篩選天然產(chǎn)物和其它化學物質(zhì)的體外轉(zhuǎn)錄方法

專利名稱：篩選天然產(chǎn)物和其它化學物質(zhì)的體外轉(zhuǎn)錄方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外分析病毒基因和細胞基因的轉(zhuǎn)錄的方法，該方法可實現(xiàn)自動化并且適合于有效而經(jīng)濟的整體篩選以查明對于基因活性具有選擇性效應的、特定的重要化學結(jié)構(gòu)。
當只是合理設(shè)計活性物質(zhì)不能成功地尋找活性物質(zhì)之后，有關(guān)篩選天然產(chǎn)物的生物活性組分的研究日益增多。因此，研究工作不僅集中于化學物質(zhì)文庫和組合文庫，而且又集中于作為物質(zhì)資源的天然產(chǎn)物傳統(tǒng)提取物。這主要是因為這些提取物所含物質(zhì)的多樣性。經(jīng)典分析方法證實，微生物發(fā)酵液的提取物中大約含有500種化合物，其結(jié)構(gòu)大不相同。考慮到它們的多樣性，它們遠遠超越于化學物質(zhì)文庫和組合物質(zhì)文庫。
限制在藥物上應用各種各樣的、大體上未探明的潛在天然產(chǎn)物的一個因素在于，能測定候選活性物質(zhì)的合適而有意義的方法數(shù)量有限。具體而言，要求所用方法能鑒定使用時引起最小副作用的高度特異性的藥理活性物質(zhì)。
下述方法基于這樣的研究其中測試物質(zhì)在參與轉(zhuǎn)換遺傳信息的第一步即基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)中的可能性。這種方法旨在鑒定對于轉(zhuǎn)錄有直接的或間接的、正的或負的效應的物質(zhì)。
基因的轉(zhuǎn)錄強度由該基因的基因調(diào)節(jié)元件來確定，具體而言，由啟動子、由增強子或由沉默子確定。基因調(diào)節(jié)元件的作用由轉(zhuǎn)錄因子和輔因子介導和轉(zhuǎn)換。這些轉(zhuǎn)錄因子對于基因的轉(zhuǎn)錄速度可產(chǎn)生負的或正的效應，因而對于轉(zhuǎn)錄強度有貢獻。同時，業(yè)已鑒定，在很多細胞過程中有大量轉(zhuǎn)錄因子作為重要的“分子開關(guān)”，其中的過程包括信號轉(zhuǎn)導、細胞周期控制、分化和控制的細胞死亡(編程性細胞死亡)。
被細胞接收的大多數(shù)信號(它們影響基因的轉(zhuǎn)錄強度)由跨膜蛋白質(zhì)“寄存”，由信號轉(zhuǎn)導鏈在細胞內(nèi)遞送并由轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)換。接收外部信號的蛋白質(zhì)的例子有cAMP-結(jié)合蛋白、生長信號用的傳感蛋白(例如血清效應因子、SRF)、參與細胞因子(cytokin)表達的激素受體或轉(zhuǎn)錄因子、所謂的STAT蛋白(信號轉(zhuǎn)導蛋白及轉(zhuǎn)錄活化蛋白)。
同時，已知有許多物質(zhì)對于基因的轉(zhuǎn)錄強度具有直接或間接效應。即使這類物質(zhì)的作用通常不是特異性的，但這類物質(zhì)特別是在藥劑中用作藥理活性物質(zhì)。因而服用這類藥劑通常會引起不希望有的副作用。
例如，免疫疾病用含有環(huán)孢菌素和類固醇衍生物為活性物質(zhì)的藥劑治療。環(huán)孢菌素A與親環(huán)素形成復合體。后者抑制鈣調(diào)磷酸酶，一種遍在的磷酸酶，它通過各種代謝途徑使蛋白質(zhì)去磷酸化。鈣調(diào)磷酸酶例如調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NFAT的亞單位從胞質(zhì)溶膠至細胞核的轉(zhuǎn)運(Liu，J.(1993)Immunology Today14，290-295)。NFAT(活化T細胞的核因子)參與某些免疫相關(guān)基因的活化。環(huán)孢菌素A(CsA)通過它對NFAT(活化T細胞的核因子)的效應而間接地調(diào)節(jié)這些基因的表達。然而，由于環(huán)孢菌素A只是經(jīng)由遍在的鈣調(diào)磷酸酶間接地調(diào)節(jié)NFAT活性，所以環(huán)孢菌素A還通過其它代謝途徑起血管收縮劑和腎毒素和神經(jīng)毒素的作用。如果已知某藥理活性物質(zhì)能特異性地、可能直接地抑制NFAT，那么含有該活性物質(zhì)的藥物就可能會引起更少的副作用。
除了所需效應外還可能帶來副作用的藥理活性物質(zhì)也包括糖皮質(zhì)激素。糖皮質(zhì)激素多年來被用于下列疾病的標準療法中變應性病、風濕病、炎癥和由免疫系統(tǒng)反應過度引起的其它疾病。它們尤其能通過刺激形成細胞NFkB抑制劑，即IkB蛋白質(zhì)而抑制細胞類型特異性轉(zhuǎn)錄因子NfkB的活化(Scheinmann，R.I.，Cogswell，P.C.，Lofquist，A.K.&Baldwin Jr.，A.S.(1995)Science270，283-286；Auphan，N.，DiDonato，J.A.，Rosette，C.，Helmberg，A & Karin M.(1995)Science270，286-290)。IkB本身又防止活性NFkB二聚體轉(zhuǎn)移入細胞核，從而防止重要的免疫靶基因的活化。類似于有關(guān)CsA的所述那樣，糖皮質(zhì)激素對于基因表達的效應相對地為非特異性的，因為糖皮質(zhì)激素不但對NFkB起作用，還對其它蛋白質(zhì)起作用。
這些實例表明，很需要這樣的藥理活性物質(zhì)，即它們的作用方式應盡可能是特異性的。為了探尋具有這種性能的新型重要化學結(jié)構(gòu)，必須對于大量物質(zhì)測試其特異的活性。
雖然具有相同的基因成分，但各個細胞通常只表達特定的蛋白質(zhì)，這取決于細胞類型和/或一定的疾病或缺損和這些細胞發(fā)育和分化的各別的程度。據(jù)認為細胞的這種特性的基礎(chǔ)是基因調(diào)節(jié)蛋白特定的所有組成成分，例如細胞類型特異性的和發(fā)育特異性的成分，它提供某些轉(zhuǎn)錄因子和輔因子(輔助蛋白)，這些因子調(diào)節(jié)不同基因的協(xié)同、受控轉(zhuǎn)錄。
因此，在確定類型的細胞中，特定的藥理活性物質(zhì)應能選擇性地活化或抑制病理相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。為了鑒定這種活性物質(zhì)，需要這樣的轉(zhuǎn)錄方法其中候選活性物質(zhì)對于各個基因的轉(zhuǎn)錄的效應，即對于參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)和對于基因調(diào)節(jié)元件的效應，可在規(guī)定的條件下直接測定。由于必須測定多種候選物質(zhì)，所以其它前提是該方法操作簡便并且它能實現(xiàn)自動化。
Weil等人首次描述了無細胞轉(zhuǎn)錄方法(Weil，P.A.，Luse，D.S.，Segall，J.，Roeder，R.G.(1979)Cell 18，469-484)。在該方法中，將細胞核的濃縮提取物(稱為S100提取物)(Weil，P.A.，Segall，J.，Harris，B.Ng，S.Y.，Roeder，R.G.(1979)J.Biol.Chem.254，6163-6173)，和純化的RNA聚合酶II用于體外轉(zhuǎn)錄。如果沒有外源的RNA聚合酶II，則這些濃縮但未進一步純化的細胞核提取物不能轉(zhuǎn)錄(Weil，P.A.，Luse，D.S.，Segall，J.，Roeder，R.G.(1979)Cell 18，469-484；Dignam，J.D.，Martin，P.L.，Shastry，B.S.，Roeder，R.G.(1983)Methods in Enzymology101，582-598)。
從這些細胞核提取物開始，接著開發(fā)出多種方法，通過些方法利用數(shù)步純化步驟可分離轉(zhuǎn)錄因子。這些方法尤其包括純化步驟，其中通過色譜法在結(jié)合核蛋白質(zhì)的材料例如磷酸纖維素柱上純化核提取物。在包括數(shù)步的這些復雜方法范圍內(nèi)，Dignam等首先描述了將可商購的P11系統(tǒng)(Whatman，Maidstone，England)用于純化步驟之一中(Dignam.J.D.，Martin，P.L.，Shastry，B.S.，Roeder，R.G.(1983)Methods inEnzymology 101，582-598)。
這些包括數(shù)步的純化方法日臻完善以至現(xiàn)在有可能通過復雜的方法從細胞核提取物中分離各種轉(zhuǎn)錄因子。此外，各種因子或者它們的亞單位現(xiàn)在還可以重組體形式獲得，例如TFIIA，TFIIB，TFIIEα，TFIIEβ和TFIIF(Zawel，L.和Reinberg，D.(1995)Annu Rev.Biochem.64.533-561)。
因而，現(xiàn)在已存在由重組體和天然純化的因子的混合物構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。然而，這類轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)從技術(shù)角度看過于復雜且對于樣品流通量大的篩選方法來說太昂貴。反之，在其它轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中，例如那些利用得自細胞核的提取物來代替重組體或純化的因子的系統(tǒng)，可發(fā)現(xiàn)大量副反應。在未充分地純化或未純化的核提取物(粗提取物)中，主要是核酸和DNA-結(jié)合蛋白，例如阻抑蛋白如組蛋白，對于體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生不利效應。在粗提取物中發(fā)現(xiàn)的核酸中，尤其是編碼t-RNAs的DNA序列具有不利效應。由于t-RNAs的基因轉(zhuǎn)錄比mRNAs的強大約100倍，所以這些t-RNA-編碼序列導致非特異性轉(zhuǎn)錄物過量。于是在特異性轉(zhuǎn)錄物可被檢測之前，必須通過復雜的純化步驟除去非特異性轉(zhuǎn)錄物。
為了定量分析體外轉(zhuǎn)錄的結(jié)果，開發(fā)了這樣的載體它們待轉(zhuǎn)錄的DNA序列缺乏鳥嘌呤堿基(稱為無G序列或無G盒)，適當時可以對無G序列接上含有大量鳥嘌呤的序列區(qū)段。應用這類載體可使轉(zhuǎn)錄作用在不存在GTP下進行。于是，只有無G序列而沒有其它含G序列被轉(zhuǎn)錄。這就產(chǎn)生特異性轉(zhuǎn)錄物，而且它們的長度(基本上)一致。Sawadogo和Roeder最早描述了將載體用于這種轉(zhuǎn)錄作用即，此時長度為400個核苷酸的序列受ML(腺病毒主要晚期)啟動子的控制。該載體產(chǎn)生長度約為400個核苷酸的轉(zhuǎn)錄物(Sawagogo，M.和Roeder，R.G.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，4394-4398)。借助于這些載體得到顯著地更少量的非特異性轉(zhuǎn)錄物，這就是為什么在轉(zhuǎn)錄反應中應用這些載體已被描述過許多次。(Goppelt，A.，Stelzer，G.，Lottspeich，F(xiàn).，Meisterernst，M.(1996)EMBO J.15，3105-3115；Kretzschmar，M.，Kaiser，K.，Lottspeich，F(xiàn).，Meisterernst，M.(1994)Cell78，525-534；Meisterernst，M.Roy，A.L.，Lieu，H.M.和Roeder，R.G.(1991)Cell66，981-993)。然而，迄今應用的載體都是這樣的，即無G序列長度不多于400個核苷酸。
為了定量和定性分析前述轉(zhuǎn)錄方法的結(jié)果，在有放射性標記的核苷酸存在時進行轉(zhuǎn)錄作用，先使放射性標記的轉(zhuǎn)錄物酚化并沉淀，然后在凝膠上分離。這不但從特異性轉(zhuǎn)錄物中除去錯誤地引發(fā)或錯誤地終止的轉(zhuǎn)錄物和非特異性地標記的核酸(例如由質(zhì)粒引起的轉(zhuǎn)錄物或tRNAs)，還從特異性轉(zhuǎn)錄物中除去過多的核苷酸。過量的放射性標記的核苷酸與放射性標記的轉(zhuǎn)錄物的活性比在不適宜條件下約為10,000∶1，于是標記的轉(zhuǎn)錄物必須濃縮大約10,000倍。特異性轉(zhuǎn)錄物的濃縮通過沉淀步驟和電泳分離達到。然而，這些濃縮步驟不適于自動化整體篩選，這就是為什么必須開發(fā)其它方法以這樣的程度除去標記的核苷酸，即仍有可能定量分析轉(zhuǎn)錄結(jié)果。
也可通過對于膜例如DEAE-纖維素膜應用反應溶液來監(jiān)測轉(zhuǎn)錄作用。可在該膜上直接檢測放射性標記的轉(zhuǎn)錄物。然而迄今只是成功地利用膜來檢測得自體外轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄物，這里所說的體外轉(zhuǎn)錄是在純化的RNA聚合酶II的存在下(Roeder，R.G.(1974)J.Biol.Chem.249，241-248)或者在純化的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子的存在下(Ohkuma，Y.，Sumimoto，H.，Horikoshi，M.，Roeder，R.G.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，9163-9167)進行的。沒有任何跡象表明，可以按這種方法檢測借助于從細胞核濃縮的和，合適的話，預先純化的提取物而獲得的轉(zhuǎn)錄物。
在WO96/26959中業(yè)已描述了利用基因轉(zhuǎn)錄來篩選活性物質(zhì)。該文獻公開了人NFATs(hNFAT)的序列及其在轉(zhuǎn)錄分析中的潛在應用，這些分析方法轉(zhuǎn)過來又可用于有可能自動化的整體篩選天然產(chǎn)物。與下述轉(zhuǎn)錄方法相反，該轉(zhuǎn)錄分析純粹是一種結(jié)合分析法，其中未進行轉(zhuǎn)錄反應。
US5,563,036描述了另一種結(jié)合分析法，它可用于篩選能抑制轉(zhuǎn)錄因子與核酸的結(jié)合的物質(zhì)。該分析法中也未進行轉(zhuǎn)錄作用。
US5,563,039描述了結(jié)合分析法的又一個實例，該方法也旨在用于尋找能抑制該場合中的蛋白質(zhì)與一定的DNA序列結(jié)合的物質(zhì)，該蛋白質(zhì)與腫瘤壞死因子受體(TRADD)相關(guān)。
本發(fā)明的一個目的是提供一種分析方法，用于分析例如細胞基因和病毒基因的基因在規(guī)定的反應條件下的轉(zhuǎn)錄作用，該方法操作簡便，可重復且尤其可廣泛用于整體篩選。
本發(fā)明涉及DNA模板的無細胞體外轉(zhuǎn)錄方法，該DNA模板含有待轉(zhuǎn)錄的DNA序列，該序列受一個或多個基因調(diào)節(jié)元件的控制，且此時
a)為了轉(zhuǎn)錄而應用一種濃縮的和合適的話純化的細胞核提取物，合適的話該提取物可被轉(zhuǎn)錄因子和/或輔因子補充或者部分或全部置換，和至少一種標記的核苷酸，b)合適的話，在轉(zhuǎn)錄之后分離和/或降解反應混合物中的蛋白質(zhì)，c)將標記的轉(zhuǎn)錄物與固體基質(zhì)結(jié)合，d)除去過剩的標記核苷酸和e)測定標記的轉(zhuǎn)錄物量。
本方法包括實際的轉(zhuǎn)錄反應(a)，分離特異性轉(zhuǎn)錄物(b，c，d)和檢測特異性轉(zhuǎn)錄物(e)。該方法包括分離特異性轉(zhuǎn)錄物的具體實施方案，上述b、c和d的順序只是一種可能性。適當時，分離特異性轉(zhuǎn)錄物的順序也可以是c、d、b或者d、b、c。此外，本發(fā)明的具體實施方案可以省去個別分離步驟。例如，本轉(zhuǎn)錄方法可以只包括步驟a、c、d和e或者只有步驟a、c和e或者只有步驟a、b、c和e或者只有步驟a、b、d和e或者只有a、b和e或者只有a、d和e。
本方法的一個獨特特征在于，所有操作步驟、即實際的轉(zhuǎn)錄反應(轉(zhuǎn)錄作用)以及特異性轉(zhuǎn)錄物的分離和檢測，可實現(xiàn)自動化，使得簡便而可靠地測定在特定的反應條件下獲得的特異性轉(zhuǎn)錄物的量，因而能測定轉(zhuǎn)錄速率。
轉(zhuǎn)錄速率表示單位時間某特定基因被轉(zhuǎn)錄的頻率，或者在所述轉(zhuǎn)錄方法中，單位時間待轉(zhuǎn)錄的DNA序列被轉(zhuǎn)錄的頻率。若要測定轉(zhuǎn)錄速率，就要測定在規(guī)定的單位時間之后所得放射性標記的轉(zhuǎn)錄物量。
本方法的一個方面在于，該轉(zhuǎn)錄作用是在激活劑和/或抑制劑存在下進行的，即在對于轉(zhuǎn)錄作用產(chǎn)生正的或負的效應的組分存在下進行。例如，能被轉(zhuǎn)錄的細胞核提取物可用于基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄。該基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)可由激活劑和/或抑制劑補充。與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄相比，轉(zhuǎn)錄抑制導致轉(zhuǎn)錄速率的降低，于是單位時間特異性轉(zhuǎn)錄物的量更??；而轉(zhuǎn)錄激活導致轉(zhuǎn)錄速率的升高，于是單位時間特異性轉(zhuǎn)錄物的量更大。
基因的轉(zhuǎn)錄可分成數(shù)步-前起始復合體(PIC)的形成、PIC激活、引發(fā)、啟動子清除、增長和終止。在真核生物中，引發(fā)轉(zhuǎn)錄作用需要RNA聚合酶(至于蛋白質(zhì)-編碼基因的轉(zhuǎn)錄，應用RNA聚合酶II)和DNA-結(jié)合蛋白，該蛋白可使RNA聚合酶II與DNA進行特異性的相互作用。這些DNA-結(jié)合蛋白被稱為轉(zhuǎn)錄因子，通用轉(zhuǎn)錄因子基本上參與同啟動子的相互作用，而特異性的轉(zhuǎn)錄因子介導位于啟動子下游或上游的基因調(diào)節(jié)元件的作用。
通用轉(zhuǎn)錄因子TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF和TFIIH在真核基因的轉(zhuǎn)錄中起作用。視啟動子而定，負責基因較低而基本的活性的、可被轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)級分含有全部或者大多數(shù)這些通用轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶II(RNA Pol II)。ML啟動子的基本活性例如可通過TBP(TFIID的TATA-結(jié)合亞單位)、TFIIB、TFIIE、TFIIF、TFIIH和RNA Pol II達到。帶來這一基本活性的蛋白質(zhì)級分被稱為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。為了本發(fā)明的目的，該術(shù)語也用于濃縮的和適當?shù)脑?，純化的細胞核提取物。借助于基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進行的轉(zhuǎn)錄作用被稱為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄。在體外進行無細胞轉(zhuǎn)錄作用需要至少一種基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，核苷酸和待轉(zhuǎn)錄的DNA模板。
除了通用轉(zhuǎn)錄因子，除了基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)之外，活化轉(zhuǎn)錄還需要特異性轉(zhuǎn)錄因子和輔因子(輔助蛋白)(Kaiser，K.，Stelzer，G和Meisterernst，M.(1995)EMBO J.14，3520-2527)。特異性轉(zhuǎn)錄因子能成倍地增加特異性基因的很低的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄強度，，能調(diào)控轉(zhuǎn)錄引發(fā)的頻率。所以，DNA-結(jié)合蛋白高度決定基因被轉(zhuǎn)錄的頻率(轉(zhuǎn)錄速率)。不直接與DNA結(jié)合但能通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用影響轉(zhuǎn)錄因子或RNA聚合酶II的活性的其它蛋白質(zhì)，例如輔因子，也在該調(diào)節(jié)過程中起使用。
本方法的一方面在于，將得自細胞核的濃縮提取物(得自細胞的核提取物，核提取物)用于基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄。考慮到這個特性，本方法可以通用；它適合所用的細胞，也適用于所用的真核種類。
例如，可以從得自人細胞或動物細胞的細胞系獲取濃縮的核提取物。能在發(fā)酵罐內(nèi)大規(guī)模地生長和繁殖的那些細胞是特別合適的，例如HeLa細胞。此外，還可應用得自選擇的細胞種類的細胞核提取物，特別是那些例如可通過下列特異性補充區(qū)別的細胞用轉(zhuǎn)錄因子和/或輔因子對它們進行的細胞種類特異性、細胞周期特異性、發(fā)育特異性、分化特異性或疾病特異性補充。特別是可應用對于疾病起源產(chǎn)生關(guān)鍵性作用的細胞種類，例如，免疫系統(tǒng)的細胞(如B細胞和T細胞)。
本方法的獨特優(yōu)點在于，還可以分離和應用來自組織或腫瘤細胞的核提取物。這特別適用于得不到合適的細胞系時的場合。具體而言，可從容易得到的組織分離核提取物并用于本方法中，其中的組織例如有動物或人的臍帶、動物或人的移植物廢品、動物或人的活檢材料或者動物或人的腫瘤組織(例如在外科手術(shù)期間取出的組織)或者動物或人的胎盤。
本方法的一方面在于，為了從新鮮的或冷凍的細胞的細胞核或者從新鮮的或冷凍的細胞核濃縮蛋白質(zhì)而通過已知方法制備濃縮的核提取物，例如采用Dignam等人描述的方法(Dignam，J.D.，Martin，P.L.，Shastry，B.S.，Roeder，R.G.(1983)Methods in Enzymology 101，582-598；Dignam，J.D.，Lebovitz，R.M.，Roeder，R.G.(1983)Nucleic Acid Res.11，1475-1489)。本方法一個特定的實施方案在于，為了制備濃縮的核提取物，所用方法包括細胞核的勻漿，接著透析該勻漿物。
本方法一個重要實施方案的一方面在于，通過一個或多個純化步驟特別是簡便的純化步驟來純化得自細胞核的已濃縮提取物，純化至可被轉(zhuǎn)錄的程度，即當實施本方法時可得到特異性轉(zhuǎn)錄物。例如，提取物可由色譜法純化。純化操作例如可在核-蛋白質(zhì)結(jié)合材料如磷酸纖維素、DEAE-纖維素或肝素-Sepharose上進行。也可將陽離子型和/或陰離子型交換柱或特異性親和柱例如那些抗體或寡核苷酸與柱材料結(jié)合的柱用于純化。
本方法一個特定實施方案的一方面在于，濃縮的核提取物在磷酸纖維素柱、特別是在P11柱(P11系統(tǒng)，Whatman，Maidstone，England)上純化。本方法又一特定實施方案的一方面在于，濃縮的核提取物只通過一步純化，例如在單一的P11柱上，或者在用含有DEAE-纖維素或肝素-Sepharose的柱材料的單一柱上。
在P11純化的特定實施方案中，在除了其它組分外還包括0.05～0.15M優(yōu)選為0.1M KCl的緩沖液的存在下，先將核提取物與磷酸纖維素結(jié)合。用適當?shù)木彌_液，優(yōu)選用包括0.05～0.15MKCl、優(yōu)選為0.1M KCl的緩沖液洗滌荷載的柱，將非特異性和干擾組分從柱中洗出。能轉(zhuǎn)錄的組分優(yōu)選呈2個級分從柱上洗脫，首先應用例如包含0.4～0.6M KCl、優(yōu)選為0.5M KCl的緩沖劑，接著應用例如含有0.7～1M KCl、優(yōu)選為0.85M KCl的緩沖劑。
本方法的一個特定實施方案在于，應用濃縮的、適當?shù)脑捈兓暮颂崛∥镌谕庠碦NA聚合酶II的存在下進行轉(zhuǎn)錄。所用的RNA聚合酶優(yōu)選是真核II類RNA聚合酶(RNA聚合酶II)，特別是動物或人RNA聚合酶II。
本方法另一個實施方案的一方面在于，濃縮的和適當?shù)脑捈兓暮颂崛∥锿ㄟ^加入蛋白質(zhì)例如轉(zhuǎn)錄因子和/或輔因子(輔助蛋白)而被補充或者全部地或部分地置換。例如，這些蛋白質(zhì)可從細胞核分離出，或者它們可由重組技術(shù)制備。
本方法的一個特定實施方案在于，核提取物只由轉(zhuǎn)錄因子和/或輔因子補充。在其它極個別情況下，本方法的一個方面在于，能轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)級分(基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng))只包括業(yè)已分離的或者業(yè)已由重組技術(shù)制備的轉(zhuǎn)錄因子和/或輔因子，和RNA聚合酶。
可應用的轉(zhuǎn)錄因子例如有它的部分的通用和/或特異性的轉(zhuǎn)錄因子，合適的話呈融合蛋白的形式。
可應用的通用轉(zhuǎn)錄因子例如有TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH、TFIIJ和TBP(TATA-結(jié)合蛋白)。
可應用的特異性轉(zhuǎn)錄因子例如有NFkB、AP1、NFAT、GATA3、TCF/Lef、CBF、Tat、fos/jun族系的因子、Oct族系(Oct-1、Oct-2)的因子和與它們相互作用的因子例如Ets族系的Bobl、OCA-B或OBF，ATF/CREB蛋白質(zhì)族系的激活蛋白，核受體例如PPARα或者相應的細胞類型特異性的轉(zhuǎn)錄因子的同種型(Kel，O.V.，Romaschenko，A.G.，Kel，A.E.，Wingender，E.，Kolachenov，N.A.，(1995)Nucl.Acids.Res.20，3-16)。
特異性轉(zhuǎn)錄因子的其它實例有1.原癌基因，例如jun、fos、ets、myc、bcl-同種型和erb2.激素受體，例如(erb)、糖皮質(zhì)素受體、雌激素受體、視黃酸受體、維生素D受體或者
3.腫瘤抑制劑，例如p53、NF1、WT1、RB4.病毒病原體，例如單純皰疹病毒的蛋白質(zhì)如VP16或ICP4，乳頭瘤病毒的蛋白質(zhì)如E1、E2、E6或E7，腺病毒的蛋白質(zhì)如E1A或E2A，巨細胞病毒的蛋白質(zhì)如IE86，乙肝病毒的蛋白質(zhì)如pX，HIV病毒的蛋白質(zhì)如Tat或Rev5.細胞類型特異性因子和/或組織特異性因子例如肌漿蛋白因子(myogenic factor)，Pit-1，Oct-2，Pu-1，OCA-B或HNFs或者T細胞特異性因子如Ets-1、GATA3、TCF/Lef、CBF6.STAT蛋白質(zhì)(信號轉(zhuǎn)導蛋白和轉(zhuǎn)錄的激活蛋白)，例如細胞因子激活的轉(zhuǎn)錄因子如IL-1 Stat，IL-2 Stat，IL-3 Stat，IL-4，IL-5 Stat，IL-6 Stat，IL-7 Stat，IL-8 Stat，IL-9 Stat，IL-10 Stat，IL-11 Stat，IL-12Stat(“Stat”表示介導該作用的蛋白質(zhì))或者7.參與第二信使轉(zhuǎn)導級聯(lián)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)例如CREB或abl，8.核受體，例如第二信使受體(如cAMP或IP3受體、Ca2+依賴性受體)，視黃酸受體，糖皮質(zhì)素受體或類固醇受體，9.基因特異性激活蛋白或抑制蛋白，例如IL-2基因的特異性激活蛋白如NFkB、AP1或NFAT10.發(fā)育特異性地、細胞周期特異性地和分化依賴性地表達的轉(zhuǎn)錄因子。
輔因子例如通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和/或蛋白質(zhì)-DNA相互作用而在轉(zhuǎn)錄中起直接的或間接的作用。有些輔因子已經(jīng)存在于基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中，而其它輔因子則只存在于激活的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中。輔因子可對轉(zhuǎn)錄速率產(chǎn)生正的或負的效應。可應用的輔因子例如有-TBP相關(guān)性因子(TAFs)，例如TAF‖30，TAF‖40，TAF‖55，TAF‖60，TAF‖110，TAF‖150，TAF‖250，(Verrijzer，C.P.和Tjian，R.(1996)Trends Biochem.Sci，21，338-342；TAFs together with TBPform the TFIID complex，it being possible for the composition of theTAFs in the TFIID to vary considerabIy)；-中介體，即與RNA聚合酶II相關(guān)的輔因子例如CTD(羧-端-區(qū))活性的蛋白質(zhì)和/或阻抑蛋白和/或RNA聚合酶II的激活蛋白，特別是RAP30、RAP74、RAP38、SR7(RNA聚合酶B的抑制因子，SRB)，細胞周期蛋白或激酶(例如CKII)；-通用輔因子；-含于USA(上游刺激活性)級分中的輔因子(Kaiser，K.和Meisterernst，M.(1996)Trends Biochem.Sci.342-345)；-正輔因子，例如PC1、PC2、PC4(p15)、PC5、PC6、Dr2(D阻抑蛋白2)/PC3、ACF(激活輔因子)CofA(輔因子A)、HMG-蛋白(染色質(zhì)相關(guān)性高遷移率族蛋白質(zhì))；-負輔因子，例如NC1、NC2和/或-特異性輔因子。
本方法的一方面在于，用于轉(zhuǎn)錄的DNA模板包括一個或多個基因調(diào)節(jié)元件和一個待轉(zhuǎn)錄的DNA序列。
本發(fā)明的主題是DNA模板，它可在上述用于無細胞體外轉(zhuǎn)錄方法中。該DNA模板包括一個或多個基因調(diào)節(jié)元件和一個待轉(zhuǎn)錄的DNA序列。該DNA模板另外還可包括其它序列區(qū)段。
基因調(diào)節(jié)元件可以是已知的基因調(diào)節(jié)元件或待研究的基因調(diào)節(jié)元件，或是一個或多個已知基因調(diào)節(jié)元件和一個或多個待研究基因調(diào)節(jié)元件的構(gòu)建物?；蛘{(diào)節(jié)元件可包括參與基因調(diào)節(jié)的任何DNA序列或其區(qū)段?？紤]到該基因調(diào)節(jié)元件、DNA模板或本方法的通用性，該基因調(diào)節(jié)元件優(yōu)選得自真核基因，或相應于后者。該基因調(diào)節(jié)元件可以是細胞的或病毒的基因調(diào)節(jié)元件或合成的基因調(diào)節(jié)元件。基因調(diào)節(jié)元件優(yōu)選包括特別是DNA序列，這些序列代表DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列，例如轉(zhuǎn)錄因子或融合蛋白的結(jié)合位點)?；蛘{(diào)節(jié)元件可包括一個啟動子(啟動子序列)和/或一個或多個增強子(增強子序列)和/或一個或多個沉默子(沉默子序列)。該基因調(diào)節(jié)元件可優(yōu)選包括自然排列和/或人工排列的啟動子、增強子和/或沉默子序列或其部分序列。
一個起動子可包括一個“TATA”盒和/或一個起始區(qū)(INR)(引發(fā)轉(zhuǎn)錄)。該啟動子可包括一個“GC”盒和/或“GAAT”盒。
在該DNA模板的一個特定實施方案中，該基因調(diào)節(jié)元件是一個模型啟動子。
一個模型啟動子包括一個啟動子和另外的蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列和，適當?shù)脑?，其它基因調(diào)節(jié)元件。該模型啟動子優(yōu)選包括一個“TATA”盒和一個起始區(qū)。在一個具體實施方案中，該模型啟動子包括人T細胞受體Vβ8.1的“TATA”盒和ML啟動子的起始區(qū)。這兩種基礎(chǔ)啟動子元件允許進行基礎(chǔ)體外轉(zhuǎn)錄。此外，該特異性模型啟動子具有用于酵母Gal 4蛋白的5個結(jié)合位點。該模型啟動子可根據(jù)需要而被改變，例如采用分子生物學的方法，例如由待研究的基因調(diào)節(jié)元件補充該模型啟動子，和/或由其它基因調(diào)節(jié)元件例如待研究的基因調(diào)節(jié)元件置換該模型啟動子的個別部分。
為了可操縱該模型啟動子，它優(yōu)選含有一個或多個用于限制酶的單一切割位點。在該模型啟動子的一個具體實施方案中，至少有一個用于限制酶的單一切割位點處于“TATA”盒和Gal4結(jié)合位點之間。
除了已存在的蛋白質(zhì)結(jié)合序列(例如除了Gal4序列)之外，也可將其它蛋白質(zhì)結(jié)合序列整合入該模型啟動子。例如，如果除了業(yè)已研究的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)之外加入其它待研究轉(zhuǎn)錄因子如特異性轉(zhuǎn)錄因子，這就尤為有趣。
本方法的一方面在于，融合蛋白與該模型啟動子組合也可用作轉(zhuǎn)錄激活物和/或抑制物。這種融合蛋白例如可包括DNA結(jié)合域如酵母Gal4蛋白的DNA結(jié)合域，和特異性激活域如HSV激活物VP16的激活域。融合蛋白可使定義的激活物和/或抑制物或其部分例如它們的激活域或抑制域被分別分析，而沒有待研究的基因調(diào)節(jié)元件的背景。例如，如果該DNA結(jié)合域得自所應用的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(如濃縮的核提取物)缺乏的DNA結(jié)合蛋白，則這是可能的。例如，如果將得自哺乳動物細胞的濃縮核提取物用于本方法中，就可以無背景地分析以與酵母Gal4結(jié)合域的融合蛋白形式而存在的轉(zhuǎn)錄因子的激活物(域)，因為得自哺乳動物細胞的核提取物不含Gal4。
可應用的基因調(diào)節(jié)元件和待研究基因調(diào)節(jié)元件規(guī)定為人的和/或動物和/或病毒的基因調(diào)節(jié)元件，特別是病理學中有意義基因的基因調(diào)節(jié)元件。實例有，下列物質(zhì)的基因的基因調(diào)節(jié)元件粘附分子，生長因子，磷酸二酯酶，磷酸酶，激酶，ATP酶，膜受體，第二信使受體，激素受體如類固醇受體，金屬蛋白酶，親免素，NO合酶，5-脂肪氧合酶；或者下列免疫靶例如細胞因子如白介素的基因調(diào)節(jié)元件，T-或B-細胞特異性地表達的基因如CD4受體、TCR或BCR(T-或B-細胞受體)的啟動子，淋巴特異性基因如TNF(腫瘤壞死因子)的啟動子，或者T細胞特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒如HTLV-1或HIV-1的基因調(diào)節(jié)元件。
本方法、該模型啟動子的一個獨特優(yōu)點在于，可應用的該基因調(diào)節(jié)元件不但是含有“TATA”盒的那些啟動子如編碼白介素-2(IL-2)的基因的啟動子，還有缺乏“TATA”盒的啟動子如編碼T細胞受體β鏈的基因的啟動子。例如，缺乏“TATA”盒的啟動子可被整合入該模型啟動子，或整合入通用報道質(zhì)粒pGS100，并應用于轉(zhuǎn)錄。
待轉(zhuǎn)錄的DNA序列的一個特征在于，在該序列中它缺乏一個或多個核堿基。待轉(zhuǎn)錄的DNA序列優(yōu)選包括任選無鳥嘌呤或者無胞嘧啶或者無胸腺嘧啶，即該序列無G，無C或者無T。此外，該序列也可缺乏一個以上核堿基，例如鳥嘌呤和胸腺嘧啶或者鳥嘌呤和胞嘧啶或者胞嘧啶和胸腺嘧啶。
應用的無G、無T或無C序列尤其是指那些長度多于400個核苷酸，優(yōu)選在400～2000個核苷酸之間或者更長的無G、無T或無C序列。具體而言，所用序列的長度約為500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、5000或更多個核苷酸。缺乏一種特定的核堿基的序列特別優(yōu)選的長度是約為800、1200、1600或2200個核苷酸的長度。
該DNA模板可以是線型或環(huán)狀DNA序列，例如該DNA模板可以是由聚合酶鏈反應產(chǎn)生的線型序列或是質(zhì)粒。
在一個實施方案中，該DNA模板是質(zhì)粒，并且由整個或部分載體、模型啟動子和例如無G、無T或無C的待轉(zhuǎn)錄DNA序列構(gòu)建而成。
本發(fā)明的目的在于可廣泛利用的報道質(zhì)粒(通用報道質(zhì)粒)。該通用報道質(zhì)粒含有用于限制酶PstI、EcoRI、SacI、KpnI、SacII、BamHI、SwaI的單一切割位點，質(zhì)粒pUC19的部分，用于酵母Gal 4蛋白的5個結(jié)合位點，介于SacII和BamHI限制酶切位點之間的人T細胞受體Vβ8.1的“TATA”盒，介于BAMHI和SwaI限制酶切位點之間的ML啟動子(腺病毒主要晚期啟動子)的INR(起始)區(qū)，和長度約為800個核苷酸(堿基對)的無G序列。通用報道質(zhì)粒中的該模型啟動子是一種合成啟動子，它含有5個酵母Gal 4結(jié)合位點，用于PstI、EcoRI、SacI、KpnI、SacII、BamHI和SwaI的單一切割位點，人T細胞受體Vβ8.1的TATA盒和ML啟動子的INR。待研究的任何基因調(diào)節(jié)元件可被整合入該啟動子區(qū)。該模型啟動子的部分或整個模型啟動子可以除去并由待研究的基因調(diào)節(jié)元件置換。
通用報道質(zhì)粒的一個具體實例稱為pGS100(圖2)。
在通用報道質(zhì)粒pGS100的一個具體實例中，合成啟動子在序列區(qū)中處于核苷酸位置2168和2337之間。腺病毒主要晚期(ML)啟動子的起始區(qū)處于核苷酸位置2322～2337上，而含有人T細胞受體Vβ8.1啟動子的TATA盒的區(qū)在核苷酸位置2289～2316上。酵母Gal4蛋白的5個結(jié)合位點處于核苷酸位置2168～2260之間。
通用報道質(zhì)粒pGS100進一步的具體實例示于序列表中(SEQ IDNo.1)。
通用報道質(zhì)粒pGS100進一步的具體實例保藏在the DSMZ-Deutsche Sammlung yon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，這遵照有關(guān)國際承認的用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約；DSM保藏號11450。
本方法的一方面在于，直接或間接地干擾特異性轉(zhuǎn)錄物的檢測致使不再能明確地檢測特異性轉(zhuǎn)錄物的蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)錄后被消除和/或降解。消除或降解尤其包括這樣的處理步驟它們操作簡便，例如其中的反應可通過化學的和/或機械的和/或酶促的處理步驟猝滅的方法和，合適的話，與此同時使轉(zhuǎn)錄物不含干擾蛋白，即在該處理步驟之后，過剩的標記核苷酸例如可通過洗滌步驟從特異性轉(zhuǎn)錄物中除去。
本方法的該實施方案一方面在于，例如在轉(zhuǎn)錄反應之后可借助于蛋白酶使蛋白質(zhì)降解?？蓱玫牡鞍酌咐缬泻\蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶和羧基蛋白酶。蛋白酶K、胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶A、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶優(yōu)選可應用。本方法一個特定的實施方案在于，轉(zhuǎn)錄之后用蛋白酶K進行消化。
為了測定轉(zhuǎn)錄程度即轉(zhuǎn)錄速率，就必須測定特異性轉(zhuǎn)錄物的量。
本方法的一方面在于，轉(zhuǎn)錄作用在標記的核苷酸存在下進行，或者在于，標記特異性轉(zhuǎn)錄物。例如，如果轉(zhuǎn)錄時應用適當?shù)姆欠派湫詷擞浐塑账?，則該轉(zhuǎn)錄物可以是非放射性標記的?？蓱玫暮塑账針擞浕缬袩晒饣绲?＝N-二甲基-1-氨基萘-5-磺酰)衍生物，熒光素衍生物或香豆素衍生物，或者化學發(fā)光基如吖啶衍生物。上述標記基可使得直接檢測特異性轉(zhuǎn)錄物。此外，也可以應用適于間接檢測該轉(zhuǎn)錄物的標記基。實例有異羥洋地黃毒甙元(digoxygenin)，它可用特異性抗異羥洋地黃毒甙元的抗體例如在ELISA中檢測；生物素，它可由生物素/阿維丁系統(tǒng)檢測；和含有功能基的連接臂，它可隨后用可檢測的報道基進行衍生化作用。最后提及的可能性實例如氨基烷基連接基，在轉(zhuǎn)錄后它可在化學發(fā)光試驗中與吖啶鎓(acridinium)活化的酯反應并檢測。
本方法的一個具體實施方案是在放射性標記的核苷酸存在下進行轉(zhuǎn)錄。該核苷酸例如可用磷(32P或33P)、硫(35S)或氚(3H)進行放射性標記。
本方法的一個特定實施方案在于，特異性轉(zhuǎn)錄物通過結(jié)合到固相(固體基質(zhì))上而從反應混合物中分離，例如通過結(jié)合到微量滴定板上或通過將特異性轉(zhuǎn)錄物與特定的濾器、膜或其它固相結(jié)合，尤其是通過結(jié)合到帶電的膜或帶電的濾器上，它們優(yōu)選由尼龍或硝酸纖維素構(gòu)成，特別優(yōu)選的是通過結(jié)合到含有帶電基例如二乙氨基乙基的膜上，例如DEAE-纖維素膜上。該實施方案的一方面在于，結(jié)合在固體基質(zhì)上的特異性轉(zhuǎn)錄物可通過洗滌步驟與過剩的標記核苷酸分離，其中的洗滌可進行到如此程度以致可以清晰地檢測該特異性轉(zhuǎn)錄物。
對比通常的分離和檢測方法(包括酚化處理、沉淀和隨后在變性凝膠上分離該轉(zhuǎn)錄物)，本方法驚人地產(chǎn)生可同樣清晰地檢測的特殊信號(參考實施例7和圖3)。
本方法適于產(chǎn)生例如由特異性轉(zhuǎn)錄引起的特殊信號，其中的轉(zhuǎn)錄例如在激活物(激活轉(zhuǎn)錄)或抑制物(抑制轉(zhuǎn)錄)的存在下進行，這些信號不同于由基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄例如當不存在激活物或抑制物時引起的基本信號強度；不同之處至少有7倍優(yōu)選有8倍，在特殊情況下甚至為9或10倍(參考實施例7和圖3)。
本方法一個重要的實施方案在于，它可用于篩選有藥理活性的物質(zhì)。為了測試候選藥理活性物質(zhì)的活性(例如活化或抑制性能)，在該待測活性物質(zhì)存在下進行轉(zhuǎn)錄。適當時，可將各組分如濃縮的核提取物與待測活性物質(zhì)預保溫。此外，待測試活性物質(zhì)的特異性的表征可這樣進行在該待測活性物質(zhì)的存在下于多種轉(zhuǎn)錄反應混合物中平行進行轉(zhuǎn)錄作用，其中每種反應混合物包含不同組分，然后測定和比較轉(zhuǎn)錄速率。
待測試活性物質(zhì)的實例可以是天然產(chǎn)物和/或得自化學的和組合的物質(zhì)文庫的物質(zhì)。天然產(chǎn)物例如可分離自植物、動物、植物分泌物、動物分泌物和，特別是得自微生物如得自真菌、酵母、細菌或藻類。
本方法的另一具體實施方案在于，在待測活性物質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、輔因子或細胞類型特異性核提取物的存在下進行轉(zhuǎn)錄，并在不存在待測活性物質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、輔因子或細胞類型特異性核提取物時平行進行反應混合物的反應，但反應條件完全相同；然后通過標記轉(zhuǎn)錄物量的差異測定待測活性物質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、輔因子或細胞類型特異性核提取物相對于基因調(diào)節(jié)元件(或基因)和/或轉(zhuǎn)錄因子和/或輔因子的活性(例如抑制性，激活性)或效應。
本方法的一方面在于，借助于在相同條件下平行進行的轉(zhuǎn)錄作用測定參與基因調(diào)節(jié)的、待研究的蛋白質(zhì)的效應，待研究的蛋白質(zhì)只存在于兩種反應混合物之一中。
本方法一個實施方案的一方面在于a)在相同條件下平行進行至少兩種轉(zhuǎn)錄作用，此時b)轉(zhuǎn)錄反應混合物的不同點只是在于，它們包括不同量的待測活性物質(zhì)和/或至少一種轉(zhuǎn)錄因子和/或至少一種輔因子和/或一種濃縮的核提取物，c)轉(zhuǎn)錄后測定每種反應混合物生成的標記轉(zhuǎn)錄物量，和d)通過生成的標記轉(zhuǎn)錄物量的差異確定待測活性物質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、輔因子和/或濃縮的核提取物相對于基因調(diào)節(jié)元件的活性和/或特異性。
本方法能靶特異性地測試轉(zhuǎn)錄反應混合物所含的各組分(例如對于核提取物(即對于特異性的細胞類型)或?qū)τ谔禺惖霓D(zhuǎn)錄因子)的效應。例如可分析待研究的活性物質(zhì)對于規(guī)定的基因調(diào)節(jié)元件的效應。此處的決定因素在于轉(zhuǎn)錄的反應條件可以準確限定。
本方法以靶特異性的方式提供影響各因子對病理基因表達的作用的方法，因為可通過選擇基因調(diào)節(jié)元件和轉(zhuǎn)錄因子和/或輔因子和/或細胞類型特異性核提取物而調(diào)節(jié)或準確設(shè)定合適的反應條件。
本方法的一個獨特優(yōu)點在于，它能鑒定能對規(guī)定條件下的轉(zhuǎn)錄作用產(chǎn)生正的或負的效應的藥理活性物質(zhì)，特別是那些激活或抑制規(guī)定的(靶)基因的轉(zhuǎn)錄作用的活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)對規(guī)定的基因調(diào)節(jié)元件和/或規(guī)定的轉(zhuǎn)錄因子、輔因子和/或細胞類型特異性核提取物(或細胞)具有特異性效應。
本發(fā)明涉及本方法在鑒定特異性活性物質(zhì)中的應用。本方法例如可用于表征待測物質(zhì)。本方法例如可用于表征待測物質(zhì)在規(guī)定條件下的特異性。由本方法鑒定的藥物活性物質(zhì)例如應能抑制或激活受基因調(diào)節(jié)元件控制的DNA序列的轉(zhuǎn)錄作用。
本方法又一個特別優(yōu)異的特征在于，所有步驟可以簡便方式實現(xiàn)自動化。例如可應用與自動供料微型組件聯(lián)接的自動移液裝置Biomek2000(Beckman，Munich)。然后可以由手工或自動方式例如借助于傳輸帶洗滌與固相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄物。
本發(fā)明一方面提供自動移液裝置，例如Biomek2000，它裝備有各反應組分例如蛋白質(zhì)級分(如核提取物和其它蛋白質(zhì))、DNA模板、轉(zhuǎn)錄緩沖液、在轉(zhuǎn)錄作用中待研究的物質(zhì)、移液管滴頭、微量滴定板和膜。各個反應由這些組分構(gòu)成例如微量滴定孔中的組分，自動地進行所有移液步驟。這樣，可以同時處理每塊板上的96個或更多的不同轉(zhuǎn)錄反應混合物，結(jié)合少量樣品體積，特別是小于100μl、優(yōu)選為10～50μl、尤其是20μl的體積。每次轉(zhuǎn)錄需大約1～1.5小時，于是當所用保溫時間呈最佳可能方式時，每天以這種方式可進行多達1000或更多次轉(zhuǎn)錄。
轉(zhuǎn)錄作用例如可在20～50℃的溫度下進行。在大約30℃下進行轉(zhuǎn)錄是特別優(yōu)選的。
由于特別是待測活性物質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、輔因子和適當時還有待測濃縮的核提取物可獲得量較少，但這些物質(zhì)應在大量轉(zhuǎn)錄作用中很多反應條件下測試，所以本方法必須滿足這一要求，即轉(zhuǎn)錄反應所需樣品體積應盡可能小。因此特別重要的是，本方法也適于在毫微升規(guī)模進行，即反應體積約為50～500nl。
本轉(zhuǎn)錄方法可以通用。它可用于鑒定和表征在基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)中起直接或間接作用的轉(zhuǎn)錄因子和/或輔因子和/或其它蛋白質(zhì)(即作為靶的特異性蛋白質(zhì))和/或濃縮的核提取物(即作為靶的特異性核提取物或特種細胞)的基因調(diào)節(jié)元件(即作為靶的特異性基因)。本轉(zhuǎn)錄方法尤其可用于鑒定病理學中有意義的新型基因調(diào)節(jié)元件和用于排布基因調(diào)節(jié)蛋白，它們介導這些元件的效應至相應基因調(diào)節(jié)元件。
與細胞分析法相比，上述轉(zhuǎn)錄方法具有更高的靶特異性。與細胞分析法相反，細胞對各組分的攝取對于轉(zhuǎn)錄效率無影響。此外，上述方法可簡便而快速地進行(例如，可制備各組分并冷凍貯存)。本方法易于標準化并可通用，因為它基本上可用于任何類型細胞和任意基因。
本方法可鑒定能用于制備藥劑的藥理活性物質(zhì)。與已知活性物質(zhì)相比，由這些轉(zhuǎn)錄方法鑒定的活性物質(zhì)應引起相當少的副作用。例如，可能測試或鑒定可用于制備治療下述疾病的藥劑的活性物質(zhì)(自身)免疫病、代謝病、癌、心血管病、傳染病、風濕病、糖尿病、變性病和精神病，尤其用于制備治療下述疾病的藥劑類風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、糖尿病、變態(tài)反應、氣喘、過敏癥、特應性皮炎、早老性癡呆、帕金森氏病、AIDS、克雅氏病、癲癇、精神分裂癥、動脈硬化和結(jié)核病。
此外，本通用方法提供大量的其它可能用途。例如，假如使用下列生物體的有關(guān)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)以及特異性基因調(diào)節(jié)元件、轉(zhuǎn)錄因子和/或輔因子和/或直接或間接地參與轉(zhuǎn)錄反應的其它蛋白質(zhì)，則本方法類似地可用于動物病理學和動物飼養(yǎng)，用于作物保護或植物栽培以尋找特異性的藥理活性物質(zhì)。
原則上，如果相應地使用微生物的或昆蟲的基因調(diào)節(jié)元件、能轉(zhuǎn)錄的系統(tǒng)，轉(zhuǎn)錄因子和/或輔因子，則該體外轉(zhuǎn)錄方法也可類似地用來鑒定可用于保藏原料和食料的物質(zhì)，所述微生物例如有酵母、真菌或細菌。
對圖的描述如下

圖1讀出轉(zhuǎn)錄反應的放射活性，其中應用了具有不同長度無G序列的各種基因調(diào)節(jié)元件和報道質(zhì)粒。示出了兩種標準啟動子與通用報道質(zhì)粒pGS100(圖2)的比較。該轉(zhuǎn)錄反應按實施例6中所述方法進行。
A)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄未活化啟動子而得到的放射活性轉(zhuǎn)錄物的量〔以相對單位表示〕(基礎(chǔ)信號強度)；B)活化轉(zhuǎn)錄用Gal4-聚谷氨酰胺活化啟動子而得到的放射活性轉(zhuǎn)錄物的量〔以相對單位表示〕。
I)所用報道質(zhì)粒為pMRG5(Kretschmar，M.，Kaiser，K.，Lottspeich，F(xiàn).，Meisterernst，M.(1994)Cell78，525-534)。pMRG5中的合成啟動子含有HIV啟動子的TATA盒，ML啟動子的起始子以及pUC19中長度約為400個核苷酸的無G序列。
II)所用報道質(zhì)粒為pVβML。報道質(zhì)粒pVβML的構(gòu)建方法與報道質(zhì)粒pGS100的相同，但它所含的無G序列長度只有400個核苷酸而不是800個核苷酸。
III)所用報道質(zhì)粒為pGS100，它包含約有800個核苷酸的無G序列。
每種情況下比較的是基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄(A)和活化轉(zhuǎn)錄(B)。采用的激活物是一種融合蛋白，它包含Gal4結(jié)合域(94個氨基端氨基酸)和聚谷氨酰胺活化域(有11個谷氨酸單元的合成肽)。標繪的數(shù)據(jù)表示扣除背景后的絕對值(以相對單位表示，是由磷酸圖象儀(phosphoimager)測得的)。在轉(zhuǎn)錄反應中，其中用pGS100為報道質(zhì)粒，測得更高的絕對值和由于合成啟動子的不同構(gòu)建而導致比mRG5更優(yōu)良的可激活性。此外，長度在400個核苷酸以上的無G序列的正效應是顯而易見的。
圖2通用報道質(zhì)粒pGS100。
通用報道質(zhì)粒pGS100在pUC19中在長度約為800個堿基對的無G區(qū)之前包含一個合成啟動子區(qū)作為模型啟動子。在BamHI和SwaI限制酶切位點內(nèi)定位有腺病毒主要晚期(ML)啟動子的起始區(qū)。在SacII和BamHI限制酶切位點之間，定位有含人T細胞受體Vβ8.1啟動子的TATA盒的區(qū)。這兩個基本啟動子元件(起始子和TATA盒)使得可在體外進行基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄作用。由于這些候選靶基因可能對于篩選尤為重要，所以有可能將它們個別地換成待研究基因的相應區(qū)(相應的基因調(diào)節(jié)元件)。靶基因的任何調(diào)節(jié)區(qū)都可引入基礎(chǔ)啟動子的多接頭下游(特異性激活)。也可以交換整個啟動子區(qū)。多接頭上游(SacII至PstI)，pGS100含有用于酵母Gal4蛋白的5個結(jié)合位點。這也使得可分析合成轉(zhuǎn)錄激活物例如融合蛋白，它們包括任意所需的活化域(例如單純皰疹反式激活蛋白VP16)和包括Gal4DNA結(jié)合域。該無G序列是pGS100的基本單元。
圖3常規(guī)的標準轉(zhuǎn)錄方法與上述無細胞體外轉(zhuǎn)錄方法功效的比較。
圖3示出了在不同反應條件下測得的信號強度(作為轉(zhuǎn)錄物量的量度，因而可反映轉(zhuǎn)錄強度)的比較。轉(zhuǎn)錄反應按實施例7中所述方法進行。
A)常規(guī)的標準轉(zhuǎn)錄方法，其中通過苯酚處理、用乙醇沉淀和隨后的變性凝膠電泳處理將特異性轉(zhuǎn)錄物與蛋白質(zhì)和過剩的核苷酸分離。
B)上述體外轉(zhuǎn)錄方法，其中蛋白質(zhì)用蛋白酶K消化，而過剩的核苷酸則通過洗滌與DEAE濾器結(jié)合的特異性轉(zhuǎn)錄物而得以除去；I)用于轉(zhuǎn)錄的原料是得自HeLa細胞核的提取物，它能轉(zhuǎn)錄且已經(jīng)在P11柱上純化過，沒有相應的DNA模板(對照試驗)；II)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄將與I的反應混合物相當?shù)姆磻旌衔镉米鳛镈NA模板的報道質(zhì)粒pMRG5處理，并進行轉(zhuǎn)錄反應；以該方式測定基本信號強度；III)活化轉(zhuǎn)錄將與反應混合物II相當?shù)姆磻旌衔锪硗庥棉D(zhuǎn)錄激活物處理，后者是一種融合蛋白，它包括Gal4的DNA結(jié)合域和VP16的活化域(Gal4-VP16)，并進行轉(zhuǎn)錄作用；這樣，可得活化信號強度；IV)將與III的轉(zhuǎn)錄反應混合物相當?shù)姆磻旌衔镉米鳛镽NA聚合酶II抑制物的α-鵝膏蕈堿處理(對照試驗)。
比較在不同反應條件下由兩種不同方法得到的信號強度，表明利用本文所述體外轉(zhuǎn)錄方法不但可測定基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄(II)，而且可測定活化轉(zhuǎn)錄(III)，信號強度類似于利用常規(guī)的轉(zhuǎn)錄方法獲得的那些。甚至基本信號強度也可測定這一現(xiàn)象極為重要，這樣，上述轉(zhuǎn)錄方法也可用于篩選轉(zhuǎn)錄抑制物。借助于特異性RNA聚合酶II抑制劑α-鵝膏蕈堿可使信號大約減小到1/8(比較III和IV)實施例實施例1HeLa核提取物的制備用HeLa細胞核為起始原料制備核提取物。HeLa細胞核可從許多公司(例如“4℃”，Mons；Sigma，Munich，Santa Cruz Biotechnology，Heidelberg)商購。下文中所述對該細胞核的處理是在4℃(冷室)下進行的。緩沖液都是在室溫(RT)下用Tris pH6.8調(diào)節(jié)的，它相當于4℃下的pH7.3。使用前，緩沖液用DTT(貯存液1M，于水中)處理至最終濃度為5mM，并用PMSF(貯存液200mM，于DMSO中)處理至最終濃度為1mM。
細胞核的處理包括下列步驟1.在冰上解凍細胞核并測定NPV體積(核沉淀體積)。
2.在兩個不同的玻璃燒杯中分別加入1/2NPV體積的0.02M KCl緩沖液(含鹽量低的緩沖液20ml 1M Tris pH6.8RT，250ml100％甘油，6.67ml 3M KCl，1.5ml 1M MgCl2，0.4ml 0.5M EDTA，加H2O至1000ml)和1.2M KCl緩沖液(含鹽量高的緩沖液20ml 1M Tris pH6.8RT，250ml 100％甘油，400ml 3M KCl，1.5ml 1M MgCl2，0.4ml 0.5MEDTA，加H2O至1000ml)。
每種緩沖液用0.0007×NPV/2β-巰基乙醇和0.001×NPV/2O.2M PMSF處理。
該沉淀重懸浮于1/2體積0.02M KCl緩沖液并用研杵(6X)輕輕地混勻。
3.將勻漿轉(zhuǎn)入玻璃燒杯，在30分鐘內(nèi)和不斷攪拌下滴加1.2M KCl緩沖液進行處理。又攪拌30分鐘后，提取完畢。離心分離(Beckman離心機，SS34轉(zhuǎn)子，在14,000rpm下，30min，4℃)，進一步分別處理沉淀和上清液。
4.在緩沖液1(40ml 1M Tris pH6.8RT，400ml甘油，0.8ml 0.5MEDTA，加H2O至2000ml)中透析上清液，直至達到緩沖液2(40ml1M Tris pH6.8RT，400ml甘油，0.8ml 0.5M EDTA，66.7ml 3M KCl，加H2O至2000ml)的電導率(45～55min)。
5.離心透析后的上清液(Beckman，SS34轉(zhuǎn)子，18,000rpm，20min，4℃)。HeLa核提取物處于該上清液中(HeLa核提取物＝HeLa NE)。在液N2中冷凍該提取物等分樣。將沉淀物從核提取液轉(zhuǎn)入勻漿器，用10ml TGME/5 mM DTT處理(TGME達1L250ml 100％甘油，50ml Tris pH7.3RT，5ml 1M MgCl2，0.2ml 500mM EDTA pH8.0)，用研杵(強烈地)攪拌(20X)，再在液N2中冷凍(Hela核沉淀物)。
實施例2制備用于分離核提取物的磷酸纖維素柱。
1.在水中反復洗滌P11柱材料。測定膨脹材料的體積。
2.加入5份體積的0.5N NaOH，放置5分鐘，然后立即用折疊濾紙吸濾。
3.水洗至pH11。
4.加入25份體積的0.5N HCl。放置5分鐘，然后立即吸濾。
5.水洗至pH3。
6.用1M Tris pH7洗滌至pH恒定為7。在4℃下貯存柱材料。最好使之平衡一夜。
實施例3用磷酸纖維素色譜法純化核提取物P11材料的容量為10mg蛋白質(zhì)/1ml材料。色譜法進行如下1.用P11材料裝填柱并在緩沖液2中平衡(加入新鮮的DTT和PMSF，見實施例1)。將柱與泵連接。
2.裝載(以1柱體積(CV)/h)核提取物(于緩沖液2中)。
3.用5CV緩沖液2洗滌柱(5～10CV/h)。
4.用緩沖液3(40ml 1M Tris pH6.8RT，400ml甘油，0.8ml 0.5MEDTA，200ml 3M KCl，加H2O至2000ml；2CV/h)洗脫。當不再能洗脫出蛋白質(zhì)后，又通入2CV緩沖液3。
5.用緩沖液4(40ml 1M Tris pH6.8RT，400ml甘油，0.8ml 0.5MEDTA，333ml 3M KCl，加H2O至2000ml；2CV/h)洗脫并收集峰級分。
6.用緩沖液5(40ml 1M Tris pH6.8RT，400ml甘油，0.8ml 0.5MEDTA，567ml 3M KCl，加H2O至2000ml；2CV/h)洗脫并收集峰級分。
7.用緩沖液2透析這2種洗脫液中每一種直至電導率保持恒定，然后在液N2中冷凍等分樣。
實施例4利用聚丙烯酰胺凝膠分離轉(zhuǎn)錄物的標準轉(zhuǎn)錄方法。
轉(zhuǎn)錄反應混合物(終體積20μl)可包括下列組分a)呈預純化的核提取物形式或由重組技術(shù)生產(chǎn)的通用轉(zhuǎn)錄因子，適當時由其它特異性轉(zhuǎn)錄因子、激活物、抑制物或融合蛋白補充；b)DNA模板(例如帶有待研究的基因調(diào)節(jié)元件的載體pGS100)；c)轉(zhuǎn)錄緩沖液，例如包括待研究的活性物質(zhì)；d)標記的和未標記的核苷酸；其中a)(實施例3的)緩沖液4洗脫物和緩沖液5洗脫物都含于能轉(zhuǎn)錄的核提取物中(所有通用轉(zhuǎn)錄因子)。每次單獨制備都要確定緩沖液4洗脫物和緩沖液5洗脫物的最適量(每種反應混合物大約3μl緩沖液4洗脫物和2μl緩沖液5洗脫物)；其中b)100ng DNA模板(報道質(zhì)粒例如pGS100中的基因調(diào)節(jié)元件)一般被用于每種反應混合物；其中c)每種反應混合物中含轉(zhuǎn)錄緩沖液(5mM MgCl2，25mMHEPES KOH pH8.2，0.5μl BSA乙?；?貯存物20mg/ml)，大約10％甘油，大約70mM KCl，0.2mM PMSF，10mM DTT)加上每種情況下20U RNA酶抑制劑；其中d)NTPs(ATP，UTP在各情況下最終濃度為100μM，CTP最終濃度為5μM，o-m-GTP最終濃度為20μM，α-32P-CTP最終濃度約為0.12μM，3000Ci/mmol，10mCi/ml)。
1.引入轉(zhuǎn)錄緩沖液和dNTPs并加入DNA模板。
2.加入轉(zhuǎn)錄激活物和緩沖液4洗脫物與緩沖液5洗脫物。
3.在30℃下保溫1h以進行轉(zhuǎn)錄反應。
4.加入400μl終止混合物(stopmix)(7M脲，10mM Tris HClpH7.8，10mM EDTA/NaOH pH7.8，0.5％SDS，100mM LiCl，100μg/mltRNA，300mM乙酸鈉)和400μl苯酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)?；旌虾箅x心分離(SS34轉(zhuǎn)子，Beckman離心機，5min，14,000rpm，RT)。吸出上清液，加入400μ上l異丙醇并混合，然后在-20℃下保溫1h。
5.離心分離(SS34 rotor，Beckman離心機，14,000rpm，30min，4℃)，用70％乙醇洗滌沉淀物，再在Speedvac中干燥。
6.在10μl荷載緩沖液(955μl100％甲酰胺(去離子化)，10μl 0.5MEDTA，20μl 1M Tris pH7，各情況下0.003％溴酚藍/二甲苯青(xylenecyanole)，加H2O至1ml)中溶解沉淀物，并在50℃下保溫15分鐘。
7.在5％加強變性(strength denaturing)聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)用1×TBE作流動緩沖液分離轉(zhuǎn)錄物。在60mA時預走20min。裝載凝膠。在60mA時走凝膠約1小時。
8.在10％乙酸中固定凝膠，干燥，再在Phosphoimager中暴露于X光片。
實施例5可實現(xiàn)自動化的、利用濾膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄物的上述體外轉(zhuǎn)錄方法的操作流程。
1.引入轉(zhuǎn)錄緩沖液和dNTRs，并加入DNA模板。
2.加入緩沖液4洗脫物和緩沖液5洗脫物和適當?shù)脑?，轉(zhuǎn)錄激活物或轉(zhuǎn)錄抑制物。
3.在30℃下將混合物保溫1h而進行轉(zhuǎn)錄反應。
4.加入5μl蛋白酶K混合物(1μl蛋白酶K溶液[20mg/ml]，1μl 10％SDS，0.5μl 0.5M EDTA pH8，1μl 50mM Tris pH7.8，加水至5μl)。
5.在30℃下保溫15min。
6.將DEAE膜NA45(Schleicher und Schuell)置于洗膜緩沖液(100mM磷酸鈉緩沖液pH7.5，250mM NaCl，2％焦磷酸鈉)中短暫地洗滌。
7.從該反應混合物中吸移5μl于膜上，讓它干燥5分鐘。
8.將該膜在大約100ml洗膜緩沖液(+1％Triton)中輕輕振動4×15分鐘。
9.將膜轉(zhuǎn)至Whatmann 3MM紙(Whatman，Maidstone，England)上，風干，用膠片覆蓋后利用Phosphoimager使濾膜暴露于X光片。
實施例6按照上述應用濾膜的體外轉(zhuǎn)錄方法，用3種不同的報道質(zhì)粒平行進行轉(zhuǎn)錄反應。
程序同實施例1-3和5。應用的報道質(zhì)粒是pMRG5(HIV啟動子的TATA盒，ML啟動子的起始區(qū)和pUC19中長度為大約400個核苷酸的無G盒(Kretschmar，M.，Kaiser，K.，Lottspeich，F(xiàn).，Meisterernst，M.(1994)Cell.78，525-534))，pGS100(圖2)和pVβML(象pGS100那樣構(gòu)建的，但只包含400bp無G盒而不是800bp無G盒)。每種情況下將100ng DNA模板和3μlP11級分(緩沖液4洗脫物和緩沖液5洗脫物)用于轉(zhuǎn)錄反應。這些反應每一種都是在不合和含有激活物(由Gal 4結(jié)合域和聚谷氨酰胺活化域構(gòu)成的融合蛋白)時平行進行的。結(jié)果如圖1所示和闡明。
實施例7比較應用標準轉(zhuǎn)錄方法獲得的和用上述體外轉(zhuǎn)錄方法獲得的放射性標記轉(zhuǎn)錄物的信號強度(作為轉(zhuǎn)錄物量的量度，因而反映轉(zhuǎn)錄強度)。
按實施例1～5中所述方法進行轉(zhuǎn)錄反應，并利用濾膜分析法(實施例5)或凝膠分析法(實施例4)分析平行反應混合物。在每種情況下將200ng pMRG5用作反應的DNA模板。某些轉(zhuǎn)錄反應是在30ng用作激活物的Gal4-VP16存在下進行的。結(jié)果示于和描述于圖3中。
序列表(1)一般信息(i)申請者(A)姓名Hoechst Aktiengesellschan(B)街名-(C)城市Germany(D)州名-(E)國別Deutschland(F)郵編65926(G)電話069-305-7072(H)電傳069-35-7175(I)電報掛號-(ii)發(fā)明名稱篩選天然產(chǎn)物和其它化學物質(zhì)的體外轉(zhuǎn)錄方法。
(iii)序列數(shù)1(iv)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release#1.0，版本#1.25(EPO)(2)SEQ ID No.1的信息(i)序列特征(A)長度3130個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學環(huán)狀(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)位置1..3130(xi)序列描述SEQ ID No.1TTTCCTGTGT GAAATTGTTA TCCGCTCACA ATTCCACACA ACATACGAGC CGGAAGCATA60AAGTGTAAAG CCTGGGGTGC CTAATGAGTG AGCTAACTCA CATTAATTGC GTTGCGCTCA 120CTGCCCGCTT TCCAGTCGGG AAACCTGTCG TGCCAGCTGC ATTAATGAAT CGGCCAACGC 180GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG TATTGGGCGC TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG 240CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA 300TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC 360AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG 420CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC 480CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC 540GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCAATG CTCACGCTGT 600AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC 660GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA 720CACGACTTAT CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA 780GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG AAGGACAGTA 840TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA 900TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG 960CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG 1020TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC 1080TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT 1140TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT 1200CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC GTGTAGATAA CTACGATACG GGAGGGCTTA 1260CCATCTGGCC CCAGTGCTGC AATGATACCG CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA 1320TCAGCAATAA ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC 1380GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT 1440AGTTTGCGCA ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG TGTCACGCTC GTCGTTTGGT 1500ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG 1560TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA 1620GTGTTATCAC TCATGGTTAT GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA 1680AGATGCTTTT CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA GTGTATGCGG 1740CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAATA CGGGATAATA CCGCGCCACA TAGCAGAACT 1800TTAAAAGTGC TCATCATTGG AAAACGTTCT TCGGGGCGAA AACTCTCAAG GATCTTACCG 1860CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT GTAACCCACT CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT 1920ACTTTCACCA GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAAAGGGA 1980ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC TTTTTCAATA TTATTGAAGC 2040ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG AATGTATTTA GAAAAATAAA 2100CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC CTGGGGGACT AGAGTCTCCG 2160CTCGGAGGAC AGTACTCCGC TCGGAGGACA GTACTCCGCT CGGAGGACAG TACTCCGCTC 2220GGAGGACAGT ACTCCGCTCG GAGGACAGTA CTCCGACCTG CAGGAATTCG AGCTCGGTAC 2280CCGCGGGGAT AAAATGTCAC AAAATTCATT TGGATCCTCA CTCTCTTCAT TTAAATATCC 2340CATACCCTTC CTCCATCTAT ACCACCCTAC TCTCCTTTCC TCATTATTCC TCCTATTATC 2400TTCTCCTCTT CTCTCCTTCT TCTATATTTC CCAAATCTAT CATCATTCAC TCTCATCCCC 2460TCTTCCTTCA CTCCCATTCT ATTCTACTCC TTTCCCTTTC CATATCCCCT CCACCCCCCT 2520TCCTCCCCTC TTTCAATCTT ATCCCCAATC ATAAAATTAT CTCAATTATA TTCTCCTTCC 2580ATACCCCCTA TCATCCTCAT CCCTATCACC CCCTACTCAC CCAATACTCC CTACTCATCT 2640CATATATCCT TATCCTCTCC TCACCTCTCC CTCCTCTATC TCCCCCCCTC ACACTCATTT 2700CTCATTCCAC TCCCAAATAT CCCATACCCT TCCTCCATCT ATACCACCCT ACTCTCCTTT 2760CCTCATTATT CCTCCTATTA TCTTCTCCTC TTCTCTCCTT CTTCTATATT TCCCAAATCT 2820ATCATCATTC ACTCTCATCC CCTCTTCCTT CACTCCCATT CTATTCTACT CCTTTCCCTT 2880TCCATATCCC CTCCACCCCC CTTCCTCCCC TCTTTCAATC TTATCCCCAA TCATAAAATT 2940ATCTCAATTA TATTCTCCTT CCATACCCCC TATCATCCTC ATCCCTATCA CCCCCTACTC 3000ACCCAATACT CCCTACTCAT CTCATATATC CTTATCCTCT CCTCACCTCT CCCTCCTCTA 3060TCTCCCCCCC TCACACTCAT TTCTCATTCC ACTCCCGGGG ATCAGCTTGG CGTAATCATG 3120GTCATAGCTG 3130
權(quán)利要求
1.DNA模板的無細胞體外轉(zhuǎn)錄方法，該DNA模板包括至少受一種基因調(diào)節(jié)元件控制的待轉(zhuǎn)錄的DNA序列，該方法包括a)為了轉(zhuǎn)錄而應用濃縮的和合適的話純化的細胞核提取物，合適的話該提取物可被轉(zhuǎn)錄因子和/或輔因子補充或者部分或全部置換，和至少一種標記的核苷酸，b)合適的話，在轉(zhuǎn)錄之后分離和/或降解反應混合物中的蛋白質(zhì)，c)將標記的轉(zhuǎn)錄物與固體基質(zhì)結(jié)合，d)除去過剩的標記核苷酸和e)測定標記的轉(zhuǎn)錄物量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中待轉(zhuǎn)錄的DNA序列至少缺乏一個選自鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶的核堿基(無G、無C或無T序列)。
3.權(quán)利要求1和2中一或二項的方法，其中無G、無C或無T序列的長度多于400個核苷酸。
4.權(quán)利要求1～3中一或多項的方法，其中無G、無C或無T序列的長度約為800個核苷酸。
5.權(quán)利要求1～4中一或多項的方法，其中的基因調(diào)節(jié)元件包括一個啟動子。
6.權(quán)利要求1～5中一或多項的方法，其中的啟動子包括“TATA”盒和/或起始區(qū)。
7.權(quán)利要求1～6中一或多項的方法，其中的基因調(diào)節(jié)元件包括一個增強子。
8.權(quán)利要求1～7中一或多項的方法，其中的基因調(diào)節(jié)元件包括一個沉默子。
9.權(quán)利要求1～8中一或多項的方法，其中的基因調(diào)節(jié)元件是模型啟動子。
10.權(quán)利要求1～9中一或多項的方法，其中的模型啟動子包括“TATA”盒、起始區(qū)和其它蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列。
11.權(quán)利要求1～10中一或多項的方法，其中的模型啟動子包括人T細胞受體Vβ8.1的“TATA”盒、ML啟動子(腺病毒主要晚期啟動子)的起始區(qū)(INR)和用于酵母Gal 4蛋白的5個結(jié)合位點和，介于“TATA”盒和Gal 4結(jié)合位點之間、用于限制酶的至少一個單一切割位點。
12.權(quán)利要求9～11中一或多項的方法，其中模型啟動子的一部分或全部被至少一個待研究的基因調(diào)節(jié)元件置換和/或該模型啟動子被至少一個待研究的基因調(diào)節(jié)元件補充。
13.權(quán)利要求1～12中一或多項的方法，其中基因調(diào)節(jié)元件和/或待研究的基因調(diào)節(jié)元件選自下列物質(zhì)的基因調(diào)節(jié)元件粘附分子、生長因子、磷酸二酯酶、磷酸酶、激酶、ATP酶、膜受體、第二信使受體、激素受體、類固醇受體、金屬蛋白酶、NO-合酶、5-脂肪氧合酶、細胞因子、白介素、T細胞受體、B細胞受體、核受體、病毒基因和逆轉(zhuǎn)錄病毒基因或者上述基因的基因調(diào)節(jié)元件的部分。
14.權(quán)利要求1～13中一或多項的方法，其中的DNA模板是通用報道質(zhì)粒。
15.權(quán)利要求14的方法，其中的DNA模板是如圖2中所示的通用報道質(zhì)粒pGS100。
16.權(quán)利要求14和15中一項或二項的方法，其中通用報道質(zhì)粒具有如表1所示的序列(SEQ ID No.1)。
17.權(quán)利要求14和15中一或二項的方法，其中的通用報道質(zhì)粒業(yè)已保藏，保藏號為DSM11450。
18.權(quán)利要求1～17中一或多項的方法，其中得自細胞核的濃縮提取物即濃縮核提取物通過至少一個色譜步驟純化。
19.權(quán)利要求1～18中一或多項的方法，其中的濃縮核提取物在選自下列物質(zhì)的核-蛋白質(zhì)-結(jié)合材料上純化磷酸纖維素、DEAE纖維素或肝素-Sepharose。
20.權(quán)利要求1～19中一或多項的方法，其中的濃縮核提取物在P11柱上純化。
21.權(quán)利要求1～20中一或多項的方法，其中的濃縮核提取物由至少一種通用的和/或特異性的轉(zhuǎn)錄因子補充。
22.權(quán)利要求1～21中一或多項的方法，其中的濃縮核提取物由至少一種選自下列組的通用轉(zhuǎn)錄因子補充TFIIA、TFIIB、TFIID或TBP、TFIIE、TFIIF、TFIIH和TFII。
23.權(quán)利要求1～22中一或多項的方法，其中的濃縮核提取物由選自下列組的至少一種特異性轉(zhuǎn)錄因子補充原癌基因、激素受體、腫瘤抑制物、病毒病原體、STAT蛋白、參與第二信使轉(zhuǎn)導級聯(lián)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)、核受體、基因特異性轉(zhuǎn)錄因子、細胞類型特異性轉(zhuǎn)錄因子、組織特異性轉(zhuǎn)錄因子、依賴于分化地表達的轉(zhuǎn)錄因子、發(fā)育特異性地表達的和細胞周期特異性地表達的轉(zhuǎn)錄因子和上述各種轉(zhuǎn)錄因子中的部分，適當時有可能將這些部分用作融合蛋白。
24.權(quán)利要求1～23中一或多項的方法，其中的濃縮核提取物由至少一種選自下列的輔因子補充通用輔因子、特異性輔因子、正輔因子、負輔因子、TAFs和介體。
25.權(quán)利要求1～24中一或多項的方法，其中轉(zhuǎn)錄反應混合物中的蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄后通過化學的和/或機械的和/或酶促的處理步驟而得以消除和/或降解。
26.權(quán)利要求25的方法，其中的處理步驟指蛋白酶消化。
27.權(quán)利要求25和26中一或二項的方法，其中將蛋白酶K用于蛋白酶消化。
28.權(quán)利要求1～27中一或多項的方法，其中將標記的轉(zhuǎn)錄物與帶電的固體基質(zhì)結(jié)合。
29.權(quán)利要求28的方法，其中的基質(zhì)指DEAE-纖維素膜。
30.權(quán)利要求1～29中一或多項的方法，其中至少將一種核苷酸進行放射性標記。
31.權(quán)利要求1～30中一或多項的方法，其中處理步驟a)～e)的全部或至少部分借助于自動系統(tǒng)進行。
32.權(quán)利要求31的方法，其中的自動系統(tǒng)指Biomek2000。
33.權(quán)利要求1～32中一或多項的方法，其中在待檢驗的活性物質(zhì)存在下進行轉(zhuǎn)錄。
34.權(quán)利要求33的方法，其中待檢驗的活性物質(zhì)抑制轉(zhuǎn)錄。
35.權(quán)利要求33的方法，其中待檢驗的活性物質(zhì)激活轉(zhuǎn)錄。
36.權(quán)利要求1～35中一或多項的方法，其中a)至少有兩種轉(zhuǎn)錄反應在相同條件下平行進行，此時b)轉(zhuǎn)錄反應混合物不同之處僅僅在于它們包括不同量的待檢驗活性物質(zhì)和/或至少一種轉(zhuǎn)錄因子和/或至少一種輔因子和/或濃縮的核提取物，c)轉(zhuǎn)錄后對于每種反應混合物測定生成的標記轉(zhuǎn)錄物量，和d)通過生成的標記轉(zhuǎn)錄物量的差異測定待檢驗的活性物質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、輔因子和/或濃縮核提取物對基因調(diào)節(jié)元件的活性和/或特異性。
37.權(quán)利要求1～36中一或多項的方法，其中得自細胞核的提取物被濃縮但未進一步純化。
38.權(quán)利要求1的DNA模板，它包括待轉(zhuǎn)錄的DNA序列且至少受一種基因調(diào)節(jié)元件控制，其中待轉(zhuǎn)錄的DNA序列至少缺乏一種選自鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶的核堿基，該無G、無T或無C序列的長度為多于400個核苷酸。
39.權(quán)利要求38的DNA模板，其中待轉(zhuǎn)錄的無G、無T或無C序列長度約為800個核苷酸。
40.權(quán)利要求38和39中一或二項的DNA模板，其中的基因調(diào)節(jié)元件包括一個啟動子和，合適的話，一個增強子和/或沉默子。
41.權(quán)利要求38～40中一或多項的DNA模板，其中該DNA模板指圖2中所示的報道質(zhì)粒pGS100。
42.權(quán)利要求38～41中一或多項的DNA模板，其中的通用報道質(zhì)粒序列如SEQ ID No.1所示。
43.權(quán)利要求38～41中一或多項的DNA模板，其中的通用報道質(zhì)粒業(yè)已保藏，保藏號為DSM11450。
44.權(quán)利要求38～43中一或多項的DNA模板在轉(zhuǎn)錄方法中的應用。
45.權(quán)利要求44中關(guān)于DNA模板的應用，其中的轉(zhuǎn)錄方法指權(quán)利要求1～37中一或多項的方法。
46.權(quán)利要求1～37的方法在鑒定特異性藥理活性物質(zhì)方面的應用。
47.權(quán)利要求46的關(guān)于方法在鑒定和表征藥理活性物質(zhì)方面的應用，其中的藥理活性物質(zhì)在規(guī)定的條件下抑制受基因調(diào)節(jié)元件控制的DNA序列的轉(zhuǎn)錄作用。
48.權(quán)利要求46的關(guān)于方法在鑒定和表征藥理活性物質(zhì)方面的應用，其中的藥理活性物質(zhì)在規(guī)定的條件下激活受基因調(diào)節(jié)元件控制的DNA序列的轉(zhuǎn)錄作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及DNA模板的無細胞體外轉(zhuǎn)錄方法,該DNA模板包括至少受一種基因調(diào)節(jié)元件控制的待轉(zhuǎn)錄的DNA序列,該方法包括:a)為了轉(zhuǎn)錄而應用濃縮的和適當?shù)脑捈兓募毎颂崛∥?合適的話該提取物可被轉(zhuǎn)錄因子和/或輔因子補充或者部分或全部地置換,和至少一種標記的核苷酸,b)合適的話,在轉(zhuǎn)錄之后分離和/或降解反應混合物中的蛋白質(zhì),c)將標記的轉(zhuǎn)錄物與固體基質(zhì)結(jié)合,d)除去過剩的標記核苷酸和e)測定標記的轉(zhuǎn)錄物量。本發(fā)明還涉及該方法所用的DNA模板及其應用。
文檔編號C12P19/00GK1193046SQ9810551
公開日1998年9月16日 申請日期1998年3月11日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月12日
發(fā)明者B·基爾施巴姆, W·斯塔爾, I·溫克勒 申請人:赫徹斯特股份公司