專利名稱：用于以生物技術(shù)氧化取代的三甲基環(huán)己烯基化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在有放線菌目微生物存在的情況下氧化取代的三甲基環(huán)己烯基化合物的方法并涉及微生物在氧化反應(yīng)中的應(yīng)用。
帶有三甲基環(huán)己烯基環(huán)的化合物廣泛存在于自然界。它們是萜類化合物代謝中的重要中間體且例如出現(xiàn)在類胡蘿卜素的生物合成過程中?？梢詮囊幌盗刑烊粊碓粗蟹蛛x它們。例如，除類胡蘿卜素外，許多香料和/或調(diào)味劑中也含有三甲基環(huán)己烯基環(huán)。還在大量植物油中發(fā)現(xiàn)了它們。
過去在以生物技術(shù)氧化帶有三甲基環(huán)己烯基環(huán)的化合物中已經(jīng)作了許多嘗試。因此，Mikami等(Appl.Environ.Microbiol.,Vol.41,No.3,1981:610-617)描述了由真菌黑色曲霉對β-芷香酮和β-甲基芷香酮進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的方法。將與作為原料的β-芷香酮反應(yīng)的主要產(chǎn)物鑒定為(R)-4-羥基-β-芷香酮和(S)-2-羥基-β-芷香酮以及2-氧基-、4-氧基-、3,4-脫氫-、2,3-脫氫-4-氧基-、3,4-脫氫-2-氧基-、(S)-2-乙酰氧基-、(R)-4-乙酰氧基-、5,6-環(huán)氧-β-芷香酮和4-(2,3,6-三甲基苯基)丁-3-烯-2-酮。使用β-甲基芷香酮作為原料而得到的類似轉(zhuǎn)化產(chǎn)物也得到了鑒定。帶有許多這類次級產(chǎn)物的反應(yīng)不適于工業(yè)化目的。
DE 32 43 091中描述了由真菌卵形孢球托霉將β-芷香酮氧化成(R)-4-羥基-β-芷香酮的方法。在該反應(yīng)中，形成的主要次級產(chǎn)物是2-羥基-β-芷香酮，它在2-位上被羥基化并且是一種不需要的產(chǎn)物。
對Mikami等的方法進(jìn)行了改進(jìn)的一種反應(yīng)由Yamazaki等描述(Appl.Environ.Microbiol.,Vol.54,No.10,1988:2354-2360)。Yamazaki使用了真菌黑色曲霉JTS191作為反應(yīng)的催化劑。所述的主要產(chǎn)物是順式/反式異構(gòu)體混合物(=順式-3-羥基-α-芷香酮和反式-3-羥基-α-芷香酮)以及3-氧基-α-芷香酮。所鑒定的其它次級產(chǎn)物是2,3-脫氫-α-芷香酮、3,4-脫氫-α-芷香酮和1-(6,6-二甲基-2-亞甲基-3-環(huán)己烯基)丁烯-3-酮。此外，由于主要和次級產(chǎn)物的光譜的原因、特別是由于順式/反式異構(gòu)體混合物的原因，該方法不能進(jìn)行工業(yè)化利用。使用真菌毛霉菌的FR 2 661 190中所述的方法也沒有產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果。
1995年，Larroche等(Appl.Environ.Microbiol.Biotechnol.,43,1995:222-227)描述了使用黑色曲霉對β-芷香酮進(jìn)行補(bǔ)料分批轉(zhuǎn)化的方法。這種生物轉(zhuǎn)化不僅產(chǎn)生了4-羥基-β-芷香酮、而且產(chǎn)生了2-羥基-β-芷香酮和4-氧基-β-芷香酮，這兩者均是不需要的。
我們擁有的使用各種真菌作為催化劑的方法已經(jīng)證實(shí)氧化帶有三甲基環(huán)己烯基環(huán)的化合物可導(dǎo)致主要和次要產(chǎn)物的多樣性。
本發(fā)明的一個目的是提供一種用于氧化帶有三甲基環(huán)己烯基環(huán)的化合物的方法，該方法不會表現(xiàn)出上述缺陷而可選擇性地產(chǎn)生氧化產(chǎn)物。
我們發(fā)現(xiàn)這一目的通過本發(fā)明的方法來實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明的方法是將結(jié)構(gòu)Ⅰ的化合物 氧化成結(jié)構(gòu)Ⅱ的化合物， 其中通式Ⅰ和Ⅱ中的取代基如下所定義R1=取代或未取代的支鏈或非支鏈的飽和或不飽和C1-C8-烷基-；R2和R3彼此獨(dú)立為氫、氧基-或羥基-，至少基團(tuán)R2或R3中的一個不同時是氫；該方法包括在有放線菌目菌存在的情況下對結(jié)構(gòu)Ⅰ的化合物進(jìn)行氧化的步驟。
優(yōu)選的情況是在有放線菌目菌存在的情況下使用本發(fā)明的方法將結(jié)構(gòu)Ⅰa的化合物 氧化成結(jié)構(gòu)Ⅱa的化合物， 其中通式Ⅰa和Ⅱa中的取代基R1如上述所定義且R2是氧基-或羥基-。
在通式Ⅰ、Ⅰa、Ⅱ和Ⅱa的化合物中，R1指的是取代或未取代的支鏈或非支鏈的飽和或不飽和C1-C8-烷基-。
可以提及的飽和烷基基團(tuán)是取代或未取代的支鏈或非支鏈C1-C8-烷基鏈，諸如例如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基、正丁基、1-甲基丙基-、2-甲基丙基、1,1-二甲基乙基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、正己基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基、正庚基或正辛基。
可以作為不飽和烷基基團(tuán)的是取代或未取代的支鏈或非支鏈C2-C8-烯基鏈，諸如例如乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基丙烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-甲基-1-丁烯基、2-甲基-1-丁烯基、3-甲基-1-丁烯基、1-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-甲基-3-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、3-甲基-3-丁烯基、1,1-二甲基-2-丙烯基、1,2-二甲基-1-丙烯基、1,2-二甲基-1-丙烯基、1-乙基-1-丙烯基、1-乙基-2-丙烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-甲基-1-戊烯基、2-甲基-1-戊烯基、3-甲基-1-戊烯基、4-甲基-1-戊烯基、1-甲基-2-戊烯基、2-甲基-2-戊烯基、3-甲基-2-戊烯基、4-甲基-2-戊烯基、1-甲基-3-戊烯基、2-甲基-3-戊烯基、3-甲基-3-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-甲基-4-戊烯基、2-甲基-4-戊烯基、3-甲基-4-戊烯基、4-甲基-4-戊烯基、1,1-二甲基-2-丁烯基、1,1-二甲基-3-丁烯基、1,2-二甲基-1-丁烯基、1,2-二甲基-2-丁烯基、1,2-二甲基-3-丁烯基、1,3-二甲基-1-丁烯基、1,3-二甲基-2-丁烯基、1,3-二甲基-3-丁烯基、2,2-二甲基-3-丁烯基、2,3-二甲基-1-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-3-丁烯基、3,3-二甲基-1-丁烯基、3,3-二甲基-2-丁烯基、1-乙基-1-丁烯基、1-乙基-2-丁烯基、1-乙基-3-丁烯基、2-乙基-1-丁烯基、2-乙基-2-丁烯基、2-乙基-3-丁烯基、1,1,2-三甲基-2-丙烯基、1-乙基-1-甲基-2-丙烯基、1-乙基-2-甲基-1-丙烯基、1-乙基-2-甲基-2-丙烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、5-庚烯基、6-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、4-辛烯基、5-辛烯基、6-辛烯基或7-辛烯基；可以作為其它不飽和烷基基團(tuán)的是取代或未取代的支鏈或非支鏈C2-C6-炔基鏈，諸如例如乙炔基-、丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基、正丁-1-炔-1-基、正丁-1-炔-3-基、正丁-1-炔-4-基、正丁-2-炔-1-基、正戊-1-炔-1-基、正戊-1-炔-3-基、正戊-1-炔-4-基、正戊-1-炔-5-基、正戊-2-炔-1-基、正戊-2-炔-4-基、正戊-2-炔-5-基、3-甲基丁-1-炔-3-基、3-甲基丁-1-炔-4-基、正己-1-炔-1-基、正己-1-炔-3-基、正己-1-炔-4-基、正己-1-炔-4-基、正己-1-炔-5-基、正己-1-炔-6-基、正己-2-炔-1-基、正己-2-炔-4-基、正己-2-炔-5-基、正己-2-炔-6-基、正己-3-炔-1-基、正己-3-炔-2-基、3-甲基戊-1-炔-1-基、3-甲基戊-1-炔-3-基、3-甲基戊-1-炔-4-基、3-甲基戊-1-炔-5-基、4-甲基戊-1-炔-1-基、4-甲基戊-2-炔-4-基或4-甲基戊-2-炔-5-基。
一般來說，與可想到的一致，R1的上述基團(tuán)的合適取代基是例如一個或多個取代基諸如氧基；?；?；CHR4OR5-(=乙縮醛)；鹵素諸如氟、氯或溴；氰基、硝基、氨基、羥基、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷氧基、芐氧基、苯基或芐基，優(yōu)選氧基、羥基-、?；?或CHR4OR5-(=乙縮醛)、烷基和環(huán)烷基。彼此獨(dú)立的基團(tuán)中R4和R5指的是C1-C4-烷基-或C3-C8-環(huán)烷基-。
另外有利的是多取代或未取代的支鏈或非支鏈C2-C8-烷基鏈可以作為通式Ⅰ、Ⅰa、Ⅱ或Ⅱa中的基團(tuán)R1存在。該鏈中可以含有多個共軛或非共軛形式的雙鍵或雙鍵和三鍵可以同時存在于所述鏈中。通過實(shí)例可以提及優(yōu)選的基團(tuán)3-甲基-1,4-二戊烯-1-基-或3-甲基戊-1-炔-4-烯-(5)-基-。
可以提及的其它優(yōu)選基團(tuán)R1是下列基團(tuán)諸如乙炔基-、羥甲基-、甲?；?、3-甲基-3-羥基-1,4-二戊烯-1-基-或3-羥基-3-甲基戊-1-炔-4-烯-5-基-。
通式Ⅱ和Ⅱa化合物中的R2和R3彼此獨(dú)立為氫、氧基或羥基-，R2或R3中至少一個基團(tuán)不是氫且通式Ⅱa中的R2不是氫。氧基總是通過一個雙鍵結(jié)合的氧。
結(jié)構(gòu)Ⅰ、Ⅰa、Ⅱ或Ⅱa的化合物中含有可以存在于下列兩個位置上的雙鍵環(huán)己烷環(huán)中的4-位或5-位。
一般來說，放線菌目的所有菌均適合于本發(fā)明的方法。在該目中的菌是革蘭氏陽性菌，其分支絲狀體的形成是典型的。象所有合適的微生物一樣，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法可以例如從土壤、堆肥或水樣品中方便地分離這些菌或者從培養(yǎng)物保藏所象ATCC或DSMZ中獲得這些菌。用于分離這些菌的方法可以例如在教科書TheProkaryotes《原核細(xì)胞》(編輯Mortimer T.Starr,Heinz Stolp,Hans G.Trüper,Albert Balows,Hans G.Schlegl,SpringerVerlag,1981，第二版，第147章，ISBN 3-540-08871-7)或Mikrobiologisches Praktikum[微生物實(shí)驗(yàn)](編輯Drews，第三版，Springer Verlag,1976,47頁和48頁)中找到。用于本發(fā)明的菌優(yōu)選自下列菌組成的組諾卡氏菌屬、紅球菌屬、分枝桿菌屬、原放線菌屬和屬于鏈霉菌科的菌諸如鏈霉菌屬、鏈輪絲菌屬、欽氏菌屬、小棘孢屬和北里菌屬。
優(yōu)選的情況是，將具有鏈霉菌屬、鏈輪絲菌屬、欽氏菌屬、小棘孢屬和北里菌屬的鏈霉菌科的菌用于本發(fā)明、特別優(yōu)選鏈霉菌屬的菌。特別優(yōu)選使用的是下列屬和種的菌諸如沙場鏈霉菌、抗生鏈霉菌、灰色鏈霉菌、紫黑鏈霉菌、脫葉鏈霉菌、灰綠鏈霉菌、弗氏鏈霉菌、唐德鏈霉菌或吸水鏈霉菌。
適合于反應(yīng)的菌的多樣性反映出放線菌目分類群的高度多變的歷史性。上述生物體的分類位置近來已經(jīng)進(jìn)行了重要改變且仍然是可變的，這是因?yàn)樾枰m正不正確的屬名和種名且要對現(xiàn)存的菌株給予新的屬名。在這些屬和種中存在相近的關(guān)系。能夠在上述微生物中發(fā)現(xiàn)實(shí)施本發(fā)明方法所用的菌。例如，將優(yōu)選的鏈霉菌屬中的215種菌用來對本發(fā)明的反應(yīng)進(jìn)行測試。將這些生物體中的15種進(jìn)行該反應(yīng)。這些生物體中的15種氧化特異性底物β-芷香酮，且這些生物體中的6種還能夠氧化α-芷香酮。這意味著所測試菌中的大約6％可進(jìn)行所需的β-芷香酮的反應(yīng)且所測試菌中的大約3％可進(jìn)行所需的α-芷香酮的反應(yīng)。即本領(lǐng)域技術(shù)人員有了良好的選擇(大約3-6％)測試用于反應(yīng)的來自放線菌目的任意微生物特別是鏈霉菌屬。
特別能夠進(jìn)行本發(fā)明反應(yīng)的所測試的菌中的5種生物體已經(jīng)被寄存在DSMZ并給予其下列寄存號DSM12134(=沙場鏈霉菌(Streptomyces arena)Tü495)、DSM12133(=抗生鏈霉菌(S.antibioticus)Tü46)、DSM12135(=灰色鏈霉菌(S.griseus)ATCC 13273)、DSM12131(弗氏鏈霉菌(S.fradiae)Tü27)和DSM12132(=紫黑鏈霉菌(S.violaceoniger)Tü38)。
有利的情況是，將菌用于本發(fā)明的方法中，其產(chǎn)量已經(jīng)得到了增加，超過了野生型分離物。通過使能夠進(jìn)行本發(fā)明生物轉(zhuǎn)化的野生型菌株發(fā)生突變而方便地獲得這類微生物(參見圖解Ⅰ)。
可以使用公知的微生物技術(shù)來生產(chǎn)這類突變體。為了引發(fā)突變，可以使用所有常規(guī)方法諸如使用誘變物質(zhì)例如亞硝基胍、甲磺酸乙酯、亞硝酸鈉；或接觸電磁輻射諸如UV、γ或X-射線輻射。此外，可以將轉(zhuǎn)座遺傳因子諸如轉(zhuǎn)座子或IS因子用于誘變。為了分離這些突變體，例如能夠利用其以提高的比例進(jìn)行這種生物轉(zhuǎn)化的能力(由GLC分析測定，參見實(shí)施例)。
然而，這類生物體也可以通過向新鮮培養(yǎng)基中添加適當(dāng)提高濃度的原料/產(chǎn)物而在連續(xù)培養(yǎng)物中選自極少采用個體的群體。
有利的是在有天然或人工的還原等效供體和/或受體存在的情況下可以在生長的細(xì)胞、休眠細(xì)胞、細(xì)胞抽提物或純化的酶類中上進(jìn)行本發(fā)明方法的生物轉(zhuǎn)化。該反應(yīng)優(yōu)選在生長細(xì)胞上進(jìn)行。
用于將通式Ⅰ或Ⅰa的化合物氧化成通式Ⅱ或Ⅱa的化合物的本發(fā)明方法特別有利地適合于選擇性氧化α-或β-芷香酮類(參見圖解Ⅰ)。在這種氧化反應(yīng)中，優(yōu)選形成單氧化產(chǎn)物。無論以何種方式都難以在該反應(yīng)中形成任何次級產(chǎn)物。圖解Ⅰ生物技術(shù)氧化反應(yīng) 在本發(fā)明的方法中氧化β-芷香酮可產(chǎn)生4-羥基-β-芷香酮即僅一種產(chǎn)物且產(chǎn)率良好。在有原料(=β-芷香酮)和產(chǎn)物(4-羥基-β-芷香酮)存在的情況下菌僅形成一種未鑒定的產(chǎn)物，其量極其微小而使得它不能夠被分析鑒定。還不清楚這種化合物是否是反應(yīng)中次級產(chǎn)物。以GLC分析的實(shí)驗(yàn)參數(shù)為基準(zhǔn)(原料+產(chǎn)物；次級圖解Ⅱ)，發(fā)現(xiàn)該化合物的量≤4％、優(yōu)選≤2％、特別優(yōu)選≤1％。圖解Ⅱβ-芷香酮的氧化 在本發(fā)明的方法中氧化α-芷香酮可產(chǎn)生3-羥基-β-芷香酮即僅一種產(chǎn)物且產(chǎn)率良好。在有原料(=α-芷香酮)和產(chǎn)物(3-羥基-β-芷香酮)存在的情況下菌僅形成一種未鑒定的產(chǎn)物，其量極其微小而使得它不能夠被分析鑒定。還不清楚這種化合物是否是反應(yīng)中次級產(chǎn)物。以GLC分析的實(shí)驗(yàn)參數(shù)為基準(zhǔn)(原料+產(chǎn)物；次級圖解Ⅱa)，發(fā)現(xiàn)該化合物的量≤6％、優(yōu)選≤4％、特別優(yōu)選≤3％、極為優(yōu)選≤1％。圖解Ⅲaα-芷香酮的氧化 根據(jù)本發(fā)明，氧化結(jié)構(gòu)Ⅰ或Ⅰa的化合物可有利地產(chǎn)生結(jié)構(gòu)Ⅱ或Ⅱa的化合物，其中取代基R1和R2位于相對于環(huán)平面的移位上。因此，本發(fā)明的方法優(yōu)選導(dǎo)致區(qū)域和立體選擇性氧化。圖解Ⅲbα-芷香酮至反式-異構(gòu)體的氧化 圖解Ⅲb通過將α-芷香酮(=結(jié)構(gòu)Ⅰa的特定化合物)氧化成反式-3-羥基-(6R)-α-芷香酮和/或反式-3-羥基-(6S)-α-芷香酮(=結(jié)構(gòu)Ⅱa的特定化合物)的實(shí)例證明了這一點(diǎn)。沒有順式-異構(gòu)體形成。
在本發(fā)明的方法中，菌生長在使這些生物體生長的培養(yǎng)基中。這種培養(yǎng)基可以是一種合成的或天然的培養(yǎng)基。根據(jù)生物體的不同，會使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的培養(yǎng)基。無論使微生物生長，所用的培養(yǎng)基中含有碳源、氮源、無機(jī)鹽和(如果合適)少量維生素和微量元素。
有利的碳源的實(shí)例是糖類諸如單、二或多糖類諸如葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素；復(fù)合糖源類諸如糖蜜；糖磷酸類諸如果糖-1,6-二磷酸；糖醇類諸如甘露醇；多元醇類諸如甘油；醇類諸如甲醇或乙醇；羧酸類諸如檸檬酸、乳酸或乙酸；脂肪類諸如大豆油或菜油；氨基酸類諸如谷氨酸或天冬氨酸；或還可以同時用作氮源的氨基糖類。
有利的氮源是有機(jī)或無機(jī)含氮化合物或含有這些化合物的物質(zhì)。實(shí)例是銨鹽諸如NH4Cl或(NH4)2SO4、檸檬酸鹽、脲；或復(fù)合氮源諸如玉米漿、啤酒酵母自溶物、大豆粉、面筋、酵母提取物、肉膏、酪蛋白水解產(chǎn)物、酵母或馬鈴薯蛋白，通常還可以將所有這些物質(zhì)同時用作氮源。
無機(jī)鹽的實(shí)例是鈣鹽、鎂鹽、鈉鹽、錳鹽、鉀鹽、鋅鹽、銅鹽和鐵鹽。所提及的這些鹽的陰離子特別是氯離子、硫酸根離子和磷酸根離子。本發(fā)明方法中用于提高多樣性的重要因素就是向產(chǎn)生培養(yǎng)基中添加Fe2+或Fe3+鹽和/或鉀鹽。
如果合適，向營養(yǎng)培養(yǎng)基中添加其它生長因子諸如例如維生素類或生長促進(jìn)劑諸如核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸鹽或吡哆醇；氨基酸類諸如丙氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸或賴氨酸；羧酸類諸如檸檬酸、甲酸、庚二酸或乳酸；或諸如二硫蘇糖醇這樣的物質(zhì)。
可以連續(xù)或分批有效地進(jìn)行菌的發(fā)酵或生物轉(zhuǎn)化。一般來說，使用活性菌來進(jìn)行氧化反應(yīng)，但當(dāng)使用休眠菌時也可成功地進(jìn)行氧化反應(yīng)，不過反應(yīng)速率相當(dāng)?shù)汀?br>
所述營養(yǎng)物的混合比例取決于發(fā)酵的類型并根據(jù)每種具體情況來決定。可以在發(fā)酵的開始階段將培養(yǎng)基中的所有成分引入發(fā)酵容器，如果合適，在分別或共同滅菌后將其引入發(fā)酵容器，否則在發(fā)酵過程中連續(xù)或分批添加它們，這根據(jù)具體需要而定。
將培養(yǎng)條件特定為這樣一種形式生物體的生長處于最佳狀態(tài)且獲得最佳產(chǎn)率。優(yōu)選的培養(yǎng)溫度在15℃-40℃。溫度在25℃-37℃之間特別有利。優(yōu)選將pH維持在3-9的范圍。pH值在5-8之間特別有利。一般來說，培養(yǎng)時間為幾小時到幾天，優(yōu)選8小時到21天，特別優(yōu)選4小時到14天，上述條件是充分的。在該期限內(nèi)在培養(yǎng)基中濃縮有最大量的產(chǎn)物。
例如，在上述在教科書“The Prokaryotes”(《原核細(xì)胞》)或在培養(yǎng)物包藏目錄諸如DSMZ或ATCC的目錄中可以發(fā)現(xiàn)用于本發(fā)明方法的有利的培養(yǎng)基和生長條件。
可以連續(xù)、分批或分批添加的反式進(jìn)行本發(fā)明的氧化反應(yīng)，能夠在發(fā)酵開始階段引入原料，否則在發(fā)酵后連續(xù)或分批添加原料。原料的濃度有利的是在0.1-5g/l的范圍，優(yōu)選的濃度為0.5-2g/l。另一方面，可以以稀釋的水溶液或有機(jī)溶液的形式添加原料。
以所用原料為基準(zhǔn)，本發(fā)明的方法產(chǎn)生的有利的產(chǎn)物的產(chǎn)率至少為10％、優(yōu)選20％、特別優(yōu)選30％。
優(yōu)選將原料的濃度控制在可確保沒有達(dá)到原料的生長抑制濃度的范圍。對于特定的原料和給定的微生物來說，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的預(yù)實(shí)驗(yàn)可以方便地確定這一濃度。例如，記錄生物體的生長曲線并由此分析生長速率顯著增長時的原料濃度。
通過取樣并分析樣品(GLC)可以監(jiān)測并定時檢測轉(zhuǎn)化率。通過公知方法(參見實(shí)施例)可以分離并從培養(yǎng)物中純化產(chǎn)物。便利的是，將固體生物量從營養(yǎng)培養(yǎng)基或轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中分離、例如實(shí)驗(yàn)有機(jī)溶劑提取所關(guān)注的產(chǎn)物并從提取物相中分離所關(guān)注的產(chǎn)物。還將柱層析法方便地用于完成操作。
通過下列實(shí)施例來更具體地解釋本發(fā)明。
在次級篩選系列實(shí)驗(yàn)中更具體地檢驗(yàn)顯示出轉(zhuǎn)化的鏈霉菌屬菌株中的兩種(ATCC13273和Lu1537)在相同條件下氧化β-芷香酮的能力。在每一天，取1ml的等分試樣、過濾并如實(shí)施例1中所述進(jìn)行提取且通過TLC或氣液層析法(=GLC)來進(jìn)行分析。10-12天后，完全如上所述對培養(yǎng)物進(jìn)行操作并分析。類似地進(jìn)行使用α-芷香酮作為原料的生物轉(zhuǎn)化和操作。
過濾出較大培養(yǎng)物體積(例如＞100ml)并用乙醚(50ml)將濾液提取兩次。將合并的提取物用飽和NaCl水溶液洗滌并用MgSO4或NaSO4干燥，且在真空中濃縮殘余物至體積為1-2ml(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，42℃)。
為了進(jìn)行TLC分析，將提取物樣品點(diǎn)在TLC平板(0.2mmm，硅膠60 F254,Merck Darmstadt)上且隨后用己烷/乙酸乙酯(3∶2)展開。根據(jù)在254nm處的熒光抑制和/或通過用2.5％(w/v)香草醛的95％EtOH/H2SO4溶液噴射并加熱來檢測產(chǎn)物。還使用α-和β-芷香酮的標(biāo)準(zhǔn)物和3-和4-羥基-β-芷香酮的標(biāo)準(zhǔn)物。對于α-芷香酮來說，隨后進(jìn)行類似的過程。
使用Carlo Erba MEGA 5300氣相色譜法進(jìn)行GC分析(GLC)分路注射(1∶5,220℃)；火焰電離檢測器(=FID)；Spectra PhysicsLabnet Version 3.5積分儀系統(tǒng)；載氣0.4巴H2；20m玻璃毛細(xì)管(i.th.0.3mm，薄膜厚度0.2mm)，充滿手性聚二甲基硅氧烷相(用化學(xué)結(jié)合反式的過甲基-α-或-β-環(huán)糊精(分別為0.38和0.34％)修飾)；溫度程序100℃(1分鐘等溫)/100-220℃(4°/分鐘)。將樣品作為二氯甲烷的溶液使用。
下列條件占主導(dǎo)溫度程序100℃(1分鐘等溫)/100-220℃(4°/分鐘)。
壓力0.4巴H2。
使用樣品的CH2Cl2溶液。
使用Bruker(Karlsruhe-Forchheim,Germany)ARX 500分光計在CDCl3溶液中記錄NMR光譜(1H頻率500.13MHz且13C為125.77MHz)。
權(quán)利要求
1．一種用于將結(jié)構(gòu)Ⅰ的化合物 氧化成結(jié)構(gòu)Ⅱ的化合物的方法， 其中通式Ⅰ和Ⅱ中的取代基如下所定義R1=取代或未取代的支鏈或非支鏈的飽和或不飽和C1-C8-烷基-；R2和R3彼此獨(dú)立為氫、氧基-或羥基-，至少基團(tuán)R2或R3中的一個不同時是氫；該方法包括在有放線菌目菌存在的情況下對結(jié)構(gòu)Ⅰ的化合物進(jìn)行氧化的步驟。
2．一種如權(quán)利要求1中所述的方法，其中在有放線菌目菌存在的情況下將結(jié)構(gòu)Ⅰa的化合物 氧化成結(jié)構(gòu)Ⅱa的化合物， 其中通式Ⅰa和Ⅱa中的取代基R1如權(quán)利要求1中所定義且R2是氧基-或羥基-。
3．一種如權(quán)利要求1或2中所述的方法，其中所形成的產(chǎn)物是一種通式Ⅱ或Ⅱa的化合物，該化合物的取代基R1和R2或R3相對于環(huán)平面來說處于反式位置。
4．一種如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中在生長從細(xì)胞上進(jìn)行所述的反應(yīng)。
5．一種如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中在有菌存在的情況下進(jìn)行所述的反應(yīng)，所述的菌選自下列菌組成的組諾卡氏菌屬、紅球菌屬、分枝桿菌屬、原放線菌屬和屬于鏈霉菌科的菌諸如鏈霉菌屬、鏈輪絲菌屬、欽氏菌屬、小棘孢屬和北里菌屬。
6．一種如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中在有鏈霉菌屬菌存在的情況下進(jìn)行所述的反應(yīng)。
7．放線菌目菌用于氧化如權(quán)利要求1中所述結(jié)構(gòu)Ⅰ的化合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在有放線菌目微生物存在的情況下氧化取代的三甲基環(huán)己烯基化合物的方法并涉及微生物在氧化反應(yīng)中的應(yīng)用。
文檔編號C12P1/06GK1298452SQ99805522
公開日2001年6月6日 申請日期1999年4月13日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月27日
發(fā)明者B·豪爾, W·沃勒本, P·菲舍爾, S·盧茨－瓦爾, C·施米德特－丹納特, R·D·施米德, O·舍爾 申請人:Basf公司