本發(fā)明涉及生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高龍須菜品質(zhì)的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
龍須菜是較為常見的大型海藻，因其具有重要經(jīng)濟(jì)價值和生態(tài)功能而被廣泛研究，并在我國沿海地區(qū)實現(xiàn)人工栽培養(yǎng)殖，成為繼海帶、紫菜、裙帶菜后的又一個新興的海藻產(chǎn)業(yè)群。龍須菜主要成分是瓊膠多糖和粗纖維，約占藻體的59.4％。龍須菜的蛋白質(zhì)含量為14.5-22.8％，氨基酸組成均衡，脂肪含量較低，為0.4-0.8％。同時，龍須菜維生素和礦質(zhì)元素含量豐富，特別是Mg、Fe、Ca、K、Na、Zn等元素。因此，龍須菜是一種高膳食纖維、高蛋白質(zhì)、低脂肪的富含維生素和礦物質(zhì)的海藻飼料原料，充分利用這些優(yōu)勢，可以將它進(jìn)一步開發(fā)利用。然而，龍須菜中過高的瓊膠多糖和粗纖維會降低其在動物胃腸內(nèi)的消化吸收，降低其營養(yǎng)價值。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種提高龍須菜品質(zhì)的發(fā)酵方法，利用黃桿菌的特性，低溫發(fā)酵，快速降低龍須菜中膠多糖和粗纖維含量，提高龍須菜中動物可消化吸收利用的寡糖含量和蛋白質(zhì)含量，分解原料部分有害物質(zhì)，降低其毒性，提高龍須菜作為飼料原料的營養(yǎng)價值和利用價值。
為了實現(xiàn)上述的目的，采用如下的技術(shù)方案。一種提高龍須菜品質(zhì)的發(fā)酵方法，所述方法包括以下步驟：
1龍須菜原料的制備
①龍須菜采集：龍須菜采集后，清洗，去除雜質(zhì)，曬干；
②龍須菜粉制備：將曬干的龍須菜放入干燥箱烘干，水分含量控制在10～15％，然后用粉碎機(jī)粉碎至40～100目，備用。
2發(fā)酵菌種的選擇
本發(fā)明優(yōu)選菌種為海洋瓊膠酶高產(chǎn)菌——黃桿菌(Flavobacterium sp.)，該菌種由汕頭大學(xué)理學(xué)院生物系所篩選,于2008年1月16日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌株保藏編號為：CGMCC NO.2342。專利CN101608166A公開了該菌種的分離篩選和鑒定方法。
2.1菌種活化培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基(2216E培養(yǎng)基)組成：蛋白胨5g，酵母粉1g，磷酸鐵0.01g，陳海水1000ml，調(diào)節(jié)pH為7.2～7.6，121℃滅菌20min；
搖瓶培養(yǎng)基：2216E培養(yǎng)基添加0.2％的瓊脂粉；
固體培養(yǎng)基：2216E培養(yǎng)基添加1.5％的瓊脂粉；
發(fā)酵培養(yǎng)基：龍須菜含量3％，NaCl含量2％，蒸餾水配制，pH7.6，121℃滅菌20min備用。
2.2培養(yǎng)方法
S1搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將-80℃保存的細(xì)菌按2％的接種量接入2216E培養(yǎng)基中，25℃，恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中150r/min培養(yǎng)58小時，在600nm波長下，用分光光度計測定OD值，每6小時測定一次并記錄，測定結(jié)果見表1，從表1可看出菌液在40小時濃度最高；
S2菌種活化：將-80℃保存的細(xì)菌劃線接于固體培養(yǎng)基平板活化，然后再轉(zhuǎn)接于100ml搖瓶培養(yǎng)基中于25℃繼續(xù)活化培養(yǎng)40h，得到菌液；
S3甘油保種：將培養(yǎng)好的菌液和50％的甘油溶液按1:1的比例混勻分裝在菌種瓶中，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>
表1不同培養(yǎng)時間菌液的濃度變化
3單因素試驗優(yōu)化發(fā)酵條件
對龍須菜添加量、菌種接種量、NaCl添加量、龍須菜粉碎顆粒大小、發(fā)酵時間等5個因素依次進(jìn)行單因素試驗優(yōu)化，根據(jù)發(fā)酵后龍須菜發(fā)酵液中的粗蛋白質(zhì)、寡糖含量及粗纖維素含量，篩選出最佳的發(fā)酵條件。每一次發(fā)酵結(jié)束后，取部分發(fā)酵樣品65℃烘干，粉碎過40目篩，用于測定粗蛋白質(zhì)，寡糖和粗纖維素含量。
3.1龍須菜添加量的優(yōu)化
將培養(yǎng)活化的菌液,按5％(v/v)的接種量接入含2％(w/v)NaCl的龍須菜培養(yǎng)基中，設(shè)置5個不同梯度的龍須菜添加量(w/v)，分別為1％、2％、3％、4％、5％，每個處理3個重復(fù)。pH7.6，25℃，恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中150r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)30小時后，測定結(jié)果見表2。
表2不同龍須菜添加量發(fā)酵產(chǎn)物變化
注：同列數(shù)據(jù)中，無相同小寫字母標(biāo)注者表示相互間差異顯著(P<0.05)。
由表2可知，粗蛋白含量隨著龍須菜添加量的增加而逐漸升高，3％時含量最高，為16.43％，隨后又降低；寡糖含量隨著龍須菜添加量的增加不斷升高，3％時含量最高，為2.07％，隨后又降低；粗纖維素含量隨著龍須菜添加量的增加而逐漸降低，3％時含量最低，為3.75％，隨后又升高。因此，選擇龍須菜添加量為3％較好。
3.2龍須菜粉碎顆粒大小優(yōu)化
將培養(yǎng)活化的菌液,按5％(v/v)的接種量接種于含3％(w/v)龍須菜，2％(w/v)NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中，設(shè)置4個不同比例的龍須菜粉碎顆粒，分別為40、60、80、100目，每個處理3個重復(fù)。pH7.6，25℃，恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中150r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)30小時后，測定結(jié)果見表3。
表3不同龍須菜顆粒大小的發(fā)酵產(chǎn)物變化
注：同列數(shù)據(jù)中，無相同小寫字母標(biāo)注者表示相互間差異顯著(P<0.05)。
由表3可知，粗蛋白和寡糖含量在龍須菜粉碎顆粒過40目時最高，為16.38％和1.88％，隨著龍須菜粉碎顆粒越細(xì)，粗蛋白和寡糖含量均降低；粗纖維素含量在龍須菜粉碎顆粒過40目時最低，為3.88％，隨著龍須菜粉碎顆粒越細(xì)，粗纖維素含量升高。因此，龍須菜粉碎顆粒過40目較好。
3.3發(fā)酵培養(yǎng)基NaCl添加量的優(yōu)化
本方法采用在蒸餾水中添加不同含量的NaCl方法來替代陳海水，從而優(yōu)化培養(yǎng)基。設(shè)置4個不同比例的NaCl添加量(w/v)，分別為1％、2％、3％、4％，將培養(yǎng)活化的菌液,按5％(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接于含3％(w/v)龍須菜發(fā)酵培養(yǎng)基中，每個處理3個重復(fù)。pH7.6，25℃，恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中150r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)30小時后，測定結(jié)果見表4。
表4添加不同NaCl含量的發(fā)酵產(chǎn)物變化
注：同列數(shù)據(jù)中，無相同小寫字母標(biāo)注者表示相互間差異顯著(P<0.05)。
由表4可知，粗蛋白含量隨著發(fā)酵培養(yǎng)基NaCl添加量的增加而逐漸升高，3％時含量最高，為16.50％，隨后又降低；寡糖含量隨著發(fā)酵培養(yǎng)基NaCl添加量的增加不斷升高，3％時含量最高，為1.97％，隨后又降低；粗纖維素含量隨著發(fā)酵培養(yǎng)基NaCl添加量的增加而逐漸降低，3％時含量最低，為3.77％，隨后又升高。因此，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基中添加3％的NaCl較好。
3.4發(fā)酵菌液接種量的優(yōu)化
將培養(yǎng)活化的菌液,設(shè)置5個不同比例的菌液接種量(v/v)，分別為1％、2％、5％、10％、15％，分別接種于含3％(w/v)龍須菜，3％(w/v)NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中，每個處理3個重復(fù)。pH7.6，25℃，恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中150r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)30小時后，測定結(jié)果見表5。
表5接種不同含量菌液的發(fā)酵產(chǎn)物變化
注：同行數(shù)據(jù)中，無相同小寫字母標(biāo)注者表示相互間差異顯著(P<0.05)。
由表5可知，粗蛋白含量隨著發(fā)酵菌液接種量的增加而逐漸升高，10％時含量最高，為16.86％，隨后又降低；寡糖含量隨著發(fā)酵細(xì)菌接種量的增加不斷升高，10％時含量最高，為2.13％，隨后又降低；粗纖維素含量隨著發(fā)酵細(xì)菌接種量的增加而逐漸降低，10％時含量最低，為3.88％，隨后又升高。因此，發(fā)酵細(xì)菌接種量選擇在10％較好。
3.5發(fā)酵時間的優(yōu)化
將培養(yǎng)活化的菌液,按10％(v/v)的接種量接入含3％(w/v)龍須菜，3％(w/v)NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中，設(shè)置9個發(fā)酵時間點，分別為12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h，每個處理3個重復(fù)。pH7.6，25℃，恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中150r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)，隔一段時間取樣檢測，測定結(jié)果見表6。
表6不同發(fā)酵時間的產(chǎn)物變化
注：同列數(shù)據(jù)中，無相同小寫字母標(biāo)注者表示相互間差異顯著(P<0.05)
由表6可知，粗蛋白含量隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸升高，72h含量最高，為16.50％，隨后又降低；寡糖含量隨著發(fā)酵時間的延長不斷升高，72h含量最高，為2.97％，隨后又降低；粗纖維素含量隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸降低，72h含量最低，為3.81％，隨后又升高。因此，發(fā)酵時間選擇在72小時較好。
4正交試驗優(yōu)化發(fā)酵條件
在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇龍須菜添加量(A)，菌液接種量(B)，NaCl濃度(C)，龍須菜顆粒大小(D)四個因素進(jìn)行4因素3水平的正交設(shè)計，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，每組3個重復(fù)。正交試驗因素水平表見表7。發(fā)酵溫度25℃，pH7.6，恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速150r/min發(fā)酵72小時。發(fā)酵結(jié)束后，取部分鮮樣65℃烘干，用于測定寡糖含量。
表7正交試驗設(shè)計的因素和水平
表8正交試驗寡糖產(chǎn)量極差分析表
表9寡糖產(chǎn)量方差分析表
由極差分析(表8)寡糖含量R值可知，影響試驗結(jié)果因素的先后順序為：A>C>B>D，即影響龍須菜發(fā)酵產(chǎn)寡糖的因素依次為：龍須菜添加量、NaCl添加濃度、菌液接種量、龍須菜顆粒大小。
根據(jù)寡糖含量的K值可得最佳組合是A3B3C2D1，即發(fā)酵龍須菜含量3％，NaCl濃度2％，菌液接種量10％，龍須菜顆粒大小40目。發(fā)酵溫度25℃，pH7.6，恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速150r/min，發(fā)酵時間72小時。龍須菜發(fā)酵條件優(yōu)化后，寡糖含量達(dá)到2.42％，而優(yōu)化前寡糖含量為0.81％，寡糖含量提高了1.99倍。
由方差分析(表9)的F值可以看出，影響試驗結(jié)果因素的先后順序為：A>C>B>D，即影響龍須菜發(fā)酵產(chǎn)寡糖的因素依次為：龍須菜添加量、NaCl濃度、菌液接種量、龍須菜顆粒大小,且四個因素對龍須菜發(fā)酵產(chǎn)寡糖的影響都顯著。
結(jié)合單因素試驗得到龍須菜發(fā)酵的最佳條件，發(fā)酵龍須菜含量3％，NaCl濃度2％，發(fā)酵菌種接種量10％，龍須菜顆粒大小40目。發(fā)酵溫度25℃，發(fā)酵時間72小時，發(fā)酵液pH7.6，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速150r/min。
5確定最優(yōu)發(fā)酵條件
結(jié)合單因素實驗設(shè)計及正交試驗設(shè)計確定龍須菜發(fā)酵的最優(yōu)條件：發(fā)酵龍須菜含量3％，NaCl濃度3％，發(fā)酵菌種接種量10％，龍須菜顆粒大小40目，發(fā)酵溫度25℃，發(fā)酵時間72小時，發(fā)酵液pH7.6，恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱150r/min。以此條件，在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵龍須菜，設(shè)3個重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵產(chǎn)物65℃烘干，粉碎過40目篩，用于測定干物質(zhì)、粗灰分、粗纖維、粗脂肪、粗蛋白、寡糖含量，測定結(jié)果見表10。
表10飼料原料發(fā)酵龍須菜、龍須菜的營養(yǎng)成分
由表10可知，以最優(yōu)條件發(fā)酵后，與對照組相比，在干物質(zhì)基礎(chǔ)上，粗灰分由30.4％提高到34.3％，粗蛋白質(zhì)由15.22％提高到16.42％，粗脂肪由0.57％降低到0.47％，寡糖由0.83％提高到1.90％，粗纖維由6.32％降低到3.87％。
綜上所述，本發(fā)明利用海洋瓊膠酶高產(chǎn)菌——黃桿菌(Flavobacterium sp.)發(fā)酵技術(shù)改善龍須菜品質(zhì)，發(fā)酵方法包括以下步驟：
S1將龍須菜洗凈烘干，粉碎至小顆粒；
S2制作發(fā)酵培養(yǎng)基，龍須菜顆粒加入蒸餾水，用NaCl調(diào)節(jié)鹽度，NaCl用量為1-4％(w/v)，混合均勻，調(diào)節(jié)pH值7.2-7.6；
S3高壓滅菌，冷卻后接種發(fā)酵菌液1-15％(v/v)；
S4發(fā)酵，設(shè)置溫度25℃，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速150r/min，發(fā)酵時間12-48小時。
其中，S3中的發(fā)酵菌液由以下方法制得：黃桿菌接種于2216E固體培養(yǎng)基平板活化，然后再轉(zhuǎn)接于100ml搖瓶培養(yǎng)基中，pH7.6，25℃，恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中150r/min轉(zhuǎn)速下活化培養(yǎng)40小時，得到菌液。
作為優(yōu)選，步驟S1中，所述龍須菜烘干后，水分含量控制在10～15％，粉碎顆粒大小為40目。
作為優(yōu)選，步驟S1中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中龍須菜的添加量為3％(w/v)。
作為優(yōu)選，步驟S2中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中NaCl添加量為2％(w/v)。
作為優(yōu)選，步驟S2中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為7.6。
按照上述發(fā)酵方法制得的龍須菜發(fā)酵產(chǎn)物，比未經(jīng)發(fā)酵的龍須菜中的營養(yǎng)成分更理想，更適合作為經(jīng)濟(jì)魚類的飼養(yǎng)飼料，經(jīng)過發(fā)酵，龍須菜中瓊膠多糖和粗纖維含量降低了，增加動物可消化吸收利用的寡糖和蛋白質(zhì)含量，同時經(jīng)過發(fā)酵后提高發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量，此外通過微生物發(fā)酵可以分解原料中部分有害物質(zhì)，降低其毒性。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用單一菌種發(fā)酵處理龍須菜，選用的黃桿菌發(fā)酵可以生產(chǎn)瓊膠酶，能夠有效快速增加龍須菜中寡糖的含量，提高其作為經(jīng)濟(jì)魚類飼料的營養(yǎng)價值，而且該菌種不需要瓊脂，只需要有NaCl，來源非常簡單，龍須菜發(fā)酵產(chǎn)物作為飼料既能提高營養(yǎng)價值又不會污染環(huán)境，該發(fā)酵方法溫度較低，速度快，步驟簡單，可操作性較強(qiáng)，容易放大實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，對龍須菜作為動物飼料的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用有重要的意義。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
本實施以優(yōu)選參數(shù)為發(fā)酵條件，具體發(fā)酵方法包括以下幾個步驟：
S1將龍須菜洗凈曬干，放入烘干箱烘干至水分含量10-15％，然后用粉碎機(jī)至顆粒大小40目；
S2制作發(fā)酵培養(yǎng)基，按照龍須菜3％(w/v)加入蒸餾水，用NaCl調(diào)節(jié)鹽度，NaCl用量為2％(w/v)，混合均勻，調(diào)節(jié)pH值7.6；
S3將黃桿菌接種于2216E固體培養(yǎng)基平板活化，然后再轉(zhuǎn)接于100ml搖瓶培養(yǎng)基中，pH7.6，25℃，恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中150r/min轉(zhuǎn)速下活化培養(yǎng)40小時，得到菌液；
S4高壓滅菌，121℃20分鐘，冷卻后接種發(fā)酵菌液10％(v/v)；
S5發(fā)酵，設(shè)置溫度25℃，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速150r/min，發(fā)酵時間72小時。
設(shè)3個重復(fù)，在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵龍須菜，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵產(chǎn)物65℃烘干，粉碎過40目篩，用于測定干物質(zhì)、粗灰分、粗纖維、粗脂肪、粗蛋白、寡糖含量，以最優(yōu)條件發(fā)酵后，與對照組相比，在干物質(zhì)基礎(chǔ)上，粗灰分由30.4％提高到34.3％，粗蛋白質(zhì)由15.22％提高到16.42％，粗脂肪由0.57％降低到0.47％，寡糖由0.83％提高到1.90％，粗纖維由6.32％降低到3.87％。