專利名稱:適冷蛋白酶mcp-01在肉類嫩化中的應用的制作方法
技術領域：
本 發(fā)明涉及適冷蛋白酶MCP-Ol在肉類嫩化中的應用，屬于食品生物技術技術領域：
。
背景技術：
我國是世界上最大的肉類生產(chǎn)國，但高新技術在我國肉制品加工業(yè)的應用還較薄弱，精深加工的肉制品很少。在肉的食用品質(zhì)中，嫩度是消費者最為重視的感官指標之一。肉質(zhì)柔軟細嫩而多汁的肉，消費者比較樂于接受。肉的硬度包括兩部分由肌原纖維變化造成的肌動球蛋白硬度和由于結締組織變化造成的背景硬度。目前，肉類嫩化的方法有很多，但從效果看來，采用蛋白酶嫩化的方法最為先迸。它可以在適當溫度下溫和地降解肉類蛋白質(zhì)，從而提高嫩度。方法簡便，所用時間短，ロ感獨特，顯著提高經(jīng)濟效率，避免不必要的浪費。
目前已用于商業(yè)的肉類嫩化酶有植物性蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶)、細菌性蛋白酶(枯草桿菌的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、嗜熱芽孢桿菌的耐熱性蛋白酶)、動物蛋白酶(胰酶、膠原酶)等幾大類。這些酶均具有降解膠原蛋白或弾性蛋白的能力。目前研究和應用的所有肉類嫩化酶均為中高溫蛋白酶，這些蛋白酶的最適酶活溫度都在50°C或以上，在0_4°C下酶活很低，因此一般在40°C以上應用。另外，中高溫蛋白酶對熱比較穩(wěn)定，這會使肉類嫩化酶在完成嫩化后難以滅活。適冷膠原蛋白酶在低溫和室溫下具有較高的酶活，可以在室溫下對肉制品進行快速嫩化。而且適冷酶具有熱敏感性，在中溫條件下就容易失活，從而使嫩化酶在完成嫩化后容易被滅活。適冷膠原蛋白酶的這些特點使其在肉類嫩化中具有很好的應用潛力。因此，適冷膠原蛋白酶在肉制品的嫩化方面中具有廣闊的應用前景，但是目前尚沒有具有肉類嫩化功能的適冷膠原蛋白酶的報道，也沒有商品化的適冷肉類膠原蛋白酶。
公開號為CN101045933A(申請?zhí)?00710013366. 2)的中國專利申請公開了ー種適冷蛋白酶的基因MCPOl及其制備方法，屬于生物技術領域：
。該發(fā)明含有深海適冷蛋白酶基因MCPOl的2676BP基因組DNA片段，其中含有ー個具有2508個核苷酸的開放閱讀框架，該開放閱讀框架即是編碼蛋白酶MCP-Ol的基因，由蛋白酶MCP-Ol的基因MCPOl表達的適冷蛋白酶最適酶活溫度為35°C左右，最適PH為9.0，可用于低溫肉的保鮮、增鮮，乳制品的加工、洗滌劑等行業(yè)。但該申請只提到適冷蛋白酶MCP-Ol具有保鮮、增鮮的作用，并沒有提及其在低溫肉類嫩化方面的作用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供適冷蛋白酶MCP-Ol在肉類嫩化中的應用。該適冷蛋白酶MCP-OI能在肉類保鮮冷藏過程中或常溫下對肉類進行嫩化，改善肉類的ロ感。
適冷蛋白酶MCP-Ol在肉制品嫩化中的應用。
上述應用，步驟如下[0008](I)將適冷蛋白酶MCP-Ol配制成濃度為5 20 μ g/ml的適冷蛋白酶MCP-Ol溶液；
(2)將待嫩化的肉洗凈后，浸入步驟(I)制得的適冷蛋白酶MCP-Ol溶液中，O 8°C保藏18 30小時。
所述步驟(I)的適冷蛋白酶MCP-Ol溶液濃度為10 15 μ g/ml。
所述步驟(2)中在O 4°C保藏20 25小時。
上述保藏溫度為4°C。
所述步驟(2)中的肉為含有膠原蛋白的各種供人食用的動物組織。
上述適冷蛋白酶MCP-Ol的制備可通過如下菌株制得
深海適冷菌假交替單胞菌株(Pseudoalteromonas) SM9913, 2010年12月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，中國.武漢.武漢大學。菌種保藏號CCTCC NO M2010336o
上述適冷蛋白酶MCP-Ol可利用上述菌株通過如下方法制得
取深海適冷菌假交替單胞菌株SM9913經(jīng)種子培養(yǎng)后接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，10 15°C震蕩培養(yǎng)55 70小時，初次離心后，上清液加入硫酸銨粉末至終濃度為50 55wt%，二次離心后，沉淀溶于Tris-HCl中，三次離心后，取上清液，2 8°C下聚こニ醇20000超濾濃縮，濃縮液在2 8°C下經(jīng)柱層析分離，回收酶活峰的峰尖部分，即得適冷蛋白酶 MCP-OI。
所述種子培養(yǎng)為在固體培養(yǎng)基中12 15°C培養(yǎng)48 70小時后；再于液體培養(yǎng)基中12 15°C震蕩培養(yǎng)20 30小時；固體培養(yǎng)基組分如下，均為重量份
蛋白胨I份，酵母粉O. 5份、I. 5份瓊脂，人工海水100份，pH為7. O 7. 2 ;
液體培養(yǎng)基組分如下，均為重量份
蛋白胨I份，酵母粉O. 5份、I. 5份瓊脂，人工海水100份，pH為7. O 7. 2。
所述初次離心條件為10000g，2 8°C離心15分鐘；二次離心條件為8000g，2 8°C離心10分鐘；三次離心條件為:10000g，2 8°C離心20分鐘。
所述Tris-HCl的濃度為20mmol/l, pH 8. 5 ;所述層析柱為Sephardex GlOO層析柱。
所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量份
豆餅粉3. 5 4. O份、玉米粉2. O 2. 5份、麩皮2. O 2. 5份、Na2HPO4O. 3 O. 4份、KH2P040. 04 O. 05 份、水 100 份。
本發(fā)明的優(yōu)良效果在于
(I)本發(fā)明所述適冷蛋白酶MCP-Ol在0°C時仍能保持最適溫度下酶活力的12.5%，在低溫冷藏條件下(0-4 °C)以及室溫下能夠提高肉制品的嫩度；該蛋白酶可在O 4°C下特異性降解肉類結締組織中的膠原蛋白，在肉類嫩化過程中具有很好的應用潛力。
(2)適冷蛋白酶MCP-Ol的熱穩(wěn)定性較差，在中高溫條件下很容易失活，從而使酶在完成嫩化后容易被滅活；該酶隨著溫度的提高，自溶速度増加，從而當肉類烹制加工后，該酶會完全失活，因而不會造成對肉類的污染。
(3)適冷蛋白酶MCP-Ol能較好的保持肉制品的新鮮色澤和持水性。
圖1、純化的適冷蛋白酶MCP-Ol的毛細管電泳檢測圖；
圖2、溫度對適冷蛋白酶MCP-Ol降解牛肌腱不可溶膠原蛋白活力的影響；
圖3、適冷蛋白酶MCP-Ol處理對牛胸肌剪切力的影響的柱狀圖；
圖4、不同的嫩化酶處理對牛胸肌失水率的影響的柱狀圖；
其中對照、未添加任何蛋白酶；MCP_01、添加適冷蛋白酶MCP-01 ;Bromelain、添加菠蘿蛋白酶；Papain、添加木瓜蛋白酶；
圖5、不同的嫩化酶處理對牛胸肌色澤影響的照片；
其中Control、未添加任何蛋白酶；MCP_01、添加適冷蛋白酶MCP-01 ；Bromelain>添加菠蘿蛋白酶；Papain、添加木瓜蛋白酶。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進ー步說明，但不限于此。
實施例中所述深海適冷菌假交替單胞菌株(Pseudoalteromonas) SM9913, 2010年12月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，中國.武漢.武漢大學，菌種保藏號CCTCC NOM2010336。
人工海水素購自中國海洋大學海水素廠，弾性蛋白購自Sigma公司，魚不可溶月交原蛋白為采用 Song 等的方法(Song, E. , Kim, S. Y. , Chun, T. , Byun, H. -J. , and Lee,Y. Μ. (2006) Biomaterials 27,2951-2961)從魚皮中提取，牛肌腱不可溶膠原蛋白購自WorthingtonBiochemical Co.,牛酸溶I型膠原蛋白購自Sigma公司，牛II型膠原蛋白購自Sigma公司，牛IV型膠原蛋白購自Sigma公司。
實施例I
深海適冷菌假交替單胞菌株SM9913制備適冷蛋白酶MCP-Ol的方法，步驟如下
I.液體種子的制備
以蛋白胨I份，酵母粉O. 5份、I. 5份瓊脂，人工海水100份，pH為7. O 7. 2，(均
為重量份)配制固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基滅菌，冷卻后，在試管斜面上劃線接種深海適冷菌假交替單胞菌株(Pseudoalteromonas) SM9913，12 15°C培養(yǎng)48 70小時。將上述菌種接種裝有150ml液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中(配方同固體培養(yǎng)基，不添加瓊脂)，12 15°C，200轉震蕩培養(yǎng)24小時，用作液體種子。
2.液體深層發(fā)酵制備適冷蛋白酶制劑
以豆餅粉3. 5 4. O份、玉米粉2. O 2. 5份、麩皮2. O 2. 5份、Na2HPO4O. 3
O.4份、KH2PO4O. 04 O. 05份和水100份，均為重量份，配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基。培養(yǎng)基滅菌，按5 7%重量百分比接種步驟I制備的液體種子，通風、攪拌、控制轉速200rpm，15°C培養(yǎng)60小時。
3.適冷蛋白酶MCP-Ol的分離純化
將上述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基4°C，10，OOOg離心15分鐘，上清液在冰浴中緩慢攪拌加入硫酸銨粉末至終濃度為55wt%，8000g離心10分鐘。沉淀溶于pH 8. 5,20mmol/l Tris-HCl中，于4°C，IOOOOg離心20分鐘，取上清液，裝于超濾袋，4°C下用聚こニ醇20000濃縮，濃縮液經(jīng)Sephardex GlOO柱層析分離，回收酶活峰的峰尖部分。所有的操作均在15°C以下進行。分離的蛋白酶用毛細管電泳檢測純度(如圖1)，命名為適冷蛋白酶MCP-01。
4.適冷蛋白酶MCP-Ol的性質(zhì)測定
4. I底物特異性
(I)Bradford法測定步驟3制備的適冷蛋白酶MCP-Ol的蛋白濃度。(Bradford法為本領域慣用技術，也可參考如下網(wǎng)址中的資料http://wenku. baidu. com/view/7b3ebld4195f312b3169a521. html)。
(2)測定酶對不可溶膠原蛋白的降解效率，不可溶膠原蛋白包括魚不可溶膠原蛋 白和牛肌腱不可溶膠原蛋白。酶活單位定義為每小時降解底物產(chǎn)生Inmol的L-亮氨酸所需要的酶量。具體步驟為稱取5mg的不可溶膠原蛋白，加入Iml濃度為10 μ g/ml的MCP-Ol酶液，置于40°C水浴中反應5h。反應中不斷晃動反應液，以保證不可溶底物與酶液的充分接觸。
(3)測定酶對可溶性底物降解效率，酶活單位定義為每分鐘降解底物產(chǎn)生Inmol的L-亮氨酸所需要的酶量。具體步驟為用50mM Tris-HCl (含O. 36mM CaCl2, pH 7. 5)配制不同的可溶底物溶液，包括牛酸溶I型膠原蛋白、牛II型膠原蛋白、牛IV型膠原蛋白，置于40°C水浴中反應30min。
(4)上述步驟(2) (3)反應結束后，10，00(^離心1011^11。取上清20 μ I加入100 μ I茚三酮-檸檬酸鈉溶液，沸水浴20min顯色，冷卻后加入500 μ I正丙醇，于600nm處測定吸光值。
(5)測定酶對彈性蛋白底物的降解效率，稱取5mg的彈性蛋白加入250 μ I濃度為10 μ g/ml的MCP-Ol酶液，置于40°C水浴中反應60分鐘，10，OOOg離心IOmin終止反應；取上清于595nm處測定吸光值。
(6)結果表明適冷蛋白酶MCP-Ol能夠特異性降解各種類型膠原蛋白，而對彈性蛋白沒有降解作用(結果如表I所示)。
4. 2最適酶活溫度測定
以牛肌腱不可溶膠原蛋白為底物，50mM Tris-HCl (含O. 36mM CaCl2,pH 7. 5)為緩沖體系，分別在0、10、20、30、40、50、55、60、70、80°C條件下測定膠原蛋白酶MCP-Ol的酶活，以確定酶的最適反應溫度。測定酶活的具體方法為
稱取5mg的牛肌腱不可溶膠原蛋白，加入Iml濃度為10 μ g/ml的適冷蛋白酶MCP-Ol酶液，不同溫度下反應5小時，10，OOOg離心lOmin。取上清20 μ I加入100 μ I茚三酮-朽1檬酸鈉溶液，沸水浴20min顯色,冷卻后加入500 μ I正丙醇,于600nm處測定吸光值，定義最高酶活溫度下的酶活力為100%。結果表明該酶的最適酶活溫度60°C，在0°C下仍保持了 12. 4%的相對活性，在70°C酶活力顯著下降如圖2所示。
實施例2
適冷蛋白酶MCP-Ol在肉制品嫩化中的應用，步驟如下
(I)將步驟3制得的適冷蛋白酶MCP-Ol配制成濃度為10 μ g/ml和100 μ g/ml的適冷蛋白酶MCP-Ol溶液；
(II)將牛胸肌肉洗浄后，浸入步驟⑴制得的適冷蛋白酶MCP-Ol溶液中，4°C保藏20小時。
結果表明添加適冷蛋白酶MCP-Ol在4°C下作用20小時的牛胸肌肉剪切力顯著下降，而未添加適冷蛋白酶的對照組牛胸肌肉剪切力下降不明顯。(如圖3)。
牛胸肌肉分別與用相同濃度的菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶在4°C下處理20小時，然
后測定失水率。定義失水率為
權利要求
1、適冷蛋白酶MCP-Ol在肉制品嫩化中的應用，其特征在于，步驟如下(1)將適冷蛋白酶MCP-Ol配制成濃度為5 20μ g/ml的適冷蛋白酶MCP-Ol溶液； (2)將待嫩化的肉洗浄后，浸入步驟(I)制得的適冷蛋白酶MCP-Ol溶液中，O 8°C保藏18 30小時。
2、如權利要求
I所述的應用，其特征在于，所述步驟(I)的適冷蛋白酶MCP-Ol溶液濃度為 10 15 μ g/ml ο
3、如權利要求
I所述的應用，其特征在于，所述步驟(2)中在O 4°C保藏20 25小時。
4、如權利要求
3所述的應用，其特征在于，上述保藏溫度為4°C。
5、如權利要求
I所述的應用，其特征在于，所述步驟(2)中的肉為含有膠原蛋白的各種供人食用的動物組織。
專利摘要
本發(fā)明涉及適冷蛋白酶MCP-01在肉類嫩化中的應用，屬于食品生物技術技術領域：
。本發(fā)明通過如下技術方案完成肉類嫩化(1)將適冷蛋白酶MCP-01配制成濃度為5～20μg/ml的適冷蛋白酶MCP-01溶液；(2)將待嫩化的肉洗凈后，浸入步驟(1)制得的適冷蛋白酶MCP-01溶液中，0～8℃保藏18～30小時。該蛋白酶可在0～4℃下特異性降解肉類結締組織中的膠原蛋白，在肉類嫩化過程中具有很好的應用潛力。
文檔編號A23L1/314GKCN102224938 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 201110121380
公開日2012年9月5日 申請日期2011年5月11日
發(fā)明者何海倫, 周明揚, 周百成, 張熙穎, 張玉忠, 石梅, 解彬彬, 趙國琰, 陳秀蘭 申請人:山東大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2),