半胱氨酸示蹤法水相制備煙用香料前體的方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于食品化學(xué)和食品加工領(lǐng)域，具體涉及一種半胱氨酸示蹤法水相制備煙用香料前體的方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

美拉德反應(yīng)(Maillard Reaction)，又稱非酶褐變或羰氨反應(yīng)，是還原糖(碳水化合物)與氨基酸/蛋白質(zhì)在常溫或加熱時發(fā)生的一系列復(fù)雜的反應(yīng)，最終生成棕色甚至黑色的高分子類黑精(或稱擬黑素)。美拉德反應(yīng)過程一般可歸納為初始階段、中間階段和高級階段3個階段。在初始階段，酮糖可與氨基化合物生成酮糖基胺，而酮糖基胺可以經(jīng)過海恩氏(Heyns)分子重排異構(gòu)成2-氨基-2-脫氧葡萄糖，也被稱作Heyns重排產(chǎn)物(HRP)。

在醇化后的煙草中已發(fā)現(xiàn)多種HRP，其總含量占烤煙干重的2％左右，并且被證實(shí)為煙草香氣重要的貢獻(xiàn)者。煙葉在自然醇化過程中，氨基糖類先增加，約2年時間達(dá)到最高，然后開始下降，氨基糖類的變化趨勢與烤煙感官品質(zhì)變化趨勢比較吻合，積累水平達(dá)到最高時，煙葉品質(zhì)最好，因而是煙葉自然醇化進(jìn)程的一個重要指標(biāo)。大量研究證明HRP是重要的香味中間體，可改善吸味，圓和煙氣，增加甜香和烘烤香，極具在卷煙加香中的應(yīng)用潛能。

HRP不僅具有完全美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)在卷煙中的加香效果，而且穩(wěn)定性較強(qiáng)，使其有望以獨(dú)特的優(yōu)勢代替部分MRPs添加至卷煙產(chǎn)品中。據(jù)現(xiàn)有的報道，由于美拉德反應(yīng)十分復(fù)雜，產(chǎn)物繁多，反應(yīng)過程不好控制，造成部分產(chǎn)品加香效果不理想。影響美拉德反應(yīng)的因素有溫度、時間、溶劑、pH值、濕度等，也和參與反應(yīng)的糖和氨基酸等有很大關(guān)系。由于煙草加香所用香料正常使用的溫度較高，所需香氣并非是常溫時具有的香氣。在卷煙的燃吸過程中煙頭最高溫度可達(dá)700～800℃，在這樣的高溫下，完全美拉德反應(yīng)產(chǎn)物MRPs將分解，自身香氣已不易被聞到。因此，加香的作用是使其裂解的產(chǎn)物能起到消除煙雜氣，增加香煙吸味，從而達(dá)到提高煙葉質(zhì)量的目的。完全美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在卷煙生產(chǎn)和儲存過程中極易發(fā)生揮發(fā)性香氣物質(zhì)的損失，導(dǎo)致加香作用不能達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。針對性地制備某些HRP中間體，作為外源香味前體補(bǔ)充添加到煙絲中，能夠提高煙葉可用性、方便葉組配方、改善卷煙評吸品質(zhì)。

國內(nèi)外許多煙草企業(yè)和科研機(jī)構(gòu)都積極開展了HRP的合成研究以及在卷煙加香方面的應(yīng)用研究。在目前已有技術(shù)中，HRP主要在有機(jī)溶劑中加熱回流制備，通常選擇甲醇作為有效的反應(yīng)溶劑。甲醇作為反應(yīng)溶劑應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)具有較高的生產(chǎn)成本且不安全。甲醇易燃易爆且具有較強(qiáng)的毒性，完全不適用于HRP的工業(yè)化生產(chǎn)。工業(yè)化的美拉德反應(yīng)過程一般在高溫水相體系下進(jìn)行，該條件下HRP一旦形成迅速發(fā)生脫水、降解等重重疊疊的次級反應(yīng)，根本不可能穩(wěn)定制備到目標(biāo)HRP，即使是實(shí)驗(yàn)室水平的微量分析都很難捕獲到這些反應(yīng)中間體。因此有待出現(xiàn)一種水相合成HRP的工藝，實(shí)現(xiàn)其安全制備。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明提供了半胱氨酸示蹤法水相制備煙用香料前體的方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

半胱氨酸示蹤法水相制備煙用香料前體的方法，將1～10重量份的氨基酸和10重量份的酮糖溶解于100～500重量份的水中，調(diào)整該混合溶液的pH至6.5～8.5，在70～140℃下進(jìn)行低溫美拉德反應(yīng)，采用冰浴冷卻終止反應(yīng)，經(jīng)低溫濃縮得到所述煙用香料前體；其中，選定條件下最適反應(yīng)時間的確定采用半胱氨酸示蹤法，具體步驟如下：

(1)按選定比例將氨基酸和酮糖溶解于水中，調(diào)整該混合溶液的pH，將所得溶液平均分為5～10份，分別倒入美拉德反應(yīng)瓶中，在相同的選定溫度下進(jìn)行第一階段低溫美拉德反應(yīng)，在15～130min內(nèi)反應(yīng)不同時間后采用冰浴冷卻終止反應(yīng)；

(2)分別在步驟(1)所得到的各份反應(yīng)液中加入等量的示蹤劑半胱氨酸，各份反應(yīng)液在相同條件下進(jìn)行第二階段高溫美拉德反應(yīng)，采用冰浴冷卻終止反應(yīng)，得到變溫美拉德反應(yīng)液；

(3)分別測定步驟(2)所得到的各份變溫美拉德反應(yīng)溶液在波長420nm下的吸光度值，描繪所得吸光度值與步驟(1)中相應(yīng)反應(yīng)時間的關(guān)系曲線，根據(jù)吸光度值最低點(diǎn)對應(yīng)的反應(yīng)時間，確定相應(yīng)條件下的最適反應(yīng)時間。

本方法基于半胱氨酸作用于Heyns重排產(chǎn)物可以有效阻止其進(jìn)一步反應(yīng)形成呈色物質(zhì)的機(jī)理，在低溫美拉德反應(yīng)過程中的不同反應(yīng)時間添加半胱氨酸示蹤劑，接著發(fā)生高溫美拉德反應(yīng)，比較其在高溫美拉德反應(yīng)中的色澤抑制效果，從而確定Heyns重排產(chǎn)物形成的臨界反應(yīng)時間，在該臨界條件下低溫水相制備中間體，所得中間體即為所述煙用香料前體。

所述氨基酸為丙氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸及其鹽中的至少一種；所述酮糖為赤蘚酮糖、木酮糖、果糖中的至少一種。

步驟(2)中，示蹤劑半胱氨酸的投加量為步驟(1)中氨基酸投加量的0.5～10％。投加量過小會導(dǎo)致美拉德反應(yīng)體系色澤抑制效果不明顯，投加量過多會導(dǎo)致剩余半胱氨酸與還原糖反應(yīng)，降低半胱氨酸的利用率，影響對變溫美拉德反應(yīng)色澤的判斷，同時成本上升。

所述第二階段高溫美拉德反應(yīng)中，各份反應(yīng)液的pH調(diào)節(jié)至6.5～8.5；反應(yīng)的溫度為120～160℃，反應(yīng)時間為60～200min。

本發(fā)明還提供了一種由上述方法制備得到的產(chǎn)品，該產(chǎn)品不僅具有完全美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在卷煙中的加香效果，而且穩(wěn)定性較強(qiáng)。

本發(fā)明的另一目的是提供一種由上述方法制備得到的產(chǎn)品在卷煙中的應(yīng)用。該產(chǎn)品作為外源香味前體補(bǔ)充添加到煙絲中，能夠提高煙葉可用性、方便設(shè)計葉組配方、改善吸味，圓和煙氣，增加甜香和烘烤香，顯著改善卷煙的評吸品質(zhì)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)現(xiàn)有公開的技術(shù)中，HRP主要在無水甲醇中長時間加熱合成，這種方法污染嚴(yán)重、毒性較大、而且成本較高，無法滿足現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)的需要。而本發(fā)明所述HRP的制備技術(shù)是以水作為溶劑、半胱氨酸作為示蹤劑，通過低溫美拉德反應(yīng)水相制備HRP，大大降低了生產(chǎn)成本，滿足現(xiàn)代工業(yè)所提出的綠色發(fā)展的設(shè)計要求，完全可以應(yīng)用于卷煙產(chǎn)品或者食品中。

(2)以半胱氨酸為示蹤劑、通過測定變溫美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的色澤來判斷HRP在水溶液中形成的臨界條件，是重要的理論創(chuàng)新和技術(shù)創(chuàng)新，并且僅采用分光光度計即可完成整個測定工作，無需標(biāo)準(zhǔn)品及其他試劑或設(shè)備，操作簡單、成本低廉，具有較強(qiáng)的應(yīng)用價值。

(3)水相低溫制備美拉德反應(yīng)中間體的方法是以現(xiàn)有美拉德反應(yīng)香精的加工工藝為基礎(chǔ)的技術(shù)創(chuàng)新，本發(fā)明水相低溫制備HRP的技術(shù)可在低成本條件下直接應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中變溫美拉德反應(yīng)溶液吸光度值與第一階段低溫美拉德反應(yīng)時間的關(guān)系曲線圖；

圖2為實(shí)施例1制備的煙用香料前體的表征結(jié)果圖，其中，(a)為總離子流色譜圖，(b)為質(zhì)譜圖；

圖3為實(shí)施例1中變溫美拉德反應(yīng)溶液吸光度值與第一階段低溫美拉德反應(yīng)時間的關(guān)系曲線圖；

圖4為實(shí)施例1制備的煙用香料前體的表征結(jié)果圖，其中，(a)為總離子流色譜圖，(b)為質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

為更好地理解本發(fā)明，結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

將5kg丙氨酸和10kg木酮糖溶解于500kg水中，調(diào)節(jié)混合溶液pH至7.5，在70℃下進(jìn)行低溫美拉德反應(yīng)，采用以下步驟確定上述條件下的最適反應(yīng)時間：

(1)按上述比例將丙氨酸和木酮糖溶解于水中，調(diào)節(jié)混合溶液pH至7.5，將溶液平均分為9份，分別倒入美拉德反應(yīng)瓶中，在70℃下加熱進(jìn)行第一階段低溫美拉德反應(yīng)，分別在10、15、20、25、30、35、40、45和50min后采用冰浴冷卻終止反應(yīng)；

(2)分別在步驟(1)所得到的各份反應(yīng)液中加入0.6kg半胱氨酸，并調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至7.5，然后升溫至120℃進(jìn)行第二階段高溫美拉德反應(yīng)120min，采用冰浴冷卻終止反應(yīng)，得到變溫美拉德反應(yīng)液；

(3)分別測定步驟(2)所得到的各份變溫美拉德反應(yīng)溶液在波長420nm下的吸光度值，描繪所得吸光度值與步驟(1)中相應(yīng)反應(yīng)時間的關(guān)系曲線，結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，變溫美拉德反應(yīng)液吸光度最低點(diǎn)對應(yīng)的反應(yīng)時間為35min，即木酮糖-丙氨酸體系的HRP在水相中形成的臨界時間35min，即可確定相應(yīng)條件下制備煙用香料前體的最適時間為35min。

在所選條件及最適時間下制備Heyns重排產(chǎn)物反應(yīng)液，進(jìn)一步經(jīng)低溫濃縮即可得到固體煙用香料前體。

將所得固體煙用香料前體溶于水后通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)對其進(jìn)行分析，得到總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖如圖2所示，其中，圖2(a)為得到的總離子流色譜圖，圖2(b)為得到的質(zhì)譜圖。根據(jù)圖2(b)質(zhì)譜圖的離子碎片信息可知，離子碎片為分子離子脫水或脫羧基形成，推斷其分子離子峰MH⁺為222，該物質(zhì)的相對分子質(zhì)量為221，分子式為C₈H₁₅O₆N，確定該物質(zhì)為木酮糖-丙氨酸體系的中間體HRP。

實(shí)施例2

將20kg天冬氨酸和60kg木酮糖溶解于800kg水中，調(diào)節(jié)混合溶液pH至8.0后，在120℃下加熱發(fā)生美拉德反應(yīng)，采用以下步驟確定上述條件下的最適反應(yīng)時間：

(1)按上述比例將丙氨酸和木酮糖溶解于水中，調(diào)節(jié)混合溶液pH至8.0，將溶液平均分為5份，分別倒入美拉德反應(yīng)瓶中，在120℃下加熱進(jìn)行第一階段低溫美拉德反應(yīng)，分別在20、25、30、35和40min后采用冰浴冷卻終止反應(yīng)；

(2)分別在步驟(1)所得到的各份反應(yīng)液中加入2.0kg半胱氨酸，并調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至8.0，然后升溫至150℃進(jìn)行第二階段高溫美拉德反應(yīng)200min，采用冰浴冷卻終止反應(yīng)，得到變溫美拉德反應(yīng)液；

(3)分別測定步驟(2)所得到的各份變溫美拉德反應(yīng)溶液在波長420nm下的吸光度值，描繪所得吸光度值與步驟(1)中相應(yīng)反應(yīng)時間的關(guān)系曲線，結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，變溫美拉德反應(yīng)液吸光度最低點(diǎn)對應(yīng)的反應(yīng)時間為30min，即木酮糖-天冬氨酸體系的HRP在水相中形成的臨界時間30min，即可確定相應(yīng)條件下制備煙用香料前體的最適時間為30min。

在所選條件及最適時間下制備Heyns重排產(chǎn)物反應(yīng)液，進(jìn)一步經(jīng)低溫濃縮即可得到固體煙用香料前體。

將所得固體煙用香料前體溶于水后通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)對其進(jìn)行分析，得到總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖如圖4所示，其中，圖4(a)為得到的總離子流色譜圖，圖4(b)為得到的質(zhì)譜圖。根據(jù)圖4(b)質(zhì)譜圖的離子碎片信息可知，離子碎片為分子離子脫水或脫羧基形成，推斷其分子離子峰MH⁺為266，該物質(zhì)的相對分子質(zhì)量為265，分子式為C₉H₁₅O₈N，確定該物質(zhì)為木酮糖-天冬氨酸體系的中間體HRP。

實(shí)施例中使用的水為蒸餾水，氨基酸和酮糖使用食品級，其余化學(xué)試劑均為分析純，高效液相色譜-質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為色譜純。高效液相色譜-質(zhì)譜檢測條件為：用于分析的分離柱是C18反向高效液相色譜柱，使用的流動相是超純水與乙腈，進(jìn)樣后用流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.3mL/min，柱溫是45℃。質(zhì)譜分析選擇的離子方式為ESI+，毛細(xì)管電壓為3.5kV，錐孔電壓為20V，離子源溫度為100℃，脫溶劑氣溫度為400℃，脫溶劑氣流速為700L/h，錐孔氣流流速為50L/h，碰撞能量是6V，檢測器電壓是1800V。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。