使編碼乙酸苯酯分解代謝酶的基因失活的方法和質(zhì)粒以及用其轉(zhuǎn)化的菌株的制作方法

專(zhuān)利名稱：使編碼乙酸苯酯分解代謝酶的基因失活的方法和質(zhì)粒以及用其轉(zhuǎn)化的菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的基礎(chǔ)是鑒定了新的DNA化合物和重組DNA分子，它們編碼從絲狀真菌構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)和產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)得到的乙酸苯酯2-羥化酶，用前述DNA化合物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)青霉素的菌株能使這一抗生素的產(chǎn)量提高。
已有技術(shù)在某些絲狀真菌中，苯青霉素(青霉素G)生物合成途徑的最后步驟包括在異青霉素N轉(zhuǎn)換成青霉素G的步驟中。這包括?；妻D(zhuǎn)反應(yīng)，在這個(gè)反應(yīng)中，用一個(gè)苯乙酸替代了異青霉素N中的L-氨基己二酸側(cè)鏈。催化這一反應(yīng)的酶(?；?輔酶A異青霉素N酰基轉(zhuǎn)移酶)利用活化的以輔酶A(CoA)的硫酯形式的苯乙酸作為它的底物之一。
用于工業(yè)生產(chǎn)青霉素的真菌產(chǎn)黃青霉，和構(gòu)巢曲霉不能合成乙酸苯酯。結(jié)果是，為了促進(jìn)青霉素G的生物合成，必須在產(chǎn)黃青霉的工業(yè)培養(yǎng)物中加入過(guò)量的乙酸苯酯。過(guò)量的乙酸苯酯能防止不需要的其它具有脂肪族側(cè)鏈的青霉素的合成，但增加了發(fā)酵過(guò)程的最終成本。
加入到青霉素生產(chǎn)的培養(yǎng)物中的部分乙酸苯酯可能參與了代謝。在產(chǎn)黃青霉發(fā)酵中積累相當(dāng)量的2-羥基乙酸苯酯是一個(gè)完全確定的事實(shí)。這一側(cè)鏈的前體組分顯然在青霉素G的生物合成中沒(méi)有貢獻(xiàn)。
構(gòu)巢曲霉和產(chǎn)黃青霉都通過(guò)同樣的酶步驟從三個(gè)前體氨基酸合成青霉素。另外，當(dāng)在培養(yǎng)物中加入過(guò)量的乙酸苯酯時(shí)，構(gòu)巢曲霉和產(chǎn)黃青霉一樣，將乙酸苯酯轉(zhuǎn)換成2-羥基乙酸苯酯。構(gòu)巢曲霉除了將乙酸苯酯轉(zhuǎn)換成2-羥基乙酸苯酯，也可以分解代謝這一最后化合物，事實(shí)上，構(gòu)巢曲霉能利用乙酸苯酯作為唯一的碳源。構(gòu)巢曲霉中的分解代謝途徑如下圖所示乙酸苯酯↓乙酸苯酯羥化酶2-羥基乙酸苯酯↓2-羥基乙酸苯酯羥化酶勻漿物↓勻漿物 雙加氧酶馬來(lái)酰乙酰乙酸↓馬來(lái)酰乙酰乙酸異構(gòu)酶富馬酰乙酰乙酸↓富馬酰乙酰乙酸水解酶富馬酸+乙酰乙酸這一途徑的第一步是乙酸苯酯的鄰位羥基化作用。第二個(gè)羥基化反應(yīng)將2-羥基乙酸苯酯轉(zhuǎn)換成2,5-二羥基乙酸苯酯(=勻漿物)。勻漿物通過(guò)富馬酰乙酰乙酸分解代謝成富馬酸和乙酰乙酸，這兩個(gè)產(chǎn)物參與了Krebs循環(huán)(參見(jiàn)Fernandez Canon y Penalva，美國(guó)核酸科學(xué)進(jìn)程92:9132-9136,1995)。
所述的絲狀真菌部分地或完全分解代謝乙酸苯酯的能力是青霉素生產(chǎn)過(guò)程中的不利特征。由于這一原因，完全或部分地去除這一特征將產(chǎn)生青霉素G生產(chǎn)能力提高的菌株。
在生產(chǎn)青霉素的真菌中進(jìn)行經(jīng)典的誘變?nèi)コ@一不利特征(也就是部分或完全分解代謝乙酸苯酯的能力)需要在大量的菌株中進(jìn)行艱巨的選擇工作。不管怎樣，所述的誘變經(jīng)常產(chǎn)生繼發(fā)突變，這些繼發(fā)突變可能會(huì)去除親本菌株的有用的特征，例如產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變或生長(zhǎng)活力或孢子形成減弱的突變，而生長(zhǎng)活力和孢子的形成是工業(yè)發(fā)酵的關(guān)鍵。所以，為了部分或完全去除分解代謝乙酸苯酯的能力，使用基因工程技術(shù)是恰當(dāng)?shù)?，這些技術(shù)沒(méi)有所述的局限性。進(jìn)行涉及的基因工程的基本需要是克隆和鑒定基因，該基因或這些基因傳遞前面所述的生產(chǎn)青霉素的真菌的不利特征。
發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的目的是解決本領(lǐng)域現(xiàn)存的前面所述的問(wèn)題。包括鑒定真菌中的基因，該基因編碼乙酸苯酯2-羥化酶活性，催化曲霉和青霉中乙酸苯酯分解代謝的第一個(gè)酶解步驟的酶，和使用該基因通過(guò)重組DNA技術(shù)去除生產(chǎn)青霉素的真菌的基因組中存在的該基因。本專(zhuān)利敘述了在基因工程構(gòu)建的菌株中這一基因是如何失活的。這一基因工程菌株不能分解代謝乙酸苯酯，產(chǎn)生的青霉素水平比親本菌株高。另外，這一重組菌株的最大青霉素產(chǎn)量需要的乙酸苯酯超額量比親本菌株需要的小。利用上面的DNA化合物使乙酸苯酯分解代謝失活，導(dǎo)致青霉素產(chǎn)量的明顯提高。
SEQ ID NO:1顯示了來(lái)自構(gòu)巢曲霉的1986個(gè)堿基對(duì)(bp)的基因組DNA片斷的序列，該序列中包括用于本發(fā)明的新基因。將該基因稱為phacA(phac是由于使用乙酸苯酯phenylacetate)，它編碼將乙酸苯酯鄰位羥基化的酶(這一反應(yīng)是構(gòu)巢曲霉中乙酸苯酯分解代謝的第一步)。與基因組DNA互補(bǔ)的DNA(cDNA)克隆的核苷酸序列覆蓋了整個(gè)編碼區(qū)和它們隨后的排列，并暴露了這一基因具有下面的特征-該基因編碼具有518個(gè)氨基酸的多肽。第一個(gè)甲硫氨酸由位置82的ATG三聯(lián)體編碼，而終止密碼(TAG)位于位置1810。這些位置與SEQ ID NO:1.中顯示的核苷酸序列匹配。
-編碼區(qū)被三個(gè)長(zhǎng)度為65,56和53個(gè)核苷酸的內(nèi)含子(SEQ ID NO:1)中斷。
-在SEQ ID NO:1中，以對(duì)應(yīng)的外顯子下面的三字母氨基酸密碼表示了推斷的518個(gè)殘基的多肽，該多肽也在SEQ ID NO:2中單獨(dú)以氨基酸密碼表示了。推斷的蛋白質(zhì)的分子量是58,495克/摩爾。利用國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI，美國(guó))的公共可得服務(wù)BLAST，在蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫(kù)(如SwissProt和PIR)中，和在DNA序列的數(shù)據(jù)庫(kù)(如，基因庫(kù)和EMBL數(shù)據(jù)庫(kù))的概念性翻譯中，對(duì)六個(gè)可能的讀碼框架進(jìn)行的研究表明該氨基酸序列與細(xì)胞色素P450家族的成員(血硫蛋白)相似。這些蛋白質(zhì)通常參與氧化過(guò)程。事實(shí)上，與殘基431和439之間的序列相對(duì)應(yīng)的含有氨基酸半胱氨酸的肽，Gly-X-Gly-X-X-X-Cys-X-Gly(其中X指任何氨基酸)，該肽參與了血紅素基團(tuán)的結(jié)合，這是這些血硫蛋白的特征。
新的DNA化合物可以從天然微生物中分離，也可以利用自動(dòng)DNA合成儀全部合成，SEQ ID NO:1詳細(xì)敘述了它的結(jié)構(gòu)。另外，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，新DNA化合物編碼的蛋白質(zhì)可以由替代的DNA序列編碼。這些也包括在本發(fā)明中。另一方面，任何起源于上面敘述的新DNA化合物的天然遺傳突變體將認(rèn)為是它的等同物。這些遺傳突變體包括從進(jìn)化角度上與構(gòu)巢曲霉密切相關(guān)的有機(jī)體如產(chǎn)黃青霉中的同源基因。如下所述，利用來(lái)自構(gòu)巢曲霉的DNA化合物作為雜交探針可以容易地鑒定這些基因。
可以將構(gòu)巢曲霉的phacA基因用作分子探針通過(guò)雜交在其它真菌品種的基因組DNA和cDNA文庫(kù)中尋找功能同源基因。所以，例如，本發(fā)明敘述了利用該基因?qū)Ξa(chǎn)黃青霉DNA文庫(kù)的篩選，表明從產(chǎn)黃青霉的工業(yè)菌株中可以分離到與構(gòu)巢曲霉的phacA同源的基因。SEQ ID NO:3顯示了來(lái)自產(chǎn)黃青霉的基因組的2558bp的DNA片斷的序列，該片斷是通過(guò)與phacA基因探針雜交分離得到的。將與構(gòu)巢曲霉的phacA同源的產(chǎn)黃青霉基因命名為pahA(由于乙酸苯酯羥基化作用phenylacetatehydrixylation)。產(chǎn)黃青霉的pahA基因編碼含有516個(gè)氨基酸的多肽，該多肽顯示了與PhacA的氨基酸序列有84％的同一性，PhacA的氨基酸序列即構(gòu)巢曲霉的phacA基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。SEQ ID NO:4顯示了產(chǎn)黃青霉的pahA基因的產(chǎn)物的序列。如前所述，這一從產(chǎn)黃青霉分離的新DNA化合物也包括在本發(fā)明中，如其它同源基因一樣，這些同源基因是通過(guò)同樣的方法從真菌的其它種類(lèi)中分離得到的。
通過(guò)反向遺傳學(xué)可以將已經(jīng)克隆的這些基因用于產(chǎn)生失去功能的突變。為了這一目的，可以在攜帶截短的該真菌基因的大腸桿菌載體中構(gòu)建新的重組DNA分子，這樣的載體可以通過(guò)轉(zhuǎn)化使該內(nèi)源基因失活。例如，這一重組質(zhì)?？梢院袠?gòu)巢曲霉的phacA基因的5’區(qū)，接著對(duì)phacA基因編碼區(qū)修飾，該修飾包括用含有構(gòu)巢曲霉的argB+基因的3.2kb XbaⅠ片斷替代289bp的Nae Ⅰ-kpnⅠ片斷(參見(jiàn)

圖1)。然后是phacA基因的3’區(qū)。這一突變的phacA基因的表達(dá)將產(chǎn)生PhacA蛋白，該蛋白在殘基297處截短，結(jié)果是缺乏221個(gè)羧基末端的殘基。突變蛋白中缺乏的后面的這些殘基包括前面提到的肽，該肽包含參與血紅素基團(tuán)的結(jié)合的Cys殘基，該殘基是這一類(lèi)型的蛋白質(zhì)活性的關(guān)鍵。
通過(guò)適當(dāng)?shù)南拗泼缚梢詮妮d體的序列中分離到含有上面提到的區(qū)域的線性DNA片斷，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化。這一線性片斷可以用于將構(gòu)巢曲霉的argB+菌株轉(zhuǎn)化成精氨酸原養(yǎng)型。由于用于轉(zhuǎn)化的DNA缺乏自我復(fù)制需要的序列。原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化體是從將該DNA片斷整合進(jìn)基因組得到的。如圖1所示，一個(gè)可能的整合方法是在線性DNA分子與存在于真菌基因組中的phacA座位之間的雙交叉連接，這一方法將產(chǎn)生argB+表現(xiàn)型。這一雙交叉連接發(fā)生導(dǎo)致體外產(chǎn)生的截短的基因替代了原初的phacA基因，引起phacA功能的丟失。通過(guò)它們的雜交方式可以識(shí)別攜帶這一替代(即失去功能的突變)基因的轉(zhuǎn)化體，在這一方法中，利用了適當(dāng)?shù)南拗泼赶蚪MDNA，然后利用32P放射性標(biāo)記的phacA或argB基因作為探針，通過(guò)Southern技術(shù)雜交分析。通過(guò)這種方式，可以容易地將其它類(lèi)型的轉(zhuǎn)化體的雜交方式與對(duì)應(yīng)于基因替代的那些雜交方式區(qū)別開(kāi)。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以純化通過(guò)phacA基因提供的缺乏功能的轉(zhuǎn)化體，用于進(jìn)一步測(cè)試。
與野生型菌株不同，通過(guò)反向遺傳學(xué)產(chǎn)生的構(gòu)巢曲霉轉(zhuǎn)化體缺乏phacA基因的功能，所以這些轉(zhuǎn)化體在乙酸苯酯作為唯一碳源時(shí)不能生長(zhǎng)。但是，它們卻可以在2-羥基乙酸苯酯或2,5-二羥基乙酸苯酯中生長(zhǎng)。這種情況表明新DNA化合物(構(gòu)巢曲霉的phacA基因)編碼乙酸苯酯的鄰位羥基化所需要的酶活性，乙酸苯酯的鄰位羥基化是構(gòu)巢曲霉中利用乙酸苯酯的基本步驟。產(chǎn)黃青霉確實(shí)不利用乙酸苯酯作為唯一碳源，但如前面所示，產(chǎn)黃青霉含有編碼酶PhacA的同系物的基因。所以，新的DNA化合物提供了去除側(cè)向的代謝轉(zhuǎn)化的方法，該方法可以降低青霉素生物合成中乙酸苯酯的積累。
在產(chǎn)黃青霉中，利用與前敘的相似的方法使pahA基因失活，其中利用了本發(fā)明中包括的新產(chǎn)黃青霉DNA化合物和任何已經(jīng)得到的產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)化標(biāo)記，例如trpC基因。同樣令人滿意的是除了argB(在構(gòu)巢曲霉中)或trpC(在產(chǎn)黃青霉中)以外的轉(zhuǎn)化標(biāo)記可以用于中斷新DNA化合物的編碼區(qū)。這些轉(zhuǎn)化標(biāo)記包括其它營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記(例如pyrG或riboB)和抗生素抗性基因(例如在真菌中授予fleomycin或潮霉素B抗性的基因)。這些方法基本上與這里所用的并包括在本發(fā)明中的那些方法相當(dāng)。圖2顯示了這些方法中的一個(gè)方法，該方法用于改變產(chǎn)黃青霉的pahA基因。在這種情況下，在失活的構(gòu)建體中，嵌合基因已經(jīng)替代了pahA基因的內(nèi)部區(qū)域，在嵌合基因中，產(chǎn)黃青霉的gdh基因(編碼谷氨酸脫氫酶活性的基因)的啟動(dòng)子控制了細(xì)菌bleR基因的表達(dá)，該基因的表達(dá)授予了對(duì)抗生素fleomycin的抗性。含有失活構(gòu)建體的質(zhì)粒被稱為pALP696。所以，由轉(zhuǎn)化體在含有fleomycin的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力可以選擇轉(zhuǎn)化體(Kolar,M.,Punt,P.J.,van del Hondel,C.A.M.J.J.和Schwab,H.基因62:127-134,1988)。
另外，通過(guò)反向遺傳學(xué)在已經(jīng)克隆和鑒定的基因中可以利用其它策略產(chǎn)生失去功能的突變。例如，利用攜帶靶基因的內(nèi)部片斷的環(huán)狀質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)化體DNA的單一拷貝的同源整合后，產(chǎn)生該基因的兩個(gè)不完全的拷貝，如果質(zhì)粒中包括的片斷是經(jīng)過(guò)適當(dāng)選擇的，這兩個(gè)拷貝缺乏功能。通過(guò)反向遺傳學(xué)在需要的基因中利用這些或其它策略產(chǎn)生失去功能的突變的方法也包括在本發(fā)明中。
去除了參與在乙酸苯酯的修飾或分解代謝過(guò)程中的酶的真菌菌株顯示了其具有提高青霉素產(chǎn)量的特性。況且這些真菌菌株在青霉素生產(chǎn)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力與親本菌株沒(méi)有區(qū)別。例如，含有如上所述的phacA替代基因的構(gòu)巢曲霉轉(zhuǎn)化體(即，缺乏乙酸苯酯2-羥化酶活性)產(chǎn)生3到8倍于親本菌株所產(chǎn)生的青霉素，而且較小地依賴于加入的乙酸苯酯的量(參見(jiàn)圖3)。以這種方式，當(dāng)把乙酸苯酯從0.125％(w/v)減少到0.0625％(w/v)，在野生菌株中會(huì)導(dǎo)致青霉素產(chǎn)量的下降時(shí)，缺乏phacA基因功能的轉(zhuǎn)化體在兩個(gè)濃度的乙酸苯酯中都產(chǎn)生了高水平的青霉素。
最后，本發(fā)明不僅僅涉及phacA基因和它的同系物。這里我們正利用編碼乙酸苯酯2-羥化酶的基因，因?yàn)樵撁复呋宜岜锦シ纸獯x途徑的第一步驟，并且產(chǎn)黃青霉生產(chǎn)菌株分泌大量的2-羥基乙酸苯酯。當(dāng)它們一旦被鑒定后，利用與本文所述的相似的方法也可以使其它參與乙酸苯酯代謝的基因失活。本發(fā)明，即通過(guò)利用反向遺傳學(xué)，使真菌有機(jī)體的個(gè)別乙酸苯酯代謝基因失活，就可以提高這些真菌產(chǎn)生青霉素的產(chǎn)量，因此本發(fā)明也包括這些替代的可能性。
實(shí)施例1．克隆和鑒定構(gòu)巢曲霉的phacA基因采取了下述的步驟通過(guò)從cDNA文庫(kù)特異選擇可以分離對(duì)應(yīng)于phacA基因的cDNA克隆a)獲得對(duì)應(yīng)于基因轉(zhuǎn)錄物的cDNA群體，當(dāng)真菌在存在乙酸苯酯時(shí)生長(zhǎng)時(shí)，這些基因轉(zhuǎn)錄物得到優(yōu)選表達(dá)(用作篩選DNA文庫(kù)的“+”探針)。
將構(gòu)巢曲霉A26菌株在37℃，在適當(dāng)補(bǔ)充的最小培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該菌株來(lái)自真菌遺傳原種收藏中心(堪薩斯大學(xué)的藥學(xué)中心，微生物系)，該培養(yǎng)基含有(克/升)KPO4H2,13.6；(NH4)2SO4,2.0；MgSO4×7H2O,0.25和Fe×7H2O,0.0005，碳源是0.3％(w/v)的葡萄糖。通過(guò)分析培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度確定利用葡萄糖的時(shí)間(利用酶試劑盒)。這通常是在不斷攪拌溫育18小時(shí)后。2小時(shí)后在培養(yǎng)物中加入乙酸苯酯，直到最后濃度10毫摩爾/升，在37℃，再攪拌1小時(shí)，目的是誘導(dǎo)所述的基因的表達(dá)。在這一時(shí)間段后，過(guò)濾收集菌絲體，用水洗滌，在液氮中冷凍。冷凍干燥用于分離總RNA。將總RNA制備物通過(guò)oligo-dT纖維素親和層析分離得到poly(A+)mRNA。在存在禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(商業(yè)來(lái)源)時(shí)制備了單鏈cDNA作為引物，這一制備過(guò)程利用了2微克來(lái)自乙酸苯酯誘導(dǎo)的菌絲體和oligo-dT(15聚合體)分離的所述mRNA作為模板。將反應(yīng)物在42℃，在緩沖液中溫育1小時(shí)，緩沖液含有10毫摩爾/升Tris-HCl,pH8.8(在25℃),50毫摩爾/升KCl,0.1％Triton X-100,5毫摩爾/升MgCl2,10毫摩爾/升每種dNTP，和0.5單位的RNasin。在第一條鏈合成后，在60℃，與3摩爾/升NaOH溫育1小時(shí)去除模板RNA。在中和(用酸)后，通過(guò)用2.5倍體積的純乙醇在-80℃沉淀2小時(shí)，并離心回收單鏈DNA。用30倍過(guò)量的poly(A+)RNA除去這種cDNA,poly(A+)RNA是從開(kāi)始利用葡萄糖時(shí)回收的菌絲體分離得到的，所用的方法如Sargent,T.D.，酶學(xué)方法152:423-432,1987所述。在68℃，通過(guò)羥磷灰石層析分離cDNA-RNA雜合分子，并丟棄。如上所述將留下的cDNA與過(guò)量的poly(A+)RNA雜交，這時(shí)的poly(A+)RNA來(lái)自缺乏乙酸苯酯時(shí)培養(yǎng)的菌絲體。再次丟棄。如上所述，回收剩余的單鏈cDNA群體，這些cDNA代表了在存在乙酸苯酯時(shí)優(yōu)先表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄物。利用[α-32P]dCTP和過(guò)量的所有其它dNTP，在存在DNA聚合酶的Klenow片斷和作為引物的任意序列的六核苷酸時(shí)均一地標(biāo)記這種cDNA。將得到的32P標(biāo)記的cDNA群體(特異活性＞108cpm/毫克)用作探針，去篩選如c)部分所述構(gòu)建的cDNA文庫(kù)。
b)得到對(duì)應(yīng)于缺乏乙酸苯酯時(shí)轉(zhuǎn)錄的基因的cDNA探針(“-”探針)。
如a)部分所述合成單鏈cDNA并用32P標(biāo)記，但是利用的mRNA來(lái)自在含有葡萄糖培養(yǎng)基中的葡萄糖用盡時(shí)并在缺乏乙酸苯酯情況，在37℃再溫育1小時(shí)所得到的菌絲體。
c)在λgt10載體中構(gòu)建cDNA文庫(kù)，構(gòu)建過(guò)程利用的cDNA來(lái)自加入10毫摩爾/升乙酸苯酯作為唯一碳源時(shí)培養(yǎng)的菌絲體。
為了構(gòu)建這種cDNA文庫(kù)，如前面所述方法進(jìn)行第一條cDNA鏈的合成反應(yīng)。將得到的cDNA-RNA雜合體轉(zhuǎn)化成雙鏈cDNA，方法是利用Rnase H在RNA鏈中導(dǎo)入任意裂口，將這些裂口用作引物點(diǎn)，并利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ。為了在這一末端平齊化的cDNA制備物中加上EcoRⅠ末端，將含有平齊化磷酸化末端的合成受接合體具有雙鏈cDNA的EcoRⅠ突出端在加入T4 DNA連接酶情況下溫育。然后純化具有EcoRⅠ末端的cDNA，并用T4多聚核苷酸激酶和ATP磷酸化。將磷酸化的cDNA與λgt10載體的群體混合，這一載體已經(jīng)預(yù)先用EcoRⅠ消化并脫磷酸化，用混合物與T4 DNA連接酶一起溫育。利用商業(yè)包裝提取物，體外包裝重組DNA分子。由于在大腸桿菌hfl菌株(F-,thi-1,leuB6,lacYl,tonA21,supE44,hflA150,[chr::Tn10]中的溶菌表現(xiàn)型選擇出重組噬菌體，在這些噬菌體中cDNA插入片斷已經(jīng)使cⅠ基因失活(其中存在EcoRⅠ位點(diǎn))。通過(guò)這種方法，得到了總共107個(gè)重組克隆。
d)cDNA文庫(kù)篩選利用在大腸桿菌C600hfl+菌株中形成的溶菌斑選出cDNA文庫(kù)，并將得到的溶菌斑轉(zhuǎn)印到硝基纖維濾膜上。一個(gè)復(fù)膜與“+”cDNA探針(a)中所述)雜交，另一個(gè)復(fù)膜與“-”cDNA探針(b)中所述)雜交。然后選擇與“+”探針雜交，與“-”探針不雜交的克隆并純化。
e)對(duì)應(yīng)于phacA基因的cDNA鑒定利用了包含在EcoRⅠ接合體的NotⅠ切割位點(diǎn)，通過(guò)用內(nèi)切核酸酶NotⅠ消化，從載體中切出了cDNA插入片斷。在用NotⅠ消化的pBluescript SK(+)質(zhì)粒選擇克隆的插入片斷被亞克隆化，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)它們測(cè)序。在六個(gè)可能的讀碼框架中翻譯cDNA插入片斷的序列，并將該序列與利用BLAST公式，在公共可得的DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank和EMBL的六個(gè)讀碼框架中的概念性翻譯比較或與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)SwissProt和PIR比較。cDNA插入片斷的一個(gè)序列產(chǎn)生了擴(kuò)展的開(kāi)放讀碼框架，這一框架沒(méi)有被終止密碼子中斷。推斷的氨基酸序列表現(xiàn)了與細(xì)胞色素P450家族中的蛋白質(zhì)的氨基酸序列明顯的同一性，該家族蛋白通常參與氧化反應(yīng)。正如后面將顯示的(參見(jiàn)實(shí)施例3)，該開(kāi)放讀碼框架編碼乙酸苯酯2-羥化酶。通過(guò)雜交，利用這一cDNA插入片斷得到了對(duì)應(yīng)于這一基因的新cDNA克隆。對(duì)這些克隆的兩條鏈測(cè)序，得到的核苷酸序列顯示了長(zhǎng)度為1554個(gè)bp的完全開(kāi)放的讀碼框架(沒(méi)有翻譯終止密碼)，這一讀碼框架編碼518個(gè)氨基酸的多肽(SEQ ID NO:2)。這一序列與細(xì)胞色素P450蛋白質(zhì)家族成員的同一性明確地決定了這一推斷的蛋白質(zhì)代表這一家族的新成員。
f)phacA基因的克隆利用對(duì)應(yīng)于幾乎完全的轉(zhuǎn)錄物的32P-標(biāo)記的cDNA探針在λEMBL4載體中篩選構(gòu)建的構(gòu)巢曲霉基因組DNA文庫(kù)。純化陽(yáng)性克隆，利用限制性酶消化和與上面提到的探針雜交鑒定它們的插入片斷。以這種方法，將兩個(gè)鄰接的長(zhǎng)度為2.4kb和1.9kb的BamHⅠ片斷的雜交區(qū)圖譜定位。圖4顯示了含有這些片斷的基因組區(qū)的限制圖譜。將所述的BamHⅠ片斷亞克隆進(jìn)pBluescript SK(+)。將含有2.4kb的BamHⅠ片斷的重組質(zhì)粒命名為pBS-FG4A，而攜帶1.9kb BamHⅠ片斷的質(zhì)粒命名為pBS-FG4B。
實(shí)施例2．克隆和鑒定產(chǎn)黃青霉的pahA基因，該基因是構(gòu)巢曲霉的phacA基因的功能同系物a)克隆和確定產(chǎn)黃青霉的pahA基因的核苷酸序列利用(32P)放射性標(biāo)記的探針篩選產(chǎn)黃青霉威斯康星54-1255的基因組DNA文庫(kù)，該文庫(kù)是利用克隆進(jìn)λEMBL4的BamHⅠ位點(diǎn)的部分Sau3A片斷構(gòu)建的，該探針含有長(zhǎng)度差不多完全的phacA基因的cDNA。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)約將12,000個(gè)克隆轉(zhuǎn)移到纖維素濾膜上。然后，在37℃，在緩沖液中雜交24小時(shí)，緩沖液含有50％甲酰胺，5×Denhart溶液，5×SSC,0.1％SDS,50微克/毫升超聲波處理的鯡魚(yú)精子單鏈DNA和50納克標(biāo)記探針。雜交濾過(guò)物在0.2×SSC,0.1％SDS中，在37℃進(jìn)行最后洗滌。用這一方法純化了10個(gè)克隆，分離它們的DNA。然后，利用限制酶消化和與前面所述探針雜交鑒定所述克隆的插入片斷。雜交區(qū)定位于2.55kbXhoⅠ片斷中，圖5顯示了這一片斷的限制性圖譜。將這一DNA片斷亞克隆進(jìn)質(zhì)粒pBluescript SK(+)中，產(chǎn)生的質(zhì)粒稱為pALP520。通過(guò)二脫氧核苷酸方法可以確定XhoⅠ片斷的核苷酸序列，該片斷含有pahA基因(圖5)(Sanger,F.,Nicklen,S.和Coul son,A.R.(1977)美國(guó)核酸科學(xué)進(jìn)程74,5463-5467)。
b)在青霉素生產(chǎn)條件下，從純化的RNA構(gòu)建產(chǎn)黃青霉cDNA文庫(kù)和鑒定對(duì)應(yīng)于pahA基因的cDNA。
產(chǎn)黃青毒的工業(yè)菌株的發(fā)酵罐培養(yǎng)物在青毒素G生產(chǎn)條件下溫育100,124和148小時(shí)后，收集生長(zhǎng)的菌絲體，并利用Poly(A)Quick mRNA純化試劑盒(Stratagene)從中得到poly(A+)mRNA。根據(jù)制造商的說(shuō)明，利用Zap-cDNA合成試劑盒(Stratagene)，將上面poly(A+)mRNA作為模板構(gòu)建cDNA文庫(kù)。將此雙鏈cDNA插入在噬菌體載體λZAP的EcoRⅠ和XhoⅠ限制位點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)錄物的5’區(qū)定位于EcoRⅠ位點(diǎn)一側(cè)。利用GigapackⅡGold包裝提取物(Stratagene)包裝cDNA文庫(kù)，產(chǎn)生約106個(gè)獨(dú)立的克隆。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook,J.Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，紐約)進(jìn)行這種cDNA文庫(kù)的篩選，其中利用了含有pahA基因的1174bp的EcoRV片斷作為探針(圖5)。以這種方法，分離了12個(gè)陽(yáng)性重組克隆(稱為#1到#12)，選擇含有最大尺寸(約1600bp)的插入片斷的克隆用于鑒定。然后確定這一克隆的全部核苷酸序列，從它的序列觀察到它包括1548個(gè)bp的開(kāi)放讀碼框架(ORF)，這一ORF編碼516個(gè)氨基酸的多肽，多肽的分子量為58，112道爾頓，與構(gòu)巢曲霉的phacA基因編碼的蛋白質(zhì)有84％的同一性。正如它的同源構(gòu)巢曲霉基因的情況一樣，數(shù)據(jù)庫(kù)的研究表明在pahA蛋白和P450蛋白家族之間有相當(dāng)大的同一性。PahA蛋白含有序列Gly-X-Gly-X-X-X-Cys-X-Gly(殘基430-438,SEQ ID NO:4)，這一序列是這一類(lèi)型的蛋白質(zhì)的特征(參見(jiàn)本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明)。從這些結(jié)果可以得出結(jié)論，產(chǎn)黃青霉的pahA基因是構(gòu)巢曲霉的pahA基因的同系物。
實(shí)施例3．通過(guò)反向遺傳學(xué)使構(gòu)巢曲霉的phacA基因失活用突變等位基因替代構(gòu)巢曲霉的phacA基因的野生型等位基因，在突變等位基因中，可能是它的功能的關(guān)鍵的編碼區(qū)的一部分(SEQ ID NO:1中的殘基298到392)受到抑制，被argB+基因替代。這一遺傳操作在密碼子297將phacA基因截短，產(chǎn)生了無(wú)效的突變等位基因。
另外，從pBS-FG4B純化出1.7kb的KpnⅠ-EcoRⅠ片斷(圖4)并亞克隆進(jìn)pUC18，該質(zhì)粒已經(jīng)用上面兩種酶消化，產(chǎn)生質(zhì)粒pUCB。然后從pBS-FG4A純化出1.9kb的NaeⅠ片斷(圖4)并克隆進(jìn)用SmaⅠ消化的pBluescriptSK(+)中。選擇質(zhì)粒，該質(zhì)粒中的不完全的phacA基因的編碼鏈(從NaeⅠ位點(diǎn)開(kāi)始)的定向與載體中的編碼β-半乳糖苷酶的基因相同取向。這一質(zhì)粒稱為pBSA。從pBSA中純化XbaI-HindⅢDNA片斷，插入用XbaⅠ-HindⅢ消化的pUCB中，產(chǎn)生質(zhì)粒pUCA-B。最后，在pUCA-B的唯一XbaⅠ位點(diǎn)插入含有構(gòu)巢曲霉的argB+基因的3.2kb的DNA片斷，產(chǎn)生pPhacA::argB+。從pUC18的lacZ啟動(dòng)子開(kāi)始，pPhacA::argB包括phacA基因的5’區(qū)的0.94kb的片斷，隨后接著質(zhì)粒的基因組序列開(kāi)始的297個(gè)密碼子，含有argB基因的3.2kb的片斷，對(duì)應(yīng)于密碼子393-518的phacA基因的基因組序列和phacA基因的3’區(qū)1.2kb。通過(guò)EcoRⅠ消化，從質(zhì)粒中純化出含有所有這些區(qū)域的線性片斷(圖6)。
同樣，轉(zhuǎn)化方法可以用于構(gòu)建含有破壞-缺失突變的phacA基因的構(gòu)巢曲霉的菌株，其中利用了上面的線性EcoRⅠ片斷和上面所述的圖中概括的方案。為了這一目的，利用2微克所述的DNA片斷轉(zhuǎn)化構(gòu)巢曲霉biAl,methG1,argB2的菌株的原生質(zhì)體，所用的方案來(lái)自Tilburn,J.,Scazzocchio,C.,Taylor,G.G.,Zabicky-Zissman,J.H.,Lockington,R.A.和Davies,R.W.(1983)基因26:205-211。利用適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基選擇精氨酸原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化體，然后純化。從對(duì)應(yīng)于一系列轉(zhuǎn)化體的菌絲體中分離DNA，用PstⅠ消化，利用特異的phacA和argB基因探針，通過(guò)Southern雜交分析。如圖1所示，許多轉(zhuǎn)化體顯示了希望得到的成功的雙互交的雜交方式。例如，利用phacA基因的0.9kb的PstⅠ片斷作為探針(參見(jiàn)圖4)，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化體中3.8kb的帶已經(jīng)替代了受體菌株中單一的0.9kb PstⅠ雜交帶，這展示了圖1顯示的整合類(lèi)型。這一帶也與argB探針雜交。選擇這些轉(zhuǎn)化體中的兩個(gè)，隨后鑒定，命名為ΔphacA#1和ΔphacA#2。這些轉(zhuǎn)化體菌株在將丙氨酸苯酯，2-羥基乙酸苯酯或2,5-二羥基乙酸苯酯作為唯一碳源的培養(yǎng)基中具有生長(zhǎng)能力，但與此相反，它們?cè)趯⒁宜岜锦プ鳛槲ㄒ惶荚吹呐囵B(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。這支持了這樣的結(jié)論，即構(gòu)巢曲霉的phacA基因編碼的細(xì)胞色素P450酶(擴(kuò)展到產(chǎn)黃青霉的pahA基因編碼的一個(gè))具有將乙酸苯酯羥基化成為2-羥基乙酸苯酯的活性，這一活性催化構(gòu)巢曲霉中乙酸苯酯利用途徑的第一個(gè)步驟(參見(jiàn)以前的技術(shù)部分)。構(gòu)巢曲霉菌株ΔphacA#1與ΔphacA#2在表現(xiàn)型上有區(qū)別，與構(gòu)巢曲霉biA1 veA1 methG1 argB2 phacA::[pPhacA::argB+]一樣，構(gòu)巢曲霉菌株ΔphacA#1于1996年6月19日保藏在西班牙培養(yǎng)物類(lèi)型收藏處(CECT),Valencia大學(xué)，研究大樓，Burjasot Campus,46100,Valencia，登記號(hào)為CECT 20195。獲得含有失活的pahA基因的產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)化體的方法是本領(lǐng)域任何技術(shù)人員所非常熟悉的。簡(jiǎn)單地，該方法將包括分離產(chǎn)黃青霉的pahA基因，方法是與存在于轉(zhuǎn)化體CECT20195中的構(gòu)巢曲霉的phacA基因雜交或選擇性地與根據(jù)SEQ ID NO:1合成的低聚核苷酸雜交。如本發(fā)明的圖7所示，利用質(zhì)粒pALfleo7(保藏于西班牙培養(yǎng)物類(lèi)型收藏處，Valencia大學(xué)，研究大樓，Burjasot Campus,46100,Valencia,1997年2月20日，登記號(hào)為CECT 4849)，可以構(gòu)建質(zhì)粒pALP696。
實(shí)施例4失活phacA基因的功能和增加青霉素產(chǎn)量的實(shí)驗(yàn)為了證實(shí)是否去除由phacA基因編碼的乙酸苯酯2-羥化酶活性可以使青霉素產(chǎn)量提高，我們進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，測(cè)量菌株ΔphacA生產(chǎn)的青霉素水平并和菌株phacA+比較。在燒瓶中的最小培養(yǎng)基中發(fā)酵比較兩個(gè)菌株，最小培養(yǎng)基含有2.5％(w/v)乳糖作為基本碳源，和2.5％(w/v)玉米浸漬液，和如標(biāo)明的不同量的乙酸苯酯鈉(w/v)。在所有情況中，都用相等數(shù)目的活的分生孢子(2×106個(gè)/毫升)接種培養(yǎng)物，在37℃，有規(guī)律地?cái)嚢?250rpm)溫育。在各種時(shí)間取樣，通過(guò)Miracloth過(guò)濾，上清液用于生物測(cè)試，測(cè)量生產(chǎn)的青霉素。
在生物測(cè)試中，將生長(zhǎng)到0D600=6的藤黃微球菌的培養(yǎng)物1毫升與Antibiotic1號(hào)培養(yǎng)基(Difco)1升在50℃混合。將這一混合物注入13.6厘米的培養(yǎng)皿(65毫升/盤(pán))中。將10微升來(lái)自培養(yǎng)物的上清液的樣品(適當(dāng)用10毫摩爾/升，pH6.8磷酸鈉緩沖液稀釋)分配在8毫米直徑的孔中。平板在4℃，溫育2小時(shí)，然后在37℃再溫育22小時(shí)。最后，測(cè)量由于樣品中存在的青霉素引起的細(xì)菌生長(zhǎng)抑制區(qū)的直徑，與校正線比較估算抗生素的量，校正線是利用不同量的青霉素G鉀制作的。
圖3顯示了在生產(chǎn)培養(yǎng)基中利用0.125％的乙酸苯酯培養(yǎng)24小時(shí)后，得到與菌株phacA+相對(duì)應(yīng)的菌株最高水平的青霉素產(chǎn)量。這時(shí)得到的青霉素產(chǎn)量是1.8微克/毫升。將乙酸苯酯的濃度減半，使這一菌株產(chǎn)生的青霉素的最高水平減少到1.1微克/毫升。
圖3也顯示，在菌株ΔphacA的培養(yǎng)物中青霉素的最高水平與親本菌株有明顯差別，達(dá)到5.6微克/毫升，即比親本菌株高3.1倍。另外，作為失活phacA基因的結(jié)果，將乙酸苯酯的開(kāi)始濃度減少到0.0625％不影響青霉素產(chǎn)量的增加。
結(jié)論是如圖1所示通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)進(jìn)行編碼乙酸苯酯2-羥化酶活性的phacA基因的破壞-缺失突變，至少在構(gòu)巢曲霉生產(chǎn)青霉素過(guò)程中產(chǎn)生兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)(ⅰ)青霉素水平有相當(dāng)大的提高和(ⅱ)青霉素水平更少地依賴于乙酸苯酯的外部供應(yīng)。
附圖的詳細(xì)說(shuō)明圖1通過(guò)同源重組在構(gòu)巢曲霉的phacA基因中產(chǎn)生破壞-缺失突變的方案。用黑體的大叉表示推斷的交互連接。
圖2通過(guò)同源重組在產(chǎn)黃青霉的pahA基因中產(chǎn)生破壞-缺失突變的方案。大的虛線叉表示了推斷的交互連接。
圖3與野生型菌株(phacA+)比較構(gòu)巢曲霉的轉(zhuǎn)化phacA::argB菌株的青霉素產(chǎn)量。橫坐標(biāo)時(shí)間，小時(shí)(h)；縱坐標(biāo)青霉素產(chǎn)量(微克/毫升)。連續(xù)的實(shí)線乙酸苯酯濃度為0.125％；斷線乙酸苯酯濃度為0.0625％。
圖4含有構(gòu)巢曲霉的phacA基因的基因組區(qū)的限制圖譜，顯示了亞克隆產(chǎn)生pFG4A和pFG4B的片斷，黑區(qū)是3個(gè)內(nèi)含子。
圖5含有產(chǎn)黃青霉的pahA基因的基因組區(qū)的限制圖譜。顯示了亞克隆產(chǎn)生pALP520的2.55kb的XhoⅠ片斷。黑區(qū)是3個(gè)內(nèi)含子。
圖6:pPhacA::argB+失活構(gòu)建體的限制圖譜和相關(guān)的特征。黑區(qū)是含有phacA基因的測(cè)序區(qū)；空白區(qū)是在phacA基因前后的側(cè)接區(qū)；條紋區(qū)是argB+區(qū)。
圖7:pALP696失活構(gòu)建體的限制圖譜和相關(guān)特征。黑區(qū)是含有pahA基因的測(cè)序區(qū)(1745bp)；空白區(qū)是pahA基因前后的側(cè)接區(qū)(4143bp)；條紋區(qū)是fleomycin抗性區(qū)，基因bleR(2048bp)。
序列表總的情況申請(qǐng)人姓名抗生素有限公司(ANTIBIOTICOS,S.A.U)街道Avda.de Burgos,8-A城市馬德里州或省馬德里國(guó)家西班牙郵政編碼28036電話91-3841200傳真91-3841220題目“使編碼乙酸苯酯分解代謝酶的基因失活的方法，包括質(zhì)粒，和用它們轉(zhuǎn)化的菌株”序列數(shù)4通訊地址收信人抗生素有限公司(ANTIBIOTICOS,S.A.U)街道Avda.de Burgos,8-A城市馬德里州或省馬德里國(guó)家西班牙郵政編碼28036機(jī)器可讀形式介質(zhì)類(lèi)型3.5”軟盤(pán)計(jì)算機(jī)PC操作系統(tǒng)WINDOWS軟件WORD律師/代理人的情況姓名阿伯特 伊麗沙白(ALBERTO DE ELZABURU)登記號(hào)232/1登記號(hào)PCT-42電信資料電話91 7009400傳真91 3193810電子信箱elzaburu@elzaburu.esSEQ ID N0:1的特征長(zhǎng)度1986個(gè)堿基對(duì)類(lèi)型核苷酸鏈數(shù)2構(gòu)型線性分子類(lèi)型基因組DNA假設(shè)沒(méi)有反義鏈沒(méi)有原始來(lái)源構(gòu)巢曲霉直接來(lái)源質(zhì)粒pPhacA::argB+
基因組的位置未知特征名稱/關(guān)鍵詞編碼序列定位820…1810其它信息phacA基因序列描述SEQ ID NO:1C CAGCCAGATA TAAAGGCCGT 21CCTTAGACGA CTTGATCTTA CTCTGGTTTC TAAAAGTTCA CTGATTATCG CAAGGTATCC 81ATG TCT CTT CAA ACA ATC GGG ATC GCC GCT GTC GCG GTG GTC TAT TTT 129Met Ser Leu Gln Thr Ile Gly Ile Ala Ala Val Ala Val Val Tyr Phe5 10 15CTC ATC CGC TAC TTC AAC CGC ACA GAC ATC CCA AAG ATC AAG GGT CTC 177Leu Ile Arg Tyr Phe Asn Arg Thr Asp Ile Pro Lys Ile Lys Gly Leu20 25 30CCT GAA GTT CCA GGC GTA CCG ATC TTT GGC AAC CTC ATC CAG CTC GGT 225Pro Glu Val Pro Gly Val Pro Ile Phe Gly Asn Leu Ile Gln Leu Gly35 40 45GAC CAG CAC GCG ACC GTA GCG CAG AAA TGG GCG AAG AAA TTT GGA CCT 273Asp Gln His Ala Thr Val Ala Gln Lys Trp Ala Lys Lys Phe Gly Pro50 55 60GTT TTC CAG GTT CGC ATG GGGAAT AAA GTGAGTTCAG TGTCTGCATT TGTAAC 326Val Phe Gln Val Arg Met Gly Asn Lys65 70AGAC GACAATATTG CGAGAATAAT TCTGACCTAA CACAG CGC GTT GTC TTC GCA 380Arg Val Val Phe Ala75AAC ACC TTC GAC TCT GTC CGT CAG CTA TGG ATC AAA GAT CAG TCC GCG 428Asn Thr Phe Asp Ser Val Arg Gln Leu Trp Ile Lys Asp Gln Ser Ala80 85 90CTC ATC TCC CGG CCG ACC TTT CAC ACC TTC CAC AGT GTA GTT TCC AGC 476Leu Ile Ser Arg Pro Thr Phe His Thr Phe His Ser Val Val Ser Ser95 100 105 110TCT CAG GGA TTC ACC ATC GGA ACG TCG CCG TGG GAC GAG TCG TGC AAG 524Ser Gln Gly Phe Thr Ile Gly Thr Ser Pro Trp Asp Glu Ser Cys Lys115 120 125CGT CGT CGG AAG GCT GCA GCT ACA GCC TTG AAC CGC CCG GCT ACC CAG 572Arg Arg Arg Lys Ala Ala Ala Thr Ala Leu Asn Arg Pro Ala Thr Gln130 135 140TCG TAT ATG CCT ATT ATC GAT CTT GAG TCG ATG TCG AGT ATC CGG GAA 620Ser Tyr Met Pro Ile Ile Asp Leu Glu Ser Met Ser Ser Ile Arg Glu145 150 155TTG CTC AGG GAT AGC GCG AAT GGA ACA ATG GAT ATC AAC CCG ACA GCG 668Leu Leu Arg Asp Ser Ala Asn Gly Thr Met Asp Ile Asn Pro Thr Ala160 165 170TAC TTC CAG CGG TTC GCG TTG AAC ACG AGC TTA ACA TTG AAC TAT GGA 716Tyr Phe Gln Arg Phe Ala Leu Asn Thr Ser Leu Thr Leu Asn Tyr Gly175 180 185 190ATC CGA ATC GAG GGC AAT GTG AAC GAT GAG CTT TTG CGC GAA ATT GTC 764Ile Arg Ile Glu Gly Asn Val Asn Asp Glu Leu Leu Arg Glu Ile Val195 200 205GAT GTC GAG CGC GGG GTG TCG AAC TTC CGG AGT ACC AGC AAC CAG TGG 812Asp Val Glu Arg Gly Val Ser Asn Phe Arg Ser Thr Ser Asn Gln Trp210 215 220CAG GAC TAT ATC CCG CTC CTG AGA ATC TTC CCG AAG ATG AAC CGC GAG 860Gln Asp Tyr Ile Pro Leu Leu Arg Ile Phe Pro Lys Met Asn Arg Glu225 230 235GCT GAG GAG TTC CGG GTG CGG AGA GAC AAG TAT CTT ACC TAT CTT TTG 908Ala Glu Glu Phe Arg Val Arg Arg Asp Lys Tyr Leu Thr Tyr Leu Leu240 245 250GAT GTT CTC AAG GAT CGC ATT GCA AAG GGA ACC GAC AAG CCC TGT ATT 956Asp Val Leu Lys Asp Arg Ile Ala Lys Gly Thr Asp Lys Pro Cys Ile255 260 265 270ACT GGA AAC ATC CTC AAA GAC CCT GAG GCT AAG CTC AAT GAT G GTATG1004Thr Gly Asn Ile Leu Lys Asp Pro Glu Ala Lys Leu Asn Asp275 280CCGTC CGGTCCTGTC CGCGCTTGAA GGAAAATAAA GATTAACAGA GTCTAG CC GAG 1060Ala Glu285ATT AAA TCG ATC TGC TTG ACC ATG GTC TCC GCC GGC CTC GAT ACT GTT 1108Ile Lys Ser Ile Cys Leu Thr Met Val Ser Ala Gly Leu Asp Thr Val290 295 300CCG GGC AAC TTG ATC ATG GGC ATC GCG TAC CTC GCC TCC GAA GAC GGC 1156Pro Gly Asn Leu Ile Met Gly Ile Ala Tyr Leu Ala Ser Glu Asp Gly305 310 315CAA AGG ATC CAG AAG CGC GCC CAC GAC GAG ATC ATG AAA GTC TAC CCG 1204Gln Arg Ile Gln Lys Arg Ala His Asp Glu Ile Met Lys Val Tyr Pro320 325 330GAC GGC GAT GCA TGG GAG AAA TGC CTG CTC GAA GAG AAA GTC CCC TAC 1252Asp Gly Asp Ala Trp Glu Lys Cys Leu Leu Glu Glu Lys Val Pro Tyr335 340 345 350GTC ACA GCT TTG GTC AAA GAA ACC CTC CGC TTC TGG ACT GTC ATT CCC 1300Val Thr Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Arg Phe Trp Thr Val Ile Pro355 360 365ATC TGT CTG CCT AGA GAA AAC ACC AAG GAT ATT GTC TGG AAC GGA GCC 1348Ile Cys Leu Pro Arg Glu Asn Thr Lys Asp Ile Val Trp Asn Gly Ala370 375 380GTT ATC CCT AAG GGA ACG ACC TTT TTC ATG AAC GCC TAC GCT GCA GAC 1396Val Ile Pro Lys Gly Thr Thr Phe Phe Met Asn Ala Tyr Ala Ala Asp385 390 395TAC GAC GAA ACA CAC TTC ACC AAT CCA CAC GCC TTT GAA CCA GAA CGC 1444Tyr Asp Glu Thr His Phe Thr Asn Pro His Ala Phe Glu Pro Glu Arg400 405 410TAC CTC ACC GCC TCA TCT GAC GGC TCC GGC ACT CCA CAC TAC GGC TAC 1492Tyr Leu Thr Ala Ser Ser Asp Gly Ser Gly Thr Pro His Tyr Gly Tyr415 420 425 430GGC GCG GGC TCG CGC ATG GTACCTCCCC CACAACCCAC ATGTTATATA GACAAT 1546Gly Ala Gly Ser Arg Met435ACTG ATTTATTATG AAG TGC GCT GGC TCG CAT CTT GCG AAC CGC GAG CTC 1596Cys Ala Gly Ser His Leu Ala Asn Arg Glu Leu440 445TTC ACC GCT TAC GTC CGT CTG ATC ACA GCA TTT ACC ATG CAT CCA GCT 1644Phe Thr Ala Tyr Val Arg Leu Ile Thr Ala Phe Thr Met His Pro Ala450 455 460AAG AGG GCT GAG GAT CGG CCG ATC CTC GAT GCG ATT GAG TGT AAT GCG 1692Lys Arg Ala Glu Asp Arg Pro Ile Leu Asp Ala Ile Glu Cys Asn Ala465 470 475ATC CCG ACC GCT TTG ACG ACG GAG CCG AAG CCC TTC AAG GTT GGG TTT 1740Ile Pro Thr Ala Leu Thr Thr Glu Pro Lys Pro Phe Lys Val Gly Phe480 485 490 495AAA CCG AGA GAT CCT GTC TTG GTA AGG AAA TGG ATT GCG GAG AGT GAG 1788Lys Pro Arg Asp Pro Val Leu Val Arg Lys Trp Ile Ala Glu Ser Glu500 505 510GAG AGG ACG AAG CAC CTG AAT TAGTTTTTCT TTTCTTTCTT GCGTGCAAGT TAC 1842Glu Arg Thr Lys His Leu Asn515AGCGCAATTT ATACTTAGCT GGGACATGGT CGATTGGAGT ATACTGATTT CAGCAACAGC 1902GCAAATAAAA ATAAGGCAAC CAATAGAAAT GCAACAATAT GCAATCTCCC AAGACCATTA 1962AATGGTTGAT CAGATGATCC CAAG1986SEQ ID NO:2的資料序列的特征長(zhǎng)度518個(gè)氨基酸類(lèi)型氨基酸鏈數(shù)1構(gòu)型線性分子類(lèi)型肽原始來(lái)源構(gòu)巢曲霉特征其它信息乙酸苯酯2-羥化酶的氨基酸序列特征其它信息分子量58495道爾頓序列描述SEQ ID NO:2Met Ser Leu Gln Thr Ile Gly Ile Ala Ala Val Ala Val Val Tyr5 10 15Phe Leu Ile Arg Tyr Phe Ash Arg Thr Asp Ile Pro Lys Ile Lys20 25 30Gly Leu Pro Glu Val Pro Gly Val Pro Ile Phe Gly Asn Leu Ile35 40 45Gln Leu Gly Asp Gln His Ala Thr Val Ala Gln Lys Trp Ala Lys50 55 60Lys Phe Gly Pro Val Phe Gln Val Arg Met Gly Asn Lys Arg Val65 70 75Val Phe Ala Asn Thr Phe Asp Ser Val Arg Gln Leu Trp Ile Lys80 85 90Asp Gln Ser Ala Leu Ile Ser Arg Pro Thr Phe His Thr Phe His95 100 105Ser Val Val Ser Ser Ser Gln Gly Phe Thr Ile Gly Thr Ser Pro110 115 120Trp Asp Glu Ser Cys Lys Arg Arg Arg Lys Ala Ala Ala Thr Ala125 130 135Leu Asn Arg Pro Ala Thr Gln Ser Tyr Met Pro Ile Ile Asp Leu140 145 150Glu Ser Met Ser Ser Ile Arg Glu Leu Leu Arg Asp Ser Ala Asn155 160 165Gly Thr Met Asp Ile Asn Pro Thr Ala Tyr Phe Gln Arg Phe Ala170 175 180Leu Asn Thr Ser Leu Thr Leu Asn Tyr Gly Ile Arg Ile Glu Gly185 190 195Asn Val Asn Asp Glu Leu Leu Arg Glu Ile Val Asp Val Glu Arg200 205 210Gly Val Ser Asn Phe Arg Ser Thr Ser Asn Gln Trp Gln Asp Tyr215 220 225Ile Pro Leu Leu Arg Ile Phe Pro Lys Met Asn Arg Glu Ala Glu230 235 240Glu Phe Arg Val Arg Arg Asp Lys Tyr Leu Thr Tyr Leu Leu Asp245 250 255Val Leu Lys Asp Arg Ile Ala Lys Gly Thr Asp Lys Pro Cys Ile260 265 270Thr Gly Asn Ile Leu Lys Asp Pro Glu Ala Lys Leu Asn Asp Ala275 280 285Glu Ile Lys Ser Ile Cys Leu Thr Met Val Ser Ala Gly Leu Asp290 295 300Thr Val Pro Gly Asn Leu Ile Met Gly Ile Ala Tyr Leu Ala Ser305 310 315Glu Asp Gly Gln Arg Ile Gln Lys Arg Ala His Asp Glu Ile Met320 325 330Lys Val Tyr Pro Asp Gly Asp Ala Trp Glu Lys Cys Leu Leu Glu335 340 345Glu Lys Val Pro Tyr Val Thr Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Arg350 355 360Phe Trp Thr Val Ile Pro Ile Cys Leu Pro Arg Glu Asn Thr Lys365 370 375Asp Ile Val Trp Asn Gly Ala Val Ile Pro Lys Gly Thr Thr Phe380 385 390Phe Met Asn Ala Tyr Ala Ala Asp Tyr Asp Glu Thr His Phe Thr395 400 405Asn Pro His Ala Phe Glu Pro Glu Arg Tyr Leu Thr Ala Ser Ser410 415 420Asp Gly Ser Gly Thr Pro His Tyr Gly Tyr Gly Ala Gly Ser Arg425 430 435Met Cys Ala Gly Ser His Leu Ala Asn Arg Glu Leu Phe Thr Ala440 445 450Tyr Val Arg Leu Ile Thr Ala Phe Thr Met His Pro Ala Lys Arg455 460 465Ala Glu Asp Arg Pro Ile Leu Asp Ala Ile Glu Cys Asn Ala Ile470 475 480Pro Thr Ala Leu Thr Thr Glu Pro Lys Pro Phe Lys Val Gly Phe485 490 495Lys Pro Arg Asp Pro Val Leu Val Arg Lys Trp Ile Ala Glu Ser500 505 510Glu Glu Arg Thr Lys His Leu Asn515SEQ ID NO:3的資料序列的特征長(zhǎng)度2558個(gè)堿基對(duì)類(lèi)型核苷酸鏈數(shù)2構(gòu)型線性分子類(lèi)型基因組DNA假設(shè)沒(méi)有反義鏈沒(méi)有原始來(lái)源產(chǎn)黃青霉直接來(lái)源質(zhì)粒pALP520基因組中的位置未知特征名稱/關(guān)鍵詞編碼序列定位371…2094其它信息pahA基因序列描述SEQ ID NO:3CTCGAGAAGG TCTGTTGACA CGAGTCCACA AGATGTTGCG AAGTATATAA TATGAGAAAT 60GGATATACAG CGGAAAATTG AAGTTTCATT CCGCGGGGGC GGGGAACAAG AGGAAGCGCG 120GAATGAACAT TCCGTCTATG CGCGGTGGAG AGATCTTCGA ACTGGGGACT TGTGGACTTG 180GACCTATGAG AGAGCTGCCT TTACTGATTC TGGGACTTGT GGCCAATGAA ACATGTCATG 240GATGTTACAG CTTTCTTTAT GCGACTCTCT AAACTCGGAA ATATGCCGTA GCCGAAATGC 300AGGAAAGGCT GGGCTATAAG AGATGCATGC TCCCACCGAA CGTCTGCAAT TCCTTGTTTC 360ACTCTATATC ATG GCC ATC CAA ACA CTC GCA GTC GCC GTG ATC ACG GTG GTC412Met Ala Ile Gln Thr Leu Ala Val Ala Val Ile Thr Val Val5 10TAT TTC GTC ATT CGA TAC TTC AAC CGC ACT GAT ATC CCT AAG ATT AAA 460Tyr Phe Val Ile Arg Tyr Phe Asn Arg Thr Asp Ile Pro Lys Ile Lys15 20 25 30GGC CTC CCG GAG ATT CCT GGT ATA CCC ATA TTT GGC AAT CTA TTG CAG 508Gly Leu Pro Glu Ile Pro Gly Ile Pro Ile Phe Gly Asn Leu Leu Gln35 40 45CTA GGA GAT CAA CAT GCC ACA GTC ACG GGG AAA TGG GCA AAG AAA TTT 556Leu Gly Asp Gln His Ala Thr Val Thr Gly Lys Trp Ala Lys Lys Phe50 55 60GGC CCA GTT TTC CAA GTG CGC ATG GGA AAC AAG GTAAGTAATC AAATAATCTT 609Gly Pro Val Phe Gln Val Arg Met Gly Asn Lys65 70TTAAATCGGA CATTCTGATA ATCTAATGCC CTTTTAG CGC ATC GTG TTC GCC AAC 664Arg Ile Val Phe Ala Asn75GGC TTT GAC TCC GTT CGT CAA TTG TGG ATT AAG GAC TCG TCG GCT CTG 712Gly Phe Asp Ser Val Arg Gln Leu Trp Ile Lys Asp Ser Ser Ala Leu80 85 90 95ATC TCC CGC CCA ACT TTC CAC ACT TTC CAC AGC GTC GTC TCC AGT TCA 760Ile Ser Arg Pro Thr Phe His Thr Phe His Ser Val Val Ser Ser Ser100 105 110CAG GGC TTC ACG ATC GGA ACT TCC CCG TGG GAT GAT TCC TGT AAG AAA 808Gln Gly Phe Thr Ile Gly Thr Ser Pro Trp Asp Asp Ser Cys Lys Lys115 120 125CGT CGC AAG GCA GCT GCC ACT GCG CTG AAT CGA CCG GCC GTG CAA TCG 856Arg Arg Lys Ala Ala Ala Thr Ala Leu Asn Arg Pro Ala Val Gln Ser130 135 140TAT ATG CCC ATC ATC GAT CTT GAA TCC AAT TCC AGC ATC AAA GAA CTG 904Tyr Met Pro Ile Ile Asp Leu Glu Ser Asn Ser Ser Ile Lys Glu Leu145 150 155TAC CGG GAC AGC CAA AAT GGC AAA CGT GAT GTG AAT CCC ACT GCA TAC 952Tyr Arg Asp Ser Gln Asn Gly Lys Arg Asp Val Asn Pro Thr Ala Tyr160 165 170 175TTC CAG CGA TAC GCT TTC AAC ACC AGT TTG ACT TTG AAC TAT GGA TTC 1000Phe Gln Arg Tyr Ala Phe Asn Thr Ser Leu Thr Leu Asn Tyr Gly Phe180 185 190CGC ATC GAG GGC AAT GTG GAT GAT ACG CTG CTG CAT GAG ATT GTG GAT 1048Arg Ile Glu Gly Asn Val Asp Asp Thr Leu Leu His Glu Ile Val Asp195 200 205GTG GAG CGT GGT GTG TCC AAC TTC CGC AGC ACT TCG AAC AAC TGG CAG 1096Val Glu Arg Gly Val Ser Asn Phe Arg Ser Thr Ser Asn Asn Trp Gln210 215 220GAC TAC ATT CCC CTA TTG CGC ATT TTC CCC AAG ATG AAC AAT GAG GCC 1144Asp Tyr Ile Pro Leu Leu Arg Ile Phe Pro Lys Met Asn Asn Glu Ala225 230 235GCT GAC TTC CGG GGT CGC CGT GAT AAA TAT CTG ACC TAC TTG CTC GAT 1192Ala Asp Phe Arg Gly Arg Arg Asp Lys Tyr Leu Thr Tyr Leu Leu Asp240 245 250 255ATG CTC AAG GAT CGA ATC GCC AAG GGA ACC GAT AAG CCT TGC ATC ACT 1240Met Leu Lys Asp Arg Ile Ala Lys Gly Thr Asp Lys Pro Cys Ile Thr260 265 270GGT AAT ATC TTG AAG GAT CCC GAG GCT AAG CTG AAT GAT G GTGAGTTACA 1290Gly Asn Ile Leu Lys Asp Pro Glu Ala Lys Leu Asn Asp275 280AAATCTCGCG AAATCTTTGT GAATGTTGGT ATTGAGTACT CATCTATCGT CTAG CC 1346Ala285GAG GTG AAA TCG ATC TGT TTG ACT ATG GTG TCG GCT GGC CTT GAC ACC 1394Glu Val Lys Ser Ile Cys Leu Thr Met Val Ser Ala Gly Leu Asp Thr290 295 300GTT CCG GGC AAC TTG ATT ATG GGA ATT GCC TAC CTG GCA TCT GAA GAC 1442Val Pro Gly Asn Leu Ile Met Gly Ile Ala Tyr Leu Ala Ser Glu Asp305 310 315GGC CAA AGA ATT CAG AAA AAG GCC TAT GAT GCA ATC ATG GAG GTA TAC 1490Gly Gln Arg Ile Gln Lys Lys Ala Tyr Asp Ala Ile Met Glu Val Tyr320 325 330CCG GAC GGC GAT GCT TGG GAG AAA TGT TTG GTG GAG GAG AAG GTC CCT 1538Pro Asp Gly Asp Ala Trp Glu Lys Cys Leu Val Glu Glu Lys Val Pro335 340 345TAT GTG ACG GCA CTG GTC AAG GAG GTC TTG CGC TTC TGG ACG GTC ATT 1586Tyr Val Thr Ala Leu Val Lys Glu Val Leu Arg Phe Trp Thr Val Ile350 355 360 365CCT ATT TGT CTG CCA CGC GAG AGC ACC AAG GAT ATC CAG TGG AAT GGA 1634Pro Ile Cys Leu Pro Arg Glu Ser Thr Lys Asp Ile Gln Trp Asn Gly370 375 380GCT ACA ATC CCT GCC GGG ACG ACC TTT TTC ATG GTATGTTGCG CCTTGCTTCT 1687Ala Thr Ile Pro Ala Gly Thr Thr Phe Phe Met385 390GTCCCTTTCG GGACGTTGCT AACAGGATCT GATAG AAT GTT TGG GCT GCC GAT1740Asn Val Trp Ala Ala Asp395TAC GAT GAA GAT CAC TTT AAG GAT GCC GAT AAA TTC ATC CCG GAG CGT 1788Tyr Asp Glu Asp His Phe Lys Asp Ala Asp Lys Phe Ile Pro Glu Arg400 405 410TAT TTG GAG GCC AGT GAG GGT GCA GGC ACT CCA CAC TAT GCA TAT GGA 1836Tyr Leu Glu Ala Ser Glu Gly Ala Gly Thr Pro His Tyr Ala Tyr Gly415 420 425 430GCG GGA TCA CGT ATG TGT GCA GGC TCA CAT CTC GCC AAT CGC GAG CTG 1884Ala Gly Ser Arg Met Cys Ala Gly Ser His Leu Ala Asn Arg Glu Leu435 440 445TTC ACT GCT TTT ATC CGC CTC GTC ACT GCT TTC AAC ATG CAC ACG GCG 1932Phe Thr Ala Phe Ile Arg Leu Val Thr Ala Phe Asn Met His Thr Ala450 455 460AAG GAG ACG GCC GAC CGA CCG ATT CTG AAT GCA ATT GAG TGC AAT TTG 1980Lys Glu Thr Ala Asp Arg Pro Ile Leu Asn Ala Ile Glu Cys Asn Leu465 470 475ATT CCG ACA GCC TTG ACA ACC GAG CCG AAG CCA TTC AAG GTT GGC TTT 2028Ile Pro Thr Ala Leu Thr Thr Glu Pro Lys Pro Phe Lys Val Gly Phe480 485 490AGT GCA CGC GAC CCT AAG AAG CTT GAG CAG TGG ATT GCT GAG AGC GAT 2076Ser Ala Arg Asp Pro Lys Lys Leu Glu Gln Trp Ile Ala Glu Ser Asp495 500 505 510GAA CGG ACC AAA GAT CTA TAAGAGGAAG TTTTATCTGA TATGATTCCC TTTTTTTTTTGlu Arg Thr Lys Asp Leu515TCGGAGGCTA TTTATGTATC TACTTGAATA TATGTGAAAT AAAGGCAATG AAGTATAGAT 2194ATAGACCTGC CCAGGTGAGA CCTACATGTA TGTAATCGAC GTCTCCCAGT ACCTATTTAG 2254GAACCGAATA GAAATTTGAG TGATGAAGGG TGAAGAATAA CCTCAGAGAA CATAGGTCTA 2314CTAAGATCTG CTAATTCTTA GACTCCTTTC CCTGAATTAT TGCCAATTTC CCCAGTTGTC 2374TCTCTCCTCT ATGACTCCCG GCCTTGTCAC ACCGGCGGAA TCTCCCCGCA TTTTCCTCGA 2434CCTCACCCTT TTCTTCCTCT TCACCCTCTC CCCATCCACT TGAAATGAAC CTCTGATCGC 2494AATCAATTGC ATCCCGAAGT CATTTTGGAT GATGAATAAT CCGCAGATGT ACCCTGTCCT 2554CGAG 2558SEQ ID NO:4的資料序列的特征長(zhǎng)度516個(gè)堿基對(duì)類(lèi)型氨基酸鏈數(shù)1構(gòu)型線性分子類(lèi)型肽特征其它信息乙酸苯酯2-羥化酶的氨基酸序列特征其它信息分子量58112道爾頓序列的描述SEQ ID NO:4Met Ala Ile Gln Thr Leu Ala Val Ala Val Ile Thr Val Val Tyr Phe1 5 10 15Val Ile Arg Tyr Phe Asn Arg Thr Asp Ile Pro Lys Ile Lys Gly Leu20 25 30Pro Glu Ile Pro Gly Ile Pro Ile Phe Gly Asn Leu Leu Gln Leu Gly35 40 45Asp Gln His Ala Thr Val Thr Gly Lys Trp Ala Lys Lys Phe Gly Pro50 55 60Val Phe Gln Val Arg Met Gly Asn Lys Arg Ile Val Phe Ala Asn Gly65 70 75 80Phe Asp Ser Val Arg Gln Leu Trp Ile Lys Asp Ser Ser Ala Leu Ile85 90 95Ser Arg Pro Thr Phe His Thr Phe His Ser Val Val Ser Ser Ser Gln100 105 110Gly Phe Thr Ile Gly Thr Ser Pro Trp Asp Asp Ser Cys Lys Lys Arg115120 125Arg Lys Ala Ala Ala Thr Ala Leu Asn Arg Pro Ala Val Gln Ser Tyr130 135 140Met Pro Ile Ile Asp Leu Glu Ser Asn Ser Ser Ile Lys Glu Leu Tyr145 150 155 160Arg Asp Ser Gln Asn Gly Lys Arg Asp Val Asn Pro Thr Ala Tyr Phe165 170 175Gln Arg Tyr Ala Phe Asn Thr Ser Leu Thr Leu Asn Tyr Gly Phe Arg180 185 190Ile Glu Gly Asn Val Asp Asp Thr Leu Leu His Glu Ile Val Asp Val195 200 205Glu Arg Gly Val Ser Asn Phe Arg Ser Thr Ser Asn Asn Trp Gln Asp210 215 220Tyr Ile Pro Leu Leu Arg Ile Phe Pro Lys Met Asn Asn Glu Ala Ala225 230 235 240Asp Phe Arg Gly Arg Arg Asp Lys Tyr Leu Thr Tyr Leu Leu Asp Met245 250 255Leu Lys Asp Arg Ile Ala Lys Gly Thr Asp Lys Pro Cys Ile Thr Gly260 265 270Asn Ile Leu Lys Asp Pro Glu Ala Lys Leu Asn Asp Ala Glu Val Lys275 280 285Ser Ile Cys Leu Thr Met Val Ser Ala Gly Leu Asp Thr Val Pro Gly290 295 300Asn Leu Ile Met Gly Ile Ala Tyr Leu Ala Ser Glu Asp Gly Gln Arg305 310 315 320Ile Gln Lys Lys Ala Tyr Asp Ala Ile Met Glu Val Tyr Pro Asp Gly325 330 335Asp Ala Trp Glu Lys Cys Leu Val Glu Glu Lys Val Pro Tyr Val Thr340 345 350Ala Leu Val Lys Glu Val Leu Arg Phe Trp Thr Val Ile Pro Ile Cys355 360 365Leu Pro Arg Glu Ser Thr Lys Asp Ile Gln Trp Asn Gly Ala Thr Ile370 375 380Pro Ala Gly Thr Thr Phe Phe Met Asn Val Trp Ala Ala Asp Tyr Asp385 390 395 400Glu Asp His Phe Lys Asp Ala Asp Lys Phe Ile Pro Glu Arg Tyr Leu405 410 415Glu Ala Ser Glu Gly Ala Gly Thr Pro His Tyr Ala Tyr Gly Ala Gly420 425 430Ser Arg Met Cys Ala Gly Ser His Leu Ala Asn Arg Glu Leu Phe Thr435 440 445Ala Phe Ile Arg Leu Val Thr Ala Phe Asn Met His Thr Ala Lys Glu450 455 460Thr Ala Asp Arg Pro Ile Leu Asn Ala Ile Glu Cys Asn Leu Ile Pro465 470 475 480Thr Ala Leu Thr Thr Glu Pro Lys Pro Phe Lys Val Gly Phe Ser Ala485 490 495Arg Asp Pro Lys Lys Leu Glu Gln Trp Ile Ala Glu Ser Asp Glu Arg500 505 510Thr Lys Asp Leu51權(quán)利要求
1．在微生物中使一些基因失活的方法，這些基因編碼乙酸苯酯分解代謝酶，該酶與青霉素生物合成酶競(jìng)爭(zhēng)乙酸苯酯，該方法包括通過(guò)同源重組整合轉(zhuǎn)化，這種重組發(fā)生在至少一個(gè)外源DNA化合物和至少待失活基因的部分序列之間。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中轉(zhuǎn)化體DNA化合物是環(huán)狀分子，至少含有一個(gè)待失活的基因的表達(dá)片斷。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中轉(zhuǎn)化體DNA化合物是線性分子，至少含有一個(gè)不包括在待失活基因的序列中的DNA片斷，但至少含有一個(gè)轉(zhuǎn)化標(biāo)記，該標(biāo)記中斷其編碼序列。
4．根據(jù)前面幾項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中轉(zhuǎn)化體DNA分子，含有全部或部分待失活基因的序列的拷貝，失活的方法是突變，優(yōu)選地是讀碼框架移動(dòng)突變，沒(méi)有有義或缺失，這將導(dǎo)致所述基因失去功能性表現(xiàn)型。
5．根據(jù)前面的任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中能夠產(chǎn)生青霉素G或V的微生物是轉(zhuǎn)化的目標(biāo)，在轉(zhuǎn)化中基因失活。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中產(chǎn)生青霉素G或V的微生物是真菌。
7．根據(jù)權(quán)利要求1到6所述的方法，其中轉(zhuǎn)化的微生物是構(gòu)巢曲霉。
8．根據(jù)權(quán)利要求1到6所述的方法，其中轉(zhuǎn)化的微生物是產(chǎn)黃青霉。
9．根據(jù)權(quán)利要求1到7所述的方法，其中所用的轉(zhuǎn)化體DNA化合物可以全部或部分地包括在載體中，優(yōu)選地在質(zhì)粒pPhacA::argB中。
10．根據(jù)權(quán)利要求1到6和8所述的方法，其中所用的轉(zhuǎn)化體DNA化合物可以全部或部分地包括在載體中，優(yōu)選地在質(zhì)粒pALP696中。
11．根據(jù)權(quán)利要求1到7和9所述的方法，其中失活的基因通過(guò)SEQ IDNO:1，它的突變基因序列和/或同源基因代表。
12．根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中失活的基因編碼SEQ ID NO:2表示的多肽，或表達(dá)P450乙酸苯酯2-羥化酶活性的相似的序列。
13．根據(jù)權(quán)利要求1到6,8和10所述的權(quán)利要求，其中失活的基因通過(guò)SEQ ID NO:3，它的突變基因序列和/或同源基因代表。
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中失活基因編碼SEQ ID NO:4代表的多肽或表達(dá)P450乙酸苯酯2-羥化酶活性的相似的序列。
15．構(gòu)巢曲霉的轉(zhuǎn)化菌株和起源于該菌株的突變體，該菌株至少摻入了一個(gè)外源DNA化合物，該DNA化合物包括在至少一個(gè)基因的截短的，不完全的或失活的序列中，該基因編碼乙酸苯酯分解代謝酶，在它同源重組整合后，使內(nèi)源基因失活。
16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的構(gòu)巢曲霉的轉(zhuǎn)化菌株，其中待失活的基因編碼傳導(dǎo)乙酸苯酯羥化作用的酶。
17．根據(jù)權(quán)利要求15和16所述的構(gòu)巢曲霉的轉(zhuǎn)化菌株，其中失活基因是phacA和在SEQ ID NO:1中，它的突變基因序列和同源基因敘述的該基因的序列和側(cè)接區(qū)。
18．根據(jù)權(quán)利要求17所述的構(gòu)巢曲霉的轉(zhuǎn)化菌株，其中失活基因與phacA同源，來(lái)源不是構(gòu)巢曲霉，該基因與構(gòu)巢曲霉的phacA基因的DNA序列的同源性足以介導(dǎo)與構(gòu)巢曲霉的內(nèi)源基因的同源重組。
19．根據(jù)權(quán)利要求15到18所述的構(gòu)巢曲霉的轉(zhuǎn)化菌株，其中失活的基因編碼蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO:2代表的多肽，或表達(dá)P450乙酸苯酯2-羥化酶活性的相似的序列。
20．根據(jù)權(quán)利要求15到19所述的轉(zhuǎn)化菌株，特征是它包括在構(gòu)巢曲霉CECT20195純化菌株，它的突變體和/或轉(zhuǎn)化衍生物中。
21．如圖6的限制圖譜所示，失活構(gòu)巢曲霉的phcA基因的質(zhì)粒pPhacA::argB，它包括在質(zhì)粒pUC18中，該質(zhì)粒含有6.8kb EcoRⅠ插入片斷，該3.2kb片斷含有構(gòu)巢曲霉的phacA基因，該基因通過(guò)插入3.2kb的片斷而失活，該片斷含有構(gòu)巢曲霉的argB基因。
22．產(chǎn)黃青霉的轉(zhuǎn)化菌株和起源于該菌株的突變體，含有包括在截短，不完全或失活的基因的序列中的DNA化合物，該基因編碼乙酸苯酯分解代謝酶，并在通過(guò)同源重組整合該基因后，使內(nèi)源基因失活。
23．根據(jù)權(quán)利要求22所述的產(chǎn)黃青霉的轉(zhuǎn)化菌株，其中待失活的基因編碼傳導(dǎo)乙酸苯酯羥化作用的酶。
24．根據(jù)權(quán)利要求22和23所述的產(chǎn)黃青霉的轉(zhuǎn)化菌株，其中基因是phcA和在該基因SEQ ID NO:3，它的突變基因序列和/或同源基因所述序列和它的側(cè)接區(qū)。
25．根據(jù)權(quán)利要求22到24所述的產(chǎn)黃青霉的轉(zhuǎn)化菌株，其中失活的基因編碼蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO:4代表的多肽，或表達(dá)確定的P450乙酸苯酯2-羥化酶活性的相似序列。
26．根據(jù)權(quán)利要求24所述的產(chǎn)黃青霉的轉(zhuǎn)化菌株，其中該基因是構(gòu)巢曲霉的phacA基因或任何其它從不同于產(chǎn)黃青霉的來(lái)源中分離的同源DNA化合物，它與產(chǎn)黃青霉的pahA的DNA序列的同源性足以傳導(dǎo)與產(chǎn)黃青霉的內(nèi)源基因的同源重組。
27．圖7限制圖譜所表明的失活產(chǎn)黃青霉pabA基因的質(zhì)粒pALP696，該質(zhì)粒包括質(zhì)粒pBC KS+,pBC KS+包含具有產(chǎn)黃青霉的pahA基因的7.9kb的SaⅡ插入片斷，然后通過(guò)插入2.0kb含有產(chǎn)黃青霉的gdh啟動(dòng)子控制下表達(dá)的S.hindustanus的bleR基因使PahA基因失活。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使編碼乙酸苯酯分解代謝酶的基因失活的方法和含有它的質(zhì)粒以及其轉(zhuǎn)化的菌株。該方法選擇性地用于構(gòu)巢曲霉pahcA基因及產(chǎn)黃青霉的pahA基因。這兩種基因分別編碼同青霉素合成酶競(jìng)爭(zhēng)底物的競(jìng)爭(zhēng)酶。使這兩種酶不表達(dá)將有利于這種抗生素的合成,即在青霉素生產(chǎn)中在培養(yǎng)其中加入少量的乙酸苯酯即可增加青霉素的產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12R1/82GK1226932SQ9880060
公開(kāi)日1999年8月25日 申請(qǐng)日期1998年4月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月18日
發(fā)明者何塞·曼努埃爾·費(fèi)爾南德斯·卡農(nóng), 馬特·羅德里格斯·塞斯, 布魯諾·戴伊斯·加西亞, 何塞·路易斯·巴雷多·富恩特, 亞歷杭德羅·維塔萊·阿爾瓦, 福蘭西斯科·塞托馬爾多納多, 米格爾·安赫爾·佩尼亞爾瓦·索托, 何塞·曼努埃爾·明戈特·阿森桑 申請(qǐng)人:抗生素有限公司