一種增強(qiáng)胰島功能的雙歧桿菌及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)胰島功能的雙歧桿菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病(diabetes)是一種與胰島素的產(chǎn)生和作用異常相關(guān)、以高血糖癥為主要特征的內(nèi)分泌代謝疾病，主要包括I型和II型糖尿病。我國糖尿病人群以II型糖尿病為主，占糖尿病患者總數(shù)的90％以上。以胰島素相對缺乏和胰島素抵抗為主的II型糖尿病最終會導(dǎo)致高血糖，長期的高血糖癥狀會引起一系列的慢性并發(fā)癥，如足病(足部潰瘍、感染和壞疽)、腎病(腎功能衰竭、尿毒癥)、眼病(視網(wǎng)膜病變、模糊不清、失明)、腦病(腦血管病變)、心臟病、皮膚病、性病等。II型糖尿病是一種緩慢進(jìn)展性疾病，其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能缺陷。目前，我國的II型糖尿病的患病人數(shù)居世界首位，所以發(fā)展II型糖尿病的預(yù)防和治療措施刻不容緩。許多研究發(fā)現(xiàn)益生菌對改善II型糖尿病具有良好生物學(xué)作用，但是關(guān)于其作用機(jī)理并未闡述明確，并且許多功能性益生菌的菌株、發(fā)酵劑以及核心技術(shù)都被國外壟斷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種增強(qiáng)胰島功能的雙歧桿菌及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供了動物雙歧桿菌的應(yīng)用，為如下(a1)和/或(a2)：

(a1)制備用于預(yù)防和/或治療糖尿病的產(chǎn)品；

(a2)預(yù)防和/或治療糖尿病。

本發(fā)明還保護(hù)動物雙歧桿菌的應(yīng)用，為如下(b1)-(b12)中的至少一種：

(b1)制備用于保護(hù)胰島的結(jié)構(gòu)和功能的產(chǎn)品；

(b2)制備用于保護(hù)胰腺的結(jié)構(gòu)和功能的產(chǎn)品；

(b3)制備用于促進(jìn)胰島損傷后結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)的產(chǎn)品；

(b4)制備用于促進(jìn)胰腺損傷后結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)的產(chǎn)品；

(b5)制備用于促進(jìn)糖尿病患者胰島結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)的產(chǎn)品；

(b6)制備用于促進(jìn)糖尿病患者胰腺結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)的產(chǎn)品；

(b7)保護(hù)胰島的結(jié)構(gòu)和功能；

(b8)保護(hù)胰腺的結(jié)構(gòu)和功能；

(b9)促進(jìn)胰島損傷后結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)；

(b10)促進(jìn)胰腺損傷后結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)；

(b11)促進(jìn)糖尿病患者胰島結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)；

(b12)促進(jìn)糖尿病患者胰腺結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)。

本發(fā)明還保護(hù)動物雙歧桿菌的應(yīng)用，為如下(c1)-(c6)中的至少一種：

(c1)制備用于促進(jìn)胰島素分泌的產(chǎn)品；

(c2)制備用于促進(jìn)糖尿病患者胰島素分泌的產(chǎn)品；

(c3)制備用于促進(jìn)胰島細(xì)胞胰島素分泌的產(chǎn)品；

(c4)促進(jìn)胰島素分泌；

(c5)促進(jìn)糖尿病患者胰島素分泌；

(c6)促進(jìn)胰島細(xì)胞胰島素分泌。

本發(fā)明還保護(hù)動物雙歧桿菌的應(yīng)用，為如下(d1)-(d4)中的至少一種：

(d1)制備用于增加機(jī)體葡萄糖耐量的產(chǎn)品；

(d2)制備用于增加糖尿病患者葡萄糖耐量的產(chǎn)品；

(d3)增加機(jī)體葡萄糖耐量；

(d4)增加糖尿病患者葡萄糖耐量。

本發(fā)明還保護(hù)一種產(chǎn)品，其活性成分為動物雙歧桿菌；所述產(chǎn)品的用途為所述產(chǎn)品的用途為預(yù)防和/或治療糖尿病。

本發(fā)明還保護(hù)一種產(chǎn)品，其活性成分為動物雙歧桿菌；所述產(chǎn)品的用途為如下(e1)-(e6)中的至少一種：

(e1)保護(hù)胰島的結(jié)構(gòu)和功能；

(e2)保護(hù)胰腺的結(jié)構(gòu)和功能；

(e3)促進(jìn)胰島損傷后結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)；

(e4)促進(jìn)胰腺損傷后結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)；

(e5)促進(jìn)糖尿病患者胰島結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)；

(e6)促進(jìn)糖尿病患者胰腺結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)。

本發(fā)明還保護(hù)一種產(chǎn)品，其活性成分為動物雙歧桿菌；所述產(chǎn)品的用途為如下(f1)-(f3)中的至少一種：

(f1)促進(jìn)胰島素分泌；

(f2)促進(jìn)糖尿病患者胰島素分泌；

(f3)促進(jìn)胰島細(xì)胞胰島素分泌。

本發(fā)明還保護(hù)一種產(chǎn)品，其活性成分為動物雙歧桿菌；所述產(chǎn)品的用途為如下(g1)和/或(g2)：

(g1)增加機(jī)體葡萄糖耐量；

(g2)增加糖尿病患者葡萄糖耐量。

以上任一所述動物雙歧桿菌具體可為動物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)。

以上任一所述動物雙歧桿菌具體可為動物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)A6。

動物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)A6，已于2014年06月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；郵編：100101)，保藏編號為CGMCC No.9273。動物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)A6簡稱為雙歧桿菌A6。

以上任一所述糖尿病具體可為II型糖尿病。

以上任一所述雙歧桿菌A6具體可為雙歧桿菌A6活菌。

以上任一所述雙歧桿菌A6具體可為雙歧桿菌A6滅活菌。

以上任一所述產(chǎn)品具體可為食品、藥品或保健品。

本發(fā)明通過實驗證明，雙歧桿菌A6對胰島結(jié)構(gòu)具有明顯保護(hù)作用。在給予糖尿病大鼠4周雙歧桿菌A6后，糖尿病大鼠的胰島數(shù)目增多，空泡變性程度得到明顯改善，同時細(xì)胞實驗證實了雙歧桿菌A6對STZ誘導(dǎo)的β胰島素瘤細(xì)胞RIN-m5F具有明顯保護(hù)作用，并能促進(jìn)其分泌胰島素。本發(fā)明通過研究雙歧桿菌A6對II型糖尿病的表觀特征以及病情的發(fā)生發(fā)展具有延緩及其他良性的生物學(xué)作用，為糖尿病相關(guān)實驗研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為造模成功后各組大鼠口服葡萄糖耐量試驗結(jié)果。

圖2為處死前各組大鼠口服葡萄糖耐量試驗結(jié)果。

圖3為動物實驗第6周和第10周檢測大鼠空腹胰島素統(tǒng)計結(jié)果。

圖4為為正常組大鼠胰腺HE切片觀察結(jié)果。

圖5為模型組大鼠胰腺HE切片觀察結(jié)果。

圖6為A6低劑量組大鼠胰腺HE切片觀察結(jié)果。

圖7為A6中劑量組大鼠胰腺HE切片觀察結(jié)果。

圖8為A6高劑量組大鼠胰腺HE切片觀察結(jié)果。

圖9為巨噬細(xì)胞光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果。

圖10為A6活菌懸液和A6滅菌懸液對巨噬細(xì)胞存活率影響統(tǒng)計結(jié)果。

圖11為A6菌上清液對巨噬細(xì)胞存活率影響統(tǒng)計結(jié)果。

圖12為β胰島素瘤細(xì)胞RIN-m5F存活率結(jié)果。

圖13為β胰島素瘤細(xì)胞RIN-m5F分泌胰島素ELISA檢測結(jié)果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

動物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)A6：已于2014年06月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；郵編：100101)，保藏編號為CGMCC No.9273。動物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)A6簡稱為雙歧桿菌A6。

基礎(chǔ)飼料配方如表1所示?；A(chǔ)飼料蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物的供能比分別為22.47％、12.11％和65.42％，能量為14.31kJ/g。

表1基礎(chǔ)飼料配方

高脂飼料配方如表2所示。高脂飼料供能比為17.77％、40.92％和41.31％，能量為19.45kJ/g。

表2高脂飼料配方

RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基：Gibco公司。

RPMI-1640完全培養(yǎng)基：RPMI-1640完全培養(yǎng)基+10mL/100mL FBS+青霉素100U/mL+鏈霉素100μg/mL。

β胰島素瘤細(xì)胞RIN-m5F：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

胰島素檢測ELISA試劑盒：Mercodia公司。

STZ溶液：STZ溶液由鏈脲佐菌素和pH 4.2的0.1mmol/L檸檬酸緩沖液組成；在STZ溶液中，鏈脲佐菌素的質(zhì)量百分含量為1％。

鏈脲佐菌素：Sigma公司。

實施例1、雙歧桿菌A6菌懸液的制備

1、將已活化的雙歧桿菌A6接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)12h，培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)體系4000g離心15min收集菌體。PBS洗滌菌體兩次，然后采用生理鹽水重懸菌體，獲得A6活菌懸液。

2、將已活化的雙歧桿菌A6接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)12h，培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)體系4000g離心15min收集菌體。PBS洗滌菌體兩次，然后采用RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸菌體，獲得A6活菌懸液。

3、將已活化的雙歧桿菌A6接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)12h，培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)體系置于72℃水浴10min，然后冷卻至室溫(吸取100μL菌體懸液接種于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)48h后檢驗滅活效果，無菌生長代表完全滅活)，4000g離心15min收集菌體，然后用RPMI-1640完全培養(yǎng)基配制成A6滅活菌懸液。

4、將已活化的雙歧桿菌A6接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)18h，培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)體系4000g離心15min后取上清，調(diào)整pH值為7.0，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾，得到菌上清液。

實施例2、II型糖尿病大鼠模型的建立及動物實驗

實驗大鼠：60只健康6-8周齡的雄性SD大鼠(240±10g)。大鼠在不銹鋼干養(yǎng)式實驗籠架中喂養(yǎng)，以防止食糞癖。動物實驗房溫度保持在22±2℃，濕度維持在55％±5％，嚴(yán)格遵循12h光照/12h黑暗循環(huán)。

1、將實驗大鼠隨機(jī)分為2組(正常組、模型組)，正常組10只，模型組50只。正常組大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，模型組大鼠飼喂高脂飼料，持續(xù)4周(第1-4周)。

2、完成步驟1后，所有大鼠禁食不進(jìn)水飼養(yǎng)12h，然后測定大鼠體重，正常組大鼠按35mg/kg的劑量腹腔注射pH值4.2的0.1mmol/L檸檬酸緩沖液，模型組按35mg/kg的劑量腹腔注射STZ溶液。

3、完成步驟2后，繼續(xù)飼養(yǎng)大鼠2周(第4-6周)，飼養(yǎng)期間各組大鼠正常進(jìn)水，正常組大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，模型組大鼠飼喂高脂飼料，第6周取模型組大鼠測定大鼠空腹血糖，檢測前大鼠禁食不禁水12h，以血糖儀測定尾靜脈血糖值，以空腹血糖≥11.0mmol/L為造模成功。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為四組(模型組、A6低劑量組、A6中劑量組和A6高劑量組)，每組10只。

造模成功后，對各組大鼠進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(Oral Glucose Tolerance Test，OGTT)，實驗方法具體為：各組大鼠禁食不禁水12h，按2g/kg體重灌胃50％(質(zhì)量百分比)的葡萄糖水溶液，并分別測定第0min、第15min、第30min、第60min、第90min和第120min鼠尾靜脈血糖值。繪制血糖變化曲線，并計算糖耐量曲線下面積(Area Under Curve，AUC)。

結(jié)果如圖1所示。圖1A為口服葡萄糖糖耐量曲線。圖1B為糖耐量曲線線下面積。

結(jié)果表明，在灌胃葡萄糖后的15-30min內(nèi)，各組大鼠血糖均呈上升趨勢，正常組大鼠表現(xiàn)出正常的耐糖現(xiàn)象，正常組大鼠的血糖在0～30min內(nèi)上升幅度平緩，在30min后逐漸降低，2h后回到空腹水平；其余各組大鼠的血糖在30min內(nèi)顯著上升(p＜0.01)，均在30min時達(dá)到最高峰，血糖在30min后逐漸降低，2h后血糖水平依然較高。此外，曲線下面積統(tǒng)計結(jié)果顯示，模型組和A6各劑量組AUC顯著高于正常組(p＜0.01)，說明造模組大鼠均出現(xiàn)嚴(yán)重糖耐量受損的情況(p＜0.01)，符合II型糖尿病糖耐量降低的特征。同時，模型組和A6各劑量組大鼠糖耐量曲線變化趨勢相同，組間無顯著性差異(p＞0.05)。表明造模成功時，所有大鼠發(fā)病程度相當(dāng)。

4、完成步驟3后，繼續(xù)飼養(yǎng)大鼠4周(第6-10周)，飼養(yǎng)期間各組大鼠正常進(jìn)水，正常組大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，其余各組大鼠飼喂高脂飼料。飼養(yǎng)過程中正常組和模型組大鼠采用滅菌生理鹽水灌胃(1次/天)，A6低劑量組采用實施例1步驟1制備的A6活菌懸液灌胃(5.0×10⁶CFU菌/kg體重/天)，A6中劑量組采用實施例1步驟1制備的A6活菌懸液灌胃(5.0×10⁸CFU菌/kg體重/天)，A6高劑量組采用實施例1步驟1制備的A6菌懸液灌胃(5.0×10¹⁰CFU菌/kg體重/天)。

分別于第6周(造模成功后)和第10周檢測各組大鼠空腹胰島素，將各組大鼠禁食不禁水12h，內(nèi)眥靜脈取血，分離血漿后用胰島素檢測ELISA試劑盒檢測血漿胰島素含量。

結(jié)果如圖3所示。在STZ誘導(dǎo)成模后，由于低劑量STZ對大鼠胰島β細(xì)胞的部分破壞作用，故模型組和A6各劑量組在第6周空腹胰島素水平低于正常組(p＞0.05)，而模型組和A6各劑量組間空腹胰島素水平無明顯差異，說明造模成功后，大鼠發(fā)病程度無差別。第10周空腹胰島素水平數(shù)據(jù)顯示，與模型組相比，A6低、中、高劑量治療組的空腹血漿胰島素逐漸升高且存在組間劑量效應(yīng)。其中A6高劑量組胰島素水平顯著高于模型組(p＜0.01)。本實驗結(jié)果表明，雙歧桿菌A6有促進(jìn)II型糖尿病大鼠分泌胰島素的功能。

第10周再一次對各組大鼠進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(Oral Glucose Tolerance Test，OGTT)實驗方法具體為：各組大鼠禁食不禁水12h，按2g/kg體重灌胃50％(w/v)的葡萄糖溶液，并分別測定第0min、第15min、第30min、第60min、第90min和第120min鼠尾靜脈血糖值。繪制血糖變化曲線，并計算糖耐量曲線下面積(Area Under Curve，AUC)。

結(jié)果如圖2所示。圖2A為口服葡萄糖糖耐量曲線。圖2B為糖耐量曲線線下面積。

結(jié)果表明，模型組和A6各劑量組口服糖耐量曲線峰值(30min)均顯著高于正常組，表明仍存在明顯的糖耐量受損。A6低、中劑量組與模型組口服糖耐量曲線峰值(30min)差異不顯著。A6高劑量組口服糖耐量曲線峰值(30min)為31.5±1.0mmol/L，低于模型組32.7±1.1mmol/L，但無顯著性差異。A6高劑量組口服糖耐量曲線90min和120min的血糖值顯著低于模型組(p＜0.05)。曲線下面積統(tǒng)計結(jié)果顯示，模型組AUC顯著大于正常組AUC(p＜0.01)，A6低、中劑量組AUC與模型組AUC差異不顯著(p＞0.05)，A6高劑量組AUC顯著低于模型組AUC(p＜0.01)。

5、完成步驟4后，將各組大鼠椎脫臼處死，取新鮮胰腺組織，制作石蠟切片并進(jìn)行HE染色。

結(jié)果如圖4-圖8所示。圖4為正常組大鼠胰腺HE切片。圖5為模型組大鼠胰腺HE切片。圖6為A6低劑量組大鼠胰腺HE切片。圖7為A6中劑量組大鼠胰腺HE切片。圖8為A6高劑量組大鼠胰腺HE切片。

正常組(圖4)：胰腺表面覆蓋著疏松的結(jié)締組織，這些結(jié)締組織深入胰腺內(nèi)，將胰腺分隔成許多胰腺小葉，胰腺的導(dǎo)管、血管、淋巴管和神經(jīng)纖維等均行走于小葉間的結(jié)締組織中。胰腺主要由腺泡細(xì)胞、腺管和胰島細(xì)胞構(gòu)成。胰腺泡和腺管組成胰腺的外分泌腺，內(nèi)分泌腺則由大小不同的胰島細(xì)胞團(tuán)所組成。胰腺外分泌腺為漿液型腺體，胞漿豐富；胰島細(xì)胞呈團(tuán)狀，分布在腺泡細(xì)胞中，胰島細(xì)胞核呈圓形，藍(lán)色著染，內(nèi)分泌胰與外分泌腺小葉清晰可辯。

模型組(圖5)：鏡下可見胰島毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血。部分腺泡細(xì)胞胞漿減少，結(jié)構(gòu)混亂。小葉結(jié)構(gòu)破壞，葉間隙增寬，胰腺損傷顯著。胰島數(shù)目減少，且不能維持圓形結(jié)構(gòu)，形狀變得不規(guī)則，胰腺濾泡與胰島交錯生長。有些胰島結(jié)構(gòu)萎縮，崩解，與周圍組織混合，部分胰島細(xì)胞內(nèi)發(fā)生空泡變性(黑色箭頭所指處)。

A6低劑量組(圖6)：與模型組相比胰腺形態(tài)學(xué)沒有明顯改變。

A6中劑量組(圖7)：胰島數(shù)目與模型組相比有所增多，胰島組織與周圍組織界限比較清楚。

A6高劑量組(圖8)：胰島數(shù)目略少于正常組，但較于低、中劑量組明顯增多。胰島細(xì)胞空泡變性程度明顯減輕，腺泡結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。

胰腺損傷可能是由于STZ的毒性和糖脂代謝紊亂引起的糖毒性與脂毒性引起的。從上述結(jié)果中可以看出，攝入雙歧桿菌A6可以保持腺泡細(xì)胞的完整，增加胰島細(xì)胞數(shù)目，減輕空泡變性程度，較大程度的恢復(fù)胰腺結(jié)構(gòu)。

實施例3、雙歧桿菌A6對β胰島素瘤細(xì)胞RIN-m5F的作用檢測

一、巨噬細(xì)胞制備

將雄性SD大鼠椎脫臼處死，依次進(jìn)行如下操作：

(1)將大鼠在75％(體積百分比)乙醇水溶液中浸泡30s，腹部朝上置于超凈臺中。

(2)小心剪去腹部毛皮，露出腹膜，用無菌注射器向腹腔注射10mL預(yù)冷的含有3％(體積百分比)胎牛血清的PBS緩沖液。

(3)輕輕揉動腹部，用注射器吸出腹腔液，置于干凈的離心管中。

(4)將腹腔液300g離心5min，收集細(xì)胞，37℃預(yù)熱的PBS緩沖液洗滌兩次，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸。

(5)用手持式細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)，按1.0×10⁵個細(xì)胞/mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于37℃培養(yǎng)2h使巨噬細(xì)胞貼壁。

(6)貼壁2h后，用PBS緩沖液洗去懸浮細(xì)胞，加入0.25％胰蛋白酶消化貼壁巨噬細(xì)胞1min，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基終止消化。

(7)鑒定：取細(xì)胞懸液滴加于潔凈載玻片上，制備涂片，室溫自然干燥。將細(xì)胞涂片置于瑞氏染液中染色3min，流水沖洗，干燥后置光學(xué)顯微鏡下觀察。

結(jié)果如圖9所示。圖9中可觀察到貼壁細(xì)胞多呈圓形或橢圓形，細(xì)胞體積較大。在瑞氏染色后，在顯微鏡下可見細(xì)胞多呈橢圓形或腎形，胞漿豐富且著色淺，富含顆粒及少許空泡。多為單核，且細(xì)胞核大多偏于一側(cè)，著色深。瑞氏染色結(jié)果顯示，從腹腔分離出來的巨噬細(xì)胞的純度＞98％，可以用于后續(xù)實驗。

二、雙歧桿菌A6對巨噬細(xì)胞的作用檢測

1、將實施例1步驟2制備的A6活菌懸液采用RPMI-1640完全培養(yǎng)基稀釋為不同濃度的A6活菌懸液(10⁶CFU/mL、10⁷CFU/mL、10⁸CFU/mL、10⁹CFU/mL和10¹⁰CFU/mL)。

2、將實施例1步驟3制備的A6滅活菌懸液采用RPMI-1640完全培養(yǎng)基稀釋為不同濃度的A6滅活菌懸液(10⁶CFU/mL、10⁷CFU/mL、10⁸CFU/mL、10⁹CFU/mL和10¹⁰CFU/mL)。

3、將實施例1步驟3制備的A6菌上清液采用RPMI-1640完全培養(yǎng)基分別進(jìn)行不同稀釋比例稀釋(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32和1∶64倍稀釋)，得到不同稀釋比例的A6菌上清液。

4、將步驟一中分離得到的巨噬細(xì)胞接種于96孔板中(每孔1.0×10⁴個細(xì)胞)，使用RPMI-1640完全培養(yǎng)基，37℃、5％CO₂溫箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分別加入100μL步驟1制備的各濃度A6活菌懸液、100μL步驟2制備的各濃度A6滅活菌懸液和100μL步驟3制備的各稀釋比例的菌上清液，靜置90min后，采用CCK8法測定巨噬細(xì)胞存活率。

結(jié)果如圖10和圖11所示。圖10為加入A6活菌懸液和A6滅菌懸液后的存活率統(tǒng)計結(jié)果。圖10中，橫坐標(biāo)為菌懸液濃度(CFU/mL)。圖11為加入菌上清液后的存活率統(tǒng)計結(jié)果。圖11中，橫坐標(biāo)為不同稀釋比例。結(jié)果表明，A6活菌懸液和滅活菌懸液的最大無毒劑量均為10⁸CFU/mL；A6菌上清液最大無毒劑量為1∶4的稀釋液。由于10⁷CFU/mL的A6活菌懸液，10⁷CFU/mL的A6滅活菌懸液和1∶16的A6菌上清液稀釋液促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，巨噬細(xì)胞增殖引起的細(xì)胞因子水平的變化會影響巨噬細(xì)胞的極化，巨噬細(xì)胞的不同極化類型會對胰島結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生不同的影響，故在后續(xù)實驗中選用這三個劑量。

三、雙歧桿菌A6對β胰島素瘤細(xì)胞RIN-m5F的作用檢測

1、將步驟一中分離得到的巨噬細(xì)胞接種與96孔板中(每孔1.0×10⁴個細(xì)胞)，使用RPMI-1640完全培養(yǎng)基，37℃、5％CO₂溫箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分別加入100μL步驟二制備的10⁷CFU/mL A6活菌懸液、100μL步驟二制備的10⁷CFU/mL滅活菌懸液、100μLMRS液體培養(yǎng)基和100μL步驟二制備的1∶16稀釋的菌上清液，靜置90min后，將培養(yǎng)體系離心取上清液，用于后續(xù)實驗。

2、將β胰島素瘤細(xì)胞RIN-m5F接種于96孔板中(每孔1.0×10⁵個細(xì)胞)，使用RPMI-1640完全培養(yǎng)基，37℃、5％CO₂溫箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，每孔培養(yǎng)基中加入終濃度為10mM的STZ溶液刺激24h。

3、完成步驟2后，取所述96孔板，按照表4的設(shè)置進(jìn)行分組并進(jìn)行操作，采用CCK8法測定3h和6h后的β胰島素瘤細(xì)胞RIN-m5F存活率、用ELISA試劑盒檢測6h后β胰島素瘤細(xì)胞RIN-m5F分泌胰島素含量。

β胰島素瘤細(xì)胞RIN-m5F存活率結(jié)果如圖12所示。由圖12可知，巨噬細(xì)胞不同處理組的上清液與STZ誘導(dǎo)后的β胰島素瘤細(xì)胞RIN-m5F共培養(yǎng)3h后，A6活菌組的細(xì)胞存活率最高，依次是滅活菌組、菌上清和MRS培養(yǎng)基組。培養(yǎng)6h后的細(xì)胞存活率趨勢與3h的相同。其中A6活菌組的細(xì)胞存活率高于對照組，但差異不顯著。

表4分組及實驗操作

使用胰島素檢測ELISA試劑盒檢測β胰島素瘤細(xì)胞RIN-m5F分泌胰島素含量結(jié)果如圖13所示。結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞不同處理組的上清液與STZ誘導(dǎo)后的RIN-m5F細(xì)胞共培養(yǎng)3h后，A6活菌組、滅活菌組的胰島素分泌量顯著高于對照組(p＜0.01，p＜0.05)。

上述結(jié)果表明，A6活菌或滅活菌可以對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生刺激，促使巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，可以對被STZ誘導(dǎo)后的β胰島素瘤細(xì)胞RIN-m5F產(chǎn)生保護(hù)作用。