本發(fā)明涉及一種抑制黃曲霉菌的復合酸化劑，還涉及一種上述抑制黃曲霉菌的復合酸化劑的制備方法。
背景技術：
黃曲霉，半知菌類，一種常見腐生真菌。多見于發(fā)霉的糧食、糧制品及其它霉腐的有機物上。黃曲霉菌落生長較快，結構疏松，表面灰綠色，背面無色或略呈褐色。菌體有許多復雜的分枝菌絲構成。營養(yǎng)菌絲具有分隔；氣生菌絲的一部分形成長而粗糙的分生孢子梗，頂端產生燒瓶形或近球形頂囊，表面產生許多小梗(一般為雙層)，小梗上著生成串的表面粗糙的球形分生孢子。分生孢子梗、頂囊、小梗和分生孢子合成孢子頭，可用于產生淀粉酶、蛋白酶和磷酸二酯酶等，也是釀造工業(yè)中的常見菌種。
1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機構劃定為1類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質。黃曲霉毒素的危害性在于對人及動物肝臟組織有破壞作用，嚴重時，可導致肝癌甚至死亡。黃曲霉毒素中毒主要對動物肝臟的傷害，受傷害的個體因動物種類，年齡，性別和營養(yǎng)狀態(tài)而異。研究結果表明，黃曲霉毒素可導致肝功能下降，降低牛奶產量和產蛋率，并使動物的免疫力降低，易受有害微生物的感染。此外，長期食用含低濃度黃曲霉毒素的飼料也可導致胚胎內中毒。通常年幼的動物對黃曲霉毒素更敏感。黃曲霉毒素的臨床表現為消化系統(tǒng)功能紊亂，降低生育能力，降低飼料利用率，貧血等。黃曲霉毒素不僅能夠使奶牛的產奶量下降，而且還使牛奶中含有轉型的黃曲霉毒素m1和m2。據美國農業(yè)經濟學家統(tǒng)計，由于食用黃曲霉毒素污染的飼料，每年至少要使美國畜牧業(yè)遭受10％的經濟損失。在中國，黃曲霉同樣給畜牧業(yè)帶來嚴重的損失。因此，開發(fā)出一種抑制黃曲霉菌的復合酸化劑具有重要的意義。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的之一是提供一種抑制黃曲霉菌的復合酸化劑，能有效抑制黃曲霉菌。
為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案，一種抑制黃曲霉菌的復合酸化劑，其制備方法如下：
(1)按照配比稱取以下質量份數的各組分：青蒿10-15份、敗醬草10-15份、滸苔8-10份、枇杷葉15-20份、艾葉3-5份、姜黃1-2份；
(2)將稱量好的青蒿、敗醬草、滸苔分別研磨粉碎，混合均勻，向混合物中加入質量為混合物總質量的1.5-2倍的0.10-0.15mol/L的檸檬酸溶液，密封，然后放振蕩器中以100-150r/min的轉速常溫震蕩10-12h；
(3)將稱量好的枇杷葉刷去絨毛，用水洗凈，切絲，曬干，將枇杷葉絲放入砂鍋中，加入質量為枇杷葉絲質量的10倍的清水，常溫浸泡4-6小時，大火燒開后文火煎煮20-25分鐘，冷卻至室溫，再加入質量為枇杷葉絲質量的1.5-2倍的甲酸，攪勻，蓋上蓋，燜50-60分鐘；
(4)將稱量好的艾葉和姜黃混合，研成碎末，加入質量為艾葉和姜黃總質量的6倍的清水，放入水浴震蕩鍋內70-80℃、100-150r/min浸泡30-40分鐘，冷卻至50-60℃；
(5)當步驟(4)的混勻物冷卻至50-60℃時，向其中加入乳酸，乳酸的添加量為乳酸與步驟(4)所得的混勻物的體積比為1:10-15，混勻，從水浴震蕩鍋中取出，密封，常溫條件下燜12小時；
(6)將步驟(2)、步驟(3)以及步驟(5)所得的產物混合均勻，超聲波震蕩處理15分鐘，再放振蕩器中以100-150r/min的轉速常溫震蕩12h，再將混合產物放入離心機中，以5000r/min離心分離5-10min，取所得上清液，即為目標產物。
優(yōu)選地，步驟(1)中，稱取的各組分的質量份數如下：青蒿15份、敗醬草12份、滸苔9份、枇杷葉16份、艾葉4份、姜黃2份。
優(yōu)選地，步驟(1)中，稱取的各組分的質量份數如下：青蒿12份、敗醬草15份、滸苔8份、枇杷葉18份、艾葉5份、姜黃1份。
優(yōu)選地，乳酸與步驟(4)所得的混勻物的體積比為1:10-12。
本發(fā)明還公開了一種上述制備方法所制得的復合酸化劑。
本發(fā)明所制得的復合酸化劑健康安全，對動物和人無毒副作用，有利于人體和動物體吸收，可有效抑制黃曲霉菌，減少了抗生素的使用，應用于畜禽養(yǎng)殖時可有利于食品安全。按照本發(fā)明的配方比例和制備方法所制得的復合酸化劑可使本發(fā)明的各原料組分之間充分的結合和反應，所制得的復合酸化劑能很好的發(fā)揮各組分的協(xié)同作用，對黃曲霉菌具有顯著的抑制效果，添加到食物或飼料中可以減少黃曲霉菌的危害，有利于人體或養(yǎng)殖動物的健康。在養(yǎng)殖動物的飼料中添加本發(fā)明的復合酸化劑，可降低黃曲霉菌的影響，有利于養(yǎng)殖動物的健康生長，提高養(yǎng)殖收益。
本發(fā)明還公開了一種上述復合酸化劑作為養(yǎng)殖動物的飼料添加劑在抑制黃曲霉菌時的應用，其用法用量為：每1kg飼料中加入5-20ml本發(fā)明所制得的抑制黃曲霉菌的復合酸化劑。
具體來說本發(fā)明與現有技術相比可產生如下積極效果：本發(fā)明所制得的復合酸化劑健康安全，對動物和人無毒副作用，有利于人體和動物體吸收，可有效抑制黃曲霉菌，減少了抗生素的使用，應用于畜禽養(yǎng)殖時可有利于食品安全。按照本發(fā)明的配方比例和制備方法所制得的復合酸化劑可使本發(fā)明的各原料組分之間充分的結合和反應，所制得的復合酸化劑能很好的發(fā)揮各組分的協(xié)同作用，對黃曲霉菌具有顯著的抑制效果，添加到食物或飼料中可以減少黃曲霉菌的危害，有利于人體或養(yǎng)殖動物的健康。在養(yǎng)殖動物的飼料中添加本發(fā)明的復合酸化劑，可降低黃曲霉菌的影響，有利于養(yǎng)殖動物的健康生長，提高養(yǎng)殖收益。
具體實施方式
以下的實施例是為了便于更好地理解本發(fā)明，但并不用于限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
本發(fā)明所用的甲酸(分析純)購自天津市凱信化學工業(yè)有限公司，乳酸(分析純)購自萊陽市康德化工有限公司；檸檬酸(分析純)購自上海埃比化學試劑有限公司，將購買的檸檬酸配制為所需濃度的檸檬酸溶液。
實施例1
一種抑制黃曲霉菌的復合酸化劑，其制備方法如下：
(1)按照配比稱取以下質量份數的各組分：青蒿15份、敗醬草12份、滸苔9份、枇杷葉16份、艾葉4份、姜黃2份；
(2)將稱量好的青蒿、敗醬草、滸苔分別研磨粉碎，混合均勻，向混合物中加入質量為混合物總質量的1.8倍的0.12mol/L的檸檬酸溶液，密封，然后放振蕩器中以120r/min的轉速常溫震蕩10h；
(3)將稱量好的枇杷葉刷去絨毛，用水洗凈，切絲，曬干，將枇杷葉絲放入砂鍋中，加入質量為枇杷葉絲質量的10倍的清水，常溫浸泡4小時，大火燒開后文火煎煮25分鐘，冷卻至室溫，再加入質量為枇杷葉絲質量的2倍的甲酸，攪勻，蓋上蓋，燜60分鐘；
(4)將稱量好的艾葉和姜黃混合，研成碎末，加入質量為艾葉和姜黃總質量的6倍的清水，放入水浴震蕩鍋內70-80℃、110r/min浸泡40分鐘，冷卻至50-60℃；
(5)當步驟(4)的混勻物冷卻至50-60℃時，向其中加入乳酸，乳酸的添加量為乳酸與步驟(4)所得的混勻物的體積比為1:10，混勻，從水浴震蕩鍋中取出，密封，常溫條件下燜12小時；
(6)將步驟(2)、步驟(3)以及步驟(5)所得的產物混合均勻，超聲波震蕩處理15分鐘，再放振蕩器中以100r/min的轉速常溫震蕩12h，再將混合產物放入離心機中，以5000r/min離心分離5-10min，取所得上清液，即為目標產物。
一種上述制備方法所制得的復合酸化劑。
實施例2
一種抑制黃曲霉菌的復合酸化劑，其制備方法如下：
(1)按照配比稱取以下質量份數的各組分：青蒿12份、敗醬草15份、滸苔8份、枇杷葉18份、艾葉5份、姜黃1份；
(2)將稱量好的青蒿、敗醬草、滸苔分別研磨粉碎，混合均勻，向混合物中加入質量為混合物總質量的2倍的0.10mol/L的檸檬酸溶液，密封，然后放振蕩器中以100r/min的轉速常溫震蕩12h；
(3)將稱量好的枇杷葉刷去絨毛，用水洗凈，切絲，曬干，將枇杷葉絲放入砂鍋中，加入質量為枇杷葉絲質量的10倍的清水，常溫浸泡5小時，大火燒開后文火煎煮25分鐘，冷卻至室溫，再加入質量為枇杷葉絲質量的1.6倍的甲酸，攪勻，蓋上蓋，燜60分鐘；
(4)將稱量好的艾葉和姜黃混合，研成碎末，加入質量為艾葉和姜黃總質量的6倍的清水，放入水浴震蕩鍋內70-80℃、120r/min浸泡35分鐘，冷卻至50-60℃；
(5)當步驟(4)的混勻物冷卻至50-60℃時，向其中加入乳酸，乳酸的添加量為乳酸與步驟(4)所得的混勻物的體積比為1:12，混勻，從水浴震蕩鍋中取出，密封，常溫條件下燜12小時；
(6)將步驟(2)、步驟(3)以及步驟(5)所得的產物混合均勻，超聲波震蕩處理15分鐘，再放振蕩器中以150r/min的轉速常溫震蕩12h，再將混合產物放入離心機中，以5000r/min離心分離5-10min，取所得上清液，即為目標產物。
一種上述制備方法所制得的復合酸化劑。
實施例3
一種抑制黃曲霉菌的復合酸化劑，其制備方法如下：
(1)按照配比稱取以下質量份數的各組分：青蒿14份、敗醬草10份、滸苔9份、枇杷葉20份、艾葉3份、姜黃2份；
(2)將稱量好的青蒿、敗醬草、滸苔分別研磨粉碎，混合均勻，向混合物中加入質量為混合物總質量的1.6倍的0.15mol/L的檸檬酸溶液，密封，然后放振蕩器中以150r/min的轉速常溫震蕩10h；
(3)將稱量好的枇杷葉刷去絨毛，用水洗凈，切絲，曬干，將枇杷葉絲放入砂鍋中，加入質量為枇杷葉絲質量的10倍的清水，常溫浸泡6小時，大火燒開后文火煎煮20分鐘，冷卻至室溫，再加入質量為枇杷葉絲質量的1.5倍的甲酸，攪勻，蓋上蓋，燜60分鐘；
(4)將稱量好的艾葉和姜黃混合，研成碎末，加入質量為艾葉和姜黃總質量的6倍的清水，放入水浴震蕩鍋內70-80℃、100r/min浸泡40分鐘，冷卻至50-60℃；
(5)當步驟(4)的混勻物冷卻至50-60℃時，向其中加入乳酸，乳酸的添加量為乳酸與步驟(4)所得的混勻物的體積比為1:11，混勻，從水浴震蕩鍋中取出，密封，常溫條件下燜12小時；
(6)將步驟(2)、步驟(3)以及步驟(5)所得的產物混合均勻，超聲波震蕩處理15分鐘，再放振蕩器中以130r/min的轉速常溫震蕩12h，再將混合產物放入離心機中，以5000r/min離心分離5-10min，取所得上清液，即為目標產物。
一種上述制備方法所制得的復合酸化劑。
實施例4
一種抑制黃曲霉菌的復合酸化劑，其制備方法如下：
(1)按照配比稱取以下質量份數的各組分：青蒿11份、敗醬草11份、滸苔8份、枇杷葉19份、艾葉4份、姜黃1份；
(2)將稱量好的青蒿、敗醬草、滸苔分別研磨粉碎，混合均勻，向混合物中加入質量為混合物總質量的1.5倍的0.14mol/L的檸檬酸溶液，密封，然后放振蕩器中以110r/min的轉速常溫震蕩12h；
(3)將稱量好的枇杷葉刷去絨毛，用水洗凈，切絲，曬干，將枇杷葉絲放入砂鍋中，加入質量為枇杷葉絲質量的10倍的清水，常溫浸泡5小時，大火燒開后文火煎煮25分鐘，冷卻至室溫，再加入質量為枇杷葉絲質量的1.8倍的甲酸，攪勻，蓋上蓋，燜50分鐘；
(4)將稱量好的艾葉和姜黃混合，研成碎末，加入質量為艾葉和姜黃總質量的6倍的清水，放入水浴震蕩鍋內70-80℃、150r/min浸泡30分鐘，冷卻至50-60℃；
(5)當步驟(4)的混勻物冷卻至50-60℃時，向其中加入乳酸，乳酸的添加量為乳酸與步驟(4)所得的混勻物的體積比為1:14，混勻，從水浴震蕩鍋中取出，密封，常溫條件下燜12小時；
(6)將步驟(2)、步驟(3)以及步驟(5)所得的產物混合均勻，超聲波震蕩處理15分鐘，再放振蕩器中以120r/min的轉速常溫震蕩12h，再將混合產物放入離心機中，以5000r/min離心分離5-10min，取所得上清液，即為目標產物。
一種上述制備方法所制得的復合酸化劑。
實施例5
一種抑制黃曲霉菌的復合酸化劑，其制備方法如下：
(1)按照配比稱取以下質量份數的各組分：青蒿10份、敗醬草14份、滸苔10份、枇杷葉15份、艾葉5份、姜黃2份；
(2)將稱量好的青蒿、敗醬草、滸苔分別研磨粉碎，混合均勻，向混合物中加入質量為混合物總質量的1.7倍的0.13mol/L的檸檬酸溶液，密封，然后放振蕩器中以140r/min的轉速常溫震蕩10h；
(3)將稱量好的枇杷葉刷去絨毛，用水洗凈，切絲，曬干，將枇杷葉絲放入砂鍋中，加入質量為枇杷葉絲質量的10倍的清水，常溫浸泡6小時，大火燒開后文火煎煮20分鐘，冷卻至室溫，再加入質量為枇杷葉絲質量的1.7倍的甲酸，攪勻，蓋上蓋，燜50-60分鐘；
(4)將稱量好的艾葉和姜黃混合，研成碎末，加入質量為艾葉和姜黃總質量的6倍的清水，放入水浴震蕩鍋內70-80℃、140r/min浸泡35分鐘，冷卻至50-60℃；
(5)當步驟(4)的混勻物冷卻至50-60℃時，向其中加入乳酸，乳酸的添加量為乳酸與步驟(4)所得的混勻物的體積比為1:15，混勻，從水浴震蕩鍋中取出，密封，常溫條件下燜12小時；
(6)將步驟(2)、步驟(3)以及步驟(5)所得的產物混合均勻，超聲波震蕩處理15分鐘，再放振蕩器中以110r/min的轉速常溫震蕩12h，再將混合產物放入離心機中，以5000r/min離心分離5-10min，取所得上清液，即為目標產物。
一種上述制備方法所制得的復合酸化劑。
實施例6
一種抑制黃曲霉菌的復合酸化劑，其制備方法如下：
(1)按照配比稱取以下質量份數的各組分：青蒿10份、敗醬草12份、滸苔9份、枇杷葉18份、艾葉3份、姜黃1份；
(2)將稱量好的青蒿、敗醬草、滸苔分別研磨粉碎，混合均勻，向混合物中加入質量為混合物總質量的2倍的0.10mol/L的檸檬酸溶液，密封，然后放振蕩器中以130r/min的轉速常溫震蕩12h；
(3)將稱量好的枇杷葉刷去絨毛，用水洗凈，切絲，曬干，將枇杷葉絲放入砂鍋中，加入質量為枇杷葉絲質量的10倍的清水，常溫浸泡5小時，大火燒開后文火煎煮20分鐘，冷卻至室溫，再加入質量為枇杷葉絲質量的1.8倍的甲酸，攪勻，蓋上蓋，燜60分鐘；
(4)將稱量好的艾葉和姜黃混合，研成碎末，加入質量為艾葉和姜黃總質量的6倍的清水，放入水浴震蕩鍋內70-80℃、130r/min浸泡30分鐘，冷卻至50-60℃；
(5)當步驟(4)的混勻物冷卻至50-60℃時，向其中加入乳酸，乳酸的添加量為乳酸與步驟(4)所得的混勻物的體積比為1:13，混勻，從水浴震蕩鍋中取出，密封，常溫條件下燜12小時；
(6)將步驟(2)、步驟(3)以及步驟(5)所得的產物混合均勻，超聲波震蕩處理15分鐘，再放振蕩器中以140r/min的轉速常溫震蕩12h，再將混合產物放入離心機中，以5000r/min離心分離5-10min，取所得上清液，即為目標產物。
一種上述制備方法所制得的復合酸化劑。
抑菌實驗
培養(yǎng)基：察氏培養(yǎng)基，加熱溶解，分裝后121℃滅菌15-20min。
菌種為：黃曲霉菌(ATCC28539)，購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院。
菌懸液制備：用接種環(huán)挑取3-4環(huán)培養(yǎng)5天左右的黃曲霉菌孢子，置于10ml帶無菌玻璃珠的無菌水中，采用活菌計數法測定菌數，制成菌體濃度為106-107CFU/ml的均勻菌懸液。
抑菌圈實驗：取0.1ml菌懸液滴入察氏培養(yǎng)基，涂布均勻，即為含菌平板。實驗組處理如下：用滅菌去離子水分別將本發(fā)明實施例1-實施例6所制得的抑制黃曲霉菌的復合酸化劑溶解稀釋至體積百分比為2％，將滅菌濾紙片(d＝6mm)分別用體積百分比為2％的本發(fā)明實施例1-實施例6所制得的抑制黃曲霉菌的復合酸化劑浸泡1h，取出分別貼于各處理組的含菌平板的瓊脂表面中央。對照組處理如下：將滅菌濾紙片(d＝6mm)用滅菌去離子水浸泡1h，取出貼于含菌平板的瓊脂表面中央。每個實驗組和對照組分別設置3個平行。將各處理組的培養(yǎng)皿置于28℃條件下恒溫培養(yǎng)，倒置培養(yǎng)5天后用游標卡尺(精度為0.02mm)測量抑菌圈大小，計算平均值，并記錄。
無抑菌圈以“-”表示；
抑菌圈直徑7-9mm為輕度抑菌，以“+”表示；
抑菌圈直徑10～15mm為中度抑菌，以“++”表示；
抑菌圈直徑＞15mm為高度抑菌，以“+++”表示；
實驗結果見表1：
表1本發(fā)明的抑制黃曲霉菌的復合酸化劑對黃曲霉的抑制效果
由表1可知，本發(fā)明的抑制黃曲霉菌的復合酸化劑對黃曲霉具有顯著的抑菌效果。
最低抑菌濃度實驗
培養(yǎng)基：察氏培養(yǎng)基，加熱溶解，分裝后121℃滅菌15-20min。
菌種為：黃曲霉菌(ATCC28539)，購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院。
菌懸液制備：用接種環(huán)挑取3-4環(huán)培養(yǎng)5天左右的黃曲霉菌孢子，置于10ml帶無菌玻璃珠的無菌水中，采用活菌計數法測定菌數，制成菌體濃度為106-107CFU/ml的均勻菌懸液。
將本發(fā)明實施例1-實施例6的抑制黃曲霉菌的復合酸化劑用滅菌去離子水分別進行50倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1000倍、1500倍稀釋。取0.1ml菌懸液滴入已滅菌冷卻凝固的培養(yǎng)基中，涂布均勻，得含菌平板。吸取各稀釋液0.1ml，于無菌條件下涂布到含菌平板的瓊脂表面，倒置培養(yǎng)5天(培養(yǎng)溫度28℃)，以不生長菌的樣品的濃度為抑制黃曲霉菌的復合酸化劑的最低抑菌濃度(MIC)。實驗結果見下表(表2)：
表2本發(fā)明的抑制黃曲霉菌的復合酸化劑對黃曲霉的MIC
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出：對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進應視為本發(fā)明的保護范圍。