它們的部分。這樣的各種病毒遞送試劑可以應(yīng)用常規(guī)技術(shù)如M.DiNocola等人《癌癥遺傳治療》5(6)350-6(1998)，和其它，在本發(fā)明的指導(dǎo)下設(shè)計(jì)。
提供在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中形成需要的上述RNA分子必需的信息的另一個(gè)遞送試劑包括活的，減毒或殺死的失活供體細(xì)胞，這些細(xì)胞已經(jīng)在體外用合成的RNA分子或DNA遞送分子或如上所述的遞送重組病毒轉(zhuǎn)染或感染過(guò)。然后，將這些供體細(xì)胞如下所述對(duì)哺乳動(dòng)物給藥，刺激哺乳動(dòng)物中介導(dǎo)抑制作用的機(jī)制。這些供體細(xì)胞令人滿意地是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如C127，3T3，CHO，HeLa，人腎293，BHK細(xì)胞系，和COS-7細(xì)胞，優(yōu)選地是與哺乳動(dòng)物受體相同的哺乳動(dòng)物種類。這樣的供體細(xì)胞可以利用和，如Emerich等人，《神經(jīng)科學(xué)雜志》16卷5168-81頁(yè)(1996)所述的技術(shù)相似的技術(shù)制成。更優(yōu)選地，可以從待治療的特定哺乳動(dòng)物中收集供體細(xì)胞，和通過(guò)體內(nèi)操作，類似于采用的轉(zhuǎn)化技術(shù)，如D.B.Kohn等人《自然方法》，4(7)775-80(1998年)所述的技術(shù)制成供體細(xì)胞。如果需要，供體細(xì)胞也可以來(lái)自非哺乳動(dòng)物種類。
最后，本發(fā)明的組合物也可以包括一種或幾種上面所述的選定試劑。組合物可以含有上面所述的合成RNA分子，上面所述的合成DNA遞送分子，和任何上面所述的其它遞送試劑，如重組細(xì)菌，細(xì)胞和病毒的混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地選擇組合物混合物的特性。
B.本發(fā)明的藥物(治療性的或預(yù)防性的)組合物藥物用途的本發(fā)明的組合物令人滿意地含有如上所述的合成RNA分子，或在體內(nèi)提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNA分子的，在藥理可接受載體中的試劑，以及其它用于藥物遞送的可選成分。藥物組合物的特定配方是由遞送RNA分子的試劑的形式?jīng)Q定的。
適當(dāng)?shù)乃幚砜山邮茌d體能促進(jìn)本發(fā)明的多核苷酸組合物的給藥，但是其本身是生理惰性的和/或無(wú)害的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇載體。這樣的載體包括，但不限于無(wú)菌鹽水，磷酸鹽，緩沖鹽，葡萄糖，無(wú)菌水，甘油，乙醇，乳糖，蔗糖，磷酸鈣，明膠，葡聚糖，瓊脂，果膠，花生油，橄欖油，芝麻油，和水和它們的結(jié)合體。另外，載體或稀釋劑可以包括延遲時(shí)間的物質(zhì)，如甘油單硬脂酸或甘油二硬脂酸，單獨(dú)或與蠟一起。另外，可以利用慢釋放的多聚物配方。配方應(yīng)該不僅適于遞送試劑的形式而且適于給藥的方式。根據(jù)給藥的方式選擇適當(dāng)?shù)妮d體是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的方法。
當(dāng)組合物含有合成的RNA分子，或試劑是另一個(gè)多核苷酸，如DNA分子，質(zhì)粒，病毒載體，或重組病毒，或多個(gè)拷貝的多核苷酸不同的多核苷酸等等，如上所述，組合物可以令人滿意地只與一個(gè)載體配制成“裸露”的多核苷酸。或者，這樣的組合物可以令人滿意地含有可選的多核苷酸促進(jìn)試劑，或“輔助試劑”，如局部麻醉劑，肽，脂，包括正離子脂，脂質(zhì)體或脂顆粒，聚陽(yáng)離子如聚賴氨酸，分枝的，三維的聚陽(yáng)離子，如dendrimer，碳水化合物，陽(yáng)離子親脂性分子，去垢劑，芐基銨鹽表面活性劑，或另一個(gè)有助于多核苷酸傳遞到細(xì)胞的的化合物。用于本發(fā)明的這樣的有助于試劑或輔助試劑的例子在美國(guó)專利號(hào)，5,593,972；5,703,055；5,739,118；5,837,533和1996年4月4日公開(kāi)的W096/10038，1994年8月8號(hào)公開(kāi)的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O94/16737中有敘述，上述各個(gè)專利引入作為參考。
當(dāng)利用的促進(jìn)試劑是局部麻醉劑時(shí)，優(yōu)選地是布比卡因，量為多核苷酸組合物的總重的約0.1％到約1.0％是優(yōu)選的。同樣參見(jiàn)，國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)?，PCT/US98/22841，在該專利中，摻入芐基銨鹽表面活性劑作為輔助試劑，給藥的量約為0.001-0.03％的重量，該專利引入作為參考。
當(dāng)遞送試劑組合物不是多核苷酸組合物，例如是如上所述的轉(zhuǎn)染的供體細(xì)胞或細(xì)菌時(shí)，組合物也可以含有其它試劑，如引入作為參考的美國(guó)專利號(hào)，5,824,538；5,643,771；5,877,159中討論的那些。
可以存在于任何組合物中的其它成分有助劑，防腐劑，化學(xué)穩(wěn)定劑，或其它抗原蛋白質(zhì)。通常，對(duì)于在靶標(biāo)人或動(dòng)物中起作用的最佳配方，穩(wěn)定劑，佐劑和防腐劑是最佳的。適當(dāng)?shù)睦痉栏瘎┌榷〈?，山梨酸鉀，山梨酸，二氧化硫，丙基沒(méi)食子酸，對(duì)羥基苯甲酸，乙基香草醛，甘油，苯酚，對(duì)氯苯酚?？梢岳玫倪m當(dāng)穩(wěn)定劑成分包括例如，酪蛋白氨基酸，蔗糖，明膠，酚紅，N-Z胺，二磷酸單鉀，乳糖，乳清蛋白水解產(chǎn)物，和干牛奶。常用的助劑是用于吸引白細(xì)胞或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的。這樣的助劑包括，Ribi，礦質(zhì)油和水，氫氧化鋁，Amphigen，Avridine，L121/角鯊烯，D-丙交酯-聚丙交酯/糖苷，pluronic plyois，胞壁酰二肽，殺死的胞特菌，皂苷，如Quil A。
另外，可以作為轉(zhuǎn)染試劑和/或復(fù)制試劑和/或炎癥試劑起作用，并且可以與本發(fā)明的組合物一起給藥的其它試劑包括生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子和淋巴因子，如α-干擾素，γ-干擾素，血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)，集落刺激因子，如G-CSF，GM-CSF，腫瘤壞死因子(TNF)，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，和白細(xì)胞介素，如IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12。另外，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，表面活性試劑，如免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)，佛氏不完全佐劑，LPS類似物包括單磷酸脂A(MPL)，胞壁酰肽，醌類似物和胞囊復(fù)合物如角鯊烯和角鯊烯和透明質(zhì)酸也可以用于和本發(fā)明的組合物一起給藥。
藥物組合物也可以含有其它適于本組合物給藥方式的添加劑。所以，這些組合物可以含有適于任何常規(guī)的給藥途徑的添加劑，給藥途徑包括，不限于腸胃外給藥，腹膜內(nèi)給藥，靜脈內(nèi)給藥，肌肉內(nèi)給藥，皮下給藥，皮內(nèi)給藥，口服給藥，局部給藥，鼻內(nèi)給藥，肺內(nèi)給藥，直腸給藥，陰道給藥等等。所有這些途徑都適于這些組合物的給藥，并且可以根據(jù)利用的試劑，治療的患者和癥狀，和相似的因素，由參與的醫(yī)護(hù)人員選擇。
本發(fā)明的組合物也可以含有凍干的多核苷酸，可以與其它藥理可接受賦形劑一起生產(chǎn)粉末，液體或懸浮液劑量形式，包括用于鼻內(nèi)或肺的那些形式，參見(jiàn)例如，Remington藥物科學(xué)或?qū)嵺`，第二卷，第19版(1995)，例如，95章，汽霧劑；和國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)枺琍CT/US99/05547，該專利引入本文作為參考。如果需要，這些組合物的給藥途徑可以相互結(jié)合或進(jìn)行調(diào)節(jié)。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以制備用于對(duì)哺乳動(dòng)物受試者給藥的本發(fā)明的藥物組合物，藥物的形式例如是液體，粉末，氣霧劑，片劑，膠囊，腸包衣片劑或膠囊或栓劑。
當(dāng)用作藥物組合物時(shí)，本發(fā)明的組合物可以含有約1納克到約20毫克的多核苷酸分子作為組合物的遞送試劑，如合成的RNA分子或可以是DNA分子，質(zhì)粒，病毒載體，重組病毒或和混合物的遞送試劑。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物含有約10納克到約10毫克的多核苷酸序列。在其它實(shí)施方案中，藥物組合物含有約0.1到約500微克的多核苷酸序列。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物含有約1到約350微克多核苷酸序列。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物含有約25到約250微克的多核苷酸序列。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，疫苗和治療劑含有約100微克的多核苷酸序列。
遞送試劑是供體細(xì)胞或細(xì)菌的本發(fā)明的組合物可以劑量約1個(gè)細(xì)胞到約107個(gè)細(xì)胞/劑來(lái)遞送。其中遞送試劑是活的重組病毒，基于適當(dāng)載體的組合物含有約1×102pfu到1×1012pfu/劑。
根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，和觀察到的待增殖到多于本發(fā)明的組合物轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞的細(xì)胞的本發(fā)明的方法或組合物的抑制效果的能力，在上面提到的劑量以下可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)膭┝空{(diào)整。所以，上面的劑量范圍僅僅是基線。通常，藥物組合物是以能夠有效抑制或降低靶多核苷酸序列的功能以治療或預(yù)防疾病，紊亂或感染的量給藥的，這樣的靶的功能是疾病，或疾病的起因試劑進(jìn)一步增殖所必需的。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，利用的劑量單位的藥物組合物的量是根據(jù)體外的細(xì)胞的應(yīng)答和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)本發(fā)明的組合物的應(yīng)答確定的。最佳劑量是每種治療的形式和適應(yīng)癥的標(biāo)準(zhǔn)方法確定的。所以，這些組合物的給藥的劑量，時(shí)間，給藥的途徑和再給藥可以考慮治療的癥狀，它的嚴(yán)重性，癥狀的復(fù)雜性，和如年齡等等因素和哺乳動(dòng)物受試者的物理?xiàng)l件，其它活性化合物的應(yīng)用等等，由本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)確定。
C.本發(fā)明的治療和預(yù)防方法本發(fā)明的方法可以利用上面詳細(xì)敘述的組合物，也可能利用可以提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞部分雙鏈的RNA分子的本領(lǐng)域目前利用的其它多核苷酸序列(例如，編碼功能性的或非功能性的蛋白質(zhì)的多核苷酸分子，或已知的RNA催化序列如核酶)。但是，可以預(yù)料，利用不產(chǎn)生蛋白質(zhì)的RNA分子，這些方法的效力增強(qiáng)了。這些方法降低或抑制了哺乳動(dòng)物中，或哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中靶多核苷酸序列的功能。如上所述的組合物，藥物組合物，給藥的劑量或方式對(duì)于治療危害哺乳動(dòng)物的各種紊亂，包括異源病原生物體，細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)的病原體的感染是特別令人滿意的。另外，本發(fā)明的組合物可用于預(yù)防病原體對(duì)哺乳動(dòng)物的感染，或預(yù)防潛伏的病原體的再活化引起的紊亂。這些組合物也可以用于治療病原體誘導(dǎo)的癌癥。
本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案是治療哺乳動(dòng)物中的病毒感染的方法。特別適于這樣的治療的有DNA病毒或有一個(gè)中間DNA時(shí)期的病毒。這些病毒包括，不限于，逆病毒，皰疹病毒，嗜肝DNA病毒，痘病毒，細(xì)小病毒，乳頭瘤病毒和乳多空病毒。用本方法治療的更令人滿意的一些特定的病毒包括，但不限于HIV，HBV，HSV，CMV，HPV，HTLV和EBV。用于本方法的試劑提供哺乳動(dòng)物的細(xì)胞如上所述的至少部分雙鏈的RNA分子，該RNA分子與靶多核苷酸基本同源，是感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中病毒的復(fù)制和/或致病所必需的病毒多核苷酸序列。這些靶多核苷酸序列是病毒的繁殖所必需的蛋白質(zhì)的編碼序列，例如，HIVgag，env和pol基因，HPV6L1和E2基因，HPV11L1和E2基因，HPV16 E6和E7基因，HPV18 E6和E7基因，HBV表面抗原，HBV核心抗原，HBV逆轉(zhuǎn)錄酶，HSV gD基因，HSV vp16基因，HSV gC，gH，gL和gB基因，HSVICP0，ICP4和ICP6基因，水痘帶狀皰疹gB，gC和GH基因，和BCR-abl染色體序列，和提供將感染從細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞所必需的調(diào)節(jié)功能的非編碼病毒多核苷酸序列，例如，HIV LTR，和其它病毒啟動(dòng)子序列，如HSV vp16啟動(dòng)子，HSV-ICP0啟動(dòng)子，HSV-ICP4，ICP6和gD啟動(dòng)子，HBV表面抗原啟動(dòng)子，HBV前基因組啟動(dòng)子，等等。如上所述，組合物和多核苷酸吸收增強(qiáng)物或促進(jìn)劑和可選的藥理可接受載體一起給藥。對(duì)哺乳動(dòng)物給藥的量或劑量是能夠有效地降低或抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中病毒序列的功能的。
如果不希望受理論的束縛，當(dāng)RNA分子遞送到病毒感染的細(xì)胞或在病毒感染的細(xì)胞中產(chǎn)生時(shí)，外源的RNA分子降低或抑制(即，關(guān)掉)了同源的病毒序列，并且受自身抑制了，所以病毒序列的功能減弱了或抑制了。正如下面的實(shí)施例中證明的，功能效果的抑制從接受外源的RNA分子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)移到?jīng)]有直接提供外源RNA分子的受試者的其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。目前在理論上說(shuō)，這一結(jié)果發(fā)生在RNA降解水平。
所以，本方法可以用于治療已經(jīng)被病毒如HIV感染的哺乳動(dòng)物受試者，以便關(guān)掉或抑制病毒復(fù)制和/或致病必需的病毒基因如HIVgag的功能?；蛘?，將本方法用于抑制在哺乳動(dòng)物中作為潛伏病毒如水痘帶狀皰疹病毒，并且是疾病如帶狀皰疹的成因試劑的病毒的功能。同樣，根據(jù)本方法，通過(guò)在哺乳動(dòng)物受試者中作用于病毒復(fù)制和/或致病所必需的一些病毒多核苷酸序列可以治療已經(jīng)顯示至少部分由病毒，細(xì)菌或另一個(gè)致病原引起的疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化，潰瘍，慢性疲勞綜合癥，和自身免疫紊亂，HSV-1和HSV-2再出現(xiàn)，HPV的持久性感染，如生殖器的疣和慢性HBV感染等等。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，如上所述的組合物可以用于在哺乳動(dòng)物中預(yù)防病毒感染的一個(gè)方法中。在將哺乳動(dòng)物與病毒接觸之前施用如上所述的方法時(shí)，即對(duì)哺乳動(dòng)物給藥如上所述的組合物，給藥的量能夠降低或抑制靶病毒多核苷酸序列的功能，我們期望哺乳動(dòng)物中保留有外源的RNA分子，并且能夠抑制后來(lái)哺乳動(dòng)物中存在的任何同源病毒序列。所以，本發(fā)明的組合物可以用于抑制或降低病毒多核苷酸序列在疫苗用途中的功能。
本發(fā)明的上述“抗病毒”方法的類似實(shí)施方案包括在哺乳動(dòng)物中治療或預(yù)防病毒誘導(dǎo)的癌癥的方法。這樣的癌癥包括HPV E6/E7病毒誘導(dǎo)的宮頸癌，HTLV誘導(dǎo)的癌癥，和EBV誘導(dǎo)的癌癥，如伯基特淋巴瘤等等。這一方法是通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物給藥如上所述的組合物完成的，其中靶多核苷酸是編碼腫瘤抗原或其功能片段的序列，或非表達(dá)調(diào)節(jié)序列，其中抗原或序列的功能是在哺乳動(dòng)物中維持腫瘤所必需的。這些序列包括，但不限于HPV 16E6和E7序列和HPV 18E6和E7序列。其它序列可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。本組合物的給藥的量是能夠有效地降低或抑制哺乳動(dòng)物中抗原的功能的量，并且優(yōu)選地利用如上所述的組合物成分，劑量和給藥途徑。本方法下面的分子機(jī)制如上所述。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以用于治療或預(yù)防細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的非病毒病原體對(duì)哺乳動(dòng)物的感染的方法中。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞內(nèi)病原體”指病毒，細(xì)菌，原蟲或其它病原體生物體，這些病原體至少部分繁殖或生命循環(huán)存在于宿主細(xì)胞中，并且在其中產(chǎn)生或?qū)е虏≡w蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。感染包括細(xì)胞內(nèi)病原體的一個(gè)生命循環(huán)時(shí)期的細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)病原體包括，但不限于利斯特氏菌，衣原體，利什曼原蟲，布魯氏菌，分枝桿菌，志賀氏菌，以及原蟲，例如，瘧疾的成因試劑，P.falciparum。細(xì)胞外病原體是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞外復(fù)制和/或繁殖的那些，例如，淋病和疏螺旋體等等。根據(jù)這一實(shí)施方案，對(duì)已經(jīng)感染或?qū)⒁c病原體接觸的哺乳動(dòng)物受試者給藥在藥理可接受載體中的如上所述的組合物和可選的第二種有助于細(xì)胞吸收多核苷酸的試劑可以治療或可能預(yù)防這樣的病原體感染。在這種情況下，組合物的RNA分子具有多核苷酸序列，該多核苷酸序列基本上與感染的哺乳動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中病原體的復(fù)制和/或致病所必需的病原體的靶多核苷酸序列同源。如上所述，給藥的組合物的量是能夠有效地降低或抑制哺乳動(dòng)物中病原體序列的功能的量。給藥的劑量，時(shí)間，途徑等等如上所述。
結(jié)合本文內(nèi)容本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地選擇病毒家族和屬，或病原體，包括原核和真核原蟲病原體以及多細(xì)胞寄生蟲，對(duì)于它們，可以制成本發(fā)明的治療性或預(yù)防性組合物。參見(jiàn)例如，常用的免疫學(xué)文章中和美國(guó)專利號(hào)5,593,972中這樣的病原體的目錄，上述文獻(xiàn)引入作為參考。
本發(fā)明的組合物和現(xiàn)有技術(shù)中可能的編碼蛋白質(zhì)的分子也可以用于本發(fā)明的另一個(gè)新的方法中。這樣的組合物可用于治療哺乳動(dòng)物的一些非病原體的疾病或紊亂，如一些癌癥或內(nèi)在的紊亂。對(duì)本發(fā)明的治療或預(yù)防特別敏感的癥狀是在存在異常的哺乳動(dòng)物的多核苷酸序列時(shí)的癥狀，這樣的多核苷酸序列的功能是啟動(dòng)紊亂或紊亂發(fā)展所必需的，這樣的紊亂可以抑制并且不會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物的健康造成危害或不利的影響。用另一句話說(shuō)，適于這一治療方法的紊亂的特征是哺乳動(dòng)物可以在該基因不起作用的情況下生存，或如果該基因的功能顯著降低了，也可以生存。在這些情況下，異常的或不正常的多核苷酸序列的功能可以被治療外源性地替代。在另一情況中，在哺乳動(dòng)物中存在不正常的多核苷酸序列或基因或它們起作用可以導(dǎo)致疾病，其中哺乳動(dòng)物也具有多核苷酸序列或基因的正?？截?，并且其中不正?；蚝驼；蛑g的差別是核苷酸序列上的差異。在這些情況中，通過(guò)本發(fā)明的方法抑制不正常多核苷酸序列的功能似乎是允許正常多核苷酸序列在沒(méi)有外源治療的情況下起作用。
所以，在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物中治療或預(yù)防癌癥的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物給藥本發(fā)明的組合物，其中靶多核苷酸序列是哺乳動(dòng)物中不正常癌癥的成因多核苷酸序列或基因。本發(fā)明的組合物的給藥量是能夠有效地降低或抑制哺乳動(dòng)物中不正常序列的功能的量。如上所述，本組合物可以含有在藥理可接受載體中的可選的第二種有助于細(xì)胞吸收多核苷酸的試劑，并且給藥的劑量，方案和途徑如上所述。
以存在不正常和正常多核苷酸序列為特征的哺乳動(dòng)物的癌癥包括慢性骨髓性白血病(CML)和急性成淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，其中不正常序列是兩個(gè)正?；虻娜诤象w，即bcr-abl，參見(jiàn)例如，1994年6月23日公開(kāi)的國(guó)際專利公開(kāi)號(hào)WO94/13793中關(guān)于這些癌癥的敘述，該專利中關(guān)于這些疾病的敘述引入作為參考。在這樣的癌癥或疾病，如CML中，患病的哺乳動(dòng)物也具有多核苷酸序列或基因的正?？截?，不正常和正常序列之間的差異在于核苷酸序列中的差異。例如，對(duì)于CML，不正常序列是bcr-abl融合體，而正常序列是bcr和abl。所以，上面的方法可以用跨越融合體的靶多核苷酸序列來(lái)實(shí)施。治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中這樣的癌癥的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物給藥本發(fā)明的組合物，其中靶多核苷酸是哺乳動(dòng)物中不正常的癌癥成因基因的多核苷酸序列，該序列也具有基因的正?？截?，并且不正?；蚝驼；蛑g的差異是多核苷酸序列中的差異。本組合物如上所述地和可選的第二種有助于細(xì)胞吸收多核苷酸的試劑在藥理可接受載體中一起給藥，給藥的量是能夠有效地降低或抑制哺乳動(dòng)物中不正常序列的功能的量。
所以，本發(fā)明包括引起治療哺乳動(dòng)物中的疾病或紊亂的上述的分子機(jī)制的方法，這些疾病或紊亂的特征是表達(dá)了健康的哺乳動(dòng)物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的不需要的多核苷酸產(chǎn)物或多核苷酸介導(dǎo)的功能，這種治療利用的是可以遞送給哺乳動(dòng)物的細(xì)胞部分雙鏈的RNA分子的組合物，這種RNA分子與表達(dá)或介導(dǎo)不需要的產(chǎn)物或功能的靶多核苷酸序列基本同源，組合物的用量是能夠降低或抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中多核苷酸的功能的量。假如該RNA分子和必需的哺乳動(dòng)物多核苷酸序列是足夠的非同源的，因此它不抑制這些必需序列的功能，那么這一方法可以明顯地看到具有許多治療和預(yù)防用途。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地選擇上述紊亂，并且容易地選擇本發(fā)明的組合物抵抗的靶多核苷酸序列。
D.本發(fā)明的其它方法如上所述的本組合物和利用這些組合物抑制或降低靶多核苷酸序列的功能的常見(jiàn)方法可以用于各種研究和體外應(yīng)用中。例如，本發(fā)明的方法可以用于研究確定細(xì)胞系或哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中選定的多核苷酸序列的功能，方法是對(duì)組織培養(yǎng)物中的細(xì)胞或?qū)υ搫?dòng)物在體內(nèi)給藥本發(fā)明的組合物，其中的RNA分子多核苷酸序列與選定的序列基本同源，并且優(yōu)選地與動(dòng)物中的其它多核苷酸序列基本上非同源。該靶序列的功能的抑制允許研究對(duì)該動(dòng)物的生物學(xué)和生理學(xué)影響。
同樣，本方法的應(yīng)用可以用于制造哺乳動(dòng)物，細(xì)菌，酵母，真菌，昆蟲和其它起源的細(xì)胞系，這些細(xì)胞系由于“沉默”了選定的功能序列，如酶序列，蛋白質(zhì)表達(dá)序列或其表達(dá)必需的調(diào)節(jié)序列而在選定的途徑中有缺陷。這樣的操作細(xì)胞可以用于常規(guī)測(cè)試或藥物篩選測(cè)試等等實(shí)驗(yàn)中。
在類似的方法中，通過(guò)改變足以永久關(guān)閉選定基因的功能的給藥劑量可以制備“敲除”實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。用與如上所述的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中待“敲除”的選定序列足夠同源的多核苷酸序列遞送RNA分子的本發(fā)明的方法提供了開(kāi)發(fā)用于藥理和遺傳學(xué)研究的“敲除”小鼠和其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的更簡(jiǎn)單的技術(shù)。
利用本組合物和本發(fā)明的方法的其它研究方法包括制備真核和原核微生物的突變體，用作微生物生產(chǎn)需要的蛋白質(zhì)的研究試劑或工業(yè)生產(chǎn)菌株。可以預(yù)期，結(jié)合本文教導(dǎo)其它用途對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
下面的實(shí)施例說(shuō)明了制備本組合物的方法，和利用本發(fā)明的組合物降低和抑制靶多核苷酸序列的方法。利用本組合物的試劑，體外合成的雙鏈RNA分子和HIV gag或HSV gD2的靶多核苷酸序列的這些實(shí)施例僅僅說(shuō)明了本發(fā)明的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在本說(shuō)明書指導(dǎo)下，我們可以容易地選擇本組合物的各種試劑，靶多核苷酸序列的特征。這些實(shí)施例是說(shuō)明性的，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1在病毒感染的細(xì)胞中降低或抑制HIVp24的功能在HIV感染期間，病毒基因組被逆轉(zhuǎn)錄為DNA模板，該模板整合到被感染的分裂中的細(xì)胞的宿主染色體?，F(xiàn)在以該整合的拷貝為藍(lán)本，制備更多的HIV顆粒。根據(jù)本發(fā)明。如果降低或抑制HIV復(fù)制和/或致病所必要的聚核苷酸序列的功能，就可以治療病毒感染。本實(shí)施例證明了本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選方案的行為。
將質(zhì)粒HIVgpt(艾滋病研究和參考試劑計(jì)劃目錄)用于產(chǎn)生穩(wěn)定整合的橫紋肌肉瘤〖RD〗或COS7細(xì)胞系，該細(xì)胞系含有缺陷HIV基因組的整合拷貝HIVgpt。HIVgpt基因組編碼替代包膜蛋白的真菌酚醛酸〖MPA〗抗性基因，從而授予對(duì)MPA的抗性。通過(guò)以質(zhì)粒感染細(xì)胞，隨后在MPA中選擇細(xì)胞制備細(xì)胞系?？寺U(kuò)增對(duì)MPA有抗性的細(xì)胞。然后利用p24ELISA測(cè)試盒〖Coulter公司〗在p24〖胞外分泌的HIVgag多肽〗存在下測(cè)試培養(yǎng)了克隆擴(kuò)增的細(xì)胞的培養(yǎng)基。所有細(xì)胞是p24陽(yáng)性。
將兩個(gè)RD細(xì)胞系和COS7細(xì)胞系用于證實(shí)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，即降低或抑制控制這些細(xì)胞中p24合成的HIVp24靶多聚核苷酸的功能。
為了制備本發(fā)明的試劑，將位置安排到HIV毒株HXB2的gag基因的相同位點(diǎn)并且缺乏一個(gè)帽的一個(gè)600多核苷酸〖nt〗有義RNA，一個(gè)600nt反義RNA，一個(gè)600bp雙鏈RNA〖dsRNA〗，一個(gè)多聚腺苷化序列，和一個(gè)天然的起始密碼子用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過(guò)攜帶噬菌體T7聚合酶啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物在一個(gè)末端轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA分子〖參見(jiàn)附圖1A和1B〗。引物的位置來(lái)源于HIV〖HXB2〗的整個(gè)基因組的遺傳圖，Genbank登記號(hào)K03455〖參見(jiàn)L.Rather等人，人反錄病毒艾滋病的研究3〖1〗57-69〖1987〗〗。正向gag引物映射到位點(diǎn)901-924并且在T7正向gag引物中該序列跟隨在T7啟動(dòng)子之后。反向gag引物映射到位點(diǎn)1476-1500并且在T7反向gag引物中該序列跟隨在T7啟動(dòng)子之后。
為了制備其中試劑為單鏈有義RNA的本發(fā)明的組合物，該單鏈T7啟動(dòng)子定位于正向PCR引物的5’末端。將PCR引物用于制備編碼ss有義RNA的DNA模板，其中從5’到3’鏈的頂端底下劃線的為T7啟動(dòng)子，T7正向引物gag〖SEQ IDNO1〗是5’CTAATACGACTCACTATAGGGCGGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAG3’和反向gag引物〖SEQ ID NO2〗5’GTGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTC3’為了制備其中試劑為單鏈反義RNA分子的組合物，將T7啟動(dòng)子定位于反向PCR引物的5’末端。這些引物是T7反向引物gag〖SEQ ID NO3〗5’GTAATACGACTCACTATAGGGCGCTGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTC3’和正向gag引物〖SEQ ID NO4〗5’GCAGGAGCTAGAACGATTCGCAG3’。
在T7轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中包括上面描述的兩種類型的PCR產(chǎn)物以產(chǎn)生其中試劑是雙鏈RNA分子的組合物?；蛘?，通過(guò)在轉(zhuǎn)錄之后將有義和反義RNA混合在一起制備本發(fā)明的組合物的試劑。
從單純皰疹病毒的gD基因衍生類似大小的有義RNA，反義RNA，和dsRNA分子作為對(duì)照，通過(guò)相同的PCR和T7轉(zhuǎn)錄技術(shù)產(chǎn)生2型基因組。HSVgD的PCR引物的定位來(lái)源于Genbank入藏號(hào)K01408，HSVgD2基因的遺傳圖。正向gD引物映射到313-336；該序列跟隨T7正向gD引物的T7啟動(dòng)子之后。反向gD引物映射到位置849-872，跟隨T7反向gD引物的T7啟動(dòng)子之后。用于產(chǎn)生這些對(duì)照分子的引物組是T7正向gD引物〖SEQ ID NO5〗5’GTAATACGACTCACTATAGGGCGGTCGCGGTGGGACTCCGCGTCGTC3’和正向gD引物〖SEQ ID NO6〗5’GTCGCGGTGGACTCCGCGTCGTC3’和T7反向gD引物〖SEQ ID NO7〗5’GTAATACGACTCACTATAGGGCGGTGATCTCCGTCCAGTCGTTTATC3’和反向gD引物〖SEQ ID NO8〗5’GTGATCTCCGTCCAGTCGTTTATC3’。
如下所述用RD和COS7細(xì)胞系分析本發(fā)明的RNA分子和上面描述的對(duì)照分子將六孔平板上的每孔5-6×105個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)到約80-90％匯合，并且用10微升lipofectamine(Gibco-BRL)作為轉(zhuǎn)染試劑用2-3微克的選定的RNA分子或?qū)φ辗肿愚D(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)1-17小時(shí)的時(shí)間。用范圍為1微克到500微克的劑量的RNA轉(zhuǎn)染另一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物，不用已知轉(zhuǎn)染劑傳遞并且在細(xì)胞上培養(yǎng)0.5分鐘到約2天。例如用有義gagRNA轉(zhuǎn)染一個(gè)組的細(xì)胞，用反義gagRNA轉(zhuǎn)染另一組，用dsgagRNA轉(zhuǎn)染另一組，用有義gDRNA對(duì)照轉(zhuǎn)染另一組，用反義gDRNA對(duì)照轉(zhuǎn)染另一組，用ds gagRNA對(duì)照轉(zhuǎn)染另一組。其他的陰性對(duì)照細(xì)胞也沒(méi)有接受RNA分子。
在37℃培養(yǎng)細(xì)胞并且在幾個(gè)星期的過(guò)程中檢測(cè)p24的合成。在RNA給藥2天之后，通過(guò)利用p24 ELISA測(cè)試盒測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)基中的p24和通過(guò)利用兔多克隆抗-p24血清〖Intracell公司〗和FITC-耦合的抗-兔IgG〖Sigma〗免疫染色細(xì)胞的p24，每星期對(duì)細(xì)胞測(cè)試3次。
根據(jù)本發(fā)明，沒(méi)有g(shù)D RNA分子顯示具有能夠阻止或抑制p24的合成的能力。但是根據(jù)本發(fā)明ds gag RNA抑制或下調(diào)p24的合成。預(yù)期有義和反義RNA分子僅僅引起中等的對(duì)p24的合成的抑制作用，除非這些RNA能夠形成一定程度的雙鏈。
實(shí)施例2測(cè)定一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物到另一個(gè)的p24合成的降低程度為了證實(shí)下調(diào)信號(hào)轉(zhuǎn)移到還沒(méi)有下調(diào)的細(xì)胞，本實(shí)施例證實(shí)在沒(méi)有試劑轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物中降低/抑制作用〖即對(duì)p24合成的抑制或降低〗轉(zhuǎn)移到細(xì)胞。
A.COS7和RD細(xì)胞的共培養(yǎng)將證實(shí)p24合成降低的實(shí)施例1的培養(yǎng)物的細(xì)胞與以前沒(méi)有與RNA分子培養(yǎng)的細(xì)胞的對(duì)照細(xì)胞共培養(yǎng)，事實(shí)上以野生型水平合成p24。根據(jù)本發(fā)明，以前轉(zhuǎn)染的細(xì)胞將靶多核苷酸功能抑制轉(zhuǎn)移到未感染細(xì)胞，共培養(yǎng)物中對(duì)照細(xì)胞的特征在于p24合成的降低。
為了將對(duì)照細(xì)胞與培養(yǎng)物中以前感染的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)，第一方案如下所述以各種比例的細(xì)胞類型例如比例范圍從1/1000到1/10〖COS7/RD〗將證實(shí)p24合成的抑制的實(shí)施例1的COS7細(xì)胞與以野生型水平表達(dá)p24的未感染RD細(xì)胞共培養(yǎng)到6孔平板中總數(shù)為6-7×105細(xì)胞。在實(shí)施例1例舉的條件下培養(yǎng)2天之后，檢測(cè)培養(yǎng)物中RD細(xì)胞的p24的合成。每星期檢測(cè)細(xì)胞約3次，共3星期。
采用2種方法分析p24的合成。在第一種方法，利用p24 ELISA測(cè)試法〖Coulter〗測(cè)試共培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中p24的合成。在第二種方法，利用抗p24的兔多克隆血清〖Intracell公司〗和偶合到FITC的抗兔IgG對(duì)細(xì)胞的p24進(jìn)行染色。由于COS7和RD細(xì)胞的形態(tài)是不同的，所以損失了染色的RD細(xì)胞易于與COS7細(xì)胞區(qū)分。由于COS7細(xì)胞表達(dá)T抗原，而RD細(xì)胞不表達(dá)，利用抗SV40 T抗原的鼠單克隆血清〖Pharmagen公司〗和偶合到r-藻紅蛋白〖PE〗的抗鼠IgG也可以染色共培養(yǎng)細(xì)胞的T Ag。在這些條件下僅僅COS7細(xì)胞染色。采用熒光顯微鏡或采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞的染色。
通過(guò)與僅僅含有RD細(xì)胞的對(duì)照培養(yǎng)物相比時(shí)共培養(yǎng)的RD細(xì)胞中FITC染色的損失證實(shí)共培養(yǎng)時(shí)RD細(xì)胞中p24功能的抑制。用FITC或PE不染色共培養(yǎng)物中RD細(xì)胞是實(shí)施例1的RNA分子〖特別是dsRNA分子〗降低或抑制p24靶多核苷酸的p24合成功能的證據(jù)。
B.將未轉(zhuǎn)染的RD細(xì)胞與轉(zhuǎn)染的RD細(xì)胞一起培養(yǎng)在第二個(gè)方案中，將已證實(shí)降低了p24的產(chǎn)生的實(shí)施例1的轉(zhuǎn)染的RD細(xì)胞與已經(jīng)被加工為含有整合了潮霉素抗性基因并且表達(dá)正常水平的p24的未轉(zhuǎn)染的RD細(xì)胞以不同的細(xì)胞比例，如范圍為1/1000到1/10〖RD/對(duì)照RD〗在6孔平板中共培養(yǎng)到細(xì)胞總數(shù)為6-7×105。按如下所述制備抗潮霉素的RD細(xì)胞在六孔平板中將RD細(xì)胞〖5-6×105細(xì)胞〗培養(yǎng)到80-90％的匯合并且用含有在胸苷激酶〖TK〗啟動(dòng)子的潮霉素抗性基因的2.5微克的pCEP4〖Invitrogen公司〗的Nru 1-SalI片段轉(zhuǎn)染。利用轉(zhuǎn)染劑，lipofectamine(Gibco BRL)完成轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染2天之后，在400微克/毫升潮霉素存在下培養(yǎng)細(xì)胞?？寺U(kuò)增抗性細(xì)胞。將克隆擴(kuò)增的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞系用作為試驗(yàn)的對(duì)照。
在實(shí)施例1的條件下共培養(yǎng)1天到幾星期之后，復(fù)制的共培養(yǎng)物與400微克/毫升的潮霉素培養(yǎng)。潮霉素的濃度殺死對(duì)潮霉素有抗性的RD細(xì)胞，僅僅留下對(duì)RD細(xì)胞有抗性的RD細(xì)胞。剩余的抗性細(xì)胞來(lái)源于對(duì)照細(xì)胞。例如利用實(shí)施例1的ELISA以及如上所述的免疫染色直接從對(duì)照細(xì)胞測(cè)量P24水平。
根據(jù)本發(fā)明，在至少一組對(duì)照細(xì)胞中證明對(duì)P24的產(chǎn)生有抑制。
實(shí)施例3采用本發(fā)明的方法體內(nèi)抑制內(nèi)源性白細(xì)胞介素-12的產(chǎn)生A設(shè)計(jì)RNA分子作為本發(fā)明的組合物在本實(shí)驗(yàn)中所有的RNA分子的長(zhǎng)度接近600nts，并且將所有的RNA分子設(shè)計(jì)為不能產(chǎn)生IL-12的p40鏈。該分子沒(méi)有帽并且沒(méi)有poly-A-序列；不存在天然的起始密碼子，RNA不編碼全長(zhǎng)的產(chǎn)物。設(shè)計(jì)了下面的RNA分子〖1〗與IL-12p40鼠信使mRNA同源的單鏈〖ss〗有義RNA多核苷酸序列；〖2〗與IL-12p40鼠mRNA互補(bǔ)的單鏈反義RNA多核苷酸序列；〖3〗由有義和反義IL-12p40鼠mRNA多核苷酸序列組成的雙鏈〖ds〗RNA分子，〖4〗與IL-12p40鼠異源RNA〖hnRNA〗同源的單鏈有義RNA多核苷酸序列；〖5〗與IL-12p40鼠hnRNA互補(bǔ)的單鏈反義RNA多核苷酸序列，〖6〗由有義和反義IL-12p40鼠hnRNA多核苷酸序列組成的雙鏈RNA分子，
〖7〗與IL-12p40啟動(dòng)子的頂端鏈同源的單鏈?zhǔn)驲NA多核苷酸序列；〖8〗與IL-12p40啟動(dòng)子的底端鏈同源的單鏈?zhǔn)驲NA多核苷酸序列；〖9〗由與IL-12p40啟動(dòng)子的頂端鏈和底端鏈同源的鼠RNA多核苷酸序列組成的雙鏈RNA分子。
作為陰性對(duì)照，還使用了來(lái)源于實(shí)施例1描述的HSV2gD基因的有義，反義和dsRNA。另一個(gè)對(duì)照組由沒(méi)有接受RNA的鼠組成。
如實(shí)施例1所述，通過(guò)一個(gè)末端攜帶T7啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物的T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生各種〖1〗-〖9〗的RNA分子。即當(dāng)需要有義RNA時(shí)，T7啟動(dòng)子定位于正向PCR引物的5’末端。當(dāng)需要反義RNA時(shí)，T7啟動(dòng)子定位于反向PCR引物的5’末端。當(dāng)需要dsRNA時(shí)，T7轉(zhuǎn)錄反應(yīng)包括兩種類型的PCR產(chǎn)物?；蛘?，在轉(zhuǎn)錄之后將有義和反義RNA一起混合。
在本實(shí)施例中用于構(gòu)建RNA分子的PCR引物是T7啟動(dòng)子的頂端鏈為底下劃線的5’到3’。正向IL-12基因組〖hn RNA〗〖SEQ ID NO9〗5’TCAGCAAGCACTTGCCAAACTCCTG3’和反向IL-12基因組〖hn RNA〗〖SEQ ID NO10〗5’GAGACAAGGTCTCTGGATGTTATTG3’；T7正向IL-12基因組〖hn RNA〗〖SEQ ID NO11〗5’GTAATACGACTCACTATAGGGTCAGCAAGCACTTGCCAAACTCCTG3’和T7反向IL-12基因組〖hn RNA〗〖SEQ ID NO12〗5’GTAATACGACTCACTATAGGGGAGACAAGGTCTGGATGTTATTG3’；T7正向IL-12啟動(dòng)子〖SEQ ID NO13〗5’GTAATACGACTCACTATAGGGCCTATAAGCATAAGAGAGACGCCCTC3’；正向IL-12啟動(dòng)子〖SEQ ID NO14〗5’CCTATAAGCATAAGAGAGACGCCCTC3’；反向IL-12啟動(dòng)子〖SEQ ID NO15〗5’GGCTGCTCCTGGTGCTTATATAC3’；和T7反向IL-12啟動(dòng)子〖SEQ ID NO16〗5’GTAATACGACTCACTATAGGGGGCTGCTCCTGGTGCTTATATAC3’；T7正向IL-12cDNA(mRNA)〖SEQ ID NO17〗5’GTAATACGACTCACTATAGGGTGTGTCCTCAGAAGCTAACCATC3’和正向IL-12cDNA(mRNA)〖SEQ ID NO18〗5’TGTGTCCTCAGAAGCTAACCATC3’和反向IL-12cDNA(mRNA)〖SEQ ID NO19〗5’GCAGGTGACATCCTCCTGGCAGGA3’和T7反向IL-12cDNA(mRNA)〖SEQ ID NO20〗5’GTAATACGACTCACTATAGGGGCAGGTGACATCCTCCTGGCAGGA3’。
基因組和PCR引物的位置是基于下面提供的遺傳圖Tone等人，歐洲免疫學(xué)雜志，261222-1227(1996)。正向IL-12基因組引物的遺傳圖定位到8301-8325。反向IL-12基因組引物遺傳圖定位到8889-8913。正向IL-12啟動(dòng)子引物定位到83-106。反向IL-12啟動(dòng)子引物定位到659-682。(CDNA)PCR引物的位置基于GenBank入藏號(hào)M86671。正向IL-12cDNA引物定位到36-58。反向IL-12cDNA引物定位到659-682。
C.測(cè)試將Balb/C小鼠〖5個(gè)小鼠/組〗用上面描述的小鼠p40鏈特異性RNA或上面定義的對(duì)照以10微克到500微克范圍的劑量肌內(nèi)或腹膜內(nèi)的注射。血清是每隔4天從小鼠搜集，共3個(gè)星期并且利用Quantikine M-IL-12p40 ELISA測(cè)試法〖Genzyme〗分析IL-12p40的鏈水平。
根據(jù)本發(fā)明，接受來(lái)源于IL-12mRNA，IL-12和IL-12 hnRNA的ds DNA分子和來(lái)源于IL-12啟動(dòng)子的dsRNA的小鼠證實(shí)IL-12的產(chǎn)生降低或抑制。除非RNA分子具有形成雙鏈的某些水平的能力，在接受來(lái)源于RNA分子的單鏈IL-12的小鼠的血清中觀察到中等的抑制作用。預(yù)期沒(méi)有HSV gD衍生的RNA可以以特定的方式體內(nèi)降低或抑制IL-12。
實(shí)施例4本發(fā)明的方法用于預(yù)防疾病A.體外測(cè)試在37℃，在加了10％FBS的DMEM中在6孔平板上培養(yǎng)以20-30％匯合的密度接種的Vero和/或BHK細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞是80-90％匯合時(shí)，用如上面實(shí)施例1所說(shuō)的2-3微克的HIVgag和HSV gD-特異性RNA分子，利用lipofectamine(Gibco BRL)作為轉(zhuǎn)染劑轉(zhuǎn)染。在沒(méi)有已知轉(zhuǎn)染劑存在下用范圍為5微克到100微克的劑量釋放RNA分子。另一組細(xì)胞沒(méi)有接受RNA。
用如上面實(shí)施例1所說(shuō)的2-3微克的雙鏈DNA質(zhì)粒，質(zhì)粒24，如引入本文作為參考的美國(guó)專利5851804描述的，類似地轉(zhuǎn)染其他另一組Vero和/或BHK細(xì)胞，所述的質(zhì)粒含有編碼處于HCMV啟動(dòng)子和SV40多A序列控制下的HSV2 gD蛋白質(zhì)的序列。
在37℃在添加了10％FBS的DMEM中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染之后1，2，4和7天，以0.1的感染復(fù)數(shù)〖MOI〗在250微升DMEM的接種劑中用HSV2感染細(xì)胞。允許接種劑吸收1小時(shí)，之后每孔加入2毫升的DMEM〖10％FBS〗。對(duì)于在轉(zhuǎn)染之后感染4和7天的那些細(xì)胞，將細(xì)胞傳遞到新的六孔平板，以便在感染時(shí)匯合，如果細(xì)胞沒(méi)有傳代，將會(huì)變得過(guò)分擁擠。
在感染之后36-48小時(shí)，通過(guò)用常規(guī)噬菌體和Vero細(xì)胞測(cè)試分析細(xì)胞裂解物的病毒效價(jià)〖臨床病毒學(xué)手冊(cè)，第2版，S.Specter和G.Lancz，第473-94頁(yè)〖1992〗〗。根據(jù)本發(fā)明，用雙鏈DNA質(zhì)粒，APL-400-024，和用含有g(shù)D2的抗原的多核苷酸的雙鏈RNA分子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不能用HSV2重復(fù)感染。引入的所有其他細(xì)胞被HSV2重復(fù)感染。
B.體內(nèi)測(cè)試?yán)貌痪哂挟a(chǎn)生HSVg-D蛋白質(zhì)的實(shí)施例1描述的HSV-gD-特異性RNA分子和HIVgag-特異性RNA分子作為對(duì)照，通過(guò)利用本發(fā)明的注射的HSVgD特異性RNA分子評(píng)價(jià)小鼠抵抗HSV攻擊的保護(hù)作用。
將Balb/C小鼠〖5個(gè)小鼠/組〗用上面描述的RNA分子以10微克到500微克范圍的劑量肌內(nèi)或腹膜內(nèi)免疫注射。在RNA注射之后1，2，4和7天，以HSV-2〖在30微升中105pfu〗陰道內(nèi)接種攻擊小鼠。HSV-2接種之后每天，觀察小鼠的感染信號(hào)并且評(píng)價(jià)為0-4的等級(jí)。O為沒(méi)有感染信號(hào)；1代表紅色；2代表泡和紅色；3代表泡，紅色和失禁；和4代表麻痹。
根據(jù)本發(fā)明，由于證明接受了含有HSVgD序列的本發(fā)明的雙鏈分子的小鼠對(duì)攻擊有抵抗作用。而接受HIVgag對(duì)照RNA分子的小鼠沒(méi)有保護(hù)作用。預(yù)期接受了含有HSVgD序列的單鏈RNA分子的小鼠獲得最小的保護(hù)作用或沒(méi)有保護(hù)作用，除非這些分子具有體內(nèi)至少部分變成雙鏈的能力。根據(jù)本發(fā)明，由于本發(fā)明的雙鏈RNA分子不具有產(chǎn)生HSVgD蛋白質(zhì)的能力，由RNA分子釋放到動(dòng)物提供的保護(hù)是由于非免疫介導(dǎo)的基因特異性的機(jī)制。
所有上面提到的公開(kāi)文獻(xiàn)引入本文作為參考。在上面的說(shuō)明書中包括本發(fā)明的許多修飾和變化并且預(yù)期對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。據(jù)信本發(fā)明的組合物和方法的這樣的修飾和改變包括在權(quán)利要求定義的范圍內(nèi)。
序列表<110>美國(guó)家用產(chǎn)品公司(American Home Products Corporation)C.帕楚克(Pachuk，Catherine)C.薩蒂斯錢德蘭(Satishchandran，C.)<120>抑制多核苷酸序列功能的方法和組合物<130>AHP28APCT<140><141><150>60/130,377<151>1999-04-21<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明T7正向gag引物<400>1gtaatacgac tcactatagg gcggcaggga gctagaacga ttcgcag 47<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明反向gag引物<400>2ctgctatgtc acttcccctt ggttc 25<210>3<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明T7反向gag引物<400>3gtaatacgac tcactatagg gcgctgctat gtcacttccc cttggttc 48<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明正向gag引物<400>4gcagggagct agaacgattc gcag24<210>5<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明T7正向gD引物<400>5gtaatacgac tcactatagg gcggtcgcgg tgggactccg cgtcgtc 47<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明正向gD引物<400>6gtcgcggtgg gactccgcgt cgtc24<210>7<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明T7反向gD引物<400>7gtaatacgac tcactatagg gcggtgatct ccgtccagtc gtttatc 47<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明反向gD引物<400>8gtgatctccg tccagtcgtt tatc24<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明正向IL-12基因組<400>9tcagcaagca cttgccaaac tcctg 25<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明反向IL-12基因組<400>10gagacaaggt ctctggatgt tattg 25<210>11<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明T7正向IL-12基因組<400>11gtaatacgac tcactatagg gtcagcaagc acttgccaaa ctcctg46<210>12<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明T7反向IL-12基因組<400>12gtaatacgac tcactatagg ggagacaagg tctctggatg ttattg46<210>13<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明T7正向IL-12引物<400>13gtaatacgac tcactatagg gcctataagc ataagagacg ccctc 45<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明正向IL-12啟動(dòng)子<400>14cctataagca taagagacgc cctc24<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明反向IL-12啟動(dòng)子<400>15ggctgctcct ggtgcttata tac 23<210>16<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明T7反向IL-12啟動(dòng)子<400>16gtaatacgac tcactatagg gggctgctcc tggtgcttat atac 44<210>17<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明T7正向IL-12cDNA<400>17gtaatacgac tcactatagg gtgtgtcctc agaagctaac catc 44<210>18<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明正向IL-12cDNA<400>18tgtgtcctca gaagctaacc atc 23<210>19<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明反向IL-12cDNA<400>19gcaggtgaca tcctcctggc agga24<210>20<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明T7反向IL-12cDNA<400>20gtaatacgac tcactatagg ggcaggtgac atcctcctgg cagga 4權(quán)利要求
1.在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制靶多核苷酸序列的功能的組合物，其中所述的組合物包括給哺乳動(dòng)物細(xì)胞提供至少部分雙鏈的RNA分子的試劑，所述RNA分子不產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)，并且包括至少約200個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的多核苷酸序列，所述的多核苷酸基本上與靶多核苷酸序列同源，并且與選定的天然存在的基本的哺乳動(dòng)物多核苷酸序列不同源。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述RNA分子的所述多核苷酸序列的至少11個(gè)連續(xù)核苷酸為雙鏈序列，數(shù)量取決于所述的組合物的核苷酸序列和約-9.2kcal/mol的ΔG。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中整個(gè)所說(shuō)RNA分子的核苷酸序列基本上是雙鏈。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所說(shuō)的RNA分子的核苷酸序列具有與所述的靶多核苷酸序列精確同源的至少約12到約16個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，所述其中RNA分子多核苷酸序列與所述的靶序列之間的整體同源性大于10％。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述的同源性大于約50％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的試劑是由在體外通過(guò)酶促合成方法或化學(xué)合成方法制備的RNA分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的試劑是可以通過(guò)從重組微生物或生產(chǎn)所述的微生物的培養(yǎng)基分離體外制備的RNA分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的試劑在釋放到所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞之后體內(nèi)產(chǎn)生所述的RNA分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的試劑是雙鏈RNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的試劑是單鏈RNA有義鏈。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述的單鏈RNA有義鏈在一個(gè)或兩個(gè)末端或兩個(gè)末端的中間形成發(fā)夾。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述的單鏈有義RNA鏈本身回折或變成部分雙鏈。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的試劑是單鏈RNA反義鏈。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述的單鏈RNA反義鏈在一個(gè)或兩個(gè)末端或兩個(gè)末端的中間形成發(fā)夾。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述的單鏈RNA反義鏈本身回折變成部分雙鏈。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的試劑是含有有義多核苷酸序列和反義多核苷酸序列的單鏈RNA序列，可選地被非堿基配對(duì)多核苷酸序列分開(kāi)，該單鏈RNA序列具有變成雙鏈的能力。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的試劑是可形成桿狀結(jié)構(gòu)的環(huán)狀RNA分子。
18.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述的試劑是編碼所述的RNA分子的雙鏈DNA分子。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述的DNA編碼雙鏈RNA。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述的DNA編碼單鏈RNA有義鏈。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述的DNA編碼在一個(gè)或兩個(gè)末端或其中間形成發(fā)夾的單鏈RNA有義鏈。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述的DNA編碼本身回折變成部分雙鏈的單鏈RNA有義鏈。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述的DNA編碼單鏈RNA反義鏈。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述的DNA編碼在一個(gè)或兩個(gè)末端或其中間形成發(fā)夾的單鏈RNA反義鏈。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述的DNA編碼本身回折變成部分雙鏈的單鏈RNA有義鏈。
26.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述的DNA編碼包括有義多核苷酸序列和反義多核苷酸序列的單鏈RNA序列，可選地被非堿基配對(duì)多核苷酸序列分開(kāi)，該單鏈RNA序列具有變成雙鏈的能力。
27.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述的DNA編碼可形成桿狀結(jié)構(gòu)的環(huán)狀RNA分子。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的試劑是質(zhì)粒。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的試劑包括編碼單鏈RNA有義多核苷酸序列的第一DNA質(zhì)粒和編碼單鏈RNA反義多核苷酸序列的第二DNA質(zhì)粒，其中所述的有義和反義RNA分子具有堿基配對(duì)和變成雙鏈的能力。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，其中所述的質(zhì)粒包括細(xì)菌序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的試劑是重組細(xì)菌。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的試劑是重組病毒。
33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的試劑是用權(quán)利要求2-32任一項(xiàng)描述的分子體外轉(zhuǎn)染的供體細(xì)胞。
34.根據(jù)權(quán)利要求30到32任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的試劑選自活的重組病毒或細(xì)菌或細(xì)胞，死病毒或細(xì)菌或細(xì)胞，或失活的病毒或細(xì)菌或細(xì)胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的試劑缺乏多腺苷化序列。
36.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的RNA分子沒(méi)有被轉(zhuǎn)譯。
37.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的試劑缺乏Kozak區(qū)域。
38.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的試劑缺乏起始甲硫氨酸密碼子。
39.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的RNA分子缺乏帽結(jié)構(gòu)。
40.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的試劑缺乏用于蛋白質(zhì)合成的信號(hào)。
41.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，包括不同的所述的試劑的混合物。
42.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的靶多核苷酸是感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的所述的病毒的復(fù)制和/或致病必需的病毒多核苷酸序列。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其中所述的病毒選自于DNA病毒和具有中間DNA階段的病毒。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的組合物，其中所述的病毒選自逆病毒，皰疹病毒，嗜肝DNA病毒，痘病毒，細(xì)小病毒，乳頭瘤病毒和乳多空病毒。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述的病毒選自HIV，HBV，HSV，CMV，HPV，HTLV和EBV。
46.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的靶多核苷酸序列是腫瘤抗原或其功能片段或病毒誘導(dǎo)的癌的調(diào)節(jié)序列，該抗原或序列是保持所說(shuō)的腫瘤在所述的哺乳動(dòng)物內(nèi)所需要的。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的組合物，其中所述的癌癥選自HPV E6/E7病毒誘導(dǎo)的子宮頸癌，HTLV-誘導(dǎo)的癌癥和EBV誘導(dǎo)的癌癥。
48.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的靶多核苷酸是感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的所述的病原體的復(fù)制和/或致病所必需的胞內(nèi)或胞外病原體的多核苷酸序列。
49.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的靶多核苷酸序列是哺乳動(dòng)物中引起不正常的癌癥的序列的多核苷酸序列，所述的哺乳動(dòng)物也具有所述的序列的正常拷貝，其中不正常序列和正常序列之間的不同是多核苷酸中的不同。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的組合物，其中所述的異常序列是兩個(gè)正?；虻娜诤?。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的組合物，其中所述的靶多核苷酸是跨越所述的融合的多核苷酸序列。
52.藥物組合物，包括權(quán)利要求1-51任一項(xiàng)所述的組合物和可選的第二種有助于細(xì)胞吸收多核苷酸的試劑，以及藥物學(xué)可接受載體。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的組合物，其中所述的第二試劑選自局部麻醉劑，肽，脂，包括正離子脂，脂質(zhì)體或脂顆粒，聚陽(yáng)離子，分支的，三維的聚陽(yáng)離子，碳水化合物，陽(yáng)離子親脂性分子，去垢劑，芐基銨鹽表面活性劑，或另一個(gè)有助于多核苷酸傳遞到細(xì)胞的化合物。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的組合物，其中所述的第二試劑是布比卡因。
55.治療哺乳動(dòng)物的病毒感染的方法，包括給所述的哺乳動(dòng)物提供有效地降低或抑制哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中的病毒序列的功能的量的藥物學(xué)可接受的載體中的權(quán)利要求1所述的組合物，或者還提供第二種有助于細(xì)胞吸收多核苷酸的試劑，其中靶多核苷酸是感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的病毒的復(fù)制和/或致病所必需的病毒多核苷酸序列。
56.預(yù)防哺乳動(dòng)物的病毒感染的方法，包括在將所述的病毒導(dǎo)入到所述的哺乳動(dòng)物后給所述的哺乳動(dòng)物提供有效地降低或抑制所述病毒序列的功能的量的藥物學(xué)可接受的載體中的權(quán)利要求1所述的組合物，或者還提供第二種有助于細(xì)胞吸收多核苷酸的試劑，其中靶多核苷酸是感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的病毒的復(fù)制和/或致病所必需的病毒多核苷酸序列。
57.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中病毒誘導(dǎo)的癌癥的方法，包括給所述的哺乳動(dòng)物提供有效地降低或抑制哺乳動(dòng)物中所述抗原的功能的量的藥物學(xué)可接受載體中的權(quán)利要求1所述的組合物，或者還含有有助于細(xì)胞吸收多核苷酸的可選的第二種試劑，其中靶多核苷酸是編碼腫瘤抗原，調(diào)節(jié)序列或其功能片段的序列，該抗原或序列的功能是哺乳動(dòng)物中維持腫瘤所需要的。
58.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的胞內(nèi)或胞外病原體感染的方法，包括給所述的哺乳動(dòng)物給藥能夠有效地降低或抑制哺乳動(dòng)物中該序列的功能的量的藥物學(xué)可接受的載體中的權(quán)利要求1所述的組合物，或者還包括第二種有助于細(xì)胞吸收多核苷酸的試劑，其中靶多核苷酸是感染的哺乳動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的病原體的復(fù)制和/或致病所必需的所述病原體的多核苷酸序列。
59.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的癌癥的方法，包括給所述的哺乳動(dòng)物給藥能夠有效地降低或抑制哺乳動(dòng)物中不正常序列的功能的量的藥物學(xué)可接受的載體中的權(quán)利要求1所述的組合物，或者還包括第二種有助于細(xì)胞吸收多核苷酸的試劑，其中靶多核苷酸是是哺乳動(dòng)物中引起癌癥的不正常的序列的多核苷酸序列，哺乳動(dòng)物同時(shí)還具有該序列的正常拷貝，并且其中不正常序列和所述正常序列的不同是多核苷酸的不同。
60.治療哺乳動(dòng)物中的疾病或紊亂的方法，包括對(duì)特征是表達(dá)了健康的哺乳動(dòng)物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的多核苷酸產(chǎn)物的疾病或紊亂的哺乳動(dòng)物給藥有效地降低或抑制哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中靶多核苷酸產(chǎn)物的功能的量的藥物學(xué)可接受的載體中的權(quán)利要求1所述的組合物，其中靶多核苷酸序列是表達(dá)該多核苷酸產(chǎn)物或該產(chǎn)物的表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)序列的多核苷酸序列。
61.權(quán)利要求1所述的組合物在制備治療哺乳動(dòng)物病毒感染的藥物中的用途，所述的組合物或者還含有有助于細(xì)胞吸收的第二試劑并且在藥物學(xué)可接受的載體中，其中所述的靶多核苷酸是感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中所述的病毒的復(fù)制和/或致病所必需的病毒的多核苷酸序列。
62.權(quán)利要求61所述的用途，其中所述的組合物是能夠降低或抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中所述病毒序列的功能的量。
63.根據(jù)權(quán)利要求61所述的用途，其中所述的組合物的量可以在所述的病毒導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞之后降低或抑制所述的病毒序列的功能。
64.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物在制備治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中病毒誘導(dǎo)的癌癥的藥物中的用途，所述的組合物或者還含有有助于細(xì)胞吸收的第二試劑并且在藥物學(xué)可接受的載體中，其中所述的靶多核苷酸是編碼腫瘤抗原，調(diào)節(jié)序列或其功能片段的序列，該抗原或序列的功能是哺乳動(dòng)物中維持腫瘤所需要的，其應(yīng)用的量為有效的降低或抑制哺乳動(dòng)物中所述的抗原的功能。
65.權(quán)利要求1所述的組合物用于制備治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外病原體感染的藥物中的用途，所述的組合物還含有可選的有助于病原體或哺乳動(dòng)物細(xì)胞吸收多核苷酸的第二種試劑，并且在藥物學(xué)可接受的載體中，其中所述的靶多核苷酸是感染的哺乳動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中所述的病原體復(fù)制和/或致病所必需的所述的病原體的多核苷酸序列，該組合物的量是有效地降低或抑制所述的哺乳動(dòng)物的所述的序列的功能的量。
66.權(quán)利要求1所述的組合物用于制備治療或預(yù)防浦乳動(dòng)物癌癥的藥物的用途，所述的組合物還含有可選的有助于病原體或哺乳動(dòng)物細(xì)胞吸收多核苷酸的第二種試劑，并且在藥物學(xué)可接受的載體中，其中所述的靶多核苷酸是引起哺乳動(dòng)物中異常癌癥的序列的多核苷酸序列，并且所述的哺乳動(dòng)物也具有所述的序列的正?？截?，并且其中的異常序列和正常序列之間的不同是多核苷酸的不同，該組合物的量是有效地降低或抑制所述的哺乳動(dòng)物的所述的異常序列的功能的量。
67.權(quán)利要求1所述的組合物的應(yīng)用，其中所述的靶多核苷酸是表達(dá)所述的多核苷酸產(chǎn)物或一種在健康的哺乳動(dòng)物中不存在的多核苷酸產(chǎn)物的表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)序列，該組合物的量是有效地降低或抑制所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的所述的靶多核苷酸產(chǎn)物的功能的量，用于制備治療或預(yù)防特征為表達(dá)所述的產(chǎn)物的哺乳動(dòng)物的疾病或紊亂的藥物。
全文摘要
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制靶多核苷酸序列的治療性組合物,它包括給哺乳動(dòng)物細(xì)胞至少提供部分雙鏈的RNA分子的試劑,所述RNA分子包括至少約200個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的多核苷酸序列,所述的多核苷酸基本上與靶多核苷酸序列同源。這一RNA分子如人所愿地不生產(chǎn)功能性蛋白質(zhì)。組合物中利用的試劑可以是在體外的酶學(xué)合成方法或化學(xué)合成方法中生成的;或微生物重組培養(yǎng)物中生成和從中分離的RNA分子,或可替代地可以在遞送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中后在體內(nèi)生產(chǎn)需要的RNA分子。在治療或預(yù)防病毒感染,其它病原體感染或一些癌癥的方法中,這些組合物以能夠有效地減少或抑制靶多核苷酸序列的功能的量給藥,而在除其它起源外靶多核苷酸可能是病原體起源的或應(yīng)答腫瘤或其它癌癥產(chǎn)生的。
文檔編號(hào)A61K47/22GK1375004SQ00806369
公開(kāi)日2002年10月16日 申請(qǐng)日期2000年4月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月21日
發(fā)明者C·帕楚克, C·薩蒂斯錢德蘭 申請(qǐng)人:惠氏公司