專利名稱：用于關節(jié)軟骨愈合和修復的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及組織修復領域，具體地說，涉及穩(wěn)定的功能性關節(jié)軟骨修復再生。因此，本發(fā)明可以用于整復外科或用于關節(jié)軟骨再生或修復的其它方法。
背景技術：
關節(jié)軟骨損傷的修復仍是當前矯形外科學的一個挑戰(zhàn)。目前的幾種治療策略基于軟骨組織和骨軟骨組織的移植。自體骨軟骨移植提供了最合適的生理材料。然而，供體組織是有限的，通常需要在第二個部位接受手術，以獲得用于移植的組織。因此，盡管在該領域進行了相當大的努力，但仍需要一種關節(jié)軟骨缺損和損傷修復的有效方法，提供適當?shù)纳硇迯?，而不需要從患者收集自體組織。
發(fā)明概述本發(fā)明提供用于合乎生理要求的功能性組織修復再生的方法和組合物，用于修復關節(jié)軟骨損傷和缺損。具體地說，本發(fā)明包括治療關節(jié)軟骨損傷或缺損患者的方法。本發(fā)明的方法和組合物的優(yōu)點是它們利用骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，所述蛋白已知具有骨發(fā)生和/或軟骨發(fā)生特性，并且可以通過重組DNA技術來生產，因此具有可能無限的供應。本發(fā)明的方法和組合物的另一優(yōu)點是可以加速功能性關節(jié)軟骨的再生，或功能性關節(jié)軟骨的再生可能具有更大的最終強度和穩(wěn)定性，并且在缺損或損傷部位形成的組織是合乎生理要求的。
應用BMP增進關節(jié)軟骨缺損和損傷的修復可能產生更好的骨關節(jié)炎治療方法，因此避免、延遲或減小對人工髖關節(jié)置換和其它常用干涉的需要。臨床前評估表明，rhBMP-2改善了兔子關節(jié)軟骨全厚度缺損的早期愈合。
發(fā)明詳述按照本發(fā)明，提供用于治療患有某些形式的關節(jié)軟骨損傷或缺損的患者的方法和組合物。所述損傷可能是急性壓迫的結果、或諸如由于參加體育運動或可能撕裂、擦傷或者傷害關節(jié)軟骨的意外發(fā)生所引起的損傷。
所述方法和組合物的優(yōu)點是修復或改善關節(jié)軟骨缺損、特別是全厚度關節(jié)軟骨缺損。其它缺損也可以用本發(fā)明的方法和組合物治療，特別是加上使所述缺損部位進一步加重以便到達作為基礎的軟骨下骨的另一種方法。
在本發(fā)明中，將活性生長因子例如一種BMP加入合適的組織源中。所述組織源或者可以是該患者自體的骨軟骨移植物，或者可以包含同種移植物或人工制備的組織。在一個優(yōu)選實施方案中，所述組織源可以是軟骨細胞的細胞培養(yǎng)物，例如已經通過離體細胞培養(yǎng)法、并且加入或不加入額外的生長因子制備的軟骨細胞或干細胞培養(yǎng)物。例如，參見US5226914、US581 1094、US5053050、US5486359、US5786217和US5723331的說明書。所有這些申請的說明書均通過引用結合到本文中。
所述組織也可以用傳統(tǒng)的基于非細胞培養(yǎng)的方法獲得，采用例如鑲嵌成形術(mosaicplasty)的技術，其中用市售的儀器例如Acufex7[Smith和Nephew，Inc.，Andover MA]、COR系統(tǒng)[InnovasiveTechnologies，Marlborough MA]或Arthrex7骨軟骨自體移植物轉移系統(tǒng)[Arthrex，Munich，德國]收集軟骨。所獲得的組織可以直接用于本發(fā)明方法中，或可以與上述基于組織的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)相結合。
生長因子用于本發(fā)明中的活性生長因子最好來自通常稱為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的蛋白亞類，它們已經被公開為具有骨發(fā)生、軟骨發(fā)生和其它生長和分化類型的活性。這些BMP包括rhBMP-2、rhBMP-3、rhBMP-4(也稱為rhBMP-2B)、rhBMP-5、rhBMP-6、rhBMP-7(rhOP-1)、rhBMP-8、rhBMP-9、rhBMP-12、rhBMP-13、rhBMP-15、rhBMP-16、rhBMP-17、rhBMP-18、rhGDF-1、rhGDF-3、rhGDF-5、rhGDF-6、rhGDF-7、rhGDF-8、rhGDF-9、rhGDF-10、rhGDF-11、rhGDF-12、rhGDF-14。例如在美國專利5,108,922、5,013,649、5,116,738、5,106,748、5,187,076和5,141,905中公開的BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-7；在PCT說明書WO91/18098中公開的BMP-8；和在PCT說明書WO93/00432中公開的BMP-9、在美國專利5,637,480中公開的BMP-10、在美國專利5,639,638中公開的BMP-11、或在美國專利5,658,882中公開的BMP-12或BMP-13、在美國專利5,635,372中公開的BMP-15以及在共同待審的專利申請序號08/715,202中公開的BMP-16。也可能有用的其它組合物包括Vgr-2和任何生長分化因子(GDF)，包括在PCT申請WO94/15965、WO94/15949、WO95/01801、WO95/01802、WO94/21681、WO94/15966、WO95/10539、WO96/01845、WO96/02559和其它申請中公開的那些因子。在本發(fā)明中也有用的是在WO94/01557中公開的BIP、在JP公布號7-250688中公開的HP00269和在PCT申請WO93/16099中公開的MP52。所有這些申請的說明書均通過引用結合到本文中。上述蛋白和修飾的蛋白或其部分缺失產物的異二聚體也可用于本發(fā)明。這些蛋白可以單獨地使用，或作為兩種或更多種蛋白的混合物使用，最好使用rhBMP-2。
BMP可以重組產生，也可以從蛋白組合物中純化。所述BMP可以是同二聚體，或者可以是與其它BMP的異二聚體(例如由BMP-2和BMP-6各一個單體組成的異二聚體)或與TGF-β超家族其它成員例如活化素、抑制素和TGF-β1的異二聚體(例如由一種BMP和一種TGF-β超家族的相關成員各一個單體組成的異二聚體)。這類異二聚體蛋白的實例描述于例如公開的PCT專利申請WO93/09229中，其說明書通過引用結合到本文中。此中有用的骨發(fā)生蛋白的量是有效刺激浸潤性祖細胞的骨發(fā)生活性增加的量，這將取決于待治療的缺損的大小和性質、以及使用的載體。一般而言，待傳遞的蛋白量范圍為約0.05mg至約1.5mg。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述骨發(fā)生蛋白與能夠誘導腱樣組織或韌帶樣組織形成的有效量的蛋白一起給予。這類蛋白包括BMP-12、BMP-13和BMP-12亞家族的其它成員以及MP52。這些蛋白及其在腱樣組織和韌帶樣組織再生方面的應用公開于1994年12月22日申請的美國申請序號08/362,670中，其說明書通過引用結合到本文中。在另一優(yōu)選實施方案中，按照下述方法，給予其中一種單體單位是一種骨發(fā)生蛋白例如BMP-2、而另一種單體亞單位是腱誘導蛋白例如BMP-12的一種異二聚體，以誘導結締組織和骨之間形成功能連接。
生長因子的應用生長因子可以以緩沖液的形式應用于組織源。一種優(yōu)選的緩沖液是除包含所述活性生長因子外還包括約1.0至約10.0％(w/v)甘氨酸、約0.1至約5.0％(w/v)糖最好是蔗糖、約1至約20mM谷氨酸鹽酸鹽和任選的約0.01至約0.1％非離子表面活性劑例如多乙氧基醚的組合物。優(yōu)選的溶液是約1％至約20％w/v纖維素載體/緩沖液。如有需要，可以加入一種鹽。
可適用于本發(fā)明方法和組合物中的生長因子應用方面的其它材料包括透明質酸、手術用網(wǎng)或縫線、polyglyconate、溫度敏感聚合物、脫礦質骨、礦物質和陶瓷，例如磷酸鈣、羥基磷灰石等，以及上述材料的組合。然而在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中不使用載體。
在例如上述的適當緩沖液中或者與合適的載體組合的本發(fā)明的生長因子，可以直接應用于需要組織修復的組織和/或部位。例如，所述生長因子可以通過噴霧或浸漬、或用刷或其它合適的涂藥器例如注射器，物理應用于所述組織?；蛘?，或另外，可以將所述蛋白直接應用于需要組織修復的部位。
以下實施例用BMP-2進一步描述本發(fā)明實施方案的實施。所述實施例不是限制性的，正如本領域技術人員將認識到的，可以根據(jù)上述具體描述而變化。
實施例I.兔同種移植物所有步驟均由IACUC批準進行。使用12只雄性新西蘭白兔(6月齡)。2只兔子作為供體，10只兔子用作受體。從供體的滑車溝(trochlear groove)或股骨中髁獲得骨軟骨移植物(直徑為3.5mm)，將其移植到受體滑車溝中3.5mm深的缺損中。在移植之前，將移植物或者浸入rhBMP-2(0.5 mg/ml)中或者浸入緩沖液對照中。手術后4周處死兔子，如Sellers等，J.Bone Joint Surg.，79-A1452-1463(1997)描述的，通過組織學的組織化學分級標準，評估移植物和周圍組織。也進行組織切片的計算機控制圖象分析。用非成對Students t檢定評估結果。
肉眼檢查時，關節(jié)未顯示出炎癥體征。所有缺損均充填修復組織。缺損的表面外觀是可變的，但是可接受的，并且與處理形式無關。在3個關節(jié)(實驗組中有2個，對照緩沖液組中有1個)中發(fā)現(xiàn)骨贅。
在任何缺損的肉眼檢查外觀和組織學外觀之間沒有關聯(lián)。在供體軟骨陷窩中軟骨細胞的存在和細胞的散在克隆表明該組織存活。供體軟骨的局灶性退化在對照組的所有兔子中均存在，但僅在rhBMP-2處理組中的1只兔子中存在。rhBMP-2處理組中缺損的愈合與對照組相比顯著增加。rhBMP-2處理組的骨整合(bony integration)改善，表現(xiàn)為軟骨下骨腔隙中纖維性修復組織較少。用rhBMP-2處理也導致高于原始潮痕(tidemark)的軟骨更多，明顯地由供體組織和新再生的受體軟骨兩者組成。在這兩組之間觀察到的骨總量沒有顯著差異。
表I軟骨修復的組織學計分和組織形態(tài)測定的測量結果，平均值(SD)
*與對照有統(tǒng)計學顯著差異(p＜0.05)。
**標準系統(tǒng)范圍為0(正常軟骨)至31(未修復)。
另一組織形態(tài)測定分析數(shù)據(jù)進一步支持rhBMP-2對移植物愈合的有益效應。例如，已經表明，高于潮痕的新組織在rhBMP-2處理組充填的百分比為81.52％，而在對照中為57.63％。在rhBMP-2處理組中(23.83％)移植物軟骨退化比對照組(44.52％)少。移植物或新形成的軟骨與宿主軟骨的整合在rhBMP-2處理組(56.48％)中比對照組(21.89％)有所改善。在rhBMP-2的影響下，或者在移植物邊緣或者在移植物頂部形成更新的軟骨，在移植物邊緣，這消除了移植物和宿主之間的間隙，而在移植物頂部，使得移植物與關節(jié)表面更好地融合。
上述結果表明，關節(jié)軟骨缺損中的同種異體骨軟骨移植物的愈合由于加入rhBMP-2而得到改善。所述活性生長因子可能加速了軟骨下骨的愈合，為關節(jié)軟骨組織提供支持和營養(yǎng)。生長因子的加入也可能刺激了骨髓和/或滑膜組織中由受體間質干細胞形成新的軟骨。這些結果表明，活性生長因子特別是骨形態(tài)發(fā)生蛋白和骨軟骨同種移植物的組合可能提供用于治療關節(jié)軟骨缺損、特別是全厚度關節(jié)軟骨缺損的有效策略。II.兔自體移植物從兔子的滑車溝或股骨髁獲得骨軟骨移植物(直徑為2.7mm，長3.0mm)，將其移植到該兔子的滑車溝或膝關節(jié)的股骨髁上寬2.7mm、長3.5mm的供體部位中。在移植之前將緩沖液滴加到一半動物的所述受體部位，然后將該移植物浸入緩沖液中2分鐘，然后置于受體部位中。在移植之前將51μg rhBMP-2滴加到另一半動物的受體部位，然后將該移植物浸入含500μg/ml rhBMP-2的緩沖液中2分鐘，然后移植到受體部位中。手術后4周處死動物，用組織學的組織化學分級標準[Sellers等，J.Bone Joint Surg.，79-A1452-63(1997)]和組織的定量計算機控制圖象分析，對受體部位進行組織評價。數(shù)據(jù)表明，用rhBMP-2處理改善了自體移植物的愈合。最突出的效應是移植物軟骨退化減少(rhBMP-2的8.18％對對照的36.25％)以及移植物邊緣形成更多的軟骨(rhBMP-2的88.23％對對照的50％)。III.非人類靈長類自體移植物用于自體移植物實驗的非人類靈長類是南美彌猴(cynomologousmacaques)。從6只南美彌猴的滑車溝收集骨軟骨移植物(3.5mm直徑×6mm長)，將其移植到鉆入同一動物(總共n＝12移植物)的股骨中髁和股骨側髁中的受體部位。在移植之前，將25μg rhBMP-2滴入6個受體部位，然后將來自那6個移植物的移植物浸入1.25mg/ml rhBMP-2的溶液中達2分鐘。在另外6個移植物中，僅將緩沖液滴入受體部位，并且在移植之前將移植物浸入單獨的緩沖液中2分鐘。手術后用石膏固定肢體達2周，手術后9周將動物處死。
所有動物的膝關節(jié)功能均正常。肉眼檢查時，關節(jié)沒有顯示出炎癥體征。在任一關節(jié)中沒有發(fā)現(xiàn)骨贅。雖然在肉眼檢查時缺損表面看來與周圍軟骨齊平，但顯微鏡觀察表明，在大多數(shù)情況下移植物下沉。肉眼觀察到的覆蓋表面的組織實際上是在移植物頂部新形成的組織。由不知情的評價人員進行計算機控制圖象分析，以對缺損充填百分比、形成的高于原始潮痕的新組織類型以及移植物和周圍的軟骨整合進行定量。在rhBMP-2處理組的所有這些參數(shù)中，均觀察到良好結果。在移植物和宿主軟骨之間形成更新的軟骨，消除了間隙，導致移植物與周圍軟骨之間更好地整合(rhBMP-2 88.59％對對照64.82％)。在rhBMP-2處理組(95.02％)中軟骨缺損的充填比對照組(86.68％)要好。在對照組中有更多的纖維組織(11.90％對rhBMP-2的5.65％)，而在rhBMP-2處理組中發(fā)現(xiàn)更多的過度型組織(36.38％對對照20.53％)。兩組之間在總體組織學的組織化學計分上沒有顯著差異。外周定量計算機控制斷層掃描術(pQCT)表明，隨著時間的推移在供體部位中骨密度增加。手術后6周和9周時，與對照部位相比，用rhBMP-2處理的供體部位中的組織明顯更為致密，愈合過程更為提前。在組織學上，在所有情況下供體部位都含有再生的骨小梁與表面的纖維組織。IV.rhBMP-2的活體外保留用來自非人類靈長類的移植物，評價采用該技術的rhBMP-2在骨軟骨移植物的保留。將移植物浸入125I標記的rhBMP-2和未標記的rhBMP-2的混合物溶液中。結果表明，被吸收到移植物中的rhBMP-2的量與該蛋白的濃度以及浸泡時間成比例。影響rhBMP-2保留的其它因素包括移植物的大小和骨小梁之間骨髓成分的存在。V.rhBMP-2的體內保留時程在兔子中評價rhBMP-2在骨軟骨移植物中的保留時程。在移植之前，將含有5ug rhBMP-2和20 uCi125I的125I標記的rhBMP-2和未標記的rhBMP-2的混合物溶液加樣至移植物上。在手術后繼續(xù)的22天時間內，用γ-攝像機掃描所述動物。與用膠原蛋白海綿作為載體的時程相比，rhBMP-2在骨軟骨移植物中的半衰期從1天增至3天。10％的起始點放射性的保持從膠原蛋白海綿的11天變?yōu)橐浦参锏?2天。VI.非人類靈長類同種移植物從12只成年南美彌猴的滑車溝取出供體部位(3.5mm寬×6mm長)，并將其移植到非相關個體的股骨中髁和側髁中的3.5×6mm的受體部位中。在移植之前，將一半的移植物浸泡在1.25mg/ml rhBMP-2中2分鐘，而將另一半移植物在緩沖液中浸泡。在首次手術后7周，對另一肢體實施同樣的步驟。在每次手術后，手術后以石膏(in a cast)固定肢體2周，在第二次手術后9周處死動物，用于組織學分析。
這些結果表明，活性生長因子(特別是骨形態(tài)發(fā)生蛋白)和骨軟骨自體移植物的組合，可能提供一種治療關節(jié)軟骨缺損、特別是全厚度關節(jié)軟骨缺損的有效的策略。在其它實施方案中，也將BMP-2應用于冷凍的骨軟骨同種移植物，用于治療局灶性關節(jié)軟骨缺損。
上述描述詳細說明了本發(fā)明目前優(yōu)選的實施方案。預計本領域技術人員在考慮這些描述時，會想到本發(fā)明實施中的許多修改和變化。那些修改和變化被認為包括在所附權利要求書中。
權利要求
1.一種再生關節(jié)軟骨的方法，包括給予需要再生所述關節(jié)軟骨的區(qū)域至少一種純化的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)。
2.一種再生關節(jié)軟骨的方法，包括給予需要再生所述關節(jié)軟骨的區(qū)域與至少一種純化的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)聯(lián)合的一種合適的組織源。
3.權利要求1的方法，其中所述BMP是BMP-2。
4.權利要求2的方法，其中所述BMP是BMP-2。
5.一種再生關節(jié)軟骨的方法，包括給予需要再生所述關節(jié)軟骨的區(qū)域至少一種選自Vgr-2、生長分化因子(GDF)和BIP的純化蛋白。
6.權利要求1的方法，還包括一種誘導腱樣組織或韌帶樣組織形成的蛋白。
7.權利要求6的方法，其中所述誘導腱樣組織或韌帶樣組織形成的蛋白選自BMP-12亞家族的BMP-12、BMP-13成員和MP52。
8.一種用于再生關節(jié)軟骨的組合物，所述組合物包含至少一種純化的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)。
9.一種用于再生關節(jié)軟骨的組合物，所述組合物包含與至少一種純化的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)聯(lián)合的一種合適的組織源。
10.權利要求8的組合物，其中所述BMP是BMP-2。
11.權利要求9的組合物，其中所述BMP是BMP-2。
12.一種用于再生關節(jié)軟骨的組合物，所述組合物包含至少一種選自Vgr-2、生長分化因子(GDF)和BIP的純化蛋白。
13.權利要求8的組合物，還包括一種誘導腱樣組織或韌帶樣組織形成的蛋白。
14.權利要求13的組合物，其中所述誘導腱樣組織或韌帶樣組織形成的蛋白選自BMP-12亞家族的BMP-12、BMP-13成員和MP52。
全文摘要
提供涉及所述組織(例如骨軟骨移植物)與活性生長因子組合的用于治療關節(jié)軟骨缺損和疾病的方法和組合物。所述活性生長因子最好是含有至少一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白和一種合適載體的組合物。所述方法導致關節(jié)軟骨組織功能性修復的再生。
文檔編號A61L27/22GK1345251SQ00805538
公開日2002年4月17日 申請日期2000年1月31日 優(yōu)先權日1999年2月1日
發(fā)明者R·張, D·佩盧索, E·莫里斯 申請人:遺傳研究所有限公司