專利名稱：用反義寡核苷酸調(diào)節(jié)神經(jīng)生長(zhǎng)并使β/A4淀粉樣肽誘導(dǎo)的形態(tài)逆轉(zhuǎn)的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及治療老年性癡呆癥和唐氏先天愚癥的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及開(kāi)發(fā)能夠逆轉(zhuǎn)與老年性癡呆癥和唐氏先天愚癥有關(guān)的由A4淀粉樣肽引起的有害影響之治療劑。相關(guān)領(lǐng)域綜述老年性癡呆癥(AD)與公共健康的關(guān)系日益密切。Katzman(N.Engl.J.Med.3 14964-973(1 986))認(rèn)為這種綜合癥的特征在于成人的智力損傷嚴(yán)重以致于影響了職業(yè)或社會(huì)活動(dòng)。Hay和Ernst(Am.J.Pub.Health 771169-1175(1987))認(rèn)為AD是成人發(fā)作性癡呆的最常見(jiàn)形式，而且在美國(guó)是導(dǎo)致死亡的第四位的原因。
與AD有關(guān)的癡呆在腦中伴有神經(jīng)病理學(xué)改變。Hyman等人(Science 2251168-1170(1984))公開(kāi)了海馬的主要輸入和輸出路徑有很高濃度的衰老斑(SP)和神經(jīng)原纖維叢(NFT)，它們可能功能性隔離了海馬，從而使記憶受到損傷。Mountjoy等人(Aging 41-11(1983))公開(kāi)了AD大腦中神經(jīng)元的明顯損失。Coyle等人(Science 2191184-1190(1983))發(fā)現(xiàn)AD大腦乙酰膽堿陽(yáng)性位點(diǎn)有所減少。
常與AD有關(guān)的一個(gè)特征是在大腦中存在含淀粉樣肽的衰老斑(SP)。Majocha等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 856182-6186(1988))發(fā)現(xiàn)這些衰老斑的直徑為約9到50μm，而且形態(tài)和密度也不同。Wisniewski和Terry(Progress in Neuropathology，Zimmerman編，Gruneand Stratton，New York，N.Y.pp.1-26(1973))認(rèn)為SP由細(xì)胞外淀粉樣肽、反應(yīng)性細(xì)胞、含NFT的退化軸突、溶酶體、異常線粒體和星形細(xì)胞突組成。Mertz等人(Acta Neuropathol.60113-124(1983))認(rèn)為SP的核心是由包括直徑為4-8nm原纖維的淀粉樣肽形成的。
已確定了SP的淀粉樣肽的性質(zhì)。Glenner和Wong(Biochem.Biophys.Res.Commun.120885-890(1984))公開(kāi)了4.2KD的AD腦衍生肽，所述肽具有28個(gè)氨基酸的特有序列。Glenner和Wong(Biochem.Biophys.Res.Commun.1221131-1135(1984))還從唐氏先天愚癥腦血管淀粉樣肽中分離出了有相似序列的多肽。在11位上的一個(gè)氨基酸取代，Glu代替Gln，使兩種蛋白質(zhì)有所不同。Masters等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 824245-4249(1985))公開(kāi)了淀粉樣肽斑核心衍生的4.2kd肽，其序列與Glenner和Wong的AD衍生肽的序列幾乎相同。它在各種溶劑中較不易溶。Castano等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.141782-789(1986))發(fā)現(xiàn)與4.2kd AD肽有同源性結(jié)構(gòu)的短合成肽表現(xiàn)出相似的聚集特性。Kang等人(Nature 325733-736(1987))發(fā)現(xiàn)引起衰老斑的肽為42或43個(gè)氨基酸長(zhǎng)。該肽是從一個(gè)較大蛋白質(zhì)切下的，現(xiàn)已知這個(gè)較大蛋白質(zhì)是一種淀粉樣前體蛋白或APP，是一種由21號(hào)染色體上的一個(gè)座位確定的普遍性跨膜糖蛋白(Goldgaberet al.，Science 235877-880(1987)；Kang et al.，Nature 325733-736(1987)；Kitaguchi et al.，Nature 331531-534(1988)；Tanzi et al.，Science235880-882(1987)；Tanzi et al.，Nature 331528-530(1988)；Ponte，etal.，Nature 331525-527(1988)；Zain et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85929-933(1988))。本文稱所述肽為β/A4肽。
分子克隆實(shí)驗(yàn)(Glodgaber et al.，Science 235877-880(1987)；Kanget al.，Nature(London)326733-736(1987)；Robakis et al.，PNAS USA844190-4194(1987)；Tanzi et al.，Science 235880-884(1987)；Kitaguchi et al.，Nature 331530-532(1988)；Ponte et al.，Nature 331525-527(1988)；Tanzi et al.，Nature 331527-530(1980))表明淀粉樣β-蛋白是至少三種不同前體(βAPP695、βAPP751、βAPP770)的一部分，所述三種前體由人21號(hào)染色體上的一個(gè)基因編碼(Robakis et al.，Lancet1384-385(1987))。βAPP751和βAPP770均含有βAPP695所沒(méi)有的與Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑(KPI)有高度序列同源性的56氨基酸插入片段(Kitaguchi et al.，Nature 331530-532(1988)；Ponte et al.，Nature331525-527(1988)；Tanzi et al.，Nature 331527-530(1988))。在經(jīng)檢測(cè)的幾乎每種組織中都有βAPP表達(dá)(Tanzi et al.，Science 235880-884(1987))，在腦中，βAPP既存在于神經(jīng)元細(xì)胞也存在于非神經(jīng)元細(xì)胞中(Robakis et al.(1988)In“Disorders of the Developing Nervous SystemChanging views on their origins，diagnosis and treatments.”(Swan，J.W.編)Alan R.Liss，Inc.New York，NY)。
正是APP的羧基末端含有約42個(gè)氨基酸的產(chǎn)淀粉樣蛋白β肽區(qū)(Kang et al.，Nature 325733-736(1987))。在β肽內(nèi)經(jīng)組成性分泌途徑可以切下這個(gè)APP區(qū)(Esch et al.，Science 2481122-1124(1990))，由于沒(méi)有留下完整的β淀粉樣肽，所述的分泌途徑是防止淀粉樣蛋白形成的過(guò)程。最近證明，4kDa β淀粉樣肽是正常的分泌產(chǎn)物，是經(jīng)高爾基核內(nèi)體介導(dǎo)的過(guò)程產(chǎn)生的，然后從細(xì)胞中釋放出來(lái)(Shoji et al.，Science 258126-129(1992)；Golde et al.，Science 225728-730(1992)；Seubert et al.，Nature 361260-263(1993))。
近來(lái)，用分子生物學(xué)工具在確定β/A4肽在老年性癡呆癥的病理學(xué)中所起的作用方面做了相當(dāng)多的研究。Maestre等人(Brain Res.59964-72(1992))發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)β/A4肽的轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞比未轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞大，有較長(zhǎng)的軸突，而且有明顯較大數(shù)量的類似氣泡和微絨毛的受膜限制的表面延伸部分。發(fā)現(xiàn)β/A4定位于這些膜突起物中。Majocha等人(Mol.Chem.Neuropathol.1899-113(1993))發(fā)現(xiàn)，表達(dá)β/A4肽的轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞分泌刺激軸突延長(zhǎng)以及使細(xì)胞分化成神經(jīng)元表型的因子。Tate等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897090-7094(1992))發(fā)現(xiàn)，表達(dá)β/A4肽的轉(zhuǎn)染細(xì)胞在植入大鼠腦中后可明顯地改變晝夜活動(dòng)。
患有唐氏先天愚癥(DS)之個(gè)體的腦病理學(xué)與AD中所見(jiàn)的變化幾乎相同。作為AD特征的NFT和SP在40歲以上的DS病例中均能見(jiàn)到。NFT和SP的形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)在這兩種疾病之間難以區(qū)分。神經(jīng)化學(xué)變化也是類似的(參見(jiàn)Ikeda，S.et al.，Lab.Invest.61133-137(1989)；Cole et al.，Acta Neuropathol.85542-552(1993)；Patterson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.858266-8270(1988)；Ikeda et al.，Prog.Clin.Biol.Res.317313-323(1989)；Beyreuther et al.，Prog.Clin.Biol.Res.379159-182(1992))。
盡管APP廣泛分布于真核細(xì)胞中，但這種蛋白質(zhì)的正常功能尚未完全闡明。已有幾個(gè)方面的證據(jù)顯示APP和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)之間的關(guān)系。用NGF處理后誘導(dǎo)釋放含所述蛋白質(zhì)KPI區(qū)，但沒(méi)有羧基末端部分的125和120kDa APP(Refolo et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.164664-670(1989))。給大鼠腦施用NGF提高了APP mRNA的水平(Refolo et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.164664-670(1989))。給發(fā)育中的基底前腦施用NGF時(shí)，前體蛋白質(zhì)(prion protein，PrP)和APP mRNA水平同時(shí)也會(huì)增加(Mobley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.859811-9815(1988))。695異構(gòu)體(isoform)的水平選擇性地提高，但較高分子量的APP則不會(huì)。用NGF處理PC12細(xì)胞后，由于除胞質(zhì)外APP還定位于生長(zhǎng)錐和突，所以會(huì)發(fā)生APP的重新分布(Fukuyama et al.，Molec.Brain Res.1717-22(1993))。APP的抗體特異性地消除了NGF對(duì)軸突長(zhǎng)度和分支的影響(Milward et al.，Neuron 9129-137(1992))。
此外，動(dòng)物研究表明大腦中的上行膽堿能突出物表達(dá)低親和性和高親和性的NGF受體，而且是NGF敏感性的，可能也是NGF依賴性的。膽堿能損傷會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知障礙，但用NGF處理可改善動(dòng)物的認(rèn)知行為。此外，在人臨床試驗(yàn)中，觀察到在老年性癡呆癥患者中進(jìn)行NGF治療得到陽(yáng)性結(jié)果，表明部分逆轉(zhuǎn)了AD在患者中的影響(LarsOlson，Experimental Neurology 1245-15(1993))。
這些重要發(fā)現(xiàn)表明了β/A4肽在AD和DS神經(jīng)病理學(xué)中的活性作用。然而，需要確定可歸因于β/A4肽的病理學(xué)是否是可逆轉(zhuǎn)的。治療性化合物而不僅僅是預(yù)防劑的開(kāi)發(fā)可能很大程度上取決于β/A4肽誘導(dǎo)的病理學(xué)，特別是細(xì)胞體積增大、軸突延伸以及細(xì)胞分化成神經(jīng)元表型的可逆轉(zhuǎn)性。另外，還需要在所述潛在治療性化合物用于臨床試驗(yàn)前，測(cè)定所述化合物對(duì)老年性癡呆淀粉樣肽生產(chǎn)的影響的體外檢測(cè)方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及如下發(fā)現(xiàn)，即，有可能停止并逆轉(zhuǎn)過(guò)度表達(dá)的β/A4肽在細(xì)胞中的積累。因此，本發(fā)明提供逆轉(zhuǎn)β/A4肽對(duì)細(xì)胞造成的形態(tài)變化的方法。在第一方面，本發(fā)明方法包括給因β/A4肽而發(fā)生形態(tài)變化的細(xì)胞施用能減少或消除β/A4肽合成的寡核苷酸?？捎糜诒景l(fā)明方法的修飾的寡核苷酸主要是比常規(guī)寡核苷酸磷酸二酯更能耐受核酸降解作用的寡核苷酸，包括具有各種修飾的核苷間連鍵、混合骨架、核酸酶抗性3’帽結(jié)構(gòu)、形成整合三螺旋的結(jié)構(gòu)或自我穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、或其任何組合的寡核苷酸。所述的寡核苷酸酸優(yōu)選具有與編碼β/A4肽或其前體蛋白APP(見(jiàn)
圖13)的核苷酸序列互補(bǔ)或與β/A4肽或APP轉(zhuǎn)譯起始密碼子互補(bǔ)的核苷酸序列。令人驚奇的是，β/A4肽表達(dá)的降低足以逆轉(zhuǎn)由β/A4肽誘導(dǎo)的形態(tài)變化，而不明顯需要消除可能由β/A4肽引起但隨后由其他分子維持的其他作用。因此，需要檢測(cè)在包括人的哺乳動(dòng)物中降低β/A4肽水平帶來(lái)的影響，以測(cè)定β/A4肽減少對(duì)整個(gè)生物的影響。本發(fā)明在第二方面提供了進(jìn)行所述測(cè)定的方法。這些研究將優(yōu)選先在非人哺乳動(dòng)物中進(jìn)行。所述研究包括給動(dòng)物施用前述的修飾的寡核苷酸以逆轉(zhuǎn)β/A4肽對(duì)細(xì)胞造成的形態(tài)變化。
在第三方面，本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防動(dòng)物特別是人的老年性癡呆癥的方法。
在第四方面，本發(fā)明還涉及治療動(dòng)物特別是人的唐氏先天愚癥的方法。
在第五方面，本發(fā)明提供了能降低細(xì)胞或動(dòng)物中的β/A4肽水平并能逆轉(zhuǎn)β/A4肽引起的細(xì)胞形態(tài)變化的寡核苷酸。本發(fā)明第一方面的討論中已簡(jiǎn)要描述了這些寡核苷酸。
在第六方面，本發(fā)明還涉及藥物組合物，所述藥物組合物含有有效量的至少一種本發(fā)明的抗β/A4寡核苷酸和藥物可接受的載體。
在第七方面，本發(fā)明涉及含有神經(jīng)生長(zhǎng)因子和抗β/A4寡核苷酸的物質(zhì)組合物。
在第八方面，本發(fā)明提供含有神經(jīng)生長(zhǎng)因子和抗β/A4寡核苷酸的藥物組合物。
在第九方面，本發(fā)明教導(dǎo)了一種測(cè)定APP反義化合物對(duì)老年性癡呆淀粉樣肽生產(chǎn)的影響的方法，包括增殖表達(dá)或優(yōu)選過(guò)度表達(dá)β/A4的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如PC12)的第一和第二培養(yǎng)物；將標(biāo)記的甲硫氨酸加到第一和第二細(xì)胞培養(yǎng)物中；將細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)一段時(shí)間；從第一和第二細(xì)胞培養(yǎng)物中收集上清液；候選APP反義化合物。
在第十方面，本發(fā)明教導(dǎo)了一種預(yù)防、治療和/或逆轉(zhuǎn)β/A4淀粉樣肽誘導(dǎo)的形態(tài)的方法，包括給需要的患者施用有效量的藥物組合物，所述組合物含有神經(jīng)生長(zhǎng)因子和抗β/A4寡核苷酸。
附圖的簡(jiǎn)要描述圖1表示在本發(fā)明寡核苷酸的一個(gè)實(shí)施方案中所用的某些優(yōu)選帽結(jié)構(gòu)。
圖2表示本發(fā)明自我穩(wěn)定的寡核苷酸實(shí)施方案的一種形式。
圖3表示本發(fā)明自我穩(wěn)定的寡核苷酸實(shí)施方案的第二種形式。
圖4圖示說(shuō)明含淀粉樣肽cDNA的Min載體。所示的插入片段攜有β/A4肽(黑色垂直框)、APP編碼序列的其余部分(白色垂直框)和非編碼區(qū)(細(xì)垂直線)。
圖5A、5B和5C表示未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖5A)、含轉(zhuǎn)化載體而沒(méi)有淀粉樣肽插入片段的細(xì)胞(圖5B)和用編碼A4到APP C末端之載體DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(圖5C)的免疫染色圖。
圖6A、6B、6C和6D表示與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖6A)或用無(wú)插入片段載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(圖6B)相比較的β/A4轉(zhuǎn)染的AC126(圖6C)和AC127(圖6D)細(xì)胞的光學(xué)顯微照片。
圖7圖示說(shuō)明用無(wú)插入片段載體(V120)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和β/A4轉(zhuǎn)染細(xì)胞(AC126和AC127)的軸突長(zhǎng)度和細(xì)胞大小。
圖8A和圖8C表示未轉(zhuǎn)染的(圖8A)和β/A4轉(zhuǎn)染的(圖8B)PC12細(xì)胞的電子顯微照片。
圖9A、9B、9C和9D表示未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖9A)、無(wú)插入片段載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(圖9B)和β/A4轉(zhuǎn)染的AC126細(xì)胞(圖9C)和AC127(圖9D)細(xì)胞之膜突起物的電子顯微照片。
圖10圖示說(shuō)明在未轉(zhuǎn)染(NN)、無(wú)插入片段載體轉(zhuǎn)染的(V120)和β/A4轉(zhuǎn)染的(AC126和AC127)細(xì)胞膜中微絨毛和/或氣泡樣結(jié)構(gòu)的頻率。
圖11A、11B、11C和11D表示未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖11A)、用無(wú)插入片段載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(圖11B)和β/A4轉(zhuǎn)染的AC126(圖11C)和AC127細(xì)胞(圖11D)的電子顯微照片。
圖12A和12B用抗核糖核酸酶抑制劑蛋白抗體(圖12A)或抗βA/4抗體(圖12B)免疫染色細(xì)胞的電子顯微照片。
圖1 3A和1 3B描述Kang等人(Nature 325733-736(1987))公開(kāi)的APP的cDNA序列(SEQ ID No.12)，從中可構(gòu)建與相應(yīng)的mRNA序列互補(bǔ)的抗β/A4寡核苷酸。起始密碼子從核苷酸147開(kāi)始。β/A4蛋白質(zhì)的編碼序列是從核苷酸1935到2060。APP編碼序列終止于核苷酸2231。
圖14A和圖14B描述不存在(圖14A)或存在(圖14B)具有SEQ IDNo.1之反義寡核苷酸的情況下培養(yǎng)的免疫染色的AC127細(xì)胞。
圖15A、15B和15C描述加入反義寡核苷酸后PC12細(xì)胞的形態(tài)。將PC12細(xì)胞與各種濃度的與APP mRNA 5’末端區(qū)互補(bǔ)的寡核苷酸-1反義寡核苷酸一起保溫1周。圖15A未處理細(xì)胞。圖15B加入10μg/ml寡核苷酸-1。圖15C加入20μg/ml寡核苷酸-1。固定細(xì)胞，然后用0.1％考馬斯藍(lán)染色。短橫＝50μm。
圖16描述影響細(xì)胞表面積的反義寡核苷酸量。將寡核苷酸-1反義寡核苷酸和無(wú)關(guān)的寡核苷酸-2以0、10和20μg/ml加到PC12細(xì)胞培養(yǎng)物中，保溫1周。隨后在細(xì)胞體面積的圖象分析檢測(cè)前，固定這些細(xì)胞，用0.1％考馬斯藍(lán)染色。在用10和20μg/ml寡核苷酸-1處理后，表面積有顯著降低(p＜0.01)。寡核苷酸-2的作用不顯著。每種類型計(jì)數(shù)150個(gè)細(xì)胞。
圖17A、17B和17C描述用10μg/ml寡核苷酸-1處理10天后，PC12細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物的Westem印跡。用抗APP抗體進(jìn)行免疫染色。圖17A未處理細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物有主要的120-150kD APP條帶。標(biāo)明了分子量標(biāo)記。圖17B用10μg/l寡核苷酸-1處理，與未處理對(duì)照相比，按上樣總蛋白量計(jì)APP水平有33％的降低。圖17C用15μg/ml處理使APP水平降低60％。用圖象分析進(jìn)行定量。
圖18描述用NGF預(yù)處理后，寡核苷酸-1對(duì)PC細(xì)胞面積的影響。用100ng/ml NGF將細(xì)胞處理48小時(shí)，然后暴露于濃度為15μg/ml的寡核苷酸-1中0、1和2天，如圖所示。在開(kāi)始NGF處理后，細(xì)胞體大小(0天標(biāo)明的)顯著高于(p＜0.05)低于500μm2的未處理細(xì)胞的大小。隨后加入寡核苷酸-11和2天，對(duì)于對(duì)NGF的反應(yīng)沒(méi)有明顯的影響。細(xì)胞體面積的圖象分析前，固定細(xì)胞，然后用0.1％考馬斯藍(lán)染色。每個(gè)柱代表至少100個(gè)觀察結(jié)果的平均值。
圖19描述用NGF預(yù)處理后，寡核苷酸-1對(duì)PC12軸突長(zhǎng)度的影響。條件和資料分析與圖18的說(shuō)明中所述的相同。
圖20描述用寡核苷酸-1或寡核苷酸-2預(yù)處理后，NGF對(duì)PC12細(xì)胞面積的影響。將PC12細(xì)胞與0、5、10或15μg/ml的寡核苷酸-1一起保溫2天，然后在相同寡核苷酸濃度加100ng/ml NGF下再保持4天。在15μg/ml，與未暴露于反義寡核苷酸的細(xì)胞相比，寡核苷酸-1對(duì)表面積的影響顯著(p＜0.01)。用0和15μg/ml寡核苷酸-2重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)。固定細(xì)胞，用0.1％考馬斯藍(lán)染色，然后用圖象分析評(píng)估。每個(gè)柱代表至少100個(gè)測(cè)量結(jié)果的平均值。
圖21描述用寡核苷酸-1或寡核苷酸-2預(yù)處理后，NGF對(duì)PC12軸突長(zhǎng)度的影響。在不存在寡核苷酸(對(duì)照)或存在指明的15μg/ml寡核苷酸-1或寡核苷酸-2的情況下，將PC12細(xì)胞培養(yǎng)2天。細(xì)胞有突起物伸出并測(cè)量軸突長(zhǎng)度。與未暴露于寡核苷酸-1的細(xì)胞相比，寡核苷酸-1的作用顯著(p＜0.01)。每個(gè)柱代表至少100個(gè)測(cè)量結(jié)果的平均值。
圖22A和22B描述NGF對(duì)用反義寡核苷酸預(yù)處理的PC12細(xì)胞的影響。圖22A僅用NGF處理的細(xì)胞。圖22B將PC12細(xì)胞與15ng/ml寡核苷酸-1一起保溫2天，然后在相同寡核苷酸濃度加100ng/ml NGF下再保持4天。短橫＝50μm。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及開(kāi)發(fā)治療老年性癡呆癥(AD)和唐氏先天愚癥(DS)的方法。本發(fā)明提供能預(yù)防和逆轉(zhuǎn)用β/A4淀粉樣肽作用于細(xì)胞而產(chǎn)生之有害影響的潛在治療劑，所述肽對(duì)AD和DS的病理學(xué)有重要影響。因此，在本發(fā)明中，“治療”指預(yù)防、減輕和/或逆轉(zhuǎn)。
在第一方面，本發(fā)明提供逆轉(zhuǎn)因在細(xì)胞中表達(dá)β/A4肽而誘導(dǎo)的形態(tài)變化的方法。在本發(fā)明的所述方法中，給表達(dá)β/A4肽并因其表達(dá)β/A4肽而產(chǎn)生形態(tài)變化的細(xì)胞施用抗β/A4寡核苷酸。所述的形態(tài)變化包括但不限于細(xì)胞體積的增大、細(xì)胞聚集、氣泡和/或微絨毛樣膜突起物的形成、軸突長(zhǎng)度的增加。
在本發(fā)明方法中，“抗β/A4寡核苷酸”指這樣一些寡核苷酸，其核苷酸序列通過(guò)特異性Watson-Crick或Hoogstein堿基配對(duì)與β/A4肽表達(dá)所涉及的特異性互補(bǔ)核苷酸序列相互作用從而降低β/A4肽的表達(dá)。優(yōu)選地，所述寡核苷酸與β/A4肽表達(dá)所涉及的特異性核酸序列之間的相互作用是經(jīng)Watson-Crick堿基配對(duì)形成雙螺旋、經(jīng)Hoogstein堿基配對(duì)形成三螺旋、或這兩種情況的結(jié)合。β/A4肽表達(dá)所涉及的特異性核酸序列是至少編碼β/A4肽的基因或RNA分子。在這里，術(shù)語(yǔ)“基因”指含有啟動(dòng)子、至少編碼β/A4肽之核苷酸序列和被動(dòng)性終止子的結(jié)構(gòu)。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基因是熟知的APP基因。相似地，術(shù)語(yǔ)“RNA”包括至少編碼β/A4肽的核RNA或信使RNA。所述RNA優(yōu)選編碼APP蛋白質(zhì)。在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方案中，施用于細(xì)胞的寡核苷酸互補(bǔ)于含有β/A4肽轉(zhuǎn)譯起始密碼子的核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)于某個(gè)核苷酸序列”指與所述序列的互補(bǔ)性足以在細(xì)胞中即生理?xiàng)l件下與該序列雜交。實(shí)際上，通過(guò)確定基因表達(dá)是否被降低可以確定所述雜交存在與否。術(shù)語(yǔ)“β/A4肽轉(zhuǎn)譯起始密碼子”指作為轉(zhuǎn)譯開(kāi)始密碼子的轉(zhuǎn)譯起始密碼子，所述的轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生含有β/A4肽的多聚氨基酸產(chǎn)物。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，超始密碼子是APP的起始密碼子。在某些其他實(shí)施方案中，本發(fā)明方法施用與編碼β/A4肽之核苷酸序列互補(bǔ)的寡核苷酸。另外，所述寡核苷酸也可以與含編碼β/A4肽之核苷酸序列的核苷酸序列互補(bǔ)。后一寡核苷酸的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例是與編碼APP之核苷酸序列互補(bǔ)的寡核苷酸。所述寡核苷酸的具體實(shí)例包括但不限于1. [SEQ ID NO.1] 5′-CCTCTCTGTTTAAAACTTTATCCAT-3′；2. [SEQ ID NO.2] 5′-TTCATATCCTGAGTCATGTCG-3′；3. [SEQ ID NO.3] 3′-GTCCCAGCGCTACGACGGGCCAAA-5′；4. [SEQ ID NO.4] 3′-GTCCCAGCGCTAC-5′；5. [SEQ ID NO.5] 3′-TACGACGGGCCAAA-5′；6. [SEQ ID NO.6] 3′-GTCCCAGCGCTACGACGGGCC-5′；7. [SEQ ID NO.7] 3′-GTCCCAGCGCTACGACGG-5′；8. [SEQ ID NO.8] 3′-GTCCCAGCGCTACGA-5′；9. [SEQ ID NO.9] 3′-CCAGCGCTACGACGGGCCAAA-5′；10.[SEQ ID NO.10] 3′-GCGCTACGACGGGCCAAA-5′；11.[SEQ ID NO.11] 3′-CTACGACGGGCCAAA-5′；12.[SEQ ID NO.15] 5′-AAACCGGGCAGCATCGCGACCCTG-在下文本發(fā)明第三方面的討論中，將更詳細(xì)地討論在本發(fā)明本方面方法中有用的優(yōu)選寡核苷酸。簡(jiǎn)言之，它們比常規(guī)的寡核苷酸磷酸二酯對(duì)核酸降解有更強(qiáng)的抗性。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述寡核苷酸可以有各種修飾的核苷間連鍵、混合骨架、核酸酶抗性3’帽結(jié)構(gòu)、形成整合三螺旋的結(jié)構(gòu)或自我穩(wěn)定結(jié)構(gòu)或其任何組合。
本發(fā)明本方面的方法可用于各種目的。尤其是，本方法可提供有關(guān)細(xì)胞中產(chǎn)生各種形態(tài)變化所必需的β/A4肽表達(dá)劑量或水平的資料。通過(guò)降低施用于細(xì)胞的寡核苷酸量，以便只是部分降低β/A4肽的表達(dá)，可達(dá)到此目的。本方法通過(guò)首先完全逆轉(zhuǎn)所述變化，然后除去寡核苷酸并觀察再發(fā)生所述變化的時(shí)間和順序，也可以提供有關(guān)由β/A4肽誘導(dǎo)的形態(tài)變化的時(shí)間和順序方面的資料。在應(yīng)用中，所述方法提供了有關(guān)對(duì)逆轉(zhuǎn)β/A4肽誘導(dǎo)的形態(tài)變化最有效的寡核苷酸的具體性質(zhì)方面的資料。本發(fā)明是基于令人驚奇地發(fā)現(xiàn)寡核苷酸可逆轉(zhuǎn)β/A4肽誘導(dǎo)的形態(tài)變化。但此外，通過(guò)考察劑量要求和形態(tài)變化逆轉(zhuǎn)的程度，所述方法可以使本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員確定用于逆轉(zhuǎn)形態(tài)變化的核苷酸序列、骨架組成、二級(jí)結(jié)構(gòu)、堿基修飾等的最有效組合。
在第二方面，本發(fā)明提供了在動(dòng)物包括人中降低β/A4肽表達(dá)的方法。在本發(fā)明本方面的方法中，將寡核苷酸施用于動(dòng)物從而使β/A4肽表達(dá)降低。施用于非人動(dòng)物時(shí)，所述寡核苷酸的核苷酸序列可以與適宜的非人β/A4肽或APP基因互補(bǔ)。在下文本發(fā)明第三方面的討論中，將詳細(xì)描述所述寡核苷酸的化學(xué)組成。這些寡核苷酸的作用方式與對(duì)本發(fā)明第一方面方法描述的相同?？梢詫⑺龉押塑账峤?jīng)口、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)肛門(mén)、注射到腦脊液中或直接注射到腦中給藥。另外，可以將本發(fā)明寡核苷酸配制成含有聚合載體的植入物或緩釋膠囊的一部分。例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，Osol.(ed.)(1990)中公開(kāi)了所述的聚合載體。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)一個(gè)泵植入體或體外泵可以連續(xù)施用本發(fā)明的寡核苷酸。
施用寡核苷酸的優(yōu)選劑量為1-100mg/kg動(dòng)物體重。
可以作為藥物組合物的一部分而施用抗β/A4寡核苷酸，所述的藥物組合物含有藥物學(xué)可接受的載體，例如可以是生理鹽水或生理葡萄糖溶液?？珊锌商岣邞腋∫赫扯戎镔|(zhì)的注射水懸浮液包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。懸浮液也可以含有穩(wěn)定劑。制備和施用所述藥物組合物的方法可參見(jiàn)Remington’s PharmaceuticalSciences，18th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，Osol(ed.)(1990)。
在開(kāi)始的研究中，優(yōu)選將所述的寡核苷酸施用于非人動(dòng)物，最好是哺乳動(dòng)物。所述的施用過(guò)程提供了有關(guān)在動(dòng)物中降低β/A4肽表達(dá)的最有效劑量和施用途徑的資料。隨后，將所述的寡核苷酸施用于患有AD或DS的人。預(yù)期所述的施用可逆轉(zhuǎn)因β/A4肽作用于腦細(xì)胞而誘導(dǎo)的形態(tài)變化，由此產(chǎn)生治療效果。
在第三方面，本發(fā)明提供可用于逆轉(zhuǎn)因β/A4肽作用于細(xì)胞而誘導(dǎo)的形態(tài)變化的抗β/A4寡核苷酸。本發(fā)明的“抗β/A4寡核苷酸”包括具有與表達(dá)β/A4肽有關(guān)的特定核酸序列相互作用從而降低β/A4肽表達(dá)之核苷酸序列的那些寡核苷酸。優(yōu)選地，寡核苷酸與涉及β/A4肽表達(dá)之特定核酸序列間的相互作用是經(jīng)Watson-Crick堿基配對(duì)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)、經(jīng)Hoogstein堿基配對(duì)形成三螺旋結(jié)構(gòu)或其結(jié)合。參見(jiàn)，例如，PCT
發(fā)明者C·A·馬羅塔, R·E·馬佐查, S·阿加拉瓦爾 申請(qǐng)人:綜合醫(yī)院公司, 海布里登公司