前列腺素類化合物、組合物和治療外周血管疾病和肺動脈高壓的方法

專利名稱：前列腺素類化合物、組合物和治療外周血管疾病和肺動脈高壓的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及修飾的前列腺素類化合物，尤其涉及其用于治療外周血管疾病和肺動脈高壓的含長效前列腺素的組合物。
前列腺素類物質包括前列環(huán)素，它是一種由機體產(chǎn)生的前列腺素類似物并且涉及維持血管的正常功能。天然前列環(huán)素生來并不穩(wěn)定，其有效壽命短于約6分鐘。包括前列環(huán)素類在內的前列腺素類物質似乎通過三種途徑維護血管正常發(fā)揮機能，1)它們擴張血管，在必要時，確保適當?shù)难鳎?)它們防止血小板聚集；和3)其參與調節(jié)血管周圍平滑肌細胞的增殖，否則將收縮血管且阻礙血液流動。
某些血管疾病的特征在于血管壁內層的降解、血小板聚集和平滑肌細胞機能的破壞。這些病癥導致血管阻塞，并且影響它們提供無阻礙血液流動流經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)的能力。包括一種或多種上述病癥的疾病是外周血管疾病和肺動脈高壓。雖然各疾病影響著特定區(qū)域的血管，但這兩種疾病的特征均在于血管縮小，其中血管不期望地收縮，致使血流減少，導致血壓和血管阻力增高。另外，這些疾病表現(xiàn)出減少產(chǎn)生天然前列腺素類物質如前列環(huán)素。
肺動脈高壓是一種進行性的、威脅生命的血管疾病，難以診斷和治療，目前無法治愈。其特征在于使心臟和肺之間的血管(稱作肺部血管)內的血壓增高，但機體其它部位的血壓正常。這種高血壓是由肺部血管的變窄引起。一種情況是和受影響血管內前列環(huán)素生產(chǎn)的減少相吻合。
肺動脈高壓通常引起心臟右側勞損，因為心臟把血液泵到肺內。早期肺動脈高壓的患者通常不知道他們患有這種疾病。然而，隨著疾病的進行，患者感到呼吸困難、昏厥發(fā)作等，使他難于進行正常的日常活動?；加形粗委熗砥诜蝿用}高壓的患者常常致殘并且可能死于心衰。
傳統(tǒng)上，肺動脈高壓被認為由兩種不同的情況組成原發(fā)性肺動脈高壓和繼發(fā)性肺動脈高壓。原發(fā)性肺動脈高壓被定義為不具有可識別具體病因的肺動脈高壓。繼發(fā)性被定義為具有已知病因如心臟、肺或肝臟機能障礙或硬皮病(一種結締組織的疾病)的肺動脈高壓。此處所用術語“肺動脈高壓”包括原發(fā)性和繼發(fā)性肺動脈高壓。
成千上萬的美國人已被診斷出患有原發(fā)性肺動脈高壓，同時更多的人被確診為患有晚期繼發(fā)性肺動脈高壓。按照1989年″Chest″(胸科醫(yī)師美國學會的官方出版物)中所公開的報告，在美國男子人群中肺動脈高壓在年齡為35至44之間的男性中的流行率為8％至13％。它還報導，在年齡為65至更高年齡的男子中肺動脈高壓的流行率超過20％。原發(fā)性肺動脈高壓和晚期繼發(fā)性肺動脈高壓對前列環(huán)素的存在表現(xiàn)出應答。
當肺系統(tǒng)外的血管和淋巴血管受到影響時，這種病癥一般被稱作外周血管疾病。此類疾病包括但不限于缺血性腦血管疾病、動靜脈瘺、缺血性腿部潰瘍、靜脈炎、靜脈機能不全、壞疽、肝腎綜合征、非開放性導管動脈骨化、非阻塞性腸系膜局部缺血、動脈炎淋巴管炎等。然而，人們還不了解外周血管疾病的準確原因，糖尿病、肥胖、動脈粥樣硬化、吸煙、缺乏鍛煉和心血管病常常和這種疾病有關。在這種疾病的早期，患者首先沒有癥狀，隨后在步行時感到輕度到重度的疼痛。隨著該疾病惡化，患者在靜止時感到腿部疼痛，并且創(chuàng)傷愈合延遲，有時會導致潰瘍、壞疽和截肢。晚期外周血管疾病患者的平均存活期約為6年。
外周血管疾病在美國影響著約6百萬人。另外，美國每年確診出約350,000新的外周血管疾病的病例。外周血管疾病也對前列腺素、包括前列環(huán)素的存在有應答。
前列腺素類物質可以用于治療人體中的外周血管疾病和肺動脈高壓，因為他們通過防止不期望的血管狹窄對血液流動產(chǎn)生積極作用。然而，許多前列腺素及其包括前列環(huán)素在內的類似物具有非常短的有效壽命，因此需要不斷地和持久地治療以便向患者提供有效治療。迄今為止，前列腺素類物質及其類似物的應用在外周血管疾病和肺動脈高壓的治療中嚴重受限制，這歸因于其化學不穩(wěn)定性、短的有效壽命和有限的給藥方式。
前列腺素類物質的短的有效壽命歸因于a)分子的活性基團在酶的作用下迅速失活，和b)其低分子量使它們易于被清除或排泄到體外。
前列腺素類物質具有一般為羥基或羧基形式的活性位點。酶可以迅速將這些活性基團滅活，由此使化合物失效。為了克服這個問題，一直采用連續(xù)輸注或頻繁給予高劑量的前列腺素類化合物使該化合物在患者中保持在治療有效水平。然而，這樣的給藥方案是不利的，因為療法昂貴，并且意外副作用的可能性相對較高。一些副作用包括惡心、腫脹、胃腸道不適、頜疼、皮疹和頭痛。在某些患者中，嚴重的副反應致使治療中斷。
多數(shù)前列腺素類物質及其類似物如前列環(huán)素業(yè)已被制備，目的在于發(fā)現(xiàn)能夠提供較高穩(wěn)定性、更寬范圍的給藥方式、更有效的活性和/或較長有效壽命的藥學上可接受的試劑。研究人員已經(jīng)尋找到可以經(jīng)口服有效給藥的前列腺素類物質及其類似物，提供更少介入和更方便的醫(yī)藥治療。前列腺素類物質及其類似物的現(xiàn)有口服形式一般具有至多1.5小時的有效壽命，并且在某些情況中僅為數(shù)分鐘。短的有效壽命要求患者頻繁攝取該藥物，致使給藥成為患者的難題，尤其對于患有慢性疾病的那些患者。
已有建議說生物活性物質如蛋白質、酶等和聚合物的偶聯(lián)能夠提高活性物質在體內的有效壽命、水溶性和抗原性。譬如，美國專利No.4,179,337公開了將肽或多肽與聚乙二醇(PEG)和類似的水溶性聚醚類化合物偶聯(lián)，該文獻在此引入作為參考。還可以參見，NucciM.，ShorrRGL&Abuchowski A.，″Advanced Drug Delivery Reviews″，6133-1511991；Harris JM(ed.)；和″Polyethylene Glycol ChemistryBiotechnicaland Biomedical Application″，Plenum Press，NY，1992。一般通過治療劑與如數(shù)倍摩爾過量的聚合物反應可以制成偶聯(lián)物，所述聚合物業(yè)已改性為含有末端連接基團，該連接基團確保活性物質與聚合物結合。以這種方式改性的多肽表現(xiàn)出降低了的免疫原性/抗原性，并且趨于在血流中具有比其未改性形式更長的有效壽命。
為了使聚醚和活性物質偶聯(lián)，至少一個末端羥基被轉化為反應性官能團。這個過程常常被稱作“活化”并且產(chǎn)物稱作“活化聚醚”。按照類似方法也可以“活化”或“官能化”其它基本上無抗原性的聚合物。
活化聚合物與具有親核性官能團作為連接位點的治療劑反應。一種常用作連接位點的親核性官能團是賴氨酸的ε-氨基。游離羧基、適當活化的羰基、氧化的糖基部分和巰基也可以用作連接位點。
在聚合物和母體生物活性部分之間可以形成具有可水解鍵(鍵合)的生物活性聚合物偶聯(lián)物，成為前藥(其中在體內最終釋放出母體分子)。業(yè)已公開了數(shù)種制備前藥的方法。前藥包括生物活性母體化合物的化學衍生物，其在給藥時最終將活性母體化合物釋放在體內。前藥是適宜的，因為它們確保了生物活性化合物在體內作用的啟動和/或持續(xù)時間的改進。前藥常常是活性化合物的生物上惰性或基本上失活的形式?；钚运幬锏尼尫潘俾适艿饺舾梢蛩氐挠绊?，包括連接生物活性化合物和前藥載體(如聚合物)的連接基的水解速率。
雖然前列腺素及其類似物如前列環(huán)素有希望作為治療劑，但需要a)提高此類化合物的穩(wěn)定性，b)延長此類化合物的有效壽命，和c)確保此類化合物能夠以更加適宜患者而不是目前所采用的給藥方案給藥。
因此，如果可以開發(fā)出前列腺素類物質及其類似物和采用它們的組合物，使其具有改進的穩(wěn)定性、持續(xù)時間足以確保以合理次數(shù)給藥的有效壽命和以更適宜患者而不是現(xiàn)有療法采用前列腺素及其類似物的方式，那將是藥物治療領域中的顯著進步，尤其對于外周血管疾病和肺動脈高壓的治療而言。
本發(fā)明提供用于治療外周血管疾病和肺動脈高壓的化合物、組合物和所述化合物和組合物的給藥方法。本發(fā)明的化合物具有提高了的化學穩(wěn)定性和有效壽命，在溫血動物中其改進了所述化合物以藥學可接受組合物形式用于治療外周血管疾病和肺動脈高壓的釋放。通過修飾已知前列腺素化合物的一個或多個活性位點可以獲得改進的穩(wěn)定性、有效壽命和更可接受的給藥方式和劑量方案。
因此，本發(fā)明的一個方面中，本發(fā)明的前列腺素類化合物或其類似物的一個或多個活性位點提供減慢化合物代謝速率的藥學可接受基團。代謝速率的減慢使活性化合物的有效壽命增長，其a)提供更有效的活性化合物的給藥，和b)確保更適宜患者的給藥方案。
在本發(fā)明的另一方面中，提供一種治療表現(xiàn)肺動脈高壓和/或外周血管疾病的溫血動物的方法，包括給予該動物治療有效量的本發(fā)明的經(jīng)修飾前列腺素類化合物及其類似物。
本發(fā)明的另一方面中，提供具有下式Ia或Ib的化合物[P-T]n-Z IaP-[T-Z]nIb其中P是前列腺素類化合物或其類似物，T表示P的修飾活性基團，Z是和T鍵合的減慢該化合物代謝速率的藥學可接受基團；和n是至少1的整數(shù)；及其藥學可接受鹽。
圖4表示一個劑量的mPEG20kDa-酯-化合物X作為靜脈內快速濃注給藥對綿羊肺部動脈血壓的影響，該綿羊肺動脈高壓是由靜脈內給予肺動脈高壓劑引起；和圖5表示mPEG5kDa-酯-化合物X和天然化合物X以氣溶膠的形式給藥對各綿羊的肺部動脈血壓的影響，綿羊的肺動脈高壓是由靜脈內給予肺動脈高壓劑引起。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及新的前列腺素類化合物及其類似物，其中至少一個活性位點連接在惰性、無抗原性、無免疫原性的基團上，該基團具有當對溫血動物(包括人)給藥時保護該活性位點的結構，由此使該化合物具有較長的有效壽命。因此，更多的化合物在更長的時間內通過處理靶向區(qū)域(例如患病組織和血管區(qū)域，如肺動脈)來有效治療血管疾病。由于利用了更多的活性化合物，給藥方案可以減輕患者的負擔。此處所用術語″有效壽命″是指本發(fā)明化合物在溫血動物中以其活性形式存在的持續(xù)時間。
至少一個活性基團的保護一般可以增加前列腺素化合物的有效壽命，使它們比天然或未保護形式的前列腺素類化合物更加適合不同的給藥方式。
此處所用術語″前列腺素化合物及其類似物″在下文中將總稱為″前列腺素類化合物″，是指所有前列腺素類化合物及其變型，它們具有至少一個活性基團(例如COOH和/或OH)并且至少最小限度地對溫血動物中的外周血管疾病和肺動脈高壓有效。此處所用術語″本發(fā)明前列腺素化合物″是指所定義的前列腺素化合物，其具有本發(fā)明所述的修飾。此處所用術語″活性基團″是指前列腺素化合物上的位點，其能夠結合或與靶向組織(如血管組織)反應。
本發(fā)明包括所用種類的本發(fā)明前列腺素(PG)化合物。例如，本發(fā)明采用的本發(fā)明前列腺素類化合物包括修飾的PGA、PGB、PGC、PGD、PGE、PGF和PGI類化合物以及上述的亞類。前列腺素類化合物可以分離或提取自溫血動物原料或利用所屬領域普通技術人員已知的方法合成制得。
優(yōu)選的本發(fā)明前列腺素類化合物由結構式II表示 其中Z1和Z2獨立地選自氫和之前在結構式I中為Z定義的基團，條件是Z1和Z2中的至少一個不是氫；和X選自O或NH。
更加優(yōu)選的結構式II的化合物是第1、2和3組定義如下的化合物，其中對于第1組的化合物Z1是和X結合并減慢該化合物的代謝速率的藥學可接受聚合物；和X選自O和NH，和Z2選自H和乙?；?；對于第2組的化合物Z1是氫；
X是O，和Z2是減慢該化合物的代謝速率并且通過酯基連接于氧的藥學可接受聚合物；和對于第3組化合物Z1是第1組定義的藥學可接受聚合物；X是O或NH，和Z2是第2組定義的、經(jīng)酯基連接于氧的藥學可接受聚合物。
優(yōu)選的化合物還是結構式III表示的化合物 其中Z1和Z2包括如上面結構式II定義的相同基團；f是1至3的整數(shù)；X選自O和NH；和R選自氫和烷基，優(yōu)選具有1-6個碳原子。
更加優(yōu)選的結構式III的化合物是第4、5和6組的化合物，其中對于第4組的化合物Z1是和X結合并減慢該化合物的代謝速率的藥學可接受聚合物；X選自O和NH，和Z2選自氫和乙?；粚τ诘?組的化合物
Z1是氫，X是O，和Z2是乙?；?，或減慢該化合物的代謝速率并且經(jīng)酯基或醚基連接于氧的藥學可接受聚合物；對于第6組的化合物Z1第4組定義的藥學可接受聚合物，X選自O和NH，和Z2是如第5組定義的藥學可接受聚合物。
非常優(yōu)選的化合物是那些其中Z1和/或Z2基團是具有結構式CH3OCH2CH2(OCH2CH2)a的聚乙二醇，其中a是1至約1000。
特別優(yōu)選的本發(fā)明前列腺素類化合物是那些具有結構式IV的化合物 其中a和X定義如上。優(yōu)選a是約6至600，首選是約6至460。
本發(fā)明還涉及一種患有包括外周血管疾病和/或肺動脈高壓在內的血管疾病的溫血動物的治療方法，包括給予該溫血動物有效量的結構式I的化合物。含有所述化合物的適合以上述目的施用給溫血動物的組合物是本發(fā)明的一部分。
外周血管疾病的特征在于流向腿部和足部的血液減少，同時局部缺血。噬斑在血管內襯層上的沉積和主動脈的逐步增厚和硬化是這種疾病的特征。器質性外周血管疾病還伴隨著炎癥和組織損傷。慢性輕度至重度的疼痛、可動性的喪失、壞疽、缺血性潰瘍、創(chuàng)傷延遲愈合和失去四肢通常與外周血管疾病有關。
肺動脈高壓的特征在于肺內血管狹窄和肺動脈血壓危險性增高。內皮細胞和平滑肌細胞之間的異常相互作用引起平滑肌收縮是這種疾病的特征。器質性肺動脈高壓還伴隨著炎癥和組織損傷引起瘢痕組織，其進一步使血管變狹窄并且使血管壁增厚。慢性輕度至重度疼痛、可動性的喪失、最終心衰和死亡與肺動脈高壓有關。
這兩種血管疾病的特征在于血管的異常縮小引起血流減少和血管阻力增高。向患有外周血管疾病的患者施用本發(fā)明的前列腺素類化合物，可以促進增加血液流經(jīng)患病血管，由此增強局部缺血組織的氧合作用。此外，本發(fā)明前列腺素類化合物的抗血小板聚集和細胞保護活性必然能夠通過抑制炎癥反應來促使損傷組織愈合。
關于肺動脈高壓，本發(fā)明前列腺素類化合物可以引發(fā)血管擴張，導致肺內小動脈中平滑肌的松弛，降低舒張血壓，預防血凝塊的形成，并且逆轉肺內的瘢痕。這些作用聯(lián)合引起肺動脈壓和肺部血管阻力大幅度降低。此外，在外周血管疾病的情況中，本發(fā)明前列腺素類化合物的固有抗血小板聚集和細胞保護活性還能夠通過抑制炎癥反應來促使損傷組織愈合。
在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明前列腺素類化合物的一個或多個活性基團(例如COOH和OH)連接于惰性、非抗原性和非免疫原性的直鏈、支鏈和/或環(huán)狀聚合物和共聚物。此外，聚合物必須能夠以適合將本發(fā)明前列腺素轉運至溫血動物的靶向區(qū)域的速率與本發(fā)明的前列腺素類化合物分離。對于任何聚合物保持連接在前列腺素化合物的程度，其應不對外周血管疾病和肺動脈高壓的治療產(chǎn)生不良影響。
為了使前列腺素和聚合物如聚醚偶聯(lián)，聚合物的一個或多個羥基被轉化為能夠進行偶聯(lián)反應的反應性官能團。
活化聚合物與前列腺素類化合物反應，由此連接優(yōu)先發(fā)生在游離羧基和/或羥基上。如果可利用或被利用在前列腺素類化合物上，適當?shù)幕罨驶?、氧化的碳水化合物部分和巰基也可以用作偶聯(lián)位點。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面中，羧基或羥基和活化聚醚之間形成酰胺或酯鍵。聚合物被尿烷形成鍵或類似的鍵活化，并且使聚合物易于經(jīng)羧基或其它基團連接于前列腺素化合物的其它官能團也屬于本發(fā)明。
在基本上非抗原性聚合物中，聚醚類化合物(PAO)尤其是單活化的、以烷基為末端的聚醚如聚乙二醇類(PEG)和尤其是以單甲基為末端的聚乙二醇類(mPEG)。雙活化聚醚也被考慮用來交聯(lián)前列腺素化合物或提供連接其它部分(如靶向試劑)的方式使聚合物-前列腺素偶聯(lián)物定位在靶向區(qū)域內，如肺或肢體血管內。
適合的聚合物、尤其是PEG或mPEG基本上在重量上有所改變。本發(fā)明一般采用分子量為約200至約80,000道爾頓的聚合物。優(yōu)選分子量約2,000至42,000道爾頓，并且特別優(yōu)選分子量約5,000至28,000道爾頓。
本發(fā)明優(yōu)選作為保護基的聚合物在室溫下可溶于水。此類聚合物的非限定實例包括聚醚均聚物如PEG和mPEG，或聚丙二醇類、聚氧乙烯化多元醇、及其共聚物和嵌段共聚物。除了mPEG以外，以C1-4烷基為末端的聚合物也適用。
作為另一種含PAO聚合物，可以采用有效的非抗原性材料，如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、含碳水化合物聚合物等。前列腺素類化合物的修飾可以進一步包括但不限于乙?；?、羧基化、葡糖基化、磷?；?、脂化和?；?。所屬領域的普通技術人員將理解上述內容僅僅是舉例說明，所有具有本發(fā)明所述品質的聚合物材料均可以被考慮。
前列腺素類化合物與上述保護基偶聯(lián)生成本發(fā)明的前列腺素類化合物，其可以有效地將活性化合物轉運到靶向區(qū)域，并且使本發(fā)明的前列腺素化合物在該靶向區(qū)域內保持比已知前列腺素化合物更長的時間。因此，本發(fā)明前列腺素類化合物特別適合于外周血管疾病和肺動脈高壓的治療。
如上所述，許多應用在外周血管疾病和肺動脈高壓療法中的已知前列腺素類化合物在溫血動物中具有非常短的有效壽命，通常少于1小時。根據(jù)本發(fā)明，提供了本發(fā)明的前列腺素類化合物，它們具有可以持續(xù)達數(shù)小時的改進的有效壽命，較長的有效壽命可以減少本發(fā)明前列腺素類化合物的給藥次數(shù)，由此使本發(fā)明的前列腺素類化合物可以以較低的劑量單位量和較低的頻率給藥。
本發(fā)明前列腺素類化合物的活性基團包括COOH和OH。這些活性基團的一個或多個由下文詳細描述的保護基保護。保護基一般可以具有500,000或更高的分子量。在本發(fā)明的優(yōu)選形式中，當OH未保護時，分子量至少為5,000道爾頓的基團與COOH偶聯(lián)，更優(yōu)選至少20,000道爾頓。分子量至少為5,000道爾頓的保護基可以減慢該化合物的排泄，由此能夠提高在溫血動物中的有效壽命。
所述保護基是任何可以起保護活性基團(COOH和OH)不被過早代謝但可以很容易地以受控方式與活性基團分離和/或與該活性基團連接但對該化合物的功能無不良影響的基團。所述保護基包括，例如聚合物、直鏈和支鏈烷基、芳烷基、芳基、?；?、雜環(huán)基、亞烷基，其全部可以被選自例如烷基、芳基和芳烷基等的取代基取代。
在可以和活性基團偶聯(lián)的聚合物中包括聚二醇類、聚乙烯聚合物、聚酯、聚酰胺、多糖和聚合酸、脂質、氨基酸、核酸、碳水化合物，和它們的聯(lián)合形式。
優(yōu)選的聚二醇包括聚乙二醇和聚丙二醇。
優(yōu)選的多糖是選自多糖B的那些。
在多元酸中本發(fā)明優(yōu)選聚氨基酸和聚乙酸。
在上述種類的聚合物中，優(yōu)選的聚合物是聚乙二醇類化合物(PEG)。
除了上述聚合物以外，所述聚合物如葡聚糖、纖維素聚合物和淀粉類也可以用于本發(fā)明。
所述聚合物可以通過一個基團如酰胺基、酯基等連接于活性COOH或OH基團。
結構式I的化合物一般用作治療血管疾病(包括外周血管疾病和肺動脈高壓)藥物組合物的組成部分，該組合物含有藥學可接受載體。出于這種目的所用的化合物一般是以0.5至100mg/kg/天，優(yōu)選約25至35mg/kg/天的量給藥。
可以通過例如采用常規(guī)固態(tài)或液態(tài)載體或稀釋劑，以及適合預期給藥方式的藥學添加劑(例如賦形劑、粘合劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、矯味劑等)、按照如藥劑領域中已知的技術配制上述含有至少一種結構式I的化合物的藥物組合物。
結構式I的化合物可以以任何適合方式給藥，例如口服給藥，如片劑、膠囊、顆粒或粉末；舌下給藥；經(jīng)頰給藥；非腸道給藥，如皮下、靜脈內、肌肉內，或胸骨內注射或輸注技術(例如滅菌可注射含水或非水溶液或混懸液)；鼻部給藥如噴射吸入；局部給藥如乳劑或軟膏方式；直腸給藥如栓劑；以含有無毒、藥學可接受賦形劑或稀釋劑的劑量單位制劑給藥。通過應用適當?shù)暮斜景l(fā)明化合物的藥物組合物，本發(fā)明的前列腺素類化合物可以是被即時釋放或延遲釋放，或特別是在延遲釋放的情況中，可以采用裝置如皮下植入物或滲透泵。本發(fā)明也可以以脂質體形式給藥。
口服給藥的組合物實例包括混懸液，其可以含有例如微晶纖維素提供疏松作用，藻酸或藻酸鈉作為助懸劑，甲基纖維素作為粘度增強劑，和甜味劑或矯味劑，如所屬領域已知的那些；和即時釋放片劑，其可以含有例如微晶纖維素、磷酸二鈣、淀粉、硬脂酸鎂和/或乳糖和/或其他賦形劑、粘合劑、填料、崩解劑、稀釋劑和潤滑劑，如所屬領域已知的那些。本發(fā)明的化合物也可以經(jīng)口腔轉運通過舌下和/或經(jīng)頰給藥。鑄模片劑、壓縮片劑或凍干片劑是可采用的示例劑型。組合物實例包括那些將本發(fā)明化合物和速溶稀釋劑如甘露糖醇、乳糖、蔗糖和/或環(huán)糊精配制。在這些制劑中還包括高分子量賦形劑，如纖維素(微晶纖維素)一起。所述制劑中也含有有助于粘膜附著的賦形劑，例如羥丙基纖維素(HPC)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羧甲基纖維素鈉(SCMC)、馬來酸酐共聚物(例如Gantrez)，和控釋試劑，例如聚丙烯酸共聚物(例如卡巴浦爾934)。加入潤滑劑、助懸劑、矯味劑、著色劑和穩(wěn)定劑可以易于制備和應用。
鼻用氣霧劑或吸入給藥的組合物實例包括存在于鹽水中的溶液，其可以含有例如芐醇或其他適宜的防腐劑、提高生物利用度的吸收促進劑，和/或其他增溶或分散劑，譬如所屬領域已知的那些。
非腸道給藥的組合物實例包括可注射溶液或混懸液，其含有例如適宜的無毒、腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑，如甘露糖醇、1，3-丁二醇、水、林格氏溶液(一種等滲氯化鈉溶液)；或其他適當?shù)姆稚┗驖駶檮┖椭鷳覄?，包括合成甘油?或二酯，和脂肪酸，包括油酸。
直腸給藥的組合物實例包括栓劑，其可以含有例如適宜的無刺激賦形劑，如可可脂或合成甘油酯，它們在常溫下為固體，但在直腸腔中液化和/或溶解釋放出藥物。
局部給藥的組合物實例包括局部載體，例如Plastibase(和聚乙烯膠凝的礦物油)。
所屬領域普通技術人員可以測定出本發(fā)明前列腺素類化合物的有效量，包括成年人的例舉劑量為約0.5至100mg本發(fā)明前列腺素類化合物/kg體重/天，其可以以單劑量或分開的劑量形式給藥，例如每天給藥1至4次。應理解，對于任何特定對象可以改變具體劑量水平和給藥次數(shù)，這取決于多種因素，包括特定化合物的活性，對象的種族、年齡、體重、全身健康、性別和飲食，給藥方式和次數(shù)，排泄速率，藥物聯(lián)用，和特定病癥的嚴重性。治療優(yōu)選的對象是患有血管疾病的動物，首選哺乳動物如人，和寵物，如狗、貓等。
一般地，與已知天然或非偶聯(lián)的前列腺素類化合物相比，本發(fā)明前列腺素類化合物獲得預期效果、即擴張有關患病脈管系統(tǒng)所需要的劑量明顯較低。由于已知天然或非偶聯(lián)形式的已知前列腺素類化合物在體內快速代謝，這些藥物需要以較大劑量長時間連續(xù)輸注才能在被治療患者中維持有效的血液水平。然而，在其他副作用中，由高血液水平的已知前列腺素類化合物引起的低血壓、心動過速和腹瀉限制了已知前列腺素的可給藥量。此外，前列腺素類化合物的高費用在價格上妨礙了以大劑量靜脈內給藥。本發(fā)明的方法提供了本發(fā)明前列腺素類化合物以低成本和低副作用有效給藥。
本發(fā)明的前列腺素類化合物可以經(jīng)皮下以液體重構形式的凍干粉末形式給藥，液體重構凍干粉末可以另外含有防腐劑、緩沖劑、分散劑等。優(yōu)選地，用靜脈內注射常用的介質如無防腐劑滅菌水重構該前列腺素類化合物。通過連續(xù)靜脈內或皮下輸注或通過靜脈內注射可以完成給藥。為了連續(xù)輸注，可以將日劑量加入普通鹽水或其他溶液中，將該溶液通過機械泵或通過重力輸注。
下列實施例舉例說明本發(fā)明的實施方式。在不脫離本發(fā)明實質和范圍下，所屬領域技術人員很容易理解對本發(fā)明的改變、改進和差異，本發(fā)明的范圍是由本申請組成部分的權利要求書定義的。
將200mg具有下列結構式的化合物X
置于含有mPEG5k胺(2.5g)、2-羥基芐基三唑(HOBT，67mg)、4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP，61mg)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，140mg)的圓底燒瓶內。反應物和60ml無水二氯甲烷混合。該混合物在室溫下攪拌過夜，此后蒸發(fā)除去溶劑。把殘余物溶解在25ml的1，4-二氧六環(huán)中，過濾除去不溶物。濃縮溶劑，隨后沉淀在100ml的50∶50/乙醚∶異丙醇中。過濾收集沉淀，真空下干燥。產(chǎn)物收率為2.5g(93％).1H NMR(DMSO-d6)δ3.5(br m，PEG)，7.897(t，-PEGNH-CO-(化合物X))，4.49(d，(化合物X)-OH1)，4.24(d，(化合物X)-OH2)，0.864(t，(化合物X)-CH3)，4.436(s，(化合物X)CH2CONHPEG)，7.045(t，化合物X芳族質子)，6.7(d+d，化合物X芳族質子)。
在圓底燒瓶中，將化合物X(400mg)和吡啶(200μl)在35ml的無水二氯甲烷中混合，向該混懸液中加入500μl的乙酸酐?；衔镌跀?shù)小時內變均相，該溶液在室溫下攪拌過夜。濃縮溶劑，向殘余物中加入磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH7.4)。將該混合物快速攪拌30分鐘，用二氯甲烷提取該混合物3次。合并的有機相用硫酸鈉干燥，蒸發(fā)除去溶劑。得到油狀產(chǎn)物，化合物X二乙酸酯。產(chǎn)量為340mg(80％)。1H NMR(DMSO-d6)1.91(s，(化合物X)-O1COCH3)，2.00(s，(化合物X)-O2COCH3)，0.84(t，(化合物X)-CH3)。
在圓底燒瓶中，將mPEG5k(3.8g)、上步制得的化合物X二乙酸酯(320mg)、2-羥基芐基三唑(HOBT，103mg)、4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP，93mg)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，238mg)溶解在50ml無水二氯甲烷中。該溶液在室溫下攪拌過夜，蒸發(fā)除去溶劑。殘余物溶于35ml的1，4-二氧六環(huán)，過濾除去不溶物。濃縮溶劑，沉淀在100ml的50∶50/乙醚∶異丙醇中。過濾收集沉淀，真空下干燥。產(chǎn)量為3.2g(78％)1HNMR(DMSO-d6)δ 3.5(brm，PEG)，4.23(t，-PEGOCH2CH2O-CO-(化合物X))，1.91(s，(化合物X)O1COCH3)，2.00(s，(化合物X)-O2COCH3)，0.84(t，(化合物X)-CH3)，4.77(s，(化合物X)-CH2COOPEG)，7.03(t，化合物X芳族質子)，6.7(d+d，化合物X芳族質子)。
在圓底燒瓶中，把化合物X(200mg)和氫氧化鈉(21mg)在40ml無水乙腈中混合。向該混懸液中加入90mg溴芐，將該混合物回流2天。過濾除去固體，濃縮溶劑，殘余物在真空下干燥。得到油狀產(chǎn)物，化合物X-芐酯。產(chǎn)量為210mg(100％).1H NMR(DMSO-d6)δ7.37(s，C6H5-CH2-OCO-(化合物X))，5.19(s，C6H5-CH2-OCO-(化合物X))，4.83(s，(化合物X)-CH2COOBz)，4.49(d，(化合物X)-OH1)，4.24(d，(化合物X)-OH1)，0.864(t，(化合物X)-CH3)，7.025(t，化合物X芳族質子)，6.7(d+d，化合物X芳族質子)。
在圓底燒瓶中，mPEG 20k(3g)、化合物X-芐酯(上步制備，100mg)、HOBT(3mg)、DMAP(25mg)和DCC(42mg)溶于40ml無水二氯甲烷中。該溶液在室溫下攪拌過夜，蒸發(fā)除去溶劑。將殘余物溶解在30ml的1，4-二氧六環(huán)中，過濾除去不溶固體。濃縮溶劑，隨后沉淀在100ml的50∶50/乙醚∶異丙醇中。過濾收集沉淀。真空下干燥。產(chǎn)量為2.7g(90％).1H NMR(DMSO-d6)δ 3.5(brm，PEG)，2.48(t，mPEG-OCH2CH2COO-(化合物X))，7.35(s，C6H5-CH2-OCO-(化合物X))，5.17(s，C6H5-CH2-OCO-(化合物X))，4.83(s，(化合物X)-CH2COOBz)，0.857(t，(化合物X)-CH3)，7.025(t，化合物X芳族質子)，6.7(d+d，化合物X芳族質子)。
存在于1，4-二氧六環(huán)(30ml)中的mPEG-化合物X芐酯(上步制得，2.7g)的溶液用H2(2atm壓力)和1g的Pd/C(10％)氫化過夜。過濾除去催化劑，催化劑用新制二氯甲烷洗滌。利用旋轉蒸發(fā)濃縮合并的溶液，將殘余漿液加入300ml乙醚中。過濾收集產(chǎn)物并且真空下干燥。產(chǎn)量為2g(74％).1H NMR(DMSO-d6)δ3.5(br m，PEG)，2.48(t，mPEG-OCH2CH2COO-(化合物X))，4.61(s，mPEG-(化合物X)-CH2COOH)，0.857(t，(化合物X)-CH3)，7.025(t，化合物X芳族質子)，6.7(d+d，化合物X芳族質子)。
方法富血小板血漿(PRP)的制備從至少14天內沒有攝取任何藥物的健康志愿者中采集血液，通過靜脈穿刺收集到3.15％(w/v)檸檬酸三鈉(9∶1 v/v)中。血液在800g下離心15分鐘制成PRP。PRP進一步在12,000g下離心1分鐘制成PPP。
血小板聚集的光度測量利用雙通道Payton血小板凝集計測量血小板聚集，該儀器用PRP(0％)和PPP(100％)分別校正透光度。將PRP的試樣(500μl)加入硅化比色杯中，攪拌(1000轉/分鐘)并加熱至37℃。測試前將血小板溫育1分鐘建立穩(wěn)定的基線。把次最大濃度的凝集劑膠原(1μg/ml)加入PRP中，在4分鐘內隨著透光率的增加測定血小板聚集作用。
抗聚集反應令化合物X(1-100ng/ml)和化合物1-3(0.1-10mg/ml)分別和PRP一起溫育1分鐘，隨后加入膠原(1μg/ml)，一種凝固劑。利用加入膠原后4分鐘內觀察的透光率峰的增量與對照值比較計算出血小板聚集的抑制百分比。利用采自至少3名志愿者的PRP重復這個試驗。
試驗結果在表1中給出。表1中的結果例證了化合物X和化合物1至3在上述試驗條件下對人血小板聚集作用的濃度依賴性效應。
用含水載體和PPP溫育后的抗聚集反應在各試驗中，令化合物X(30和300ng/ml)的樣本和化合物1(0.3和3mg/ml)、化合物2(0.03、0.3和3mg/ml)和化合物3(3mg/ml)的樣本與500μl含水載體(乙酸鹽緩沖液)在37℃下一起溫育不同的時間，包括15分鐘、1小時和4小時。溫育期后，取50μl含有相應樣本化合物的含水載體加入新制PRP(450μl)中，測定膠原刺激后的抗聚集活性。利用采自至少3名志愿者的PRP重復這個試驗?；衔颴和化合物1-3在和含水載體(乙酸鹽緩沖液)溫育15分鐘、1小時和4小時后對人血小板聚集的影響分別在表2中詳細給出?；衔颴和化合物1-3在和PPP溫育15分鐘、1小時和4小時后對人血小板聚集的影響分別在表3中詳細給出。表2和3中的數(shù)據(jù)表示n個供體的平均值和標準偏差。
結果化合物X對血小板聚集的影響如表1所示，化合物X(1-100ng/ml)在加入膠原之前和PRP一起溫育1分鐘，引起膠原誘發(fā)的血小板聚集的濃度依賴性抑制。在較高濃度(30和100ng/ml)下，化合物X完全抑制聚集反應(參見表1)?；衔颴抑制50％聚集反應的濃度(ID50)測定出為20ng/ml。
參考表3，化合物X(3和300ng/ml)與PPP溫育15分鐘、1小時和4小時對于抗血小板活性沒有顯著作用。同樣地，化合物X(30和300ng/ml)與含水載體單獨15分鐘、1小時和4小時的溫育對于抗血小板活性的水平也沒有明顯影響，如表2所示?；衔?對血小板聚集的影響化合物1(0.1-3mg/ml)在加入膠原之前與PRP溫育1分鐘，引起血小板聚集的濃度依賴性抑制，如表1所示。最高濃度(3mg/ml)下，化合物1完全抑制對膠原的聚集反應(參見表1)?；衔?在溫育1分鐘后抑制血小板聚集的活性比化合物X的抗聚集活性低約105倍。
如表3所示，化合物1的抗聚集活性在分別與PPP溫育1小時和4小時后是以時間依賴的方式增高。1小時后，活性提高7倍；4小時后，活性比1分鐘溫育后觀察到的活性提高了約22倍(參見表3)。
通過比較，化合物1和含水載體單獨的溫育在任何試驗時間點對抗血小板活性都沒有影響(參見表2)?；衔?對血小板聚集的影響如表1所示，在所評估的最高濃度(10mg/ml)下，化合物2在與PRP溫育1分鐘時產(chǎn)生約20％的血小板聚集抑制率。較低濃度的化合物2在1分鐘溫育后沒有顯著的抗血小板活性(參見表1)。
如表3所示，觀察到化合物2的活性在和PPP溫育1小時和4小時后以時間依賴性方式大大提高。當在PPP中溫育1小時這種活性比1分鐘的溫育提高了50倍。此外，這種活性在溫育4小時后比1分鐘溫育后觀察到的活性提高了至少3,500倍(參見表3)。
然而，化合物2和含水載體單獨的溫育對抗血小板活性在任何試驗時間點都沒有上述作用(參見表2)?；衔?對血小板聚集的影響如表1所示，化合物3(0.3-10mg/ml)與PRP溫育1分鐘，引起血小板聚集的濃度依賴性抑制。在最高濃度(10mg/ml)時，化合物3完全抑制該聚集反應(參見表1)。
化合物3(300μg/ml)以1分鐘溫育后無效的濃度和PPP一起溫育4小后，可以引起活性增高，達到40％血小板聚集的抑制率(參見表3)。由于在這樣的溫育期后活性較弱，所以沒有進一步評價其他濃度。
化合物3和含水載體的溫育在任何試驗時間點都對于抗血小板活性沒有影響(參見表2)。
結論上述有關化合物X和化合物1-3的發(fā)現(xiàn)表明，分子量為5,000至20,000道爾頓的PEG部分的包含以及乙酸酯基化可以降低化合物X的抗(血小板)聚集活性。然而，這些化合物的活性在和人血漿但不是單獨的緩沖液一起溫育約4小時期間有所提高，這表明存在對這些衍生物的酶促水解，由此活性化合物可以長時間釋放。
表1化合物X和化合物1-3對人血小板聚集的濃度依賴性作用
表2化合物X和化合物1-3在和含水載體(乙酸鹽緩沖液)溫育后對人血小板聚集的影響
表3化合物X和化合物1-3在和人PPP溫育后對人血小板聚集的影響
實施例5靜脈內給藥的化合物X和化合物1-3在麻醉大鼠中的體內全身血液動力學作用介紹這個研究報導了化合物1-3和化合物X比較在硫噴妥鈉麻醉大鼠中的生物活性的效價、活化和持續(xù)時間。觀察各化合物在快速濃注靜脈內注射后對血壓(BP)和心搏率的影響。評價啟動時間、最大反應以及反應回歸到基線值的50％所需的時間用于對比有效壽命。
材料和方法用硫噴妥鈉麻醉雄性Wistar大鼠(INTRAVAL_，120mg kg-1i.p.)。插入導管便于呼吸。將右頸動脈插導管并且和血壓傳感器(SpectramedP23XL)相連，用于測量平均動脈血壓(MAP)和心搏率(HR)，在四道Grass 7D多種波動描記器上連續(xù)記錄(Grass，Mass.，USA)。在左股靜脈或右頸靜脈插管用于給藥。試驗動物的體溫利用直腸探針式溫度計維持在37±1℃，該溫度計與恒溫毯式控制單元(Harvard Apparatus Ltd)相連。
15分鐘穩(wěn)定期后，給動物靜脈內注射一次選定劑量的各種化合物，并且連續(xù)監(jiān)測3小時的血液動力學參數(shù)，以確定被研究化合物的作用時間。
結果化合物X分別以0.1mg/kg和1mg/kg的靜脈內劑量的給藥引起MAP的即時、劑量相關性衰減，和劑量相關性心搏率加快。約70mmHg的MAP最大衰減出現(xiàn)在化合物X給藥后的第1分鐘內。化合物X的有效壽命與回歸到基線值的50％的MAP反應直接相關，化合物X在0.1mg/kg劑量時的有效壽命約為15分鐘，在1.0mg/kg劑量時化合物X的有效壽命約為30分鐘。
化合物1以靜脈內劑量為0.1mg/kg和1mg/kg的給藥引起MAP的即時、劑量相關性衰減，其與心搏率的劑量相關性加快有關。60mmHg的MAP最大衰減出現(xiàn)在化合物1給藥后的第1分鐘內。有效壽命是回歸到基線值的50％之前的MAP衰減持續(xù)時間的函數(shù)，對于10mg/kg和30mg/kg的化合物1，有效壽命分別約為15分鐘和約30分鐘。
對于化合物2，即時的MAP衰減出現(xiàn)在10和30mg/kg劑量的給藥時，與心搏率的劑量相關性加快有關。注射10mg/kg化合物2后，30mmHg的MAP最大衰減出現(xiàn)在該化合物給藥后的10分鐘內。有效壽命是由10mg/kg化合物2引起的MAP衰減持續(xù)時間的函數(shù)，該有效壽命約為125分鐘。注射30mg/kg化合物2后，30mmHg的MAP最大衰減出現(xiàn)在化合物給藥后的5分鐘內。此后MAP似乎向基線回歸。然而，在約30分鐘時MAP出現(xiàn)第2次衰減(其如同第1次衰減般明顯)。由30mg/kg化合物2引起的兩次觀察到的MAP衰減的有效壽命分別為105-160分鐘。
當化合物3以30mg/kg的劑量給藥時，可以觀察到小但即時的MAP衰減。然而，在注射化合物3后的45和120分鐘時，MAP出現(xiàn)漸進式衰減。化合物3注射后135-165分鐘內MAP的這種延遲性衰減向基線回歸。30mmHg的MAP最大衰減出現(xiàn)在該化合物給藥后的75分鐘內。由30mg/kg引起的MAP衰減的有效壽命大于105分鐘。
結論已經(jīng)證實化合物X引起基本上為劑量相關性的MAP衰減。與化合物X相似，化合物1引起MAP在數(shù)量和時間上相似的劑量相關性衰減。化合物2和3產(chǎn)生較小的MAP衰減，但它們各自的作用時間相對較長。化合物2引起血壓明顯且長時間的衰減，該化合物在10mg/kg的劑量下與心搏率的明顯加快無關?；衔?引起的MAP即時衰減不如化合物X那樣明顯，此發(fā)現(xiàn)在安全性方面具有優(yōu)越性。
在圓底燒瓶中，將化合物X(400mg)和吡啶(200μl)在35ml的無水二氯甲烷中混合，向該混懸液中加入500μl的乙酸酐。混合物在數(shù)小時內變均相，該溶液在室溫下攪拌過夜。濃縮溶劑，向殘余物中加入磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH7.4)。將該混合物快速攪拌30分鐘，用二氯甲烷提取該混合物3次。合并的有機相用硫酸鈉干燥，蒸發(fā)除去溶劑。得到油狀產(chǎn)物，化合物X二乙酸酯。產(chǎn)量為340mg(80％)。1H NMR(DMSO-d6)1.91(s，(化合物X)-O1COCH3)，2.00(s，(化合物X)-O2COCG3)，0.84(t，(化合物X)-CH3).實施例7mPEG20K-酯-化合物X二乙酸酯的合成此后稱作“化合物5”以下列方式制備第4組的化合物，其中Z1是分子量約20,000道爾頓的mPEG，X是O和各Z2是乙?；?br> 在圓底燒瓶中，將mPEG 20千道爾頓(5.2g)、化合物X二乙酸酯(140mg)、1-羥基芐基三唑(HOBT，35mg)、4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP，30mg)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，75mg)溶解在60ml無水二氯甲烷中。該溶液在室溫下攪拌過夜，蒸發(fā)除去溶劑。殘余物與35ml的1，4-二氧六環(huán)混合，過濾除去不溶固體。真空下濃縮溶液，隨后加入200ml的50∶50/乙醚∶異丙醇中。過濾收集沉淀，真空下干燥。產(chǎn)量為4.8g(92％)。1H NMR(DMSO-d6)δ3.5(brm，PEG)，4.23(t，-PEGOCH2CH2O-CO-(化合物X))，1.91(s，(化合物X)-OCOCH3)，2.00(s，(化合物X)-OCOCH3)，0.84(t，(化合物X)-CH3)，4.77(s，(化合物X)-CH2COOPEG)，7.03(t，化合物X芳族質子)，6.7(d+d，化合物X芳族質子)。
化合物6和7分別是mPEG 20kDa-酰胺-化合物X和mPEG20kDa-酰胺-化合物X二乙酸酯并且按照類似于實施例1的化合物1制備。每種化合物6和7是第4組的化合物，其中Z1是分子量約為20,000道爾頓的mPEG和X是NH。對于化合物6，Z2是氫，對于化合物7，Z2是乙?；?br> 方法富血小板血漿(PRP)的制備從至少14天內沒有攝取任何藥物的健康志愿者中采集血液，通過靜脈穿刺收集到3.15％(w/v)檸檬酸三鈉(9∶1 v/v)中。血液在800g下離心15分鐘制成PRP。PRP進一步在12,000g下離心1分鐘制成PPP。共12名志愿者獻血用于該研究。
血小板聚集的光度測量利用雙通道Payton血小板凝集計測量血小板聚集，該儀器用PRP(0％)和PPP(100％)分別校正透光度。將PRP的試樣(500μl)加入硅化比色杯中。攪拌(1000轉/分鐘)并加熱至37℃。將血小板溫育1分鐘建立穩(wěn)定的試驗前基線。把次最大濃度的凝集劑膠原(1μg/ml)加入PRP。在4分鐘內隨著透光率的增加測定血小板聚集作用。
抗聚集活性令化合物X(1-100ng/ml)和化合物4(1-300ng/ml)和PEG偶聯(lián)衍生物，化合物5-7(0.1-10mg/ml)分別和PRP一起溫育1分鐘，隨后加入膠原(1μg/ml)，一種凝固劑。利用加入膠原后4分鐘內觀察的透光率的峰增量與對照值比較計算出血小板聚集的抑制百分比。利用采自至少3名志愿者的PRP對被研究化合物重復這個試驗。
與含水載體和PPP溫育后的抗聚集反應在各試驗中，令不同濃度的化合物X(30和300ng/ml)和化合物4和化合物5-7與500μl PPP或含水載體(乙酸鹽緩沖液)在37℃下一起溫育不同的時間，包括15分鐘、1小時和4小時。溫育期后，取PPP或含水載體的試樣加入新制PRP(450μl)中用于測定抗血小板活性。利用采自至少3名志愿者(50μl)的PPP對各化合物重復這個試驗。
結果化合物X對血小板聚集的作用化合物X(1-100ng/ml)和PRP溫育一(1)分鐘，引起膠原誘導血小板聚集的濃度依賴性抑制。在較高濃度(30和100ng/ml)，化合物X完全抑制該聚集反應?；衔颴抑制50％聚集反應的濃度(IC50)為19±1ng/ml?；衔?對血小板聚集的影響化合物4、化合物X二乙酸酯(1-300μg/ml)和PRP溫育一(1)分鐘，引起血小板聚集的濃度依賴性抑制。在最高濃度(300μg/ml)，化合物4完全抑制對膠原的聚集反應，抑制50％聚集反應的濃度為68±2μg/ml。化合物4在溫育一(1)分鐘后抑制血小板聚集的活性比化合物X的抗聚集活性低約3×103倍。
化合物4的抗血小板活性在與PPP溫育后第1個15分鐘后提高。15分鐘后，活性提高了約10倍，同時IC50為5±0.2μg/ml。當該化合物在鹽水中溫育的過程中也可以觀察到這種效果。然而，當在PPP中溫育達4小時觀察到活性沒有進一步提高?；衔?對血小板聚集的影響化合物5在最高評估濃度(10mg/ml)時與PRP一起溫育一(1)分鐘時引起約10％的血小板聚集抑制率。較低濃度的化合物5在這種1分鐘溫育后沒有顯著的抗血小板活性。
高濃度的化合物5的活性在與PPP溫育一(1)和四(4)小時后以時間依賴方式提高。當在PPP中溫育四(4)小時后這種活性提高了十(10)倍以上，同時IC50為513±18μg/ml。然而，化合物5與含水載體的溫育在任何試驗時間點對抗血小板活性都無影響?；衔?對血小板聚集的影響化合物6(0.1-3mg/ml)與PRP溫育一(1)分鐘，引起血小板聚集的濃度依賴性抑制。在最高濃度(3mg/ml)下，化合物6接近最大抑制聚集反應?；衔?的IC50為600±34μg/ml。
化合物6(100μg/ml)以一(1)分鐘后無效的濃度與PPP溫育四(4)小時，引起活性提高，達到85％的血小板聚集抑制率?；衔?的在(4)小時溫育后的IC50為60±5μg/ml。由于在上述溫育期后活性微弱，所以沒有進一步評價其他濃度。
化合物6和含水載體的溫育對抗血小板活性在任何試驗時間點沒有影響。化合物7對血小板聚集的影響化合物7(10mg/ml)以最高濃度與PRP溫育一(1)分鐘，無法顯著抑制聚集反應。
化合物7(10mg/ml)與PPP或含水載體四(4)小時的溫育，表現(xiàn)出活性沒有提高。由于在上述溫育期后活性微弱，所以沒有進一步評價其他濃度。
結論本發(fā)明研究證實了前列環(huán)素的苯并茚衍生物，化合物X在人富血小板血漿中的有效體外抗血小板聚集活性，利用光學凝集計測定。在本研究中這種化合物在與血小板混懸液溫育一(1)分鐘后，其功效類似于上述的實施例4。在上述研究中，通過和無血小板血漿或含水載體在37℃下溫育四(4)小時對于抗血小板活性沒有影響，證明了其在生理條件下的化學穩(wěn)定性。
本研究的發(fā)現(xiàn)表明，化合物X具有明顯高于二乙酸酯衍生物，化合物4的抗血小板活性，二乙酸酯的活性約低3,000倍。這種乙?；苌镌谂c血漿或含水載體溫育時其活性在開始十(10)分鐘內提高了約10倍，但這種活性的提高在溫育四(4)小時后不再增高。這種早期增高的機理可以反映出二乙酸酯在與PPP介質溫育時的瞬時不穩(wěn)定性。
本研究還表明，化合物X具有比化合物4-7明顯高的抗血小板活性。化合物6在與富血小板血漿溫育一(1)分鐘后是三種PEG偶聯(lián)衍生物(化合物5-7)中活性最高的，但有效性明顯低于化合物X，活性低約3×104倍。
在于貧血小板血漿(PPP)溫育四(4)小時的作用下，化合物5-7的抗血小板活性有所變化。利用人血漿無法體外試驗大于四(4)小時的時間點，因為血小板聚集反應在收集后6小時快速衰減?；衔?和6的活性在四(4)小時的溫育后提高了10倍以上，當在鹽水中溫育時沒有觀察到這種作用。這些發(fā)現(xiàn)表明這些PEG偶聯(lián)衍生物(化合物5-7)的活性基團在人血漿中存在的酶的作用下、在37℃下溫育四(4)小時后以時間依賴方式釋放，即在人血漿中這些分子上的酯基和乙酸酯基分別水解。然而，應注意到由這些化合物觀察到的活性提高基本上低于實施例4中研究的某些化合物。
有關化合物5-7的上述發(fā)現(xiàn)表明，分子量20,000道爾頓的PEG部分以及乙酸酯基的包含降低了化合物X的抗聚集活性。然而，化合物5和6的活性在與人血漿溫育四(4)小時時提高，這表明這些取代基水解。在與人血漿溫育4小時后觀察到這些化合物的活性提高了10倍，但當單獨在緩沖液中溫育時活性不提高，這表明這些衍生物中的酯鍵和酰胺鍵被酶促水解，同時釋放活性基團。上述發(fā)現(xiàn)證實了創(chuàng)造出基于PEG取代的化合物X的緩釋衍生物，它們可以在人血漿中活化。實施例 9化合物X和化合物4-7在麻醉大鼠中的體內全身血液動力學影響介紹在本研究中，觀察化合物4-7在硫噴妥鈉麻醉大鼠中的心血管活性。測定在快速濃注靜脈內注射后這些化合物對血壓(BP)和心搏率的影響。記錄啟動的時間和最大反應，以及反應回歸到基線所需的時間。各化合物以單劑量向各只動物給藥，建立劑量—反應曲線。
在它們的其他作用中，化合物4-7體外引起腸系膜動脈的濃度依賴性松弛，當靜脈內給予麻醉大鼠時，這造成平均動脈血壓(MAP)的可測量減少。為了證實化合物4-7比化合物X的有效壽命有所改進，申請人尋找到測量MAP隨時間的變化，外推出化合物的有效壽命，其被定義為反應回歸到基線值的50％所需要的時間。
材料和方法本研究包括選用硫噴妥鈉(Intraval_，120mg kg-1i.p.)麻醉的雄性Wistar大鼠插入導管便于呼吸。將右頸動脈插導管并且和血壓傳感器(Spectramed P23XL)相連，用于測量平均動脈血壓(MAP)和心搏率(HR)，連續(xù)記錄在4道Grass 7D多種波動描記器(Grass，Mass.，USA)。在左股靜脈或右頸靜脈插管用于給藥。試驗動物的體溫利用直腸探針式溫度計維持在37±1℃，該溫度計與恒溫毯式控制單元(HarvardApparatus Ltd)相連。
15分鐘穩(wěn)定期后，給動物分別靜脈內注射選定單劑量的天然化合物X和化合物4-7，并且連續(xù)監(jiān)測3小時的血液動力學參數(shù)，以確定被研究化合物的作用時間。
結果化合物4分別以1、3和10mg/kg的靜脈內劑量的給藥引起MAP快速的、劑量相關性衰減，其與心搏率的劑量依賴性加快相關聯(lián)。注射1mg/kg后，約30mm Hg的MAP最大衰減出現(xiàn)在該化合物給藥后30分鐘。由1mg/kg的化合物4引起的MAP衰減的有效壽命約為110分鐘。
一個劑量的化合物X的給藥(1mg/kg i.v.)引起與最高劑量的化合物4(10mg/kg i.v.)相似的MAP最大衰減。當和化合物X進行比較時，化合物4引起的MAP衰減實質上持續(xù)時間更長，同時其有效壽命約為90分鐘，而化合物X的為30分鐘?；衔?的作用時間比10倍最大劑量的化合物X所激發(fā)的作用時間長。這個發(fā)現(xiàn)表明，由該衍生物觀察到的作用時間的增加是超大劑量的化合物X所無法獲得的。此外，化合物4引起的心動過速比化合物X引起的心動過速開始得慢。應注意化合物4引起的心動過速在化合物注射后3小時仍然非常顯著。
化合物5(3、10和30mg/kg i.v.)的給藥引起MAP劑量相關性衰減，其不如化合物4或化合物X所引起的那樣明顯，并且其與心搏率的明顯加快無關。反應在15分鐘后達到其最大值，同時作用時間非常長，有效壽命約為120分鐘。
化合物6(3、10和30mg/kg i.v)的給藥引起MAP即時、劑量相關性衰減，其啟動緩慢并且出現(xiàn)在較高劑量，在該化合物注射后3小時達到最大。在10分鐘內最大衰減約為60mm Hg。然而，該反應的起始相的持續(xù)時間較短，隨后是一個血壓向靜止值恢復的平緩相。令人感興趣地，化合物6沒有引起心搏率明顯改變。
化合物4和化合物6均使MAP快速和明顯衰減。然而，在化合物4的情況中，MAP的衰減還伴隨著心搏率的明顯加快。雖然化合物4所產(chǎn)生的MAP衰減持續(xù)較長的時間，但是MAP的快速衰減和造成的心動過速對于安全性而言是不利的。
相反，化合物7(3、10和30mg/kg i.v)引起MAP漸進式衰減，其在135-165分鐘后才達到其平臺水平。該漸進式衰減逐步進行并且在3小時試驗期結束時達到約30mm Hg的最大值。MAP的這種衰減與心動過速無關。
結論本發(fā)明化合物的心血管性能能夠定義某些結構—活性關系，由此設計表現(xiàn)出較長的作用時間的化合物X衍生物。此外，上述化合物可以制成緩慢開始起作用，其使任何初期低血壓危象的可能性最小化。比較5,000或20,000道爾頓PEG偶聯(lián)的化合物的性能，雖然兩種PEG的大小在MAP性能和降血壓作用的時間上沒有差異，但存在一種趨勢，含有20,000道爾頓PEG的化合物對心搏率的作用較小。需要進一步考慮潛在的臨床優(yōu)越性或反射性心動過速缺失有關的問題。
比較經(jīng)酰胺或酯鍵與PEG取代基相連的化合物的性能，表明對于酰胺鍵，MAP衰減的啟動比用酯鍵觀察到的更緩慢，并且沒有觀察到誘發(fā)反射性心動過速。
化合物2的皮下給藥(30mg/kg s.c.)引起MAP大的衰減，其啟動緩慢并且在該化合物注射后45分鐘時達到最大。此外，化合物2引起心搏率加快。當與實施例5的化合物2的靜脈內給藥(30mg/kg i.v)對比時，皮下給藥引起的MAP的長時間持續(xù)衰減更加明顯，但啟動較慢。3小時時，產(chǎn)生較大的數(shù)值，它大于同一化合物靜脈內給藥所產(chǎn)生的數(shù)值。值得對這種和其他化合物的皮下給藥進行進一步的分析。
所述化合物8按照類似于實施例1的化合物1的方法制備。該化合物為第4組的化合物，其中Z1是分子量約為20,000道爾頓的mPEG，X是NH和Z2是乙?；?br> 結果化合物4分別以1、3和10mg/kg的皮下劑量的給藥引起MAP劑量相關性衰減，其還和心搏率的劑量依賴性加快有關。注射1mg/kg后，26mm Hg的MAP最大衰減出現(xiàn)在該化合物給藥后60分鐘，并且在210分鐘時出現(xiàn)另一次28mm Hg的最大衰減。由化合物4的三種劑量分別引起的MAP衰減的有效壽命分別為＞300、＞330和＞300分鐘(參見表5).
化合物X(0.1、0.3和1mg/kg s.c)的給藥引起MAP的快速、劑量相關性衰減，其與心搏率的劑量依賴性加快有關。(參見表4)。皮下注射1mg/kg后，約70mm Hg的MAP最大衰減出現(xiàn)在該化合物給藥后15分鐘。當和化合物X相比，化合物4引起的MAP衰減持續(xù)時間長很多。化合物4引起的心動過速在啟動時比化合物4引起的心動過速要慢很多，應注意化合物4引起的心動過速對于10mg/kg的劑量在該化合物注射后6小時仍然明顯。在較低劑量下，對于1mg/kg和3mg/kg，心搏率分別在注射后約5分鐘和45分鐘穩(wěn)定。
化合物7的給藥(3、10和30mg/kg)引起MAP漸進式、進行性劑量相關性衰減，其連續(xù)衰減至注射后6小時?；钚缘臄?shù)值比天然化合物X和化合物4低。對于3、10和30mg/kg的劑量MAP的最大衰減分別為35、29和25mm Hg。全部最大衰減是在注射后約330至360分鐘出現(xiàn)(參見表6)。
化合物8(3、10和30mg/kg s.c.)引起MAP的緩慢劑量相關性衰減，并且在最大劑量注射后約240分鐘達到約24mm Hg的最大值。有效壽命大于120分鐘。(參見表7)。
表4化合物X(皮下給藥)約6小時期間測量的平均動脈壓(mm Hg)
表5化合物4(皮下給藥)約6小時期間測量的平均動脈壓(mm Hg)
表6化合物7(皮下給藥)約6小時期間測量的平均動脈壓(mm Hg)
表7化合物8(皮下給藥)約6小時期間測量的平均動脈壓(mm Hg)
實施例12mPEG350Da-酰胺-化合物X二乙酸酯此后稱作“化合物9”按照下列方式制備第4組的化合物，其中Z1是分子量約350道爾頓的mPEG，X為NH和各Z2是乙酰基。
在圓底燒瓶中，將化合物X(400mg)、mPEG(350Da)胺(360mg)、HOBT(15mg)和DCC(267mg)在20ml無水二氯甲烷中混合，混合物在室溫下攪拌過夜。過濾除去不溶固體，有機溶液用5％(重量)碳酸氫鈉溶液洗滌。有機相用硫酸鈉干燥，真空下除去溶劑。所得產(chǎn)物溶于10ml的乙腈，過濾除去不溶固體。向該溶液加入乙酸酐(3ml)和吡啶(0.3ml)。所得溶液在40℃下加熱過夜。向該溶液加入300ml的5％(重量)碳酸氫鈉溶液，該混合物在室溫下攪拌30分鐘。該混合物用二氯甲烷提取，有機相用磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH2)洗滌并且用硫酸鈉干燥。除去溶劑并且在真空下干燥該產(chǎn)物。產(chǎn)量為600mg(72％)。1H NMR(DMSO-d6)δ 3.5(br m，PEG)，7.897(t，-PEGNH-CO-(化合物X))，1.91(s，(化合物X)-O1COCH3)，2.00(s，(化合物X)-O2COCH3)，0.864(t，(化合物X)-CH3)，4.436(s，(化合物X)-CH2CONHPEG)，7.045(t，化合物X芳族質子)，6.7(d+d，化合物X芳族化合物)。
在圓底燒瓶中，將化合物X(3g)和三乙胺(TEA，1.5μl)在100ml無水乙腈中混合。向該溶液中加入3ml的乙酰氯。該混合物室溫下攪拌過夜。此溶液與5％(重量)碳酸氫鈉溶液混合，室溫下攪拌30分鐘。水相用二氯甲烷提取。有機相用磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH2)洗滌，隨后硫酸鈉干燥。產(chǎn)量為3.3g(80％)。1H NMR(DMSO-d6)1.91(s，(化合物X)-O1COCH3)，2.00(s，(化合物X)-O2COCH3)，0.84(t，(化合物X)-CH3).
在圓底燒瓶中，將mPEG(350Da)(550mg)、上步制得的化合物X二乙酸酯(750mg)、HOBT(60mg)、DMAP(150mg)和DCC(375mg)溶于30ml無水二氯甲烷。該溶液在室溫下攪拌過夜。經(jīng)過濾除去不溶性固體，用5％(重量)碳酸氫鈉溶液和磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH2)洗滌該溶液。有機相用硫酸鈉干燥，真空下濃縮。所得產(chǎn)物溶于10ml乙腈中，過濾除去不溶性固體。蒸發(fā)除去溶劑，得到的產(chǎn)物為澄清油。產(chǎn)量1g(76％)。1H NMR(DMSO-d6)δ 3.5(brm，PEG)，4.23(t，-PEGOCH2CH2O-CO-(化合物X))，1.91(s，(化合物X)-O′COCH3)，2.00(s，(化合物X)-O2COCH3)，0.84(t，(化合物X)-CH3)，4 77(s，(化合物X)-CH2COOPEG)，7.03(t，化合物X芳族質子)，6.7(d+d，化合物X芳族質子)。
上述研究評價了多種與不同分子量的基團相連的化合物X的衍生物。在那些研究中，5,000和20,000道爾頓的PEG的高分子量聚合物通過酯或酰胺鍵連接于天然化合物的不同區(qū)域，同時還研究了乙酰化游離羥基的效果。其全身性血液動力學性能是在靜脈內快速濃注給藥后的麻醉大鼠中進行研究，在后面的研究中，是在皮下快速濃注后進行。本研究評價了分子量350的PEG衍生物在靜脈內或口服給藥后對大鼠全身動脈血壓的作用。
化合物評價本研究中所用化合物是乙?；痬PEG 350Da化合物X-酰胺(mPEG350-NHCO-化合物X-Ac)，此后稱作“化合物9”，其中分子量為350道爾頓的PEG是經(jīng)酰胺鍵與化合物X的羧基連接并且化合物X的羥基被乙?；?。
通用方法本發(fā)明的這組研究是針對上述化合物在硫噴妥麻醉大鼠中的心血管活性。在這些研究中，觀察到化合物9在快速濃注靜脈內和口服給藥后對血壓(BP)和心搏率的影響。測定啟動的時間和最大反應，以及反應回歸到基線值的50％所需要的時間。各化合物以單劑量給予各組的各個動物，建立劑量—反應關系，測定靜脈內給藥后3小時和口服給藥6小時的心血管參數(shù)。
用硫噴妥鈉(INTRAVAL_，120mg/kg i.p.)麻醉雄性Wistar大鼠(250-330g)。插入導管便于呼吸。將右頸動脈插導管并且和血壓傳感器(Spectramed P23XL)相連，用于測量平均動脈血壓(MAP)和心搏率(HR)，連續(xù)記錄在4道Grass 7D多種波動描記器(Grass，Mass.，USA)。在左股靜脈或右頸靜脈插管用于給藥。試驗動物的體溫利用直腸探針式溫度計維持在37±1℃，該溫度計與恒溫毯式控制單元(HarvardApparatus Ltd)相連。
15分鐘穩(wěn)定期后，化合物9以靜脈內快速濃注給藥(3、10和30mg/kg)。
靜脈內給藥的方法將化合物9溶于絕對乙醇得到200mg/ml的儲備液，其保存在-20℃的冰箱中。在使用前即時取出儲備液的試樣，并且溶于鹽水中。大鼠接受3、10和30mg/kg的化合物9，也就是接受0.3ml的1.5％、5％和15％的乙醇。在對照組中，大鼠接受最高濃度的乙醇，0.3ml的15％乙醇溶液。
15分鐘穩(wěn)定期后，化合物9(3、10和30mg/kg)以靜脈內快速濃注給藥。
口服給藥的方法將橡膠導管置于胃內(經(jīng)食道)便于口服給藥。20分鐘穩(wěn)定期后，化合物9共計1ml的大丸劑經(jīng)此導管給藥。
化合物9溶于絕對乙醇中得到200mg/ml的儲備液中，將其保存在-20℃的冰箱內。在使用之前即時取出儲備液的試樣，并且溶于鹽水中。接受30mg/kg化合物9的大鼠也就是接受1.0ml的15％乙醇。在對照組中，大鼠接受1ml的15％乙醇溶液。
本研究是在未禁食動物中進行，它們在餐后胃內含有食物，或研究之前15小時未進食的大鼠。
靜脈內給藥的結果在麻醉大鼠中，靜脈內注射化合物9(3、10和30mg/kg i.v.)引起MAP快速劑量依賴性衰減(參見表8A)，但對心搏率的影響不顯著。采用最大劑量，這種降血壓反應在15分鐘內達到其峰值，而且具有較長的作用時間，同時有效壽命至少為120分鐘。應注意，較高劑量的化合物9可以引起心搏率暫時性衰減(參見表8B)。
表8A化合物9的靜脈內給藥的劑量反應(平均動脈壓，mm Hg)
表8B化合物9的靜脈內給藥的劑量反應(心搏率)
口服給藥的結果在麻醉大鼠中，化合物9(30mg/kg)對進食或饑餓大鼠的口服給藥均引起MAP衰減，該衰減啟動緩慢，進行性衰減并且長時間作用(參見表9A)。MAP的衰減在120分鐘后達到其峰值，并且在6小時的觀察期結束時MAP始終被抑制。在觀察期6小時結束時觀察到約33mmHg的MAP最大衰減。然而應注意，含有乙醇載體(0.3ml 15％乙醇)也引起MAP小的、漸進式衰減，其啟動緩慢并且在6小時后達到20mmHg的最大值(參見表9A)。對化合物9的血管減壓反應在進食或饑餓大鼠之間沒有差異。
乙醇載體引起心搏率進行性衰減(參見表9B)，這種衰減比試驗藥物本身引起的任何心搏率衰減都更加顯著(參見表9B)。
表9A對化合物9的口服給藥的反應(平均動脈壓，mm Hg)
表9B對化合物9的口服給藥的反應(心搏率)
結論這些在大鼠中化合物9的靜脈內給藥的發(fā)現(xiàn)表明，該分子具有快速啟動的作用和長時間的效應。然而，雖然分子量低10倍，但化合物9作為降血壓藥的效價可以和早期研究報導的mPEG 5kDa-酰胺化合物X(化合物1)的相比。其原因不很清楚，但可以反映出向活性物質的緩慢轉化。這種可能性難以用PEG衍生物的現(xiàn)有知識作出解釋，但可代表酰胺鍵的酶促水解的重要特征，以及去除保護性的乙?；蔀榱u基。低分子量PEG可以比更剛性更高分子大小的PEG基團受到更少約束，并且不會使化合物X上的酰胺鍵充分暴露，令該分子不易被攻擊并且釋放出活性物質。不同大小取代基如何影響化合物X的苯并茚化學主鏈上靜電荷的分布仍不清楚，但這也可以調控PEG類似物的水解速率或隨后釋放游離天然化合物X的速率，假設游離天然化合物X是誘發(fā)降血壓反應的活性物質。
經(jīng)酰胺鍵連接5,000道爾頓或20,000道爾頓PEG的二乙酰化化合物，其靜脈內給藥的早先研究顯示，乙?；饔脤е略摲肿赢a(chǎn)生小的MAP漸進式衰減，同時恢復速率緩慢。MAP的漸進式衰減與反射性心動過速無關。相反，在本發(fā)明研究中，化合物9具有快速啟動的作用，并且和心搏率的初始衰減有關。因此，在通過酯基或酰胺基相連的分子量為5,000或20,000道爾頓的PEG中經(jīng)乙酰化保護的羥基，不調控低分子量化合物中活性物質的釋放。這是否也適用于低分子量乙?；ヮ愌苌镞€有待于進一步研究。但是，這對于未連接PEG的化合物X的乙酰化形式同樣產(chǎn)生快速啟動的作用具有重要意義。這表明，這種在腸胃外給藥后減弱作用的快速啟動的化學途徑只有大于350道爾頓的PEG衍生物才能實現(xiàn)。
口服給藥后，雖然衰減的大小在載體(含有乙醇作為溶劑用于溶解所提供的油)所引起的小的MAP漸進式衰減的作用下難以辨認，但最高劑量的化合物9的確產(chǎn)生了MAP漸進式衰減。由于這種作用的數(shù)值，沒有再研究更低劑量。然而，比較禁食和進食大鼠中的這種血壓降低作用，數(shù)據(jù)表明在這兩種條件下生物利用度相當。由于化合物9在靜脈內給藥和口服給藥后的血壓性能的差異性，這些研究中難于測定出口服途徑的絕對生物利用度。
先前發(fā)現(xiàn)，乙?；痬PEG 5,000或20,000道爾頓化合物X酰胺衍生物的血液動力學性能在靜脈內或皮下給藥后相類似，這表示這些類似物緩慢激活、隨后緩慢代謝或消除。相反地，本發(fā)明有關化合物9的研究表明，雖然其分子量較低，但這種化合物不產(chǎn)生增高的效價，在非腸道給藥后對心血管活動的作用的緩慢啟動沒有潛在益處。然而，使用低分子量的PEG衍生物，就可以提供合理的化學方式，開發(fā)新的、長效口服吸收的前列環(huán)素衍生物。
評價的化合物試驗化合物是乙?；痬PEG 350 Da-酯-化合物X，此后稱作“化合物10”，其中分子量350道爾頓的mPEG與化合物X的羧基經(jīng)酯鍵相連，并且化合物X的羥基乙酰化。
方法用硫噴妥鈉(INTRAVAL_，120mg/kg i.p.)麻醉雄性Wistar大鼠(250-330g)。插入導管便于呼吸。將右頸動脈插導管并且和血壓傳感器(Spectramed P23XL)相連，用于測量平均動脈血壓(MAP)和心搏率(HR)，連續(xù)記錄在4道Grass 7D多種波動描記器(Grass，Mass.，USA)。左股靜脈或右頸靜脈插管用于給藥。試驗動物的體溫利用直腸探針式溫度計維持在37±1℃，該溫度計與恒溫毯式控制單元(HarvardApparatus Ltd)相連。
15分鐘穩(wěn)定期后，化合物10以靜脈內快速濃注給藥(0.3、3、10和30mg/kg)。
化合物10溶于乙醇中，保存在-20℃。在使用前取出儲備液的試樣在含水載體中稀釋。
結果化合物10(0.3、3、10和30mg/kg i.v.)的靜脈內給藥引起MAP劑量相關性衰減(參見表10A)。較高劑量的化合物10(10和30mg/kg)誘發(fā)心搏率小幅度加快或反射性心動過速，其在化合物10的給藥后45分鐘時達到最大(參見表10B)。
表10A對化合物10的靜脈內給藥的劑量反應(平均動脈壓，mm Hg)
表10B對化合物10的靜脈內給藥的劑量反應(心搏率)
比較化合物10的全身血液動力學作用和實施例12中化合物9所產(chǎn)生的作用。
在3mg/kg的劑量下，由化合物10引起的MAP衰減比化合物9引起的(最大約15mm Hg)更顯著(約30mm Hg)。兩種化合物對心搏率的影響類似。
在10mg/kg的劑量下，由化合物10引起的MAP衰減比化合物9引起的(最大約25mm Hg)更顯著(約33mm Hg)?；衔?0引起輕微的心搏率加快，而化合物9似乎引起心搏率輕微降低。由化合物9觀察到的心搏率降低可以歸因于在化合物9載體中乙醇的濃度(4.5％ v/v)高于用作化合物10載體的乙醇終濃度(2.5％ v/v)。
在30mg/kg下，化合物10和化合物9引起的MAP最大衰減相似(約45mm Hg)?；衔?0造成心搏率輕微加快，而化合物10似乎使心搏率輕微降低。后者的作用也可以歸因于在化合物9的載體中(15％v/v)和在化合物10的載體中(8.5％ v/v)的乙醇濃度的差異。
將化合物10的全身血液動力學效應也與由mPEG 5kDa-酯-化合物X二乙酸酯(化合物2)或mPEG 20kDa-酯-化合物X二乙酸酯(化合物5)引起的效應作對比。顯然，根據(jù)結果，MAP的衰減取決于PEG-部分的大小，具有最低PEG分子量的化合物激發(fā)最大的MAP衰減。例如，在10mg/kg下，化合物10激發(fā)的MAP最大衰減是35mm Hg，而化合物5引起的MAP衰減為20mm Hg。同樣地，含最低分子量PEG的化合物引起最大反射性心動過速。
在30mg/kg下，化合物10激發(fā)的MAP最大衰減是約40mm Hg，而化合物5引起的MAP衰減約為30mm Hg。所有化合物對心搏率的影響相似。
將化合物9的全身血液動力學影響與由mPEG 5kDa-酰胺-化合物X二乙酸酯(化合物8)或mPEG 20kDa-酰胺-化合物X二乙酸酯(化合物7)引起的效應作對比。
MAP的衰減取決于PEG部分的大小，含有最低分子量PEG的化合物激發(fā)最快的MAP衰減。譬如，在10mg/kg下，化合物9在1分鐘內激發(fā)的MAP衰減約為20mm Hg(最大約25mm Hg，在60分鐘時)，而化合物7在1分鐘內引起的MAP衰減可以忽略不計(最大約30mm Hg，在180分鐘)。溶于乙醇中的化合物9(4.5％)引起心搏率輕微降低。而其它化合物(溶于醋酸鹽緩沖液)對心搏率沒有影響。
在30mg/kg下，化合物9在1分鐘內激發(fā)的MAP衰減約為45mmHg(最大約45mm Hg，在1分鐘時)，化合物7在1分鐘內引起的MAP衰減忽略不計(最大約30mmHg，在180分鐘時)。溶于乙醇中的化合物9(15％)引起心搏率明顯衰減，而其它化合物(溶于醋酸鹽緩沖液)對心搏率沒有影響。
該試驗測定靜脈內輸注mPEG20kDa-酰胺-化合物X的效果，該化合物的制備類似于實施例1的化合物1和實施例3中稱作化合物3的mPEG20kDa-酯-化合物X，及在肺動脈高壓誘導過程中氣溶膠化mPEG 20kDa-酯-化合物X(化合物3)。參見

圖1，在約15分鐘基線建立之后，利用已知藥物(PGH2類似物，U44069或9，11-二脫氧，9α，11α-環(huán)氧甲烷前列腺素F2α)的靜脈內給藥在綿羊中誘發(fā)肺動脈高壓。使綿羊達到穩(wěn)態(tài)約85分鐘后，靜脈內輸注mPEG20kDa-酰胺-化合物X(1.25gI.V.)。mPEG20kDa-酰胺-化合物X輸注75分鐘后，在試驗其余的時間內觀察到肺部動脈高血壓的完全逆轉。
參見圖2，使綿羊獲得30分鐘穩(wěn)態(tài)后進行mPEG20kDa-酯-化合物X(1.25g I.V.)的靜脈內快速濃注。在給藥后30分鐘內PPA-PLA讀數(shù)由約28 cmH2O降低到約17 cmH2O。此后約5小時內血壓抑制維持在同樣的水平，并且此后在下一小時內逐漸升高至約25 cmH2O。
參見圖3，在U44069輸注后令綿羊獲得穩(wěn)態(tài)約30分鐘后，mPEG20kDa-酯-化合物X(0.625g)作為氣溶膠給藥約1小時。PPA-PLA迅速由約32.5 cmH2O降低至約21 cmH2O。在氣溶膠輸注中斷之前血壓略微上升至約22.5 cmH2O。在約另一個135分鐘內血壓穩(wěn)定保持在約22.5 cmH2O，并且在此后105分鐘內逐漸地上升至約32.5 cmH2O。
參見圖4，令綿羊在輸注U44069后達到穩(wěn)態(tài)約30分鐘，隨后給予較小靜脈內快速濃注的mPEG 20kDa-酯-化合物X(0.625 g I.V.)。PPA-PLA在約1小時的過程中由最大讀數(shù)的約37.5降低至約31cmH2O。血壓在約90分鐘內保持穩(wěn)定，此后的約1小時內開始緩慢上升至約35 cmH2O。
參見圖5，在另一個試驗中，利用和上述方法相同的方法，對比顯示天然化合物X和按照類似于實施例3的化合物3制備的mPEG5k-酯-化合物X之間在U44069誘導的肺動脈高壓中的作用。在令U44069輸注綿羊達到穩(wěn)態(tài)約90分鐘后，在15分鐘內天然化合物X以1μg/kg在一種氣溶膠制劑中給藥。在此圖中PPA-PLA水平正?；?。在天然化合物X的氣溶膠化輸注結束后10分鐘由約11.25 cmH2O降低到約5cmH2O。此后，僅在化合物X輸注結束后30分鐘后血壓迅速升高至約10cmH2O。
在U44069輸注綿羊達到穩(wěn)態(tài)約90分鐘后，在約15分鐘內mPEG5k-酯-化合物X以1mg/kg作為氣溶膠制劑給藥。輸注結束后30分鐘血壓出現(xiàn)急劇下降，由約18.25cmH2O降低到基線讀數(shù)以下1cmH2O。血壓在此后一小時內保持抑制在約1.5cmH2O。血壓在此后約2.5小時內逐漸地上升至約7.5cmH2O。血壓在mPEG5k-酯-化合物X的氣溶膠化輸注結束后整個240分鐘內維持在最大讀數(shù)的50％以下。
監(jiān)測每只綿羊的肺動脈壓(PPA)、左動脈壓(PLA)、全身動脈壓(PSA)、心輸出量(CO)和心搏率(HR)。在整個試驗中從綿羊對象采集血漿樣本測量血液中的藥物水平。試驗開始時是靜脈內給予U44069(9，11-二脫氧，9a，11α-環(huán)氧甲烷前列腺素F2α，一種PGH2類似物)人為誘導肺動脈高血壓。調節(jié)U44069輸注的速率使肺血管阻力(PVR)提高到初始基線PVR的3至4倍。PVR計算作PPA和PLA之間的差，除以CO。在穩(wěn)定期后，經(jīng)外科有備的氣管切開術用MEDICATOR_氣溶膠給藥系統(tǒng)(Healthline Medical Inc.，BaldwinPark，CA)，施用一種本發(fā)明的前列腺素化合物。
具體方案A.進行第一組試驗測定本發(fā)明前列腺素類化合物的合理有效劑量，其可以逆轉U44069誘導的肺部動脈高血壓，并且確定所施用的本發(fā)明前列腺素類化合物的特定劑量的有效持續(xù)時間。
在對所列全部變量進行基線測量20分鐘后，以足以引起PVR提高到其基線值的3至4倍的速率靜脈內輸注U44069。10分鐘達到相對穩(wěn)定反應后，將本發(fā)明的一種前列腺素類化合物作為氣溶膠以3000ng/kg/分鐘的速率給藥60分鐘(即，對于30kg的綿羊3000ng*30*60＝5.4mg藥物或270mg的藥物/PEG)。如果本發(fā)明的前列腺素類化合物對于升高的PVR產(chǎn)生了可測量效應，則連續(xù)輸注U44069直至觀察到穩(wěn)定反應。在達到穩(wěn)定反應后，U44069停止輸注20分鐘并且在下一個10分鐘恢復。重復該過程直至U44069誘導的PVR提高不再被本發(fā)明前列腺素類化合物樣本衰減。
如果樣本化合物劑量在其給藥的30至60分鐘內無效，可以將劑量升高3倍。如果該樣本化合物劑量有效，則選用新的綿羊對象并且用原劑量三分之一的新劑量重復該試驗。重復這種方法直至測定出其最低有效劑量及其相應的有效劑量。
B.進行第2組試驗測定本發(fā)明前列腺素類化合物對對照綿羊的效應。在附加試驗中制備本發(fā)明前列腺素類化合物的三種劑量。第一種劑量是由第一組試驗中測定出的最低有效劑量。本發(fā)明前列腺素類化合物的第二種劑量是最低有效劑量的兩倍，并且第三種劑量是最低有效劑量的5倍。監(jiān)測相應劑量給藥的綿羊，每種給藥劑量最少進行2小時。
權利要求
1.Ia或Ib的化合物及其藥學可接受鹽[P-T]n-ZIaP-[T-Z]nIb其中P是前列腺素類化合物或其類似物，T表示P的活性基團，和Z是與T鍵合的減慢該化合物代謝速率的藥學可接受基團；n是至少1的整數(shù)。
2.權利要求1的化合物，其中T選自羧基、羥基、羰基、氧化碳水化合物和巰基。
3.權利要求1的化合物，其中T是羧基或羥基。
4.權利要求1的化合物，其中Z是藥學可接受聚合物或乙酰基。
5.權利要求4的化合物，其中所述藥學可接受聚合物選自聚醚、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和含碳水化合物聚合物。
6.權利要求5的化合物，其中所述藥學可接受聚合物選自聚醚類化合物。
7.權利要求6的化合物，其中所述聚醚選自聚乙二醇類化合物。
8.權利要求7的化合物，其中所述聚乙二醇類化合物的分子量是約200至80,000。
9.權利要求7的化合物，其中所述聚乙二醇類化合物的分子量是約2,000至42,000。
10.權利要求9的化合物，其中所述聚乙二醇類化合物的分子量是約5,000至25,000。
11.權利要求1的化合物，具有式II所示的結構 其中Z1和Z2分別獨立地選自氫、藥學可接受聚合物和乙酰基，條件是Z1和Z2中的至少一個不是氫，且X選自O和NH。
12.權利要求11的化合物，選自第1組的化合物，其中Z1是藥學可接受聚合物，X選自O和NH，并且各Z2獨立地選自氫和乙?；?。
13.權利要求11的化合物，選自第2組的化合物，其中Z1為氫，X選自O，且至少一個Z2是經(jīng)酯基與氧原子連接的藥學可接受聚合物。
14.權利要求11的化合物，選自第3組的化合物，其中Z1為藥學可接受聚合物，X選自O和NH，并且至少一個Z2是經(jīng)酯基與氧原子連接的藥學可接受聚合物。
15.權利要求1的化合物，具有式III所示的結構 其中Z1和Z2分別獨立地選自氫、藥學可接受聚合物和乙?；?；f是1至3的整數(shù)；X選自O和NH；和R選自氫和烷基。
16.權利要求15的化合物，其中R是具有1-6個碳原子的烷基。
17.權利要求15的化合物，選自第4組的化合物，其中Z1是藥學可接受聚合物，X選自O和NH并且各Z2獨立地選自氫和乙酰基。
18.權利要求15的化合物，選自第5組的化合物，其中Z1是氫，X為O并且各Z2是乙?；蚪?jīng)酯基或醚基與氧原子連接的藥學可接受聚合物。
19.權利要求15的化合物，選自第6組的化合物，其中Z1是藥學可接受聚合物，X選自O和NH并且各Z2是經(jīng)酯基或醚基與氧原子連接的藥學可接受聚合物。
20.權利要求11的化合物，其中所述藥學可接受聚合物是分子量為約200至80,000的聚乙二醇。
21.權利要求20的化合物，其中所述聚乙二醇的分子量是約2,000至42,000。
22.權利要求15的化合物，其中所述藥學可接受聚合物是分子量為約200至80,000的聚乙二醇。
23.權利要求22的化合物，其中所述聚乙二醇的分子量是約2,000至42,000。
24.權利要求15的化合物，具有式IV所示的結構 其中a是約6至600。
25.權利要求15的化合物，其中Z1是以甲基為末端的分子量約5,000的聚乙二醇，X是NH且各Z2為氫。
26.權利要求15的化合物，其中Z1以甲基為末端的分子量約5,000的聚乙二醇，X為O且各Z2為乙?；?br> 27.權利要求15的化合物，其中Z1是氫且各Z2是以甲基為末端的分子量約20,000的聚乙二醇，該聚乙二醇通過-O-(CH2)2-CO-與氧原子連接。
28.權利要求15的化合物，其中Z1是氫且各Z2是乙?；?。
29.權利要求15的化合物，其中Z1是以甲基為末端的分子量約20,000的聚乙二醇，X為O且各Z2是乙?；?。
30.權利要求15的化合物，其中Z1是以甲基為末端的分子量約20,000的聚乙二醇，X為NH且各Z2為氫。
31.權利要求15的化合物，其中Z1是以甲基為末端的分子量約20,000的聚乙二醇，X為NH且各Z2是乙?；?br> 32.權利要求15的化合物，其中Z1是以甲基為末端的分子量約5,000的聚乙二醇，X為NH且各Z2是乙酰基。
33.權利要求15的化合物，其中Z1是以甲基為末端的分子量約350的聚乙二醇，X為NH且各Z2是乙?；?。
34.權利要求15的化合物，其中Z1以甲基為末端的分子量約350的聚乙二醇，X為O且各Z2是乙?；?。
35.一種藥物組合物，其中包括有效量的如權利要求1所述的化合物和藥學可接受載體。
36.一種藥物組合物，其中包括有效量的如權利要求11所述的化合物和藥學可接受載體。
37.一種藥物組合物，其中包括有效量的如權利要求15所述的化合物和藥學可接受載體。
38.一種治療至少一種外周血管疾病和肺動脈高壓的方法，該方法包括給溫血動物施用如權利要求35所述的組合物。
39.權利要求38的方法，包括將所述組合物以足以提供約0.5至100mg/kg/天的量施用給所述溫血動物。
40.權利要求35的方法，包括將所述組合物靜脈內給藥到所述溫血動物。
41.權利要求35的方法，包括將所述組合物皮下給藥到所述溫血動物。
42.權利要求35的方法，包括將所述組合物通過吸入給藥到所述溫血動物。
43.權利要求35的方法，包括將所述組合物經(jīng)口服給藥到所述溫血動物。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療外周血管疾病和肺動脈高壓的前列腺素及其類似物,其包括連接于至少一個位點的藥學可接受且能夠減緩向溫血動物給藥時活性基團代謝速率的保護基。事實上,圖1圖示了一個劑量的mPEG20kDa－酰胺－化合物X經(jīng)靜脈內輸注給用肺動脈高壓劑靜脈內誘導的綿羊對其肺動脈壓的影響。
文檔編號A61K31/343GK1354622SQ00804756
公開日2002年6月19日 申請日期2000年3月29日 優(yōu)先權日1999年3月31日
發(fā)明者羅伯特·肖爾, 馬蒂納·羅思布拉特, 邁克爾·D·本特利, 趙宣 申請人:聯(lián)合治療公司