專利名稱：蓖麻蠶細胞核骨架結(jié)合元件的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子細胞生物學，真核基因表達調(diào)控技術研究領域。具體涉及蓖麻蠶rRNA基因的一個新型的轉(zhuǎn)錄增強子元件-細胞核骨架結(jié)合元件(SAR)，該SAR元件應用于基因表達載體的構(gòu)建，能提高外源基因在真核細胞中的高效、穩(wěn)定表達。
真核生物的細胞核經(jīng)核酸酶消化后除去游離DNA、組蛋白和其它可溶性蛋白后，殘留一個網(wǎng)絡狀結(jié)構(gòu)，稱為核骨架或核基質(zhì)。核骨架維持細胞核的形態(tài)，并形成三維空間將細胞核內(nèi)成千上萬個基因的復制、轉(zhuǎn)錄、加工和運輸?shù)壬顒咏M織在一定的空間內(nèi)。染色質(zhì)上一些特定的DNA區(qū)域能與核骨架特異結(jié)合，稱為核骨架結(jié)合區(qū)(SAR)或核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MAR)。SAR/MAR通常位于染色質(zhì)環(huán)的基部，決定染色質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，并對基因的復制和轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用。
國外最早由Mirkovitch J等報道了組蛋白基因簇SAR的檢測及其特性(Mirkovitch J,et al.,Cell,1984,39:223～232)，發(fā)現(xiàn)SAR是富含A、T的DNA序列(A+T＞70％)，長約400～1000bp，能特異地與核骨架蛋白結(jié)合。接著Cockerill和Garrard報道了免疫球蛋白κ基因的MAR(Cell,1986,44:273-282)，發(fā)現(xiàn)該MAR含有拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的識別位點；隨著對SAR/MAR的基礎研究不斷深入，越來越多的基因的SAR/MAR被檢測，SAR/MAR的功能引起人們廣泛的興趣，Phi-VanL等在90年報道了雞溶菌酶基因5’MAR能增強異源啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。我們實驗室最近報道了蓖麻蠶rRNA基因簇的SAR元件(趙慕鈞等，中國科學(C輯)，1998,28(1):42～49)，該元件是由我們克隆、測序并鑒定的。本發(fā)明是將該SAR元件應用于基因表達載體的構(gòu)建，以提高外源基因在真核細胞中穩(wěn)定高效表達。
為此，本發(fā)明的目的是通過克隆蓖麻蠶的SAR元件，將SAR元件應用在體外組建成真核基因表達載體，由該載體攜帶外源基因轉(zhuǎn)染真核細胞，增強外源基因的穩(wěn)定高效表達。
關于蓖麻蠶SAR元件克隆的構(gòu)建方法是通過首先檢測并鑒定蓖麻蠶rRNA基因的核骨架結(jié)合區(qū)(SAR)，然后將該SAR插入pBluescript(pSK+)質(zhì)粒的EcoRⅠ-SacⅡ位點，構(gòu)建成pSK(+)-SAR克隆(見圖1)。該SAR是長約1,000bp的DNA片段，經(jīng)DNA序列分析后表明，該SAR富含A、T堿基(A+T＞70％)，含有topⅡ位點和酵母的自主復制序列(ACS)等其它重復序列和結(jié)構(gòu)花式，DNA的序列組成表明該SAR是一個重要的功能元件(見圖2)。
本發(fā)明以SAR元件組建成真核基因表達載體pLu-SAR為例，結(jié)構(gòu)見圖3。該載體含有SAR和報告基因蟲螢光素酶(Luciferase)基因以及一些篩選標記。該載體的構(gòu)建方法是用EcoRⅠ和SacⅡ雙酶切pSK-SAR質(zhì)粒(見圖1)，將SAR片段分離出來，然后用Klenow酶補平，接上BamHⅠ接頭，插入pLu質(zhì)粒的BamHⅠ位點，構(gòu)建成pLu-SAR表達載體(圖3)。pLu質(zhì)粒含有SV40啟動子和蟲螢光素酶基因(Luc)，含有氰霉素抗性基因(AmpR)和新霉素抗性基因(NeoR)篩選標記。蟲熒光素酶基因是插入在質(zhì)粒載體上的外源基因，將其導入真核細胞，通過檢測蟲螢光素酶的活力，來確定外源基因的表達高低。圖4是蟲螢光素酶活力的檢測結(jié)果。將pLu質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳類細胞NIH3T3，蟲螢光素酶基因的表達很低，將其作為對照，將pLu-SAR轉(zhuǎn)染哺乳類細胞NIH3T3，發(fā)現(xiàn)SAR能增強蟲螢光素酶基因在真核細胞中的穩(wěn)定表達約十七倍。將pAGLu作為陽性對照(pAGLu和pLu質(zhì)粒由美國Kohwi-Shigematsu T.實驗室惠贈)，轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞后，增強蟲螢光素酶基因表達七倍，與文獻報導相似(Bode J,et al.,Science,1992,255:195～197)。因此我們克隆的SAR元件應用于真核表達載體，作為一種增強子元件，提高外源基因的表達約17倍，具有很高的活性。
本發(fā)明的優(yōu)點在于SAR元件在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)水平調(diào)控基因的表達，利用SAR元件構(gòu)建的真核表達載體pLu-SAR，將外源基因?qū)胝婧思毎⒄系饺旧w上，SAR能在染色體上增強啟動子活力，使基因表達增強。由于外源基因整合在染色體上，隨細胞分裂而分配到后代子細胞中，不易丟失，因此SAR增強基因表達的能力具有穩(wěn)定高效的優(yōu)點，特別適用于基因治療，以提高治療基因的表達。由于SAR/MAR能結(jié)合在核骨架上，有利于提高表達蛋白的水平及其穩(wěn)定性，適用于真核細胞生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品，提高質(zhì)量。
本發(fā)明通過以下附圖和實施例作進一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。
圖1是蓖麻蠶SAR元件的pSK(+)-SAR克隆圖2是蓖麻蠶SAR元件的DNA序列組成圖3是真核基因表達載體pLu-SAR的圖譜圖4是蓖麻蠶SAR元件增強蟲螢光素酶相對活力的檢測結(jié)果實施例1蓖麻蠶SAR元件的檢測與克隆a．分離和制備蓖麻蠶絲腺體組織細胞核取5齡1～3天蓖麻蠶絲腺體組織3～5g，勻漿并過濾，勻漿緩沖液為Al(0.25mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl(pH8.0),5mmol/L氯化鎂)，l,500rpm離心10分鐘，收集沉淀并用Al懸浮，加入終濃度為0.5％的Triton X-100，冰浴10分鐘后，1,500rpm離心10分鐘，用Al懸浮沉淀，作2.2mol/L蔗糖密度梯度超離心，超離心條件為20,000rpm,60分鐘，沉淀物為細胞核。
b．細胞核骨架的制備經(jīng)超離心分離的細胞核，用二碘水楊酸鋰鹽(LIS)緩沖液B(5mmol/LTris-HCl pH7.4,20mmol/L氯化鉀，0.125mmol/L亞精胺，0.05mmol/L精胺，0.1％毛地黃皂苷(進口分裝，上海試劑供應站)，0.1mmol/L PMSF)懸浮，然后參照Mirkovitch(Cell,1984,39:223～232)的方法制備核骨架，即用終濃度為20mmol/L二碘水揚酸鋰鹽提取核內(nèi)組蛋白和其它可溶性蛋白，用1,000u/mL限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SacⅡ消化染色質(zhì)，離心沉淀和核骨架結(jié)合的DNA。
c．蓖麻蠶SAR元件的檢測和pS(+)-SAR克隆的構(gòu)建DNA經(jīng)純化后走1～1.2％瓊脂糖電泳，32P-α-dATP(Amersham產(chǎn)品)標記rRNA基因片段作探針，雜交結(jié)果證明蓖麻蠶rRNA基因的5’EcoRⅠ-SacⅡ片段，長約1,000bp，能與核骨架結(jié)合，定義為蓖麻蠶的SAR元件。將此SAR插入pBluescript(pSK+)的EcoRⅠ-SacⅡ位點，構(gòu)建pSK(+)-SAR克隆(見圖1)，SAR元件的DNA序列組成見圖2。
實施例2蓖麻蠶SAR元件應用于pLu-SAR真核表達載體的構(gòu)建用SacⅡ和EcoRⅠ雙酶切，將SAR片段pSK(+)-SAR質(zhì)粒中切下，用Klenow酶補平后，接上BamHⅠ接頭，再用BamHⅠ切出粘性末端后，插入pLu質(zhì)粒的BamHⅠ位點，構(gòu)建成pLu-SAR真核表達載體(見圖3)，pLu質(zhì)粒由美國Kohwi-Shigematsu,T.實驗室提供，是實驗室常用的質(zhì)粒，pLu質(zhì)粒含有青霉素抗性基因(AmpR)和新霉素抗性基因NeoR作為篩選標記，含有SV40啟動子和作為外源基因的蟲螢光素酶報告基因(Luc)，通過測定蟲螢光素酶的活力來確定外源基因的表達高低。pLu質(zhì)粒表達Luc的活力很低，因此可以作為對照。將蓖麻蠶SAR元件插入pLu質(zhì)粒的BamHl位點，位于SV40啟動子的5’上游，如果該SAR元件能夠增強基因的表達，經(jīng)檢測蟲螢光素酶的活力就提高。
實施例3蓖麻蠶SAR元件增強外源基因在真核細胞中表達活性的檢測將實施例2構(gòu)建的真核表達載體pLu-SAR，以及作為對照的pLu、作為陽性對照的pAGLu質(zhì)粒各1.5μg，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(GIBCO公司產(chǎn)品)6μl，轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，轉(zhuǎn)染方法按公司提供的操作手冊進行，NIH3T3細胞數(shù)約為2.5×105/60mm平皿，在轉(zhuǎn)染48小時后用0.7mg/mL G418進行篩選，得到抗G418抗性克隆后，驗證質(zhì)粒DNA已整合到染色體DNA上，然后檢測蟲螢光素酶活性。質(zhì)粒DNA整合到染色體DNA上的鑒定方法是用常規(guī)方法提取細胞基因組DNA，用PCR檢測標記基因NeoR的存在，PCR條件為94℃45秒，55℃45秒，72℃1分30秒，30個循環(huán)，1％瓊脂糖電泳鑒定，出現(xiàn)790bpDNA擴增片段，說明質(zhì)粒DNA已整合到細胞基因組DNA上。蟲螢光素酶的活性用蟲螢光素酶檢測系統(tǒng)(Promega公司產(chǎn)品)進行測定，方法見Promega公司產(chǎn)品說明書，LB9507熒光計數(shù)儀為EG&G Berthold公司產(chǎn)品。測定結(jié)果如圖4所示，相對熒光強度讀數(shù)分別為3T3/pLu為2033；3T3/pAGLu為14028；3T3/pLu-SAR為33954。3T3/pAGLu細胞相對熒光強度比3T3/pLu細胞大七倍，與文獻報導相似(Bode J,et al.,Science,1992,255:195～197),3T3/pLu-SAR細胞其相對熒光強度則增強了十七倍，說明SAR應用于真核細胞表達載體有很強的增強外源基因表達的能力。
權(quán)利要求
1．一種蓖麻蠶細胞核骨架結(jié)合元件的應用，其特征在于該元件應用于構(gòu)建真核基因表達載體，增強外源基因在真核細胞中的表達。
2．如權(quán)利要求1所述的蓖麻蠶細胞核骨架結(jié)合元件的應用，其特征在于所述真核基因表達載體是pLu-SAR,SAR位于SV40啟動子的上游。
全文摘要
一種蓖麻蠶SAR元件長約1,000bp,能特異地與細胞核骨架結(jié)合。將該SAR元件應用于真核基因表達載體的構(gòu)建,即將該SAR插入質(zhì)粒pLu,構(gòu)建成pLu－SAR真核基因表達載體,轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞,使外源基因蟲熒光素酶基因在真核細胞中的表達活性比對照提高十七倍。SAR是一個很強的增強子元件,利用SAR組建真核基因表達載體,具有使外源基因穩(wěn)定高效表達的優(yōu)點,可進一步應用于基因工程和基因治療的載體構(gòu)建。
文檔編號C12N15/79GK1223299SQ9812202
公開日1999年7月21日 申請日期1998年11月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月20日
發(fā)明者趙慕鈞, 吳震宇, 何明亮, 李載平 申請人:中國科學院上海生物化學研究所