專利名稱：：蟲草素提取工藝及制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藥用真菌領(lǐng)域，特別是涉及從蟲草中提取蟲草素的工業(yè)化工藝，本方面還涉及利用蟲草素制備的醫(yī)藥制劑。據(jù)報導(dǎo)，蟲草屬菌中的冬蟲夏草、蛹蟲草、人工培養(yǎng)蛹蟲草菌絲等多種蟲草中的化學(xué)成分基本一致。除含有甾醇類、糖醇類、有機酸及氨基酸等化合物外還含有蟲草素(Cordycepin)即3＇-脫氧腺苷(3＇-Doxyadenosine)3＇-氨基3＇-脫氧腺苷及其他核苷類等生理活性成分。Cunnigham等早期用Dowex-1-ce樹脂從蛹蟲草〔Cordycepsmilitaris(L)link〕中提取得蟲草素。經(jīng)研究證明蟲草素有抗病毒、抗腫瘤、抑制癌細胞分裂等作用。腺苷具有舒張血管、降低血壓、減慢心率、抑制血小板凝集等多種生理活性。目前國內(nèi)外一些學(xué)者采用高效液相色譜法、薄層層析法等測定多種蟲草菌中蟲草素及腺苷的含量，并也有從冬蟲夏草發(fā)酵菌絲及人工培養(yǎng)蛹蟲草米飯培養(yǎng)基固體殘渣中提出蟲草素的報導(dǎo)。但目前為止以工業(yè)化為目標(biāo)提取蟲草素結(jié)晶體的工藝流程技術(shù)，并將其制成蟲草素系列制劑的深層次分離開發(fā)新藥制品，尚未有報道。本發(fā)明目的之一提供從蟲草菌中提取蟲草素(3＇-氨基-3＇-脫氧腺苷)結(jié)晶體的工業(yè)化生產(chǎn)工藝流程。本發(fā)明的目的之二是將蟲草素制成針劑、乳劑、脂質(zhì)體等制劑，使中藥產(chǎn)品達國際先進水平，開辟藥學(xué)方面新用途。本發(fā)明是如下所述完成1、蟲草素提取工藝將蟲草置于60℃-80℃的干燥箱中進行干燥，然后粉碎，過40-60目篩備用，取粉碎后的原料加5倍30％乙醇(溫度70℃)浸泡24-48小時，將浸泡后的混懸液上回流裝置，加熱回流2小時，回收乙醇，加水沉淀，調(diào)pH3．5，24小時后過濾，將回收后的藥液加水溶解進行冷藏沉淀，溫度4℃，時間24小時。將冷置后的藥液用微孔濾膜進行過濾(0．85μm)濾液用0．1mol／L調(diào)4．0備用，上離子換柱，收集洗脫液，將洗脫液進行減壓濃縮至粘稠狀，將粘稠的液體于4℃，冷置24小時使之結(jié)晶析出，過濾，上述濾液加適量正丁醇，置4℃，冷置24小時使之結(jié)晶析出，過濾，濾液如此反復(fù)處理2-3次，將過濾所得結(jié)晶至冷凍干燥機中進行干燥，即得。高效液相法檢查蟲草素含量(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備分別吸取0．46mg／ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液0．25、0．5、0．75、1．00、1．25、1．5ml配成2．5ml的系列標(biāo)準(zhǔn)液，分別進樣20ml進行高效液相法含量測定。條件固定相250×4．6mmODS柱。流動相水∶甲醇∶四氫呋喃(70∶20∶10)的碳酸銨緩沖液pH=6，柱前壓40kg／cm2，流速1ml／min溫度16℃。以積分值對測試液濃度作回歸處理，在0．92-5．5mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程y=3．1×10-6x-0．0456γ=0．9966(2)樣品制備取蛹蟲草1g于是塞管內(nèi)，先乙醚脫脂(10ml×3次)涼干后取10ml乙醇浸72小時，取浸液5ml，通過裝2g的硅膠小柱，用甲醇洗至50ml做樣品測試液，進樣20ml，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品基本一致，加樣回收率97．3±4．8％，n=4。2．蟲草素制劑生產(chǎn)工藝流程(1)蟲草素凍干粉針將蟲草素溶解于注射用水，加入配料甘露醇，EDTA-2Na，用針用活性炭0．2％，吸附30分鐘，用濾紙過濾掉活性炭，用0．12μm濾膜，過濾，用0．15μm濾膜，除菌過濾，分裝為每瓶0．1克蟲草素，上塞，軋蓋，包裝。(2)蟲草素注射液將蟲草素溶解于注射用水，然后加入EDTA-2Na，攪拌溶解，加水至1000ml，加針用活性炭0．2％，攪拌吸附30分鐘，用濾紙過濾掉活性炭，用0．22μm濾膜，精濾、分裝于2ml安瓶中(每只相當(dāng)于蟲草素0．1g)溶封于100℃流通蒸汽滅菌30分鐘，燈檢包裝。(3)蟲草素糖衣片取蟲草素淀粉加10％淀粉糊制成軟材，用16#篩進行制粒，14#篩整粒，加入適量滑石粉攪均，用直徑=8mm淺弧沖打片、包衣、干燥、分裝、包裝即得。(4)蟲草素滴丸稱取處方量的聚乙二醇6000，聚乙二醇10000于80℃進行熔融，然后加入蟲草素繼續(xù)加熱，攪拌均勻，然后上滴丸機，采用下列方法進行滴制，每丸重25mg，取丸、甩干，吸去多余冷卻液、干燥、分裝即得。本工藝技術(shù)特征1、凡蟲草屬菌，不論是天然蟲草或人工培養(yǎng)蟲草、菌米飯培養(yǎng)基培養(yǎng)的固體菌米的蟲草等含有蟲草素成份的蟲草屬真菌各部位，均能用于提取。2、工藝簡便易行，可以達到工業(yè)化生產(chǎn)蟲草素。一般中藥提取設(shè)備即可滿足本工藝需要，無需特殊加工。便于本技術(shù)的推廣。3、工藝成熟，效果可靠。該工藝經(jīng)過多次試驗，蟲草素收率達到90％以上。4、所用試劑、輔料易于采購且價格底廉，工藝成本低。5、產(chǎn)品制劑填補國內(nèi)空白，具有抗腫瘤、抗白血病等作用，可用于胃癌、鼻咽癌等的治療。成本相對比較低，解決了廣大癌癥患者的經(jīng)濟負擔(dān)。優(yōu)點和積極效果1、方法簡單易行，普通中藥提取條件即可，可達工業(yè)化大量提取。2、降低成本，有綜合利用價值。3、回收率高，蟲草素腺苷回收率達90％以上。4、蟲草素冷干粉針等制劑優(yōu)于豬苓多糖，干擾素-γ、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子白介素-Ⅱ的作用，同時對白血病細胞表面標(biāo)志物表達有誘導(dǎo)作用。實施例1蟲草素的提取1．干燥粉碎取原料蟲草置于60℃-80℃的干燥箱中進行干燥，然后用粉碎機進行粉碎，過40-60目篩備用。2．浸泡取粉碎后的原料加5倍呈的30％乙醇(溫度70℃)浸泡24-48小時，備用。3．回流提取將浸泡后的混懸液按回流裝置，加熱回流2小時(溫度不易太高，回流液成滴即可)。4．回收乙醇回醇提取后的混懸液按乙醇回收裝置回收乙醇至無醇味為止。5．加水沉淀將回收后的藥液加水溶解進行冷藏沉淀，溫度4℃，時間24小時。6．過濾將冷置后的藥液用微孔濾膜進行過濾(0．85μm)濾液用0．1mol／L調(diào)4．0備用。7．上離子換柱(1)上柱樹脂型號732號、724號、717號樹脂樹脂處理方法將樹脂加2倍量的蒸餾水或去離子水浸泡之后，15分鐘倒掉水，再加2倍量的水浸泡，如此反復(fù)5次，再用去離子水浸泡30分鐘7次，之后用2mol／L鹽酸浸泡8小時以上，再用去離子水沖洗至pH為8，再用2mol／L鹽酸處理，用蒸餾水洗至中性(或用蒸餾水或去離子水浸泡15分鐘，水洗3次，再用乙醇浸泡過液，倒掉乙醇，用蒸餾水將樹脂裝入玻璃柱內(nèi)，再用蒸餾水滴洗至樹脂為無乙醇味為止，用2mol／L鹽酸沖洗約5-8倍量，用2mol／L鹽酸沖洗藥2倍量<與樹脂量比>、用蒸餾水洗至中性)。用2mol／L氯化銨(是樹脂量的4倍)去中洗，將中性柱轉(zhuǎn)換成NH+4型柱，NH+4柱流液的pH≈5。將pH=4的濾液通過上述制備好的NH+4型離子交換柱，柱流量為1．2ml／分。(2)洗脫液用蒸餾水或去離子水洗脫柱內(nèi)樹脂，并將回收洗脫液，洗至洗脫液不呈現(xiàn)棕色為好，再用0．152氨水洗脫，每接收一定量時做一次紙層析檢查，直至洗脫液干凈為止。(3)收集洗脫液洗脫下來的液體進行集中收集。8．濃縮將洗脫液進行減壓濃縮至粘稠狀。9．冷藏、結(jié)晶將粘稠的液體于4℃，冷置24小時使之結(jié)晶析出，過濾。10．正丁醇結(jié)晶上述濾液加適量正丁醇，置4℃，冷置24小時使之結(jié)晶析出，過濾，濾液如此反復(fù)處理2-3次。11．蟲草結(jié)晶將過濾所得結(jié)晶至冷凍干燥機中進行干燥，即得(蟲草素含量≥98％)。實施例2蟲草素制劑的制備(1)蟲草素凍干粉針劑產(chǎn)品處方蟲草素100gEDTA-2Na0．05g甘露醇500g制成1000支操作過程取處方量的蟲草素加適量熱注射用水溶解，再加入EDTA-2Na，然后再加入甘露醇加0．2％的針用活性碳吸符30分鐘，脫炭，在無菌條件下進行粗濾、精濾、除菌過濾、分裝，每瓶裝蟲草素0．1g，然后置凍干機中進行冷凍干燥、上塞、軋蓋、包裝。(2)蟲草素注射液產(chǎn)品處方蟲草素100gEDTA-2Na0．05g注射用水加至1000ml制成1000支操作過程取處方中的蟲草素，加適量注射用水溶解，然后加入EDTA-2Na，攪拌溶解，加水至1000ml，加針用活性炭0．2％，攪拌吸附30分鐘，脫炭、精濾、分裝于2ml安瓶中(每只相當(dāng)于蟲草素0．1g)溶封于100℃流通蒸汽滅菌30分鐘，燈檢包裝。(3)蟲草素糖衣片產(chǎn)品處方蟲草素100g淀粉150g滑石粉適量制成1000片操作過程取蟲草素淀粉加10％淀粉糊制成軟材，用16#篩進行制粒，14#篩整粒，加入適量滑石粉攪均，用直徑=8mm淺弧沖打片、包衣、干燥、分裝、包裝即得。(4)蟲草素滴丸產(chǎn)品處方蟲草素100g聚乙二醇600050g聚乙二醇10000100g制成10000粒操作方法稱取處方量的聚乙二醇6000，聚乙二醇10000于80℃進行熔蛹，然后加入蟲草素繼續(xù)加熱，攪拌均勻，然后上滴丸機采用下列方法進行滴制，每丸重25mg，取丸、甩干，吸去多余冷卻液、干燥、分裝即得。實施例3蟲草素的提取材料蛹蟲草菌，蠶蛹蟲草工藝流程如上實施例1所述。實驗結(jié)果見表1、表2表1以蛹蟲草菌米為原料提取蟲草素結(jié)果<tablesid="table1"num="001"><table>批次菌米投入量(公斤)提取蟲草素(克)150525053505</table></tables>表2蠶蛹蟲草為原料提取結(jié)果<tablesid="table2"num="002"><table>批次蠶蛹蟲草投入量(公斤)提取蟲草素(克)150102501035010</table></tables>實施例4蟲草素制劑的制備工藝同實施例2，結(jié)果見下表<tablesid="table3"num="003"><table>序號制劑名稱蟲草投入量成品名含量測定(相當(dāng)標(biāo)示量)1蟲草素凍干粉劑100克814支98．52蟲草素水針劑100克826支97．23蟲草素糖衣片100克1800片99．84蟲草素滴丸100克9200粒100．2</table></tables>注上述結(jié)果為三次投料的平均值。實施例5蟲草素凍干粉針?biāo)幮г囼瀸⑻崛〕龅南x草素制成凍干粉針，送吉林市中醫(yī)中藥研究院做藥效試驗，初步試驗結(jié)果，具有抑制服癌細胞分裂，對離體、整體肝細胞有促進ATP生成和抗氧化的作用。權(quán)利要求1．從蟲草中提取蟲草素的方法，包括干燥粉碎，浸泡，回流提取，回收乙醇，加水沉淀，過濾，上離子換柱，收集洗脫液，濃縮，冷藏、結(jié)晶，過濾，正丁醇結(jié)晶，蟲草結(jié)晶。2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中干燥粉碎是取原料蟲草置于60℃-80℃的干燥箱中進行干燥，然后用粉碎機進行粉碎，過40-60目篩備用。3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中浸泡是指取粉碎后的原料加5倍30％乙醇(溫度70℃)浸泡24-48小時。4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中回流提取是指將浸泡后的混懸液按回流裝置，加熱回流2小時。5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中回收乙醇是指回流提取后的混懸液按乙醇回收裝置回收乙醇至無醇味為止。6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將回收后的藥液加水溶解進行冷藏沉淀，溫度4℃，時間24小時。7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，將冷置后的藥液用微孔濾膜進行過濾(0．85μm)濾液用0．1mol／L調(diào)pH4．0。8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中上離子換柱為將濾液上NH+4型離子交換柱，柱流量為1．2ml／分，用蒸餾水或去離子水洗脫柱內(nèi)樹脂，并將回收洗脫液，洗至洗脫液不呈現(xiàn)棕色為好，再用0．152氨水洗脫，每接收一定量時做一次紙層析檢查，直至洗脫液干凈為止。9．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將洗脫液進行減壓濃縮至粘稠狀。10．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將粘稠的液體于4℃，冷置24小時使之結(jié)晶析出，過濾。11．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中正丁醇結(jié)晶為將濾液加正丁醇，置4℃，冷置24小時使之結(jié)晶析出，過濾，濾液如此反復(fù)處理2-3次。12．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將過濾所得結(jié)晶至冷凍干燥機中進行干燥，得蟲草素結(jié)晶。13．蟲草素制劑，含有權(quán)利要求1所述的方法獲得的蟲草素。14．根據(jù)和權(quán)利要求13所述的方法，該制劑為凍干粉針劑，其配方如下蟲草素，100g，EDTA-2Na，0．05g，甘露醇，500g，制成1000支。15．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，該制劑為蟲草素注射液，產(chǎn)品處方蟲草素，100g，EDTA-2Na，0．05g，注射用水加至1000ml，制成1000支。16．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，該制劑是蟲草素糖衣片，產(chǎn)品配方為蟲草素100g，淀粉150g，滑石粉適量，制成1000片。17．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，該制劑為蟲草素滴丸，其配方為蟲草素100g，聚乙二醇600050g，聚乙二醇10000100g，制成10000粒。全文摘要本發(fā)明公開了從蟲草中提取蟲草素的方法,包括干燥粉碎,浸泡,回流提取,回收乙醇,加水沉淀,過濾,上離子換柱,收集洗脫液,濃縮,冷藏、結(jié)晶,過濾,正丁醇結(jié)晶,蟲草結(jié)晶。該發(fā)明還公開了含有蟲草素的藥用制劑,如凍干粉劑,針劑,糖衣片和滴丸。文檔編號A61P31/12GK1294133SQ0013037公開日2001年5月9日申請日期2000年11月6日優(yōu)先權(quán)日2000年11月6日發(fā)明者徐哲,苑桂華,王波申請人:吉林東北虎藥業(yè)股份有限公司